Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протеолитические ферменты семян сои

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Типисева, Ирина Анриевна

1. ЕВДЕНИЕ

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1. Протеолитические ферменты - общая характеристика.

2.2. Протеолитические ферменты растений.

2.3. Протеазы семян растений.

2.4. Протеазы семян бобовых.

2.5. Протеолитические ферменты соевых бобов.

2.6. Белковые ингибиторы протеаз в растениях.

2.7. Белковые ингибиторы семян растений как регуляторы активности собственных протеаз

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Характеристика объекта исследования

3.2. Обезжиривание измельченного материала

3.3. Проращивание семян сои

3.4. Определение белка по методу Лоури

3.5. Определение активности протеаз по методу Ансона

3.6. Определение начальной скорости реакции, протеолиза сывороточного альбумина

3.7. Выделение .протеаз сои

3.7.1. Выбор.экстрагента для извлечения протеаз сои

3.7.2. Выбор оптимального времени извлечения ферментов

3.8. Лиофилизация препаратов протеаз и белковых ингибиторов . ' '

3.9. Гель-хроматография препаратов протеаз и ингибиторов

3.10. Ионообменная хроматография.

3.11. Изоэлектрическое .фокусирование

3.12. Аффинная хроматография

3.13. Электрофорез в ПААГ

3.14. Получение зимограмм протеаз после диск-электрофореза в ПААГ

4. ХАРАКТЕРИСТИКА. ПРОТЕОЛИТШСКйХ ФЕРМЕНТОВ СОЙ

4.1. Определение оптимума рН действия протеаз

4.2. Осаждение протеаз сои при изменении рН

4.3. Стабильность протеаз при хранении измельченного материала и препаратов ферментов

4.4. Влияние температуры на активность протеаз сои

4.5. Влияние активаторов и ингибиторов на протеазы сои

4.5.1. Влияние активаторов и ингибиторов тиоловых протеаз

4.5.2. Влияние ингибиторов сериновых протеаз

4.5.3. Влияние ЭДТА на активность протеаз сои

4.5.4. Влияние'триптофана и тирозина на активность протеаз

4.5.5. Влияние Na.ce на активность протеаз

5. ОЧИСТКА ПРОТЕАЗ СОЙ

5.1. Выделение и очистка нейтральных протеаз сои

5.1.1. Фракционирование протеаз сульфатом аммония

5.1.2. Осаждение нейтральных протеаз при подкислении

5.1.3. Ионообменная хроматография нейтральных протеаз

5.1.4. Схема очистки нейтральных протеаз

5.2. Выделение и очистка щелочных протеаз сои

5.2.1. Осавдение , щелочных протеаз при подкислении

5.2.2. Ионообменная хроматография щелочных протеаз

5.2.3. Аффинная хроматография щелочной протеазы I

5.2.4. Схема очистки щелочных протеаз сои

6. ХАРАКТЕРИСТИКА ОЧИЩЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТЕАЗ СОИ.

6.1. Характеристика очищенного препарата нейтральных протеаз

6.1.1. Определение оптимума pH

6.1.2. Влияние активаторов и ингибиторов

6.1.3. Определение молекулярной массы

6.1.4. Определение однородности препаратов нейтральных протеаз методом электрофореза в ПААГ

6.2. Характеристика очищенного препарата щелочных протеаз сои

6.2.1. Определение оптимума pH

6.2.2. Влияние активаторов и ингибиторов

6.2.3. Определение молекулярной массы.

6.2.4. Определение однородности препаратов щелочных протеаз методом электрофореза в ПААГ

6.2.5. Определение изоэлектрической точки щелочной протеазы

7. БЕЛКОВЫЕ ИНгаШТОШ ПРОТЕАЗ СОИ И ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИШ ФЕРМЕНТАМИ СОИ.

7.1. Взаимодействие протеаз сои с ингибиторами надо садочной жидкости

7.2. Выделение белковых ингибиторов из надосадочной жидкости

7.3. Гель-фильтрация препарата белковых ингибиторов на сефадексе 6

7.4. Электрофорез в ПААГ препаратов белковых ингибиторов

7.5. Изоэлектрическое фокусирование препарата ингибиторов

7.6. Схема выделения препаратов ингибиторов

7.7. Аффинная хроматография протеаз сои на иммобилизо-. ванных белковых ингибиторах

8. ДЕЙСТВИЕ ПРОТЕАЗ СОИ НА СОБСТВЕННЫЕ БЕЛКИ.

9. ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПРОТЕАЗ И ИХ ИНГИБИТОРОВ

ПРИ ПРОРАСТАНИИ СЕМЯН СОИ.

10. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Протеолитические ферменты семян сои"

В решениях ХХУ1 съезда КПСС большое внимание уделяется проблеме кормового белка, преимущественно за счет увеличения производства зернобобовых культур и, в частности, сои.

Соя отличается богатым химическим составом. В ее семенах содержится до 4596 белка, довольно высокое количество масла /19-24%/, большое разнообразие зольных элементов, витаминов, ферментов и других ценных веществ. Белок сои по составу аминокислот и усвояемости близок к белкам животных.

Являясь одновременно кормовой, технической и продовольственной культурой, соя не имеет себе равных по многообразию и универсальности использования. Из ее зерна можно изготовить более 300 видов продукции - от авиационного масла и пластмасс до соевого молока и конфет. Сою используют в кондитерской, хлебопекарной, мясной и других областях пищевой промышленности. Добавляя, например, соевые обогатители к мясным изделиям, получают вкусные и питательные продукты, пользующиеся большим спросом во всем мире.

В фармакологической промышленности сою используют как сырье для приготовления препаратов, которые улучшают деятельность головного мозга, а также при лечении диабета. Употребление в пищу соевого масла предупреждает гипертонию и атеросклероз.

Соевый шрот в качестве белковых добавок является наиболее экономичным и доступным источником белка в кормах для скота и птицы. По данным Министерства сельского хозяйства СССР 'себестоимость белка из шрота сои ниже по сравнению с себестоимостью белка из других культур. Так, I т белка из соевого шрота стоит 50 руб, а из семян гороха - 260 руб.

За последние 50 лет мировое производство сои возросло в 6 раз и достигло в настоящее время более 80 млн.т , что составляет половину мирового производства зернобобовых культур.

По динамике роста производства соя превосходит не только распространенные масличные и зернобобовые, но и зерновые культуры. Так, валовой сбор урожая зерна еще в 1974 году / в % к среднему за 1952-1956 гг/ составил для сои - 244, кукурузы - 210, пшеницы -175.

Характерный для сои большой видовой полиморфизм и относительная пластичность в приспособлении к условиям внешней среды являются предпосылкой дальнейшего расширения ее ареала в разных странах.

Несмотря на все достоинства этой культуры, ее громадное народно-хозяйственное значение, до настоящего времени она не получила дальнейшего распространения в нашей стране.

Продовольственной программой, одобренной .майским /1982г./ Пленумом ЦК КПСС, предусматривается обеспечить производство зернобобовых культур в 1985 г. в количестве 12 - ,14 млн.т и в 1990 г. -18 - 20 млн.т. Среднегодовое производство соевых бобов к 1985 г. намечено довести до 1,4 млн.т , а к 1990 г. до 2,2 - 2,3 млн.т , т.е. с ростом в 1,6 раза.

ЦК КПСС и Совет Министров СССР обязали местные партийные и советские органы усилить работу не только по расширению площадей под соей, но и создания материальной базы по переработке ее зерна и зеленой массы. В нашей стране на 1981-1985 гг. принята программа по созданию и внедрению высокопродуктивных сортов сои интенсивного типа для возделывания, разработке технологических приемов возделывания, уборки и послеуборочной переработки зерна сои. В ней предусмотрен ряд крупных заданий, успешное решение которых, должно обеспечить увеличение производства семян этой культуры, повышение качества получаемой из них продукции. В выполнении программы участвуют свыше 50 научно-исследовательских и проектноконструкторских организаций.

Выполняемые в нашей стране исследования по культуре сои в основном посвящены вопросам селекции и агротехники новых .сортов, высокоурожайных и приспособленных к климатическим условиям страны.

За рубежом значительную часть исследований сои составляют как теоретические, так и прикладные работы по изучению биохимии запасных белков, белковых ингибиторов протеаз и других биологически активных соединений, а также изучению свойств компонентов сои, определяющих возможности использования ее для производства широкого спектра пищевых, кормовых, медицинских, технических -продуктов.

Проведение исследований с отечественными сортами сои не может ограничиться простым переносом методологии, а требует оригинальных разработок из-за отличия химического состава и разных технологических целей.

До сих пор протеазы сои не были объектом детальных .исследований и остаются малоизученными. Не ясен вопрос о механизмах регуляции активности протеолитических ферментов в семенах сои и роли в этом процессе ингибиторов протеаз белковой природы, которыми особенно богаты соевые бобы.

Исследование протеаз сои важно также с технологической точки зрения, поскольку соевые бобы находят широкое применение и состояние белкового комплекса во многом определяется состоянием протеолитических ферментов.

Целью настоящей работы являлось выделение и исследование протеолитических ферментов соевых бобов, а также изучение регуляции их активности при покое и прорастании.

2. ЖТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Типисева, Ирина Анриевна, Москва

1. Амиров Н.Ш.,Белостоцкий Н.И.,Антонов Д.В. Модификация определения активности протеолитических ферментов желудочного сока.-Лаб .дело, 1981 ,№ 12,707-708.

2. Антонов В.К. Химия протеолиза.-м.:Наука,1983?368 с.

3. Белозерский М.А.,.Дунаевский Я#Е.,Аденская Г.Н. »Степанов В.М; Карбоксильные протеиназы из семян гречихи.-Биохимия,1984, т.49,вып.3,479-485.

4. Бенкен й;И.,Буданова В.М. Ингибиторы трипсина в семенах фасоли.-'Тр. по прикл.бот.,ген. и сел. ,1976,т.Ь6,вып.3.

5. Бенкен И.И.,Мосолов В.В.,Федуркина Н.В. Влияние ингибитора протеиназ из фасоли на фитопатогенные грибы.-Микология и фитопатология, 1976,т.10,вып.3,198-201;

6. Бенкен И.и.,Кузнецова Е.А. Активность протеолитических ферментов и ингибиторов протеиназ в прорастающих семенах чины;-Тр. по прикл.бот.,ген. и сел.,1981,т.70,№ 3,11-195*

7. Благовещенский A.B. »Колобкова Б).В.,Кудряшова H.A. Изменен ние активности и качества ферментов при прорастании семян.-Труды Главн.бот;сада АН СССР,1951,т.2,73.

8. Детерман Г. 1'ель-хроматография; М.:Мир,1970.16;Дщссон М.,Уэбб Э. Ферменты. -М. :Мир, 1982,т.1,291-324."

9. Дин Р. процессы распада в клетке.-М.:Мир, 1981,120с.

10. Дунаевский Я.Ё. Выделение и свойства протеиназы, расщепляющей БАиА из семян ржи.-Автореферат диссерт. на соискание уч. степени канд.биол.наук.M,1976,20с.

11. Дунаевский Я.Е.,Белозерский М.А. О природе изменений актив ностей протеолитичееких ферментов /БАиАаз/ в прорастающих семенах гречихи и ржи.-Биохимия,1980,т.45,вып.5,908-911;

12. Дунаевский Я.ni.,Белозерский м.А.,Эдпщцина is.ii. иротеиназа семян гречихи, гидролизующая главный запасной белок этих семян.-Биохимия,1983,т.48,вып.4,572-576.

13. Дюкянджиев C.B.»Саянова О.В.»Вайнтрауб И.А.,Шутов А.Д. Распад запасных белков и протеолитическая активность в прорастающих семенах фасоли.-Изв.Акад.наук Молд.ССр,Сер. биол. и хим.наук, 1980,Р 2,48-51.

14. Емцева И.Б. Выделение и свойства сериновой протеиназы из семян гречихи.-Автореферат диссерт. на соиск.уч.степ. канд.биол. наук. M.,1976,21с.

15. Земчик Е.И. ,Нгуен '1'ьен Тханг,Шутов А.Д. »Вайнтрауб И.А, О протеолитических ферментах в покоящихся и прорастающих семенах вики.-В кн. ¡Растительные белки. Кишинев:Штиинца,1972,19-52•

16. Земчик Е.И.,Фам Минь Там,Шутов А.Д.»Вайнтрауб Несходство бензоиларгинин-п-нитроанилидазы из проростков и семядолей вики.-Физиол. и биохим. культ.раст.,1973,т.5,Р 3,257-259.

17. Земчик Е.И.,Шутов А.Д.»Вайнтрауб И,А. Частичная очистка и характеристика ариламидазы из семян вики.-Биохимия,1973,т.38, Р 5,964-970.

18. Земчик Е.И.,Фам Минь Там,Шутов А.Д.,Вайнтрауб И.А. Выделение фермента, гидролизующего бензоил-2),£-аргинин-п-нитроанилид /БАПА-аза/, из проростков вики и его дальнейшая характеристика.-Биохимия,1975,т.40, Р 4,746-750.

19. Карпиленко 1'.П. Исследование кислых протеиназ ячменя и ячменного солода.-Автореферат диссерт. на соискание уч.степ.канд. биол.наук. М.,1973,22с.

20. Кондратьев М.Н.,Камалова Т.Г* Протеазы листьев в онтогенезе растений.-Физиология и биохимия культ.растений,1983,т.15,Р 2, 107-115.

21. Королева Т.Н. »Алексеева М.В.,Шутов А.Д. »Вайнтрауб И.А;О локализации протеолитических ферментов в алейроновых зернах семян вики.-Физиол,раст.,1973,т.2О,Р 4,769-772.

22. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии.-М.:Высшая школа,1980,272с.

23. Кретович В.Л. Белковый обмен высшего растения.-Труды Пятой конференции по высокомолекулярным соединениям.-М.-Л.:Изд-во АН СССР,1948с.

24. Кретовин В.Л. Введение в энзимологию.-М.:Наука,1967, 243-244.

25. Левицкий A.ÏI. Классификация, номенклатура и биохимические свойства протеолитических ферментов зерна пшеницы и ячменя.-В сб.:иротеолитические ферменты и их ингибиторы в семенах зерновых и зернобобовых культур. Одесса,1982,7-19,

26. Левицкий А.Д.,Вовчук C.B.»Адамовская В.Г. Протеолитические ферменты и ингибиторы трипсина в эндосперме и зародыше зерна пшеницы.-Шизиол. и биохим. культ. раст.,1982,т.14,№ 6,545-548.

27. Ленинджер А. Биохимия. М.:Мир,1976,798-799.

28. Локшина Л.А, Реакции ограниченного протеолиза и их регу-ляторное значение.-В сб.:Успехи биол.химии. М.:Наука,1977,т.18, 162-184.

29. Локшина Л.А. Регуляторная роль протеолитических ферментов. -Молекулярная биология, 1979,т.13,вып.6,1205-I229é;

30. Малиновский В.А. Выделение, очистка и антиферментный спектр ингибиторов трипсина из зерна кукурузы.-В сб.:иротеолити-ческие ферменты и их ингибиторы в семенах зерновых и зернобобовых культур. Одесса,ВСГИ, 1982,34-41.

31. Маурер Г. Диск-электрофорез. Теория и практика электрофореза в полиакриламидном геле. М.:Мир,1971,248с.

32. Мосолов В.В. протеолитические ферменты. М.:Наука,1971,104с

33. Мосолов В.В.»Колосова Г.В.,Валуева Т.А.»Дронова Л.А. Ингибитор трипсина из семян гледичии /Gtedctschia tricathos LJ Биохимия,1982,т.47,Р 5,797-802.

34. Мосолов В.В. природные ингибиторы протеолитических ферментов.-В кн.:Успехи бйолог.химии. М.:Наука,1982,т.22,100-118.

35. Монголов В.В. Белковые ингибиторы как регуляторы процессов протеолиза.36-е Баховское чтение. М.:Наука,1983,40с.

36. Мосолов В.В.,Малова Е.Л.,Чебан А.Н. Выделение из семян фасоли специфического ингибитора сериновых протеиназ микроорганизмов.-Биохимия,1983,т.48,нщп.10,1680-1686.

37. Номенклатура ферментов. М.:ВИНИТИ,1909,321с.

38. Нортроп Д.,Кунитц М.,Херриот Д. Кристаллические ферменты. М.:Изд-во иностр.лит-ры,1950,346с.

39. Овчаров К.Е. Физиология формирования и прорастания семян. М.:Колос,1976,256с.

40. Ори Р. Активность ферментов, связанных с белковыми тельцами семян.-В сб.:Белки семян зерновых и масличных культур. М.: Колос,1977,90-103.

41. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование /практическое пособие/. М.:Наука,1981,288с.

42. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.:Наука,1983,304с.

43. Плешков В.Н. Биохимия сельскохозяйственных растений, М.: Колос,1980,495 с.

44. Раджабов Л.р., Нигомонов М., Шибнев В.А. Содержание белка, масла и активность ингибитора трипсина в различных сортах сои.- Химия природных соединений,1980, Р I, 84-88.

45. Саянова В.В., Павлова Л.С., Бронштейн А.Н. Ингибиторы протеолитических ферментов в семенах сои.-В сб.: Биохим.генетика и селекция бобовых и злаковых культур. Кишинев,1982,3-34.

46. Степанов В.М. Эволюция структуры и функции протеолитически ких ферментов.-В сб.:Химия протеолитических ферментов. Вильнюс, 1973,11-17.

47. Степанов В.М. иротеолитические ферменте структура, функциональные особенности, эволюция.-В сб.:Химия протеолитических ферментов. Углич,1979,5-11.

48. Фурсов О.В.»неруанский Ю.В. О системе протеазы-ингибиторы в зерне кукурузы.-В сб.:Генетика и селекция растений и животныхв Казахстане. Алма-Ата,1974,106-109.

49. Шутов А.Д. »Королева Т.Н.,Нгуен Тхи Хонг Хань»Вайнтрауб ИаА Иротеаза прорастающих семян вики,гидролизующая нативные запасные белки.-Докл.АН СССР,1976,т.231,Р 4,1010-1013.

50. Шутов А.Д.,Вайнтрауб И.А. Нротеолиз запасных белков при прорастании семян.-В кн.:Биохимические и физиологические исследования семян. Иркутск,1979,136-146.

51. Шутов А.Д.,Бульмага В.а.,поло Р.Э. протеиназа А прорастающих семян вики и ее роль в мобилизации запасных белков.-В кн.: Биохимия нуклеиновых кислот и метаболизм белка:Тез. респ. научн. конф. Минск,1981,73-74.

52. Шутов А.Д.,До Нгок Лань,Вайнтрауб И.А. Очистка и частичная характеристика протеазы В из прорастающих семян вики.-Биохимия,1982,т.47,№ 5,814-821.

53. Шутов А.Д.,поло Р.Э. Об участии фенилаланин-п-нитроанили-дазы в распаде запасных белков прорастающих семян вики.- Биохимия,1983,т.48,Р 5,870-874.

54. Шутов А.Д. иротеолиз запасных белков в прорастающих семенах бобовых. Автореферат диссерт. на соиск.уч.степ.докт.биол.наук. М.,1983.

55. Шутов А.Д. ,Белтей Н.К. ,Вайнтрауб И.А. Цистеиновая протеи-наза из прорастающих семян пшеницы: частичная очистка и гидролиз клейковины.-Биохимия,1984,т.49,вып.7,I171-1177.

56. Abe M., Arai S., Kato H., Fujimaki M. Thiol-protease inhibitors occuring in endosperm of corn. Agr. Biol. Chem., 1980, v.44, No.3, 685-686.

57. Adams C.A., Novelle L. Acid hydrolases and autolytic properties of protein bodies and spherosomes isolated from un-germinated seeds of sorghum bicolor (Linn) Moench. Plant Physiol., 1975, v.55, No.1, 7-11.

58. Adams C.A., Novelle L., Liebenberg W. Biochemical pro perties and ultrastructure of protein bodies isolated from selected cereals. Cereal Chemistry, 1976, v.53, No.1, 1-12.

59. Ainouz I.L., Benevides N.B., Freitas A.L.P. Proteolytic activities in seeds of Vigna unguiculata (L) Walp. Biol, plant., 1981, v.23, No.2, 133-140.

60. Ambe K.S., Sohonie K. Studies of trypsin inhibitors in Indian foodstuffs. Part III. Trypsin inhibitors in germinating double bean, field bean and their growing plants. J. Sci. Industr. Res., 1956, v.15c, No.6, 136-140.

61. Amen R.D. A model of seed dormancy. Botanical Review, 1968, v.34, No.1, 1-31.

62. St.Angelo A.I., Yatsu L.J., Altenschul A.M. Isolation of edestin from aleurone grains of Cannabis sativa. Arch. Biochem. Biophys., 1968, v.124, 199-205.

63. St.Angelo A.I., Ory R.L., Hansen H.I. Properties of a purified proteinase from hemp seed. Phytochemistry, 1970, v.9, 1933-1938.

64. Anson M.L. The estimation of pepsin, trypsin and catepsin with hemoglobin. A. Gen. Physiol., 1938, v.22, 79.

65. Aschton F.M. Mobilisation of storage proteins of seeds. Ann. Rev. Plant. Physiol., 1976, v.27, 95-117.

66. Baumgartner B., Chrispeels M.I. Purification and characterization of vicilin peptidhydpolase, the major endopep-tidase in the cotyledons of mung bean seedlings. Eur. J. Bio-chem., 1977, v.77, No.2, 223-233.

67. Beevers L. Protein degradation and proteolytic activity in the cotyledons of germinating pea seeds (P.sativatum). -Phytochemistry, 1968, v.7, 1837-1844.

68. Bhatty R.S. Note on the development of proteolytic enzymes in germinating Barley. Cereal Chemistry, 1969, v.46, No.1, 74-77.

69. Birk Y. Purification and some properties of a highly active inhibitor of trypsin and «¿-chymotrypsin from soybeans. -Biochim. Biophys. Acta, 1961, v.54, 378.

70. Birk' Y., Gertler A., Khalef S. Separation of a tribo-lium-protease inhibitor from soybeans on a calcium phosphate column. Biochim. et Biophys. Acta, 1963, v.67, No.2, 326-328.

71. Bond H.M., Bowles D.I. Characterization of soybeans endopeptidase activity using exogenous and endogenous substrates, Plant. Physiol., 1983, v.72, No.2, 345-350.

72. Boulter D. The ultrastructure and composition of legume cotyledon protein bodies. Abh. Akadem. Wiss. DDR. Abt. Math., Naturwiss., Techn., 1981, No.5n, 95-101.

73. Bowman D.E. Fractions derived from soybeans and navy beans which retard tryptic digestion of casein. Proc. Soc. Exptl. Biol, and Med., 1944, v.57, 139.

74. Bowman D.E. Differentiation of soy bean antitryptic factors. Proc. Soc. Exptl. Biol, and Med., 1946, v.63, 547.

75. Bryant I., Green T.R., Gurusaddaiah T., Ryan C.A. Proteinase inhibitor II from potatoes. Isolation and characterization of its protomer components. Biochemistry, 1976, v.15, No.16, 3418-3424.

76. Burger W.G. Multiple forms of acidic endopeptidase from germinated barley. Plant Physiol., 1973, v. 51» No.6, 10151021.

77. Carasco I.F., Xavier-Filho I. Sequential expression of trypsin inhibitors in developing fruit of cowpea (Vigna un-guiculata). Ann. Bot., 1981, v.47, No.2, 259-266.

78. Catsimpoolas N., Funk S., Wang J., Kenney J. Iso-electrical fractionation and some properties of a protease from soybean seeds. J.Sci. Fd. Agric., 1977, v.22, No.2, 79-82.

79. Chan I., de Lumen B.O. Properties of trypsin inhibitor from winged bean (Pspphocarpus tetragonolobus) seed isolatedby affinity chromatography. J. Agr. and Food Chem., 1982, v.30, No. 1, 42-46.

80. Chavan J.K., Heigaard I. Detection and partial characterization of subtilisin inhibitors in legume seeds by isoelectric focusing. J. Sci. Pood and Agr., 1981, v.32, No.9, 857-862.

81. Chrispeels M.I., Boulter D. Control of storage protein metabolism in the cotyledons of germinating mung beans: role of endopeptidase. Plant. Physiol., 1975, v.55, No.6, 1031-1037.

82. Chrispeels M.I., Baumgartner B., Harris H. Regulations of reserve protein metabolism in the cotyledons of mung bean seedlings. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1976, v.73, No.9, 3168-3172.

83. Chrispeels M.I., Bollini R., Harris N. Biosynthesis, accumulation and catabolism of reserve proteins in legume seeds.-Ber. Dtsch. Bot. Ges., 1980, v.92, No.2-3, 535-551.

84. Dechary J.M. Seed proteases and protease inhibitors. Econ. Bot., 1970, v.24, No.2, 113-122.

85. Filho I.Y. Trypsin inhibitors during germination of Vigna sinensis seeds. Physiol. Plant., 1973, v.28, No.1, 149154.

86. Frattali Y., Steiner R.F. Soybean inhibitors. 1. Separation and some properties of three inhibitors from commercial crude soybean trypsin inhibitor. Biochemistry, 1968, v.7, 521.

87. Freed R.C., Ryan D.S. Note on modification of the Kunitz soybean trypsin inhibitor during seed germination. Cereal Chemistry, 1978, v.55, No.4, 534-538.

88. Furusawa Y., Kurosawa Y., Chuman I. Purification and properties of trypsin inhibitor from Hakuhewzu bean (Dolichos lablab). Agr. Biol. Chem., 1974, v.38, 1157-1164.

89. Gaier I.R., Tulinsky A., Liener I.E. Formation, crystallization and perliminary crystallographic data of the ternary complex of od-chymo trypsin, -trypsin and the Bowman-Birk inhibitor. J. Biol., Chem., 1981, v.256, No.22, 11417-11419.

90. Garg G.K., Virupakscha T.K. Acid protease from germinated sorghum. 1. Purification and characterization of the enzyme. Eur. J. Biochem., 1970, v.17, No.1, 4-12.

91. Gennis L.S., Cantor C.R. Double-headed protease inhibitors from Black eyed Peas. 1. Purification of two new protease inhibitors and the endogenous protease by affinity chromatography. J. Biol. Chem, 1976, v.251, 734-740.

92. Gennis L.S., Cantor C.R. Double-headed protease inhibitors from Black eyed Peas. 11. Structural studies by optical absorption and circular dichroism. J. Biol. Chem., 1976, v-251, No.3, 741-746.

93. Gibson R.A., Paleg L.G. Lysosomal nature of hormonal-ly induced enzymes in wheat aleurone cells. Biochem. J., 1972, v.128, No.2, 367-375.

94. Guardiola I.L., Suteliffe I.F. Control of protein hydrolysis in the cotyledons of germinating pea seeds (P.sati-vatum). Annals Botany, 1971, v.35, No.142, 791-807.

95. Hobday S.M., Thurman D.A., Barber D.I. Proteolytic and trypsin inhibitory activities in extracts of germinating Pisum sativatum seeds. Phy-tochemistry, 1973, v. 12, No.5, 10411046.

96. Horisberger M., Tacchini-Vonlauten M. infrastructure localization of Kunitz inhibitor on thin sections of Glycine max (soybean) cv.Maple Arrow by Gold Method. Histochemistry, 1983, v. 77, No.1, 37-50.

97. Hwang D.L.-R., Lin K.-T.D., Jang W.-K., Foard D.E. Purification, partial characterization and immunochemical relationships of multiple low molecular weight protease inhibitor of soybean. Biochem. et biophys. acta, 1977, v.495, No.2, 368382.

98. Hwang D.L., Yang W.-K., Foard D.E. Rapid release of protease inhibitors from soybeans. Immunochemical quantitation and parallels with lectins. Plant Physiol., 1978, v.61, No.1, 30-34.

99. Ihle I.K., Dure L.S. Synthesis of a protease in germinating cotton cotyledons catalysed by mRNA synthesized during embryogenesis. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1969, v.36, No.5 705-710.

100. Jacobsen I.V., Varner I.E. Gibberellic acid-induced synthesis of protease by isolated aleurone layers of barley.Plant Physiol., 1967, v.42, No.11, 1596-1600.

101. Jatsu L.J., Jaks T.I. Lysosomal activity in aleurone grains of plant seeds. Arch. Biochem. Biophys., 1968, v.124, 466-471.

102. Keiko A., Mitsuko 0. Trypsin inhibitors of black soybean (Glycine max. Merrill forma Kuromance Makino). Shoku-motsu Gakkaishi, 1981, v.36, 45-49.

103. Kitamyra K., Shibasaki K. Isolation and some physi-cochemical properties of the acidics bunits of soybean 11S globulin. Agr. Biol. Chem., 1975, v.39, 5-9.

104. Kitamyra K., Tagaki T., Shibasaki K. Subunit structure of soybean 11S globulin. Agr. Biol. Chem., 1976, v.40, 9-14.

105. Koide T., Ikenaka T. Studies on soybean trypsin inhibitors. 3. Amino-acid sequence of the carboxyl-terminal region and the complete amino-acid sequence of soybean trypsin inhibitor (Kunitz). Europ. J. Biochem., 1973, v.32, No.3, 417431.

106. Kortt A.A. Isolation and properties of a chymotrypsin inhibitor from winged bean seed (Psophocarpus tetragonolobus (L.) Dc.). Biochim. et biophys. acta, 1980, v.624, No.1, 237248.

107. Kortt A.A., Jermyn M.A. Acacia proteinase inhibitors. Purification and properties of the trypsin inhibitors from Acacia elata seed. Eur. J. Biochem., 1981, v.115, No.3, 551-557.

108. Kortt A.A., Tao L., Rubira M.R. N-terminal amino acid sequence of trypsin inhibitor 3 from winged bean. Phytoche-mistry, 1983, v.22, No.3, 767-768.

109. Kruger I.E. Purification and some properties of malted-wheat BAPA-ase.-Cereal Chemistry, 1971, v.48, No.5, 512522.

110. Laskowski M., Kato I. Protein inhibitors of proteinases. Ann. Rev. Biochem., 1980, v.49, 593-626.

111. Laufer S., Tauber H., Davis C.F. The amylotytic and proteolytic activity of soybean seed. Cereal Chemistry, 1944, v.21, 267-274.

112. Leung D.W.M., Bewlwy I.D., Reid I.S.G. Mobilisation of the major stored reserves in the embryo of fenugreek (Trigo-nella foenum-graecum L., Leguminosae) and correlated enzyme activities. Planta, 1981, v.153, 95-100.

113. Lichtenfeld C., Mantenfell R., Müntz K., Schlesier B., Scholz G. Changes in proteolytic activity and protein pattern during germination of field beans (Vicia faba L.). Abh. Akad. Wiss. DDR. Abt. Math. Naturwiss. Technol., 1978 (1979), No.4n, 163-164.

114. Lichtenfeld C., Mantenfell R., Müntz K., Scholz G. Protein degradation in germinating legume seeds. Abh. Akad. Wiss. DDR. Abt. Math., Naturwiss., Techn., 1981, No.5N, 133-152.

115. Lowry F., Kosehronph N., Farry A., Rondall R. Protein measurement with the Folin-phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951, v.193, 265.140. di Martino-Ferrer M., Ferrer A. Trypsin inhibitor from bambara pea. Phytochemistry, 1983, v.22, No.4, 813-816.

116. Matile P. Aleurone vacuoles as lysosomes. Z. Pflan-zenphysiol., 1968, v.58, 365-368.

117. Matile P. The lytic compartment of plant cells. Springer-Verlag, New-York-Wien, 1975.

118. Matile Ph., Yfinkenbach F. Function of lysosomes and lysosomal enzymes in senescing corolla of the morning glory (Ipomoea purpurea). J. Exp. Bot., 1971, v.22, No.73, 759-771.

119. Melville I.e., Ryan C.A. Chymotrypsin inhibitor 1 from potatoes. Large scale preparation and characterization of its subunit components. J. Biol. Chem., 1972, v.247, No.11, 3445-3453.

120. Melville I.C., Scandalios I.e. Maize Endopeptidase: genetic control, chemical characterization and relationship to an endogenous trypsin inhibitor. Biochem. Genet., 1972, v.7, No.1, 15-31.

121. Miege M.N., Mascherpa I.M. Isolation and analysis of protein bodies from cotyledons of lablab purpureusand f*ha-seolus vulgaris (Leguminoseae). Physiol. Plantarum, 1976, v.37, No.3, 229-238.

122. Mikola I., Enari T.-M. Changes in the contents of barley proteolytic inhibitors during malting and mashing. J. Inst. Brew., 1970, v.76, 182.

123. Mikola I., Snolinna E.-M. Purification and properties of an inhibitor of microbial alkaline proteinases from barley. -Arch. Biochem. and Biophys., 1971, v.144, No.2, 566-575.

124. Mikola I., Kolehmainen L. Localisation and activity of various peptidases in germinating barley. Planta, 1972,v.104, No.2, 167-177.

125. Mitsuo A., Kazuo N., Kazuo S., Kazuoshi 0. Biosynthesis of the 7S and 11S proteins, the main components of soybean globulins. Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, 1978, v.25, No.2, 88-93.

126. Mitsuoshi Y., Toshifumi K., Teruo I., Izumi Y. Modification of proteinase inhibitor 11 in adzuki during germination. Agr. and Biol. Chem., 1979, v.43, No.9, 1989-1999.

127. Neurath H., Walsh K. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (A review). Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1976, v.73, No.11, 3825-3832.

128. Nishikata M. Trypsin like protease from soybean seeds. Purification and some properties. J. Biochem., 1984, v.95, No.4, 1169-1177.

129. Nummi M., Vilhuren R., Enari T.M. Amylases of different molecular size in barley and malt. European Brewly Conv. Proc., Stockholm, 1965, 51-61.

130. Ochiaii-Yanagi S., Takagi T., Kitamyra K., Tajima M., Watanaba T. Reevalution of the subunit molecular weight of soybean 11S globulin. Agr. Biol. Chem., 1977, v.41, 4.

131. Odani S., Ikenaka T. The amino acid sequence of two soybean double headed proteinase inhibitors and evolutionary consideration on the legume proteinase inhibitors. J. Biochem., 1976, v.80, No.3, 641-643.

132. Odani S., Ikenaka T. Studies on soybean trypsin inhibitors. XII. Linear sequence of two soybean double headed trypsin inhibitors, D-11 and E-1. J. Biochem., 1978, v.83, No.3, 737-745.

133. Odani S., Odani S., Ono T., Ikenaka T. Proteinase inhibitors from a mimosoideae legume albizzia julibrissin. Homologues of soybean trypsin inhibitor (Kunitz). J. Biochem.,1979, v.86, No.6, 1795-1805.

134. Ofelt C.W., Smith A.K., Mills J.M. Proteases of the soybean. Cereal Chemistry, 1955, v.32, No.1, 53-63.

135. Orf I.H., Mies D.W., Hymowitz K. Qualitative changes of the Kunitz soybean seeds during germination as detected by electrophoresis. Botanical Gazette, 1977, v.138, No.1-4, 255.

136. Ory R.L., Hennigsen K.W. Enzymes associated with protein bodies isolated from ungerminated barley seeds. Plant Physiol., 1969, v.44, No.11, 1488-1498.

137. Penner D., Ashton F.M. Hormonal control of proteinase activity in squash cotyledons. Plant Physiol., 1967, v.42, N0.6, 791-796.

138. Pernolett I.-C. Protein bodies of seeds: ultrastructure, biochemistry, biosynthesis and degradation. Phy-tochemistry, 1978, v.17, 1473-1480.

139. Pike C.S., Briggs W.R. Partial purification and characterization of a phytochromedegrading neutral protease from etiolated oat shoots. Plant Physiol., 1972, v.49, No.4, 521-530.

140. Polanowski A. Trypsin inhibitor from rye seeds. -Acta Biochem. Poln., 1967, v.14, 389-395.

141. Porath I., Axen R., Ernback S. Nature (London), 1967, V.215, 1491-1492.

142. Pusztai A., Duncan I. Changes in proteolytic enzyme activities and transformation of nitrogenous components in the germinating seeds of kidney bean. Planta, 1971, v.96, No.4, 317-325.

143. Pusztai A. Metabolism of trypsin-inhibitory proteins in the germinating seeds of kidney bean (Phaseolus vulgaris). -Planta, 1972, v.107, No.2, 121-129.

144. Easkis I.I., Sasame H.A., Mann R.A., Andersen R.E., Smith A.K. Soybean trypsin inhibitors: isolation,, purification and physical properties. Arch. Biochem. Biophys., 1962, v.98, 471,

145. Raskis I.I., Andersen R.E. Isolation of four soybean trypsin inhibitors by DEAE-cellulose chromatography. Biochem. Biophys. Res. Communs., 1964, v.15, 230-235.

146. Reddy M.N., Keim P.C., Heinriksen R.L., Kezdy F.I. Primary structural analysis of sulfhydryl protease inhibitors from pineapple stem. J. Biol. Chem., 1975, v.250, No.5, 17411750.

147. Richardson M. The proteinase inhibitors of plants and micro-crg anisms. Phytochemistry, 1977, v.16, No.2, 159169.

148. Richardson M. Protein inhibitors of enzymes. -Food Chem., 1981, v.6, No.3, 235-253.

149. Royer A., Miege M.N., Grange A., Miege I., Mascherpa I.M. Trypsin inhibitors and proteolytic activities of the albumins in seeds of Vigna unguiculata. Planta, 1974, v.119, No.1, 1-16.

150. Royer A. Activities proteolytiques of anti-trypti-cal des graines de Vigna unguiculata: repartition et interaction. Phytochemistry, 1975, v.14, No.4, 915-919.

151. Ryan C.A., Huisman O.C. Chymotrypsin inhibitor 1 from potatoes: a fransient protein component in leaves of young potato plants. Nature, 1967, v.214, No.5092, 1047-1049.

152. Ryan C.A. Proteolytic enzymes and their inhibitors in plants. Ann. Rev. Plant Physiol., 1973, v.24, 173-196.

153. Salmia M.A. Inhibitors of endogenous proteinases in scots pine seeds: fractionation and activity changes during germination. Physiol. Plantarum, 1980, v.48, 266-270.

154. Schnarrenberger C., Oeser A., Tolbert N.E. Isolation of protein bodies on sucrose gradients. Planta, 1972, v.104, No.3, 185-194.

155. Seidl D.S., Abreu H., Jaffe W.G. Partial characterization of a subtilisin inhibitor from black bean seeds. Int. J. Peptide and Protein Res., 1982, v.19, No.2, 153-157.

156. Sgarbieri V.C., Whitaker I.E., Partial characterization of trypsin-chymotrypsin inhibitors from bean (Phaseolus vulgaris): chemical and physical properties. J. Food Biochem., 1981 (1982), v.5, No.3, 215-232.

157. Shain Y., Mayer A.M. Proteolytic enzymes and endo-gehous trypsin inhibitor in germinating lettuce seeds. Physiol.Plant., 1965, v.18, No.3, 853-859.

158. Shain Y., Mayer A.M. Activation of enzymes during germination trypsin-like enzyme in lettuce. - Phytochemistry, 1968, v.7, No.9, 1491-1498.

159. Shantilae M., Mahavir S.M. Purification and characterization of trypsin inhibitor from moth bean, Phaseolus aco-nitifolius. Indian J. Biochem. amd Biophys., 1982, v.19, No.6, 403-407.

160. Siffert 0., Emod I., Keil B. Interaction of clos-tripain with natural trypsin inhibitors and its affinity labeling by N,cA-p-nitrobenzyloxycarbonil arginine chlormethyl ketone. FEBS Letters, 1976, v.66, No.1, 114.

161. Shutov A.D., Bulmaga V.P., Vaintraub I.A. Protease A from germinating vetch seeds: purification by affinity chromatography and substrate specifity studies. Biochem. Physiol. Pflanzen, 1983, B,178.

162. Smirnoff P., Rotman M., Ladizinsky G. Presence and activity of trypsin and chymotrypsin isoinhibitors on the annual species of Cicer. Biochem. Syst. and Ecol., 1981, v.9, No.1, 23-25.

163. Soedigo R., Gruber M. Purification and some properties of a protease from pea seeds, pisum sativatum L., S.sp. arvense A and G. Biochem. Biophys. Acta, 1960, v.44, No.2, 315-323.

164. Taisuke I., Masayuke K., Kazuo M. Partial purification and properties of proteases from defatted soybean flour.J. Nutr. Sci. Vitaminol., 1979, v.25, No.4, 333-342.

165. Tan-Wilson A.L., Righmire B.R., Wilson K.A. Different rates of metabolism of soybean proteinase inhibitors during germination. Plant Physiol., 1982, v.70, No.2, 493-497.

166. Tan-Wilson Â.L., Wilson K.A. Nature of proteinase inhibitors released from soybeans during imbibition and germination. Phytochemistry, 1982, v.21, No.7, 1547-1551.

167. Tazawa Y., Hirokawa T. Plant proteases VI. The proteolytic activity of soybean legumelin. J. Biochem., 1956, v.43, 785.

168. Toshifumi K., Kouichi Y., Yuji M., Osamu M., Teruo I., Mitsuyoshi Y. The amino acid sequence of proteinase inhibitors I-A and I-A1 from adzuki beans. J. Biochem., 1981, v.90, No.3, 721-728.

169. Tronier B., Ory R.L., Hennigsen K.W. Separation and characterization of the fine structure and proteins from barley protein bodies. Phytochemistry, 1971, v.10, 1207-1211.

170. Tsutomu Y., Yukiko Y., Imao T., Hisashi K. Proteolytic enzymes in green asparagus, kiwi fruit and miut: occurence and partial characterization. Agr. and Biol. Chem., 1982, v.46, No.8, 1983-1986.

171. Weil I., Pinsky A., Grossman S. The proteases of the soybean. Cereal Chem., 1966, v.43, No.4, 392-399.

172. Whitaker I.R., Sgarbieri V.C. Purification and composition of the trypsin-chymotrypsin inhibitors of Pha-seolus vulgaris L. var. Rosinha G2. J. Food Biochem., 1981 (1982), No.3, v.5, 197-213.

173. Wilden W.V., Gilkes N.R., Chrispeels M.I. The endoplasmic reticulum of mung bean cotyledons role in accumulation of hydrplases in protein bodies during seedling growth. Plant Physiol., 1980, v.66, 390-394.

174. Wilson K.A., Laskowski M. The partial amino acid sequense of trypsin inhibitor II from garden bean (Phaseolus vulgaris) with location of the trypsin and elastase-reactive sites. J. Biol. Chem., 1975, v.250, No.11 4261-4267.

175. Wilson K.A. The release of proteinase inhibitors from legume seeds during germination. Phytochemistry, 1980, v.19, No.12, 2517-2519.

176. Wilson K.A., Chen I.e. Amoni acid sequence of mu ng bean trypsin inhibitors and its modified forms appearing during germination. Plant Physiol., 1983, v.71, No.2, 341-349.

177. V/ong P.P., Kuo T., Ryan C.A. Growth-dependent accumulation and utilization of proteinase inhibitor I in tobacco callus tissues. Biochem. and Biophys. Res. Commun.,

178. Yamamoto M., Ikenaka T. Studies on soybean trypsin inhibitors. I. Purification and characterization of the two soybean trypsin inhibitors. J. Biochem., 1967, v.62, 141-149.

179. Yoshida C., Yoshikawa M. Purification and characterization of proteinase inhibitors from adzuki beans (Phaseolus angularis). J. Biochem., 1975, v.78, No.5, 935-945.

180. Yoshikawa M., Iwasaki T., Fuji M»> Oogaki M. Isolation and some properties of a substilisin inhibitor from barley. J. Biochem., 1976, v.79. No.4, 765-763.

181. Young I.L., Varner I.E. Enzyme synthesisin the cotyledons of germinating seeds. Arch. Biochem. and Biophys., 1959, v.84, No.1, 71-78.

182. Yukiho K., Shozo S., Teruaki Y., Masaaki Y. Carnoxypeptidases from germinating soybeans. II. Stability and some chemical and kinetic properties of carboxypepti-dases Sa and S^. Yakugaki Lasshi, 1976, v.96, No.12, 1421-1425.

183. Zuber H. Reinigung and Eigenschaften der Carboxypeptidases aus Citrusfruchten. Hoppe-Seylers Zeitschrift für Physiologische Chemie, 1968, v.349, No.10, 1337-1352.