Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Противомикробные свойства базидиомицетов Fomitopsis officinalis (Vill.:Fr.)Bond.et Sing., Fomitorsis pinicola(Sw.:Fr.)P.Karst. и Trametes versicolor(L.:Fr.)Lloyd: оценка перспектив использования в технологии пищевых продуктов

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Противомикробные свойства базидиомицетов Fomitopsis officinalis (Vill.:Fr.)Bond.et Sing., Fomitorsis pinicola(Sw.:Fr.)P.Karst. и Trametes versicolor(L.:Fr.)Lloyd: оценка перспектив использования в технологии пищевых продуктов"

На правах рукописи

Í^J

ЖИЛИНСКАЯ Наталия Викторовна

ПРОТИВОМИКРОБНЫЕ СВОЙСТВА БАЗИДИОШЩЕТОВ FOMITOPSIS OFFICINALIS (V1LL.: FR.) BOND. ET SING., FOMITOPSIS flNICOLA (SW.: FR.) P. KARST. И TRAMETES VERSICOLOR (L.: FR.) LLOYD: ОЦЕПКЛ" ПЕРСПЕКТИВ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ТЕХНОЛОГИИ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

Специальность: 03.01.06 - Биотехнология (в том числе биоианотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 АПР 2015

Москва-2015

005566613

005566613

Работа выполнена на кафедре биотехнологии и технологии продуктов органического синтеза федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московского государственного университета пищевых производств.

Научный Громовых Татьяна Ильинична

руководитель: доктор биологических наук, профессор

Официальные Краснопольская Лариса Михайловна

оппоненты: доктор биологических наук,

ФГБ1ГУ Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе, заведующая лабораторией биосинтеза биологически активных веществ

Блннкова Лариса Петровна

доктор биологических наук, профессор, ФГБНУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.й. Мечникова, заведующая лабораторией микробиологических питательных сред

Ведущая Федеральное государственное бюджетное образовательное

организация: учреждение высшего профессионального образования

Московский государственный машиностроительный университет, кафедра экологической и промышленной биотехнологии.

Защита диссертации состоится »СЫЬ^ЬСсОЯ 2015 г. в 15.30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, биологический факультет МГУ, ауд. М-1.

Тел. 8(495)939-54-83, эл. почта: npiskunkova@rambler.ni

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова http://www.bio.msu.ru/.

Автореферат разослан «,/Д » ¿.¿¿С/Ь^Я.2015 г.

Ученый секретарь /'

Диссертационного совета кандидат биологических наук

Пискункова Нина Федоровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: Основными факторами, влияющими на показатели качества пищевой продукции, такие как физико-химические и органолептические характеристики, безопасность, являются условно-патогенные и патогенные микроорганизмы (из родов Bacillus, Clostridium, Escherichia, Proteus, Salmonella, Shigella) и микромицеты (из родов Aspergillus, Candida, Cladosporium, Fusarium, Odium, Pénicillium), вызывающие порчу пищевых продуктов. Особую опасность представляют токсинообразующие микромицеты рода Pénicillium, которые распространены повсеместно на предприятиях перерабатывающей и пищевой промышленности России и вызывают плесневение и ухудшение качества сырья и продукции, растительного и животного происхождения (Кузнецова, 2010; Pitt, 2000; Samson, 2004).

Большинство добавок, используемых для сохранения качества продуктов, имеют химическую природу. В связи с тем, что многие производители пытаются найти альтернативную замену ингредиентам, имеющим индекс «Е», перспективно получение добавок природного происхождения. Одними из возможных источников получения пищевых добавок являются грибы класса Basidiomycetes, обладающие антибактериальными, фунгицидными, антиоксидантными и противоопухолевыми свойствами (Li, 2014; Phan, 2013; Vazirian, 2014; Wu, 2014). В различных странах в качестве продуцентов этих соединений используют базидиомицеты из родов: Agaricus, Boletus, Coriolus, Calvatia, Flammulina, Ganoderma, Grifola, Inonotus, Lentinus, Phollota, Pleurotus (Белова, 2001; Гвоздкова, 2007).

Однако, несмотря на огромный потенциал и преимущества производства препаратов из высших базидиомицетов, такие как экологическая чистота, безотходность производства и не дефицитность сырьевых ресурсов, промышленное производство пищевых добавок, созданных на основе глубинного мицелия грибов, только начинает налаживаться (Бабицкая, 2006; Краснопольская, 2007). Кроме того, в настоящее время отсутствует достаточное количество сведений о противомикробных свойствах мицелия представителей родов Fomitopsis и Trametes в отношении возбудителей порчи пищевых продуктов. Оценка возможности их использования и поиск антагонистически активных штаммов представителей данных родов является перспективным направлением в пищевой промышленности.

Цель работы - изучение противомикробных свойств ксилотрофных базидиомицетов - представителей родов Fomitopsis и Trametes в отношении возбудителей порчи пищевых продуктов, и оценка перспектив применения антагонистически активных штаммов в пищевой промышленности. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: • определить противомикробную активность штаммов базидиомицетов из родов Fomitopsis и Trametes в отношении опасных контаминантов и

возбудителей порчи пищевых продуктов и провести скрининг штаммов, обладающих высокой активностью;

• изучить морфолого-культуральные, физиологические и молекулярно-генетические свойства антагонистически активных штаммов базидиомицетов из родов Fomitopsis и Trametes и идентифицировать их до вида;

• определить показатели роста антагонистически активных штаммов F. officinalis, F. pinícola и Т. versicolor при различных условиях культивирования;

• исследовать влияние когерентного и некогерентного света и акустических волн в слышимом диапазоне частот на ростовые показатели мицелия антагонистически активных штаммов F. officinalis, F. pinícola и Т. versicolor,

• определить хитиназную и целлюлазную ферментативную активность штаммов F. officinalis, F. pinícola и Т. versicolor,

• исследовать токсичность мицелия штаммов F. officinalis, F. pinícola и Т. versicolor в отношении инфузорий Paramecium caudatum и Tetrahymena pyriformis;

• определить биохимический состав и переваримость биомассы мицелия штаммов базидиомицетов F. officinalis, F. pinícola и Т. versicolor на установке «искусственный желудок»;

• провести оценку возможности использования препарата мицелия штамма Т. versicolor В 08/06 как пищевой добавки при производстве мясопродуктов;

• разработать способ получения полимерного покрытия пищевых продуктов, содержащего в качестве «активного» компонента мицелий штамма Т. versicolor В 08/06, и оценить противомикробные свойства пленок.

Научная новнзна работы.

В результате исследований установлено, что штаммы базидиомицетов из родов Fomitopsis и Trametes обладают широким спектром антибактериальной активности в отношении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans - опасных контаминантов пищевых продуктов.

В условиях активного роста базидиомицеты из родов Fomitopsis и Trametes проявляют противоплесневую активность в отношении микромицетов рода Pénicillium: P. commune, P. brevicompactum, P. polonlcum, P. roquefort1 и Р. nalgiovense, вызывающих порчу пищевых продуктов. Антагонистические свойства штаммов базидиомицетов в отношении микромицетов рода Pénicillium обусловлены наличием у исследуемых штаммов хитиназной и целлюлазной активности.

На основании исследований культурально-морфологических, физиологических и молекулярно-генетических свойств установлена принадлежность антагонистически активных штаммов базидиомицетов к видам Fomitopsis officinalis, Fomitopsis pinicola и Trametes versicolor.

4

Показано, что при твердофазном и жидкофазном культивировании, когерентный и некогерентный свет оказывает стимулирующий эффект на рост мицелия штамма Т. versicolor, а на штаммы рода Fomitopsis достоверного влияния не оказывает.

Установлено, что биомасса мицелия штаммов Fomitopsis officinalis, Fomitopsis pinicola и Trametes versicolor не является токсичной в отношении инфузорий Paramecium caudatum и Tetrahymena pyriformis и может быть рекомендована при разработке кормовых добавок для животных.

На основании исследований физиологических, культуральных, биотехнологических и биохимических свойств для разработки пищевых добавок отобран антагонистически активный штамм Т. versicolor В 08/06, мицелий которого содержит 17,9 % белка с переваримостью 15,9 мг тирозина/г белка.

Впервые предложено использование штамма вида Trametes versicolor в качестве «активного» компонента в полимерном покрытии для защиты пищевых продуктов.

Практическая значимость работы:

- штамм Т. versicolor В 08/06, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов с коллекционным номером ВКПМ F-1024 как продуцент противоплесневых препаратов и рекомендован для разработки функциональной пищевой добавки и как «активный» компонент полимерного покрытия;

- разработаны рекомендации по применению когерентного света с выходной мощностью 33 мВт для ускорения роста мицелия штамма Т. versicolor В 08/06 в условиях погруженного и поверхностного культивирования;

- показана возможность биоконверсии штаммами F. pinicola и Т. versicolor растительных отходов предприятий АПК для получения кормовых добавок животным;

- разработан способ получения полимерного покрытия нового типа методом биоконверсии метилцеллюлозы штаммом Т. versicolor В 08/06 для зашиты поверхности пищевых продуктов от плесневения и микробной порчи;

- проведены испытания опытных партий препарата мицелия штамма Т. versicolor В 08/06 и даны рекомендации для разработки на его основе функциональной добавки для производства мясопродуктов.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы были представлены на XXIII Международной научно-технической конференции «Лазеры в науке, технике, медицине» (Дивноморск, 2012); III Съезде микологов России (Москва, 2012); Международной научной конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (Саранск, 2012); X Международной научно-практической конференции с международным участием «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2012); Международной научно-практической конференции «Инновационное развитие современной науки» (Уфа, 2014);

Международной научно-практической конференции «Биотехнология и качество жизни» (Москва, 2014); IV Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2014); Общеуниверситетской научной конференции молодых ученых и специалистов «День науки» (Москва, 2014); III Международной научно-практической конференции «Наука и Образование XXI века» (Уфа, 2014).

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов: проекта № 9353 «Коллекция культур бактерий, бактериофагов, дрожжевых и мицелиальных грибов как база для научно-образовательного процесса, сохранения биоразнообразия и развития современной биотехнологии»; госконтракта П175 в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг.; грантов Президента РФ по поддержке ведущих научных школ - НШ № 16.120.11.3245 - «Разработка новых пищевых технологий с участием живых систем на основе нетрадиционных подходов к управлению их жизнедеятельностью и обеспечению качественных показателей готовой продукции», НШ № 5543.2014.4 - «Расширение альтернативных источников пищевого и лекарственного сырья на основе клеточных технологий, биотехнологий и нетрадиционных способов управления жизнедеятельностью живых систем».

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Общий объем диссертации 195 страниц (основная часть - 161 стр.; приложения - 34 стр.). Диссертация включает 34 рисунка и 20 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 267 источников, 141 из которых на иностранных языках.

Публикации.

Материалы диссертации изложены в 16 публикациях (из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 1 патент). Экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены лично соискателем и опубликованы в соавторстве с руководителем и сотрудниками, работавшими совместно с автором в процессе выполнения исследований.

Благодарности.

Автор выражает благодарность: проф., д.т.н. А.И. Жаринову; проф. кафедры микологии и альгологии МГУ имени М.В. Ломоносова, д.б.н. А.В. Шныревой и д.б.н. О.В. Камзолкиной; д.т.н. Т.Н. Данильчук; руководителю лаборатории лазерных методов диагностики и лечения опухолей Российского онкологического научного центра имени Н.Н. Блохина, д.ф.-м.н. А.В. Иванову; инженеру Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина В.Я. Лысанской; м.н.с. лаборатории научно-методической работы и контрольно-аналитических исследований ВНИМП им. В.М. Горбатова А.В. Куликовскому; Генеральному директору ООО «Микобор» Л.С. Кузнецовой за представленные для работы штаммы микромицетов рода Pénicillium.

Отдельная благодарность научному руководителю проф., д.б.н. Т.И. Громовых за неоценимую помощь, понимание и поддержку на всех этапах работы над диссертацией.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность проблемы, сформулированы цели и задачи исследований, показана научная новизна и практическая значимость результатов работы.

В первой главе представлены сведения о поражении пищевых продуктов и основных возбудителях, в том числе наиболее вредоносных видов рода Pénicillium. Особое место уделяется характеристике антибиотических свойств базидиомицетов и оценке перспектив их использования в мировой практике. Представлена информация об использовании физических факторов - световых и звуковых волн для повышения скорости роста биологических объектов.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Базидиомицетовые грибы: трутовик лекарственный (лиственничная губка) -Fomitopsis officinalis (Vill.: Fr.) Bond, et Sing., трутовик окаймленный - Fomitopsis pinícola (Sw.: Fr.) P. Karst, и трутовик разноцветный - Trámeles versicolor (L.: Fr.) Lloyd - известны как продуценты ряда биологически активных соединений.

В течение длительного периода времени 18 штаммов, выделенные из плодовых тел базидиомицетов Fomitopsis и Trametes пораженных древостоев республики Тыва и Красноярского края, были собраны в коллекции культур Московского государственного университета прикладной биотехнологии (ныне Московский государственный университет пищевых производств (МГУПП):

Согласно данным авторов, проводивших исследования с коллекцией, ряд штаммов показали высокую биологическую активность в отношении опухолевых клеток и грамположительных бактерий (Громовых, 2009; Садыкова, 2006). Эти штаммы представляли интерес и послужили объектами предпринятых нами исследований:

Штаммы 12/91 (1991 г.), 03/99 (1999 г.), 11/05 (2005 г.), 01/06 (2006 г.), 02/06 (2006 г.) и В 08/06 (2006 г.) (ВКПМ F-1024) - выделены из плодовых тел базидиомицетов рода Trametes;

. Штаммы Fp-04 (1994 г.), Fp-04/99 (1999 г.), Fp-11/2 (2002 г.), Fp-02/06 (2002 г.), Fp-04/06 (2004 г.), Tyv-5/shag-4 (2005 г.), Tyv-2006/bal-2 (2006 г.), Tyv-6/bal-4 (2006 г.), Tyv-6/bal-5 (2006 г.), Tyv-6/bal-l 1 (2006 г.), Tyv-6/shag-3 (2006 г.) и Tyv-2006 (2006 г.) (ВКПМ F-961) - выделены из плодовых тел базидиомицетов рода Fomitopsis.

В качестве тест-объектов для оценки противомикробной активности были использованы коллекционные штаммы условно-патогенных и патогенных микроорганизмов коллекции Научно-исследовательского центра «Биотест»: Bacillus coagulans 429, Bacillus subtilis АТСС 6633, Listeria monocytogenes 766, Staphylococcus aureus 6538-P, Escherichia coli M 17, Candida albicans\ a также штаммы микромицетов рода Pénicillium коллекции культур МГУПП, выделенные J1.C. Кузнецовой: штамм P. brevicompactum F-4481, выделенный с оболочки в/к колбасы; штамм P. roquefort1 F-4484, выделенный с поверхности сыра; штамм Р. commune F-4486, выделенный с поверхности сыра; штамм P. nalgiovense F-4492, выделенный с оболочки с/к колбасы; штамм P. polonicum F-4497, выделенный из воздуха камеры по хранению готовых колбас.

Методы исследования

Антибиотическую активность культуральных фильтратов штаммов, водных и спиртовых экстрактов из мицелия базидиомицетов в отношении тест-культур условно-патогенных и патогенных микроорганизмов и микромицетов рода Pénicillium изучали методом дисков (Егоров, 2004).

Миколитическую активность в отношении микромицетов рода Pénicillium изучали методом встречных культур (Методы общей бактериологии, 1983).

Изучение микроморфологии штаммов проводили с использованием сканирующей микроскопии на электронном микроскопе «Hitachi» S-405A (Япония). Микроморфологию ядер изучали с использованием люминесцентной микроскопии на микроскопе Axioskop 40 FL (Zeiss, Германия) в лаборатории электронной микроскопии МГУ имени М.В. Ломоносова.

Для подтверждения видовой принадлежности проводили генетическую идентификацию штаммов. Исследовали участок ядерной р-ДНК, содержащий транскрибируемый спейсерный участок ITS. Для анализа хроматограмм, полученных после секвенирования, использовали программу Chromas Pro Sequence Scanner. Поиск гомологичных последовательностей в Генбанке - с помощью программы BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov). Исследования проводили на базе кафедры микологии и альгологии МГУ имени М.В. Ломоносова.

Культурально-морфологические признаки исследуемых штаммов изучали на агаризованных питательных средах: Maltax 10, грибная, капустная, картофельно-декстрозная, картофельная, мальт-дрожжевая, морковная, овсяная, с гороховой мукой, Сабуро, Чапека и Maltax 10 (с добавлением 1, 3 и 5% лиственничных опилок, молочной сыворотки). Учет результатов проводили в течение всего срока наблюдения по показателям: диаметр разрастания колонии, текстура и форма колонии, плотность и высота воздушного мицелия, среднесуточная скорость роста, ростовой коэффициент (Бухало, 1988).

Твердофазное культивирование проводили на растительных субстратах: опилках лиственничных пород с добавлением и без добавления ржаных отрубей или кукурузной муки, пшене, соломе, лузге подсолнечника с добавлением соломы или кукурузной муки. Оценивали рост изучаемых штаммов по показателям среднесуточной скорости роста и характеру формирования воздушного мицелия (Решетникова, 1997).

Динамику накопления биомассы штаммов изучали путем статического и погруженного жидкофазного культивирования на среде Maltax 10 при температуре 27±ГС. Оценку продуктивности проводили весовым методом на 7, 14, 21, 28, 35 и 42-е сутки культивирования.

Исследование хитиназной и целлюлазной активности изучаемых штаммов проводили при помощи ДНС-метода, основанном на определении активности фермента по количеству образующихся в результате реакции редуцирующих Сахаров с коллоидным хитином или целлюлозой в качестве субстрата (Патент RU 2241744).

Изучение действия когерентного и некогерентного света проводили путем облучения штаммов на опытных установках, разработанных в лаборатории лазерных методов диагностики и лечения опухолей Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина, в одном варианте лазером мощностью 33 мВт и длине волны 1,264 нм при экспозиции 12 и 60 секунд. Облучение проводили однократно и многократно через: 1,2 и 3 суток. В другом варианте облучение проводили светодиодами различной мощности: 0,4 мВт и длине волны 578 нм, 2,0 мВт и длине волны 400 нм и 518 нм, 2,6 мВт и длине волны 496 нм, 4,0 мВт и длине волны 467 нм, 7,5 мВт и длине волны 461 нм - экспозиция составляла 30 секунд. Изучение действия акустических волн частотой 200, 1000 и 2000 Гц и экспозицией 60 секунд на рост мицелия штаммов проводили на опытной установке, разработанной в МГУПП (Данильчук, 2008).

Изучение биохимического состава мицелия штаммов проводили в соответствии со следующими методами: содержание белка в мицелии штаммов - на анализаторе Кьельтек (Foss, Дания); качественный состав аминокислот - на аминокислотном анализаторе Biotronik LC 2000 (Германия); количество углеводов - методом Кизеля и Семигановского (Ушанова и др., 2004); содержание глюканов -наборами образцов «Грибы и дрожжи. Бета-глюкан» K-YBGL 09/13 (www.megazyme.com). Степень переваримости белка определяли на аппарате «искусственный желудок» (Патент RU 2045918). Биомассу мицелия для биохимического исследования наращивали путем жидкофазного культивирования на среде Maltax 10 (4°Б).

Изучение токсичности штаммов проводили путем биотестирования с использованием простейших - инфузорий Paramecium caudatum и Tetrahymena pyriformis на аппарате БиоЛаТ-2 (Черемных, 2003).

Испытание препарата мицелия штамма В 08/06 Т. versicolor проводили на технологии ливерной колбасы 1-го сорта. Фарш готовили по рецептуре в соответствии с ГОСТ Р 54646-2011. Исследование характеристик препарата мицелия и колбасных изделий проводили в соответствии со следующими методиками: массовая доля влаги - на анализаторе влажности МХ-50/ MF -50 (Япония); содержание белка (ГОСТ 25011-81); количество жира (ГОСТ 23042-86); массовая доля золы (ГОСТ Р 53642-2009); рН, степень набухаемости, водосвязывающая и водоудержавающая способности (Забалуева, 2005); жироудерживающая, эмульгирующая и гелеобразующая способности (Тимошенко, 2014); перекисное число (ГОСТ Р 51487-99); кислотное число (ГОСТ Р 50457-92); хлорид натрия (ГОСТ 9957-73); предельное напряжение сдвига (ГОСТ Р 50814-95); пластичность и потери при термообработке (Рогов, 2000); оценка органолептических показателей (ГОСТ 9959-91).

Полимерные покрытия получали на основе метилцеллюлозы с использованием в качестве «активного» компонента порошка мицелия или культуральных фильтратов, и при культивировании жизнеспособного мицелия в растворе метилцеллюлозы. Исследование опытных партий пленок с добавлением мицелия штамма В 08/06 Т. versicolor проводили в соответствии со следующими методиками: стойкость к воздействию плесневых грибов (ГОСТ 9.049-91); стойкость к колонизации условно-патогенными и патогенными микроорганизмами (Егоров, 2004); вязкость (ГОСТ 18249-72); убыль массы при хранении (Рогов, 2000); действие разрушающего напряжения и относительного удлинения пленок -на разрывной машине «РМ-50» (ГОСТ 14236-81).

Микробиологические показатели безопасности определяли в соответствии с ГОСТ 10444.12-88, ГОСТ 10444.15-94, ГОСТ 29185-91ГОСТ Р 51448-99, ГОСТ Р 51921-2002, ГОСТ Р 52814-2007, ГОСТ Р 52815-2007, ГОСТ Р 52816-2007.

При проведении научно-исследовательской работы получали не менее трех-пяти параллельных вариантов результатов экспериментов. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием пакета программ Statistica 6.0.

ГЛАВА 3. СКРИНИНГ ШТАММОВ БАЗИДИОМИЦЕТОВ ПО БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

Антибактериальная активность штаммов

Исследования показали, что все изучаемые штаммы содержат в биомассе мицелия антибактериальные соединения, экстрагируемые этанолом и водой. Спиртовые экстракты мицелия исследуемых штаммов обладают максимальной антибиотической активностью в отношении всех тест-культур микроорганизмов, включая дрожжеподобный гриб С. albicans.

Экстракты мицелия всех штаммов, полученные методом холодной экстракции и культуральные фильтраты проявляют антимикробные свойства в

10

отношении Е. coli. Экстракты мицелия штаммов рода Fomitopsis, полученные методом холодной экстракции проявляют антимикробную активность в отношении В. coagulans и С. albicans, а экстракты штаммов рода Trametes задерживают рост тест-штамма S. aureus.

Водные экстракты, полученные методом горячей и исчерпывающей экстракции мицелия, проявляют активность в отношении бактерии Е. coli, а также избирательную активность в отношении грамположительных бактерий. Следует отметить, что тест-штамм С. albicans чувствителен только к водным экстрактам, полученным методом горячей и исчерпывающей экстракции мицелия всех штаммов рода Fomitopsis,

Противоплесневая активность штаммов

Противоплесневая активность в отношении микроскопических грибов рода Pénicillium, отмечалась у всех исследуемых продуцентов, однако, по степени действия была различной. Исследования показали, что тест-штаммы рода Pénicillium не чувствительны к действию культуральных фильтратов штаммов базидиомицетов.

Все исследуемые штаммы в биомассе мицелия содержат экстрагируемые спиртом и водой противомикробные соединения: спиртовые экстракты родов Fomitopsis и Trametes вызывают зоны подавления роста у всех штаммов микромицетов, однако штамм P. brevicompactum устойчив к спиртовым экстрактам мицелия штаммов рода Fomitopsis, а штамм P. polonicum - к спиртовым экстрактам штаммов рода Trametes. Водные экстракты исследуемых штаммов обладают избирательной активностью: экстракты мицелия штаммов из рода Fomitopsis оказывают ингибнрующее действие на рост микромицетов P. commune, Р. roquefort!, P. polonicum, P. nalgiovense, а рода Trametes - на штаммы P. commune, Р. brevicompactum. Максимальную активность имели спиртовые экстракты мицелия штаммов рода Fomitopsis.

Методом встречных культур установлено наличие миколитической активности у штаммов базидиомицетов в отношении микромицетов рода Pénicillium, которая возрастает по мере увеличения продолжительности инкубирования после засева. Исследования, проведенные в двух параллельных вариантах: с одновременным засевом тест-культур и поэтапным подсевом микромицетов к исследуемым штаммам, показали, что в течение 6-7 суток культивирования в обоих вариантах опыта штаммы базидиомицетов полностью подавляли рост и развитие и вызывали лизис мицелия грибов рода Pencillium.

Максимальной миколитической активностью обладают штаммы рода Trametes, которые останавливали рост всех штаммов рода Pénicillium, в том числе и наиболее устойчивого P. polonicum. Кроме того, они обладают наиболее высокой скоростью лизиса мицелия микромицетов рода Pénicillium (рисунок 1).

А Б

Рисунок 1 - Миколитическая активность штамма Trametes spp.В 08/06 в отношении Р. polonicum: А - рост на 3 сутки; Б - на 6-е сутки культивирования

Оценка биологической активности 18 исследуемых штаммов из родов Fomitopsis и Trametes показала, что в отношении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов и микромицетов рода Pénicillium наиболее активными являются три штамма Fomitopsis spp. Tyv-2006 и Fp-04/99 и Trametes spp. В 08/06, с которыми и проводились дальнейшие исследования.

ГЛАВА 4. КУЛЬТУРАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ШТАМММОВ

Микроморфологические свойства штаммов

Установлено, что все исследуемые штаммы образуют мицелий кремового или белого цвета, обильный, разветвленный, септированный, с многочисленными пряжками. Полученные данные свидетельствуют о принадлежности штаммов к группе базидиальных грибов. Ядра в гифах располагаются попарно, что свидетельствует о диплоидности мицелия (рисунок 2).

А Б В

ГДЕ

Рисунок 2 - Микроморфология мицелия исследуемых штаммов:А - Fomitopsis spp. Tyv-2006, Б - Fomitopsis spp. Fp-04/99, В - Trametes spp.. В 08/06, Г - дикариотический мицелий Fomitopsis spp. Tyv-2006, Д - дикариотический мицелий Fomitopsis spp.Fp-04/99, E -дикариотический мицелий Trametes spp. В 08/06

Молекулярно-генетические свойства штаммов

Штаммы Fomitopsis spp. Tyv-2006 и Fp-04/99 и Trametes spp. В 08/06 предварительно идентифицировали по микроморфологическим признакам как относящиеся к видам Fomitopsis officinalis, Fomitopsis pinícola и Trametes versicolor, соответственно. Для точной видовой принадлежности была проведена молекулярно-генетическая идентификация.

При секвенировании вариабельных участков ITS рДНК штамма Fomitopsis spp. Tyv-2006 была получена следующая собранная нуклеотидная последовательность:

AGTTNTAACTGGCCTTCCGGGCATGTGCACGCCCCACTCATTCCAAATTCTCATACA

CCATGTTGCAGATCCGTGTTAGGTTTTGGTTCGAGNTTGCGGTTCTCTTCGCGGAGAT

TGCGGCTCGGCCTTTCCTATGTTATATATAAATTCTATACAGTCTGCAGAATGTAAA

CCGCGTTTAACGCATTAAATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCG

AAGAAGAACGCAGCAAAATGCTATAAGTAATGTGAATTGCAAAATTCTGTGAATCA

TCAAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCATGGTATTCCGAAGAGCATGCCTGTTTGA

GTGTCATGAAATTCACACAACCCAAA

Скрининг по базе данных GenBank показал, что гомология исследуемого штамма с видом Fomitopsis officinalis составляет 70 %.

При секвенировании вариабельных участков ITS рДНК штамма Fomitopsis spp. Fp-04/99 была получена следующая собранная нуклеотидная последовательность:

AAGGGTGTAGCTGGCCGTTTCGTTTGAGCGGCATGTGCACGCCCTGATCATTATCCA

TCTCACACACCTGTGCACACACTGTAGGTCGGCTTTTGATTGGAGTGGGGTCTTCAT

CGACTCTGCTTTTTAGTTGGGGCCTTCCTATGTTTTATCACACACTACTTCAGTTAAA

AGAATGTCCTCTTGCGTCTAACGCATTTAAATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTG

GCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAA

TTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGC

ATGCCTGTTTGAGTGTCATGGAATTCTCAACTCTATTTGCTTTTGTGAATAGAGCTTG

GACTTGGAGGTTTATTGCCGGTACCTGTGATCGGCTCCTCTTGAATGCATTAGCTCG

AACCTTTTGTGGATCAGCTTA.

Скрининг по базе данных GenBank показал, что гомология исследуемого

штамма с видом Fomitopsis pinícola составляет 98 %.

При секвенировании вариабельных участков ITS рДНК штамма Trametes spp. В 08/06 была получена следующая собранная нуклеотидная последовательность: ACGAGTTGTAGCTGGCCTTCCGAGGCATGTGCACGCTCTGCTCATCCACTCTACCCC TGTGCACTTACTGTAGGTTGGCGTGGGCTCCTTAACGGGAGCATTCTGCCGGCCTAT GTATACTACAAACACTTTAAAGTATCAGAATGTAAACGCGTCTAACGCATCTATAAT ACAACTTTTAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATG CGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTT GCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGGAATTCTCAACTT ATAAATCCTTGTGATCTATAAGCTTGGACTTGGAGGCTTGCTGGCCCTTGTTGGTCG GCTCCTCTTGAATGCATTAGCTCGATTCCGTACGGATCGGCTCTCAGTGTGATAATT GTCTACGCTGTGACCGTGAAGTGTTTTGGCGAGCTTCTAACCGTCCATTAGGACAAC TTTTTAACATCTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA TAAGCGGAGGAA.

Скрининг по базе данных GenBank показал, что гомология исследуемого штамма с видом Trametes versicolor составляет 99 %.

Культурально-морфологические свойства

Оценка динамики роста колоний на агаризованных питательных средах для исследуемых штаммов показала, что максимальный прирост мицелия штамма F. officinalis отмечен на 28-е сутки культивирования и на 14-е - у штаммов F. pinicola и Т. versicolor. В результате исследований была рассчитана линейная скорость роста и ростовой коэффициент мицелия штаммов.

Учитывая рассчитанные ростовые коэффициенты, штамм Т. versicolor можно отнести к грибам растущим со средней скоростью, а штаммы F. officinalis и F. pinicola к медленнорастущим грибам (Бухало, 1988). Наиболее благоприятными средами для культивирования штаммов по показателям роста являются Maltax 10-агар с добавлением лиственничных опилок от 1 до 5%, картофельно-декстрозный и овсяный агар; использование среды Чапека нецелесообразно, что подтверждают исследования по среднесуточной скорости роста и динамики прироста колоний.

При культивировании исследуемых штаммов базидиомицетов на растительных субстратах было выявлено, что колонизация субстратов начиналась практически с первых суток культивирования. Штаммы F. pinicola и Т. versicolor обладают высокой скоростью роста мицелия на всех исследуемых субстратах, за исключением опилок и лузги подсолнечника с добавлением кукурузной муки (1:1). Штамм F. officinalis проявляет среднюю скорость роста на всех твердых растительных субстратах кроме соломы.

Наилучшими субстратами по показателю скорости роста для штаммов рода Fomitopsis является измельченное зерно пшеницы и опилки с добавлением ржаных отрубей (1:1) или кукурузной муки (2:1), в качестве дополнительного источника азотного питания. Для штамма Т. versicolor максимальные показатели роста были на измельченном зерне пшеницы и соломе без добавок и с добавлением лузги подсолнечника (1:1).

При статическом жидкофазном культивировании максимальное накопление биомассы у штамма Т. versicolor отмечено на 28 сутки культивирования и составляет 4,7 г/л, в то время как у штаммов F. officinalis и F. pinicola только на 35 сутки культивирования, и выход биомассы составляет 2,9 и 3,1 г/л, соответственно. Для штамма Т. versicolor, накапливающего наибольшую биомассу из исследуемых штаммов, было проведено исследование динамики накопления биомассы в условиях погруженного культивирования. Показано, что данный штамм при погруженном культивировании выходит на стационарную фазу роста на 8 сутки культивирования; при этом выход биомассы составляет 11,6 г/л.

Ферментативная активность штаммов

Исследование культуральных фильтратов базидиомицетов показало наличие хитиназной и целлюлазной активности для всех штаммов. Наибольшая хитиназная активность наблюдалась у штамма F. pinicola (12,4 ед/мл), а наименьшая - у штамма Т. versicolor (9,1 ед/мл). Максимальная целлюлазная активность выявлена в культуральном фильтрате штамма F. pinicola (16,4 ед/мл), а у штаммов F. officinalis и Т. versicolor- 13,8 и 13,1 ед/мл, соответственно.

ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ФИЗИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА РОСТ МИЦЕЛИЯ

ШТАММОВ

Влияние оптического излучения на показатели роста штаммов

Сравнительная оценка показателей роста штаммов F. officinalis, F. pinicola и Т. versicolor при облучении когерентным светом с экспозиционной дозой 1,8 Дж и 0,36 Дж представлена в таблице 1.

Таблица 1 - Показатели роста штаммов при воздействии когерентного света с различной экспозиционной дозой

Экспозиционная Скорость роста Cmm/cvt) Ростовой коэффициент

доза F. officinalis F. pinicola Т. versicolor

1,8 Джх1 I,9±0,0 II,7** 9,2±0,2 36,8* 18.4±0,2 154,6*

1,8 Дж><2 2.0±0,1 12,2** 10.1±0,1 40,6* 18.4±0.6 143,5*

1,8 ДжхЗ I.9±0,0 II,8** 10.7±0,2 42,8* 18,8±0 213,8*

0,36 Джх1 1.7±0,1 9,9±0,2 17.2±0,2

10,5** 39,6* 103,2*

0,36 Джх2 1,7±0,0 10,0** 9,6±0,1 38,0* 17,9±0,3 193,9*

0,36 ДжхЗ 2,0±0,0 12,0** 10,1±0,1 40,4* 17.7±0,2 169,4*

контроль 1.6±0,1 9,5** 8.5±0,2 33,8* 13,9±0,1 74,8*

*- Ростовой коэффициент измеряли на 4 сутки культивирования ** - Ростовой коэффициент измеряли на 14 сутки культивирования

Как показали результаты исследований, при облучении когерентным светом с экспозиционной дозой 1,8 Дж и 0, 36 Дж у штамма Т. versicolor скорость роста увеличивается на 3,5-4,4 мм/сут., а ростовой коэффициент при трехкратном облучении экспозиционной дозой в 1,8 Дж равен 213,8, что в 2,9 раза больше чем в контроле без облучения, и обеспечивается более плотным и высоким мицелием. У штаммов рода Fomitopsis не наблюдается достоверного увеличения скорости роста и ростового коэффициента по сравнению с контролем.

Для сравнения было проведено облучение всех исследуемых штаммов некогерентным светом с разной мощностью и разными длинами волн. У штамма Т. versicolor среднесуточный прирост на 4-5 мм выше, а ростовой коэффициент в 2 раза больше, чем в контроле без облучения. При облучении некогерентным светом штаммов рода Fomitopsis не наблюдается достоверного увеличения среднесуточного прироста и ростового коэффициента, также как и при воздействии когерентным светом. Следует отметить, что при облучении как когерентным, так и некогерентным светом у штаммов F. pinícola и Т. versicolor на 45 и 30 сутки культивирования, наблюдалось формирование примордий в сравнении с контролем без облучения (рисунок 3).

А Б В

Рисунок 3 - Рост колоний штамма Т. versicolor на 30-е сутки культивирования: А - с облучением когерентным светом (экспозиционная доза 1,8 Дж*3); Б - с облучением некогерентным светом (длина волны >.=467 нм), В - контроль без облучения

На основании полученных положительных эффектов воздействия когерентного и некогерентного света на рост исследуемых штаммов при твердофазном культивировании, была проведена попытка использования лазера экспозиционной дозой 0,36 Дж для стимулирования роста базидиомицетов при жидкофазном культивировании среде Maltax 10. Влияние облучения когерентного света на накопление биомассы мицелия штаммами базидиомицетов представлена на рисунке 4.

Рисунок 4 - Биомасса мицелия исследуемых штаммов при статическом жидкофазном культивировании при облучении когерентным светом и контрольных

образцов без облучения

Исследования показали, что выход биомассы мицелия штаммов достоверно увеличивается: у F. officinalis на 7 %, F. pinícola - на 8,5 % и у Т. versicolor - на 11 % в сравнении с контролем.

Оценка динамики роста штаммов F. officinalis, F. pinícola и Т. versicolor при действии на них акустических волн в слышимом диапазоне частот показала, что у штамма Т. versicolor ростовой коэффициент увеличивается в 1,5 раза, однако, формирование примордий по мере культивирования штамма не наблюдалось. У штаммов F. officinalis и F. pinícola ростовой коэффициент достоверно не увеличивается.

ГЛАВА 6. БИОХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ МИЦЕЛИЯ ШТАММОВ. ОЦЕНКА ПЕРЕВАРИМОСТИ И БЕЗОПАСНОСТИ МИЦЕЛИЯ

Для разработки пищевых добавок необходимо учитывать такой показатель, как биохимический состав мицелия. Исследования показали, что общее содержание белка в мицелии штаммов F. officinalis, F. pinícola и Т. versicolor на абсолютно сухую биомассу составляет 20,9; 26,2 и 17,8 % соответственно.

Проведенный аминокислотный анализ белка показал, что в мицелии исследуемых штаммов в наибольшем количестве присутствуют пролин, аспарагин и глутаминовая кислота. В мицелии F. officinalis и F. pinícola на долю незаменимых аминокислот (кроме триптофана) приходится 24,5 и 22,9 %, соответственно, от общего количества аминокислот, а у штамма Т. versicolor -31,8 %, что позволяет оценивать мицелий как ценный пищевой компонент. Наибольшее количество незаменимых аминокислот приходится на лейцин (0,74-0,91 г/100 г белка), треонин (0,60-0,82 г/100 г белка), лизин (0,58-0,84 г/100 г белка), которые играют важную роль в организме животных и человека.

Исследования углеводного состава штаммов показали, что наибольшее их количество приходится на штамм Т. versicolor (57,2 %) (таблица 2).

Штаммы Трудногидролизуемые полисахариды Легко гидролизуемые полисахариды

F. officinalis 16,5±0,9 6,7±0,4

F. pinícola 28,3±0,8 9,9±0,6

Т. versicolor 42,9±0,6 14,3±0,4

Из данных, приведенных в таблице 2 видно, что количество легкогидролизуемых полисахаридов значительно ниже у всех исследуемых штаммов, чем трудногидролизуемых.

Одним из главных составляющих компонентов углеводов являются глюканьт, с которыми связывают биологическую активность грибов. Исследования по определению содержания глюканов в мицелии штаммов показали, что наибольшее их количество, как и углеводов, также приходится на штамм Т. versicolor^ 08/06 (41,2 %) (таблица 3).

Таблица 3 - Доля глюканов в мицелии изучаемых штаммов

Штаммы Содержание Содержание а- Содержание (3-

глюканов в глюканов в глюканов в

мицелии, % мицелии, % мицелии, %

F. officinalis 9,9 5,4 4,5

F. pinícola 27,7 16,4 11,3

Т. versicolor 41,2 10,4 30,8

Из полученных данных видно, что у штаммов рода Fomitomsis среди общего количества глюканов преобладают а-глюканы, в то время как у штамма Trame tes versicolorВ 08/06 в мицелии обнаружено больше р-глюканов.

Переваримость белка штаммов

При оценке биологической ценности белка всегда важно учитывать такой показатель, как переваримость. Результаты по исследованию переваримости белка по пепсину изучаемых штаммов показали, что она составляет от 31,1 % для штамма F. pinícola до 41,9 % для штамма Т. versicolor, а по тирозину - от 40,3 для штамма F. pinícola и до 49,9 % для штамма Т. versicolor (рисунок 5).

Рисунок 5 - Переваримость белка изучаемых штаммов

Суммарное количество тирозина по завершении двух стадий гидролиза составило: F. officinalis -23,7 мг/г белка, F. pinicola - 17,6 мг/r белка, а у штамма Т. versicolor- 15,9 мг/r белка, что характерно для многих грибов.

Оценка токсичности мицелия штаммов на культурах простейших

Оценка степени токсичности на Paramecium caudatum водных и спиртовых экстрактов мицелия штаммов F. officinalis, F. pinicola и Т. versicolor показала, что водные экстракты мицелия штаммов (мицелий:вода - 1:30) нетоксичны для данного биологического объекта при соотношении экстракт:вода -1:10 для всех исследуемых штаммов. Спиртовые экстракты мицелия исследуемых штаммов (1 % спирт) также нетоксичны при соотношении экстракт;вода - 1:10, коэффициент прироста для них составляет от 0,92 до 0,98.

При исследовании на инфузориях Tetrahymena pyriformis разведение водных и спиртовых экстрактов мицелия исследуемых штаммов в соотношении 1:10 показало не токсичность штаммов по отношении к культуре простейших. По коэффициенту прироста Tetrahymena pyriformis, который составил от 2,99 до 3,09 для водных экстрактов и от 2,09 до 2,57 для спиртовых экстрактов, можно утверждать о биологической активности экстрактов исследуемых базидиомицетов, положительно влияющей на жизнеспособность инфузорий.

ГЛАВА 7. ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ШТАММА TRAMETES VERSICOLOR В08/06

Испытание препарата мицелия для получения колбасной продукции

Для выработки колбасного продукта использовали измельченную на гомогенизаторе до размера частиц 0,2-0,5 мм высушенную до постоянной массы пленку гриба, полученную путем культивирования на жидкой питательной среде Maltax 10 в течение 14 суток. Сухой препарат представляет хлопьевидный порошок бежевого цвета (рисунок 6) с нейтральным вкусом и выраженным грибным запахом. Определены функционально-технологические свойства препарата. Несмотря на относительно низкую набухаемость, водосвязывающую способность и отсутствие выраженных гелеобразующих свойств, мицелий имеет

19

достаточно высокую жироудерживающую способность и может образовывать устойчивые эмульсии мицелий:вода:масло при соотношениях (1:(1-2):(1-3)).

Проведена оценка влияния препарата на основные показатели мясных систем, в качестве которых использовали фарши ливерных колбас 1 сорта. Результаты испытаний показали, что введение в рецептуры свыше 3 % препарата мицелия штамма Т. versicolor в состав рецептуры ливерных колбас приводило к снижению рН среды, и, соответственно, к падению величины ВУС, ухудшению пластичности, росту потерь при термообработке. Поэтому наиболее рациональным уровнем введения препарата мицелия в рецептуры ливерных колбас был признан диапазон до 2 %.

На заключительном этапе на базе опытно-технологической станции кафедры технологии мяса и мясопродуктов МГУПП были изготовлены две партии ливерных колбас: контрольная и опытная - с введением 2 % мицелия, и проведена сравнительная оценка комплекса физико-химических, технологических, органолептических и микробиологических показателей, характеризующих базовые показатели качества готовой продукции. Полученные данные свидетельствуют о том, что введение препарата мицелия Т. versicolor в мясные системы не только не интенсифицирует процессы окисления и гидролиза, но даже при малых концентрациях обеспечивает ингибирование этих процессов. При этом имеют место положительные изменения структуры и органолептических показателей готового продукта. Образец опытной партии колбасы характеризовался более нежной консистенцией и выраженными вкусовыми свойствами. Результаты микробиологических исследований готовой продукции показали их соответствие требованиям СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов".

Получение пленочного покрытия пищевых продуктов с противомикробными

Полимерный материал, используемый для получения пищевой пленки -модификация природного полимера целлюлозы - метилцеллюлоза марки МЦ-100 водорастворимая, полученная по ТУ 2231-107-057427-55-96. На первом этапе исследования были получены полимерные пленки с введением мицелия штамма Т. versicolor как противомикробного компонента.

Рисунок 6 - Сухой препарат мицелия штамма Т. versicolor

компонентами

Получение пленки на основе метилцеллюлозы с добавлением сухого препарата мицелия штамма T. versicolor: в водные растворы метилцеллюлозы различной концентрации добавляли высушенный до постоянной массы и однородно измельченный мицелий данного штамма, после чего полученные растворы дробно стерилизовали и отливали для получения пленки в стерильных условиях.

Получение пленки на основе метилцеллюлозы с добавлением культуральной жидкости штамма T. versicolor: метилцеллюлозу различной концентрации разводили культуральной жидкостью, после чего доводили дистиллированной водой до нужного объема, дробно стерилизовали и отливали для получения пленки в стерильных условиях.

Получение пленки на основе метилцеллюлозы с использованием биоконверсии штаммом T. versicolor. в стерильные водные растворы метилцеллюлозы различной концентрации добавляли посевной материал исследуемого штамма, после чего проводили культивирование в течение 14 суток и отливали пленки в стерильных условиях.

При стационарном культивировании штамма В 08/06 T. versicolor в водных растворах метилцеллюлозы различной концентрации мицелий распределяется в субстрате в виде клочкообразных «островков» белого цвета, тогда как при глубинном культивировании базидиомицет в процессе роста распределяется в форме мелких пеллет по всему объему полимера.

Исследование противомикробной устойчивости пленок в отношении тест-штаммов условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, микромицетов рода Pénicillium показали, что пленки, полученные из растворов метилцеллюлозы различной концентрации с добавкой сухого препарата мицелия или культурального фильтрата штамма T. versicolor, не обладают антимикробными свойствами. Все образцы данных пленок были полностью колонизированы тест-организмами, вызывающими порчу пищевой продукции. Пленки, полученные при модификации метилцеллюлозы путем биоконверсии штаммом T. versicolor, проявляют противомикробную стойкость. Наибольшая устойчивость к колонизации тест-организмами отмечена у пленок, полученных биоконверсией раствора 5 %-пой метилцеллюлозы жизнеспособным мицелием штамма T. versicolor. Следует указать, что при искусственном инфицировании пленок тест-штаммом Р. polonicum, рост данного возбудителя плесневения замедляется, но не ингибируется полностью.

Исследования пленок, проведенные на разрывной машине «РМ-50», показали, что у пленок, полученных после биоконверсии штаммом T. versicolor раствора метилцеллюлозы, изменяются физико-механические показатели: уменьшается разрушающее напряжение и относительное удлинение при разрыве.

Поэтому в дальнейшем для испытания в качестве покрытия пищевых продуктов использовали пленки на основе 5 %-ного раствора метилцеллюлозы после её биоконверсии штаммом Т. versicolor. Результаты исследований показали, что в течение всего периода наблюдений убыль массы у продуктов, обработанных полученным полимерным покрытием, ниже, чем у продуктов в контроле без покрытия в 1,5 раза. Микробиологические показатели смывов с поверхности исследуемых продуктов, по истечении 3 месяцев, как контрольных, так и опытных образцов, полностью соответствуют СанПиН 2.3.2.1078-01. Следовательно, использование разработанного полимерного покрытия, обладающего противомикробными свойствами, для сохранения свойств и защиты пищевых продуктов, целесообразно.

ВЫВОДЫ

1. В результате исследований установлено, что штаммы базидиомицетов из родов Fomitopsis и Trametes обладают широким спектром противомикробной активности в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий и микромицетов рода Penicillium - опасных контаминантов пищевых продуктов. Антагонистические свойства штаммов базидиомицетов в отношении возбудителей плесневения обусловлены наличием у исследуемых штаммов хитиназной и целлюлазной активности.

Штаммы, обладающие максимальной противомикробной активностью, идентифицированы на основании культурально-морфологических, физиологических и молекулярно-генетических свойств как: Fomitopsis officinalis Tyv-2006, Fomitopsis pinícola Fp-04/99 и Trametes versicolor В 08/06.

2. При твердофазном и жидкофазном культивировании когерентный и некогерентный свет оказывает позитивный стимулирующий эффект на ростовые показатели роста мицелия штамма Т. versicolor В08/06. Максимальный эффект отмечен при трехкратном облучении когерентным светом экспозиционной дозой в 1,8 Дж, что может быть использовано для стимулирования роста штамма при производстве мицелия.

3. Установлено, что мицелий штаммов базидиомицетов содержит биологически ценный белок в количестве 20,9 % у F. officinalis; 26,2 % у F. pinícola и 17,8 % у Т. versicolor, в составе которого преобладают незаменимые аминокислоты - лейцин, треонин и лизин. На установке «искусственный желудок» доказано, что переваримость мицелия штаммов составляет для F. officinalis — 23,7 мг, F. pinícola - 17,6 мг и Т. versicolor — 15,9 мг тирозина/г белка и сопоставима с эталонным белком.

4. Биомасса мицелия штаммов Fomitopsis officinalis, Fomitopsis pinícola и Trametes versicolor не является токсичной в отношении инфузорий Paramecium caudatum и Tetrahymena pyriformis. Способность штаммов F. officinalis, F. pinícola и

22

T. versicolor утилизировать широкий набор субстратов, технологичность и низкая токсичность в отношении простейших позволяет рекомендовать их для разработки кормовых добавок.

5. В результате испытаний показано, что мицелий штамма Т. versicolor В 08/06 целесообразно рекомендовать для разработки пищевой добавки в технологиях ливерных колбас и других мясопродуктов.

6. Установлено, что при проведении процесса биоконверсии метилцеллюлозы штаммом Т. versicolor В08/06 получено полимерное покрытие, обладающее противомикробными свойствами, обусловленными наличием жизнеспособного мицелия в пленке, и которое можно рекомендовать в качестве «активного» компонента для защиты пищевых продуктов от поражения опасными биологическими контаминантами. Использование сухого мицелия штамма как компонента противомикробных соединений в полимерных покрытиях на основе метилцеллюлозы нецелесообразно.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Жилинская, Н.В. Оценка возможности использования мицелия базидиальных грибов в технологии мясных продуктов / Н.В. Жилинская, Т.И. Громовых, А.И. Жаринов, Г.Г. Абдрашитова, Т.Н. Данильчук // Мясная индустрия. -Москва.-2013,-№ 12.-е. 25-27.

2. Громовых, Т.И. Оценка фунгицидной активности штаммов базидиомицетов в отношении индукторов плесневения пищевых продуктов грибами из рода Pénicillium LINK / Т.И. Громовых, JI.C. Кузнецова, Н.В. Жилинская, К.В. Лушина // Проблемы медицинской микологии. - Санкт-Петербург. - 2014. - Т. 16, № 1. - с. 40-45.

3. Жилинская, Н.В. Штамм Fomitopsis pinícola (SW.) Р. Karst. -перспективный источник противомикробных соединений / Н.В. Жилинская, Т.И. Громовых // Вестник РАСХН. - Москва. - 2014. - № 5. - с. 25-27.

4. Патент RU 2541770 C12N1/14, А61К35/10, А61Р31/10 Штамм макромицета Trametes versicolor В 08/06, используемый в качестве продуцента для получения биологически активных противоплесневых препаратов / Т.И. Громовых, B.C. Садыкова, Н.В. Жилинская. - № 2013146035/10; Заяв. 16.10.2013. Опубл. 20.02.2015. - Бюл. № 5. - 13 с.

Издания в других журналах, материалы конференций и конгрессов

5. Жилинская, Н.В. Аминокислотный состав базидиомицетов -перспективных штаммов биотехнологии / Н.В. Жилинская, Т.И. Громовых, В.Я. Лысанская // Статья в материалах Международной научно-практической конференции «Инновационное развитие современной науки». - Уфа. - 2014. - с. 218-220.

6. Фролова, Ю.В. Использование мицелия базидиомицета Trametes versicolor как анимикробного компонента в полимерных материалах / Ю.В.

Фролова, H.B. Жнлинская, Т.Н. Громовых // Статья в материалах Международной научно-практической конференции «Наука и образование XXI века». - Уфа. - 2014. -с. 106-108.

7. Жилинская, Н.В. Ускорение развития мицелия Trametes versicolor (L.) Lloyd под воздействием лазерного излучения 1,265 нм / Н.В. Жилинская, Т.И. Громовых, B.JI. Евстигнеев, A.B. Иванов // Тезисы в материалах XXIII Международной научно-технической конференции «Лазеры в науке, технике, медицине». -Дивноморск. - 2012. - с. 96-97.

8. Громовых, Т.И. Антимикробная и антигрибная активность штамма Trametes versicolor (L.) Lloyd / Т.И. Громовых, Н.В. Жилинская II Тезисы в материалах 3-го Съезда микологов России. - Москва. -2012.-е. 374.

9. Жилинская, Н.В. Действие лазерного излучения 1, 265 мкм на рост и развитие мицелия Trametes versicolor (L.) Lloyd / H.B. Жилинская, Т.И. Громовых, В.Л. Евстигнеев, A.B. Иванов // Тезисы в материалах Международной научной конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии». - Саранск. -2012.-е. 57.

10. Жилинская, Н.В. Рост мицелия и плодоношение Trametes versicolor (L.) Lloyd в результате воздействия лазерного излучения 1,265 мкм / Н.В. Жилинская, Т.И. Громовых // Тезисы в материалах X Научно-практической конференции с международным участием «Живые системы». - 2012. - с. 10-12.

11. Жилинская, Н.В. Штамм Trametes versicolor В 08/06 — перспективный источник получения противоплесневой добавки для пищевой промышленности / Н.В. Жилинская // Тезисы в материалах Международной научно-практической конференции «Биотехнология и качество жизни». - Москва. - 2014. - с. 363-364.

12. Жилинская, Н.В. Изучение антимикробной и фунгицидной активности штаммов Fomitopsis officinalis (Fr.) Bondartsev & Singer, Piptoporus betulinus (Bull.) P. Karst и Trametes versicolor (L.) Lloyd / H.B. Жилинская, Т.И. Громовых, E.A. Кузнецова II Тезисы в материалах VI Всероссийского конгресса по медицинской микологии. - Москва. - 2014. - Т. 12.-е. 448-449.

13. Громовых, Т.И. Противоплесневые свойства штаммов базидиомицетов / Т.И. Громовых, Л.С. Кузнецова, Т.А. Кордюкова, Н.В. Жилинская, К.В. Лушина // Тезисы в материалах VI Всероссийского конгресса по медицинской микологии. -Москва. - 2014. - Т. 12. - с. 395-397.

14. Жилинская, Н.В. Штамм Trametes versicolor В 08/06 - перспективный источник получения добавки с противоплесневыми свойствами для сельскохозяйственных кормов / Н.В. Жилинская, Т.И. Громовых, Н.Р. Шехмаметьева // Тезисы в материалах Общеуниверситетской научной конференции молодых ученых и специалистов «День науки». - Москва. - 2014. - Ч. 4. - с. 102-104.

15. Жилинская, Н.В. Недооцененный потенциал грибов / Н.В. Жилинская // Научно-популярная статья в электронном издании «Биомолекула» http://biomolecula.ru/content/1365 - 2013.

16. Жилинская, Н.В. Недооцененный потенциал грибов / Н.В. Жилинская // Научно-популярная статья в журнале «Биология». - 2014. - № 12.-е. 11-15.

Подписано в печать:

25.02.2015

Заказ № 10565 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru