Протекторное действие активированного протеина С при воспалении и репарации тканей

Макарова, Анастасия Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Протекторное действие активированного протеина С при воспалении и репарации тканей
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Протекторное действие активированного протеина С при воспалении и репарации тканей"

На правах рукописи

003053767

МАКАРОВА АНАСТАСИЯ МИХАЙЛОВНА

ПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ АКТИВИРОВАННОГО ПРОТЕИНА С ПРИ ВОСПАЛЕНИИ И РЕПАРАЦИИ ТКАНЕЙ

03 00 13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 ? •• ■

Москва-2007

003059767

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ им М В Ломоносова (заведующий биологических наук, профессор А А Каменский)

- доктор

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор С М Струкова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биолот ических наук Е Г Колокольчикова

кандидат биологических наук АЕ Коган

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт Физиологически Активных Веществ РАН

Защита диссертации состоится 21 мая 2007г в 15 час 30 мин на заседании диссертационного совета Д501 001 93 при Биологическом факультете Московского государственного университета им М В Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ им М В Ломоносова, Биологический факультет, аудитория М-1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета им М В Ломоносова

Автореферат разослан 20 апреля 2007г

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук

Б А Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

При повреждении тканей активируются процессы свертывания крови и воспаления, образуется ряд протеиназ, в том числе сериновые протеиназы системы гемостаза - тромбин, фактор Ха (фХа) и активированный протеин С (АРС) Тромбин - ключевой прокоагулянт, поскольку превращает фибриноген в фибрин - основу тромба, активирует факторы V, VIII, XI, XIII свертывания крови Связывая рецепторы, активируемые протеиназами (PARI и PAR4), тромбин индуцирует агрегацию тромбоцитов, активацию клеток крови, соединительной ткани и запускает процессы воспаления (Coughlin 2000, 2005, Струкова 2001, 2006) Вместе с тем, тромбин регулирует свертывание крови по механизму отрицательной обратной связи, поскольку связывает на эндотелии нерасщепляемьш рецептор - тромбомодулин и превращает протеин С в антикоагулянт - активированный протеин С АРС, в свою очередь инактивирует факторы Va и Villa, участвующие в образовании протромбина, и тем самым блокирует процесс тромбообразования (Esmon 2003, 2005)

В последнее время активно развивается представление о противовоспалительном и антиапоптотическом действии АРС на эндотелиальные клетки и моноциты, а также о его протекторном действии при системном воспалении и сепсисе (Joyce et al, 2004, Mosnier, Griffin 2006) Показано взаимодействие АРС с двумя мембранными рецепторами -эндотелиальным рецептором протеина С (EPCR) (Esmon 2000) и PARI эндотелия (Reiwald, Ruf 2005, Feistritzer et al, 2006) Рецепторы PARI экспрессируются всеми клетками, вовлекаемыми в процессы свертывания крови, воспаления и репарации тканей, что позволяет предполагать их участие в осуществлении острых защитных реакций организма и в патогенезе хронических процессов (Macfarlane et al ,2001, Струкова 2001, 2006) В связи с этим весьма актуальным является изучение рецептор-опосредованных механизмов противовоспалительного действия АРС

Известно, что при воспалении активируются тучные клетки и освобождают широкий спектр провоспалительных медиаторов, в том числе гистамин, (3-гексозаминадазу, протеазы, цитокины, оксид азота (N0) и др (Metcalfe et al, 1997) N0 регулирует активность тучных клеток, повышая уровень цГМФ, секрецию медиаторов и ингибируя агрегацию тромбоцитов (Bunnett 2006) Тучные клетки тонкого кишечника секретируют дуоденазу (ЕС 3 4 21) - сериновую протеиназу, обнаруженную в слизистой двенадцатиперстной кишки, которая помимо участия в активации протеиназ пищеварения, может играть роль в воспалении (Pemberton et al, 2002)

Роль APC и других сериновых протеиназ в механизмах, ответственных за запуск, развитие и/или регуляцию воспалительных и репаративных процессов в тканях еще не достаточно исследована, хотя известно, что повышается экспрессия PAR на поверхности клеток, участвующих в основных этапах репарации тканей (воспалении, пролиферации клеток и созревании ткани) (Струкова 2001) Ранее в нашей лаборатории было установлено PAR1-опосредованное действие тромбина и пептидов - агонистов PARI (PARI-АР) на тучные клетки и выявлена аутокринная регуляция оксидом азота ответа тучных клеток (Strukova et al, 1996, 1999) На модели острого перитонита у крыс было показано усиление секреции медиаторов тучными клетками в ответ на действие тромбина и PARI-АР, что свидетельствует о дополнительной экспозиции PARI на тучных клетках в условиях воспаления (Dugina et al, 2003) Иммобилизованный в полимерные матрицы PARI-АР ускоряет заживление кожных ран (у мышей и крыс), что подтверждает регуляторную функцию агонистов PARI при воспалении - первой фазе заживления ран (Strukova et al, 2001, 2002, Дугина и др, 2004) Однако до настоящего времени не было исследовано влияние АРС на активность тучных клеток при воспалении В связи с этим изучение участия тучных клеток в реализации противовоспалительного действия APC, а также влияние АРС на процесс заживления экспериментальной язвы желудка представляется весьма актуальным и перспективным

Цели и задачи исследования.

Цель работы - выявление механизмов действия активированного протеина С (АРС) на секреторную активность тучных клеток при воспалении, и выяснение участия АРС в репарации тканей на модели экспериментальной язвы желудка

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1 Исследовать динамику появления протеиназ системы гемостаза (фХа, тромбина, АРС) в перитонеальной жидкости (на модели острого воспаления у крыс)

2 Изучить влияние АРС на секреторную активность перитонеальных тучных клеток в моделях спонтанной и вызванной активации Оценить влияние АРС на активность тучных клеток, полученных от крыс с острым перитонитом

3 Исследовать PAR- опосредованные механизмы действия АРС на тучные клетки

4 Исследовать действие АРС на процесс заживления экспериментальной язвы желудка

Научная новизна работы. На модели острого воспаления у крыс впервые обнаружено появление сериновой протеиназы системы гемостаза -АРС, вслед за появлением тромбина в перитонеальной жидкости

Впервые показано, что противовоспалительное действие АРС может реализовываться через регуляцию активности тучных клеток В моделях спонтанной и вызванной активации перитонеальных тучных клеток выявлено, что АРС дозозависимо в узком диапазоне низких концентраций блокирует секрецию медиаторов воспаления тучными клетками Кроме того, впервые показано протекторное влияние АРС на секреторную активность тучных клеток, полученных от крыс с острым воспалением

инактивированный APC не имитирует действие фермента на тучные клетки Показано, что действие АРС на тучные клетки блокируется катепсином G и протеиназой желудочно-кишечного тракта и тучных клеток - дуоденазой, которая, как установлено, стимулирует секрецию медиаторов воспаления перитонеальными тучными клетками через PARI Показано, что регуляция секреторной активности тучных клеток АРС обусловлена усилением генерации эндогенного оксида азота, о чем свидетельствует отмена защитного действия АРС в присутствии L-NAME - ингибитора образования N0

На модели экспериментальной язвы желудка у крыс впервые показано, что АРС при однократном введении сокращает фазу воспаления и сдвигает фазу пролиферации на более ранние сроки, что приводит к ускорению заживления язвы желудка

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты данного исследования имеют важное как теоретическое, так и практическое значение Полученные данные расширяют представления о механизмах защитных функций активированного протеина С в процессах воспаления Нами обнаружено появление протеиназ системы гемостаза (тромбина и АРС) в перитонеалыюй жидкости на модели острого воспаления у крыс Впервые выявлено противовоспалительное действие АРС на перитонеальные тучные клетки в норме и при воспалении Показано, что АРС блокирует секрецию медиаторов воспаления тучными клетками через высокоспецифичную активацию PARI рецептора и аутокринную регуляцию оксидом азота ответа тучных клеток

Имеют практическое значение данные о том, что АРС, подобно пептиду-агонисту PARI, иммобилизованному в полимерные микрочастицы, способен ускорять (после однократного внутрижелудочного введения) заживление экспериментальной язвы желудка Создание нового класса антиульцерогенных препаратов на основе АРС и пептидов-агонистов PARI представляется перспективным в связи с их высокой эффективностью

Апробация материалов диссертации. Основные результаты работы

были доложены на I Съезде физиологов СНГ (Россия, Дагомыс, 2005), Всероссийской конференции «Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром Современные достижения» (Россия, Москва, 2005), Международной конференции «Биотехнология и медицина» (Россия, Москва, 2006), XIII Международной конференции и дискуссионном научном клубе «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Крым, Гурзуф, 2006), 18-м Международном конгрессе по фибринолизу и протеолизу (USA, San-Diego, 2006), заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ (Россия, Москва, 2006), III Всероссийской научной конференции «Клиническая г емостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Россия, Москва, 2007), VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Россия, Москва, 2007)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ (в том числе 6 статей)

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах и включает введение, обзор литературы, описание объекта и методов исследования, результаты, обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы (содержит 246 источников) Работа иллюстрирована 47 рисунками

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Все эксперименты с животными выполняли в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF) и декларацией о гуманном отношении к животным В работе использовали самцов крыс Вистар весом 250-300г

Материалы: APC (Chromogemx, Sigma), синтетический пептид - агонист PARI (PARI-АР, SFLLRN) (Biosyntan, Berlin, Germany, Российский Кардиологический Научно-производственный комплекс МЗ РФ, Москва, Россия), дуоденаза (26 5кДа, любезно предоставлена к х н ТС

Замолодчиковой, ИБХ РАН, Москва), фактор Ха, a-тромбин человека, фиколл-400, L-NAME, фенилметилсульфонил фторид (PMSF), хромогенный субстрат для р-гексозаминидазы - />нитрофенил-№ацетил-(3-0-глюкозаминид (Sigma), хромогенные субстраты для APC - pyroGlu-Pro-Arg-pNA (S-2366), для тромбина - H-D-Phe-Pip-Arg-pNA (S2238), для фХа - Boc-Pro-Gly-Arg-pNA (S2222) (Chromogenix), для дуоденазы - Tos-Gly-Pro-Lys-pNA (Sigma), АДФ, фактор активации тромбоцитов (PAF) (Serva), вещество 48/80 (Biomol), Трис (ICN)

Раствор Тироде (все реактивы Sigma) NaCl 145мМ, HEPES ЮмМ, КС1 5мМ, СаС12 1мМ, MgCl2 1мМ, глюкоза 5мМ, 0 1% сывороточного альбумина, рН 7 4, буфер Na-HEPES. NaCl 145мМ, HEPES ЮмМ, рН 7 4

В работе использовали следующие методы

Определение содержания АРС, тромбина и фХа в псритонеальной жидкости крыс при воспалении. Острое воспаление у крыс вызывали внутрибрюшинным введением 40%-го раствора тиогликолата Na в дозе 4i /кг (по методу Pejler, 1999) в модификации Dugina et al, 2003) В исследуемые интервалы времени (1-30 мин, 1-17 часов после инициации перитонита) отбирали образцы экссудата из перитонеальной полости, клетки отделяли центрифугированием и в супернатанте определяли содержание общего белка (по методу Бредфорд) и амидазную активность ферментов по отношению к специфическим хромогенным субстратам тромбина - S2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNa), APC - S2366 (pyroGlu-Pro-Arg-pNA) или фХа - S2222 (Boc-Pro-Gly-Arg-pNA) Стандартные препараты тромбина (1000 NIH ед/мг), АРС и фХа использовали для построения калибровочных графиков Количество протеипаз рассчитывали на общее количество белка в пробе

Для характеристики воспаления рассчитывали индекс дегрануляции (ИД) тучных клеток по формуле ИД=Д/(Д+Н), где Д - количество дегранулированных тучных клеток, H - количество не активированных тучных клеток

Концентрирование и определение активности АРС. АРС

(Chromogenix, США) освобождали от примеси солей и пептидов (< ЮкДа) и

концентрировали в пробирках Центрикон-10 пятикратным центрифугированием и отмывкой Определяли амидазную активность АРС по отношению к хромогенному субстрату S2366 (pyroGlu-Pro-Arg-pNA) и антикоагулянтную активность АРС по удлинению активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) свертывания плазмы крови человека Количество АРС рассчитывали по калибровочному графику, построенному с использованием стандарта (АРС, Sigma)

Активность дуоденазы определяли спектрофотометрически по отношению к субстрату Tos-Gly-Pro-Lys-pNA

Влияние протеиназ и пептидов-агонистов PARI на секрецию перитонеальных тучных клеток. Тучные клетки выделяли из перитонеальной полости самцов крыс линии Вистар по методу Thon, Uvnas (1967) в нашей модификации Перитонеальные тучные клетки инкубировали (10 мин при 37°С) с препаратами АРС, АРС, инактивированного PMSF, дуоденазы, дуоденазы, инактивированной SBBI, тромбина, фактора Ха, PARI-АР Для ингибирования синтеза N0, тучные клетки инкубировали с 300 мкМ L-NAME (30 мин при 37°С) Исследовали действие АРС (0 5-20нМ) на клетки, активированные веществом 48/80 (400мкг/мл) Отбирали аликвоты для определения активности ß-гексозаминидазы методом Schwartz et al (1982) по расщеплению хромогенного субстрата - р-шпрофенил-КГ-ацетил-Р-0-глюкозаминида Вычисляли содержание ß-гексозаминидазы по формуле %секреции=А/(А+Б) 100%, где А - содержание ß-гексозаминидазы в супернатанте, Б - в осадке

Десенситизировали PARI рецепторы ЮОнМ тромбином до добавления действующих концентраций агонистов (АРС, фХа, дуоденазы) Принцип метода основан на способности активированных рецепторов к интернализации и толерантности к последующим предъявлениям агониста

Исследование активности тучных клеток, полученных от крыс с острым перитонитом. Для стабилизации клеток использовали антагонист Ш гистаминовых рецепторов - кетотифен, который вводили животным

интрагастрально (Dugina et al, 2003) за 10 часов и за 1 час до введения тиогликолата Животным контрольной группы вводили кетотифен по той же схеме Затем внутрибрюшинным введением тиогликолата Na вызывали острое воспаление у крыс и через 16 часов после его индукции выделяли перитонеальные тучные клетки и исследовали их активацию агонистами

Определение агрегации тромбоцитов. Для анализа агрегации тромбоцитов использовали богатую тромбоцитами плазму (PRP) человека Из цитратной крови получали PRP и бедную тромбоцитами плазму (РРР) Агрегацию тромбоцитов определяли с помощью лазерного агрегометра (Биола, Россия)

Действие АРС на заживление экспериментальной язвы желудка. На

модели повреждения слизистой оболочки желудка у крыс ледяной уксусной кислотой по методу Okabe (1971) в нашей модификации изучали действие АРС (Chromogemx) АРС (110 мкг/200г веса) вводили интрагастрально в плюроническом геле спустя 2 часа после операции Динамику заживления язвы желудка оценивали на 3 и 7-е сутки после операции Критериями оценки были относительная площадь язвы и параметры морфометрического анализа образцов грануляционной ткани

Статистическую обработку данных проводили, используя t-критерий Стьюдента Результаты представлены как средние значения из 4-6 независимых экспериментов ± стандартная ошибка среднего Различия считали достоверными при значении Р<0.05 п - количество животных в эксперименте

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Динамика появления протеиназ гемостаза в пернтонсалыюи полости крыс при воспалении

Ранее в нашей лаборатории было показано увеличение проницаемости эндотелия сосудов тонкого кишечника и появление тромбина в перитонеальной полости крыс в первые 30-й мин острого воспаления (Киселева и др, 2004)

Мы предположили, что другие протеиназы гемостаза - фактор Ха, предшествующий тромбину и АРС, образуемый при активации тромбином

(связанным с тромбомодулином эндотелия сосудов) профермента - протеина С - могут проникать в очаг острого воспаления из кровотока. Определение активности ферментов перитонеальной жидкости по отношению к амидачному субстрату Вос-Рго-С1у-А^-рЫА, специфичному к фактору Ха, не выявило появления фактора Ха в исследуемые промежутки времени (5-180 мин после индукции воспаления). Вместе с тем, подтверждено появление тромбина (специфически расщепляющего Н-0-РЬе-Р1р-Аг§-р1^а) в очаге воспаления, При этом максимум концентрации тромбина (2.37±0.88 нМ/мг белка, п=6) наблюдали уже на 10-й минуте после индукции перитонита. Концентрация тромбина в перитонеальной жидкости оставалась достоверно высокой на протяжении первых 30 минут воспаления, а затем снижалась.

А/,/,

^ / /

время после индукции воспаления

Рис. 1. Динамика появления АРС в перитонеальной жидкости крыс при развитии острого воспаления в течение 17 часов (а=6), *Р<0.05 - по отношению к 1-й мин воспаления.

Появление АРС в перитонеальной Полости нами было обнаружено на 60-й минуте после индукции воспаления - в концентрации, в 3.6 раза превышающей исходную концентрацию (1 мин). Максимальную концентрацию АРС регистрировали на 120-й минуте развития воспаления (4.91 ±0.9 нМ/мг белка, п=6) (рисД). Отсроченное появление АРС в перитонеальной полости

можно объяснить малой эффективностью протеолиза профермента протеина С тромбином, что обусловлено блокадой экспрессии рецептора тромбина -тромбомодулина, при остром воспалении (Esmon, 2003) У животных контрольной группы не наблюдали генерации фактора Ха, тромбина и АРС в исследуемые временные точки

Доказательства в пользу появления тромбина в перитонеальной жидкости при воспалении были получены в следующей серии экспериментов с помощью высокоселективного специфического ингибитора тромбина - гирудина Показано, что в присутствии гирудина в перитонеальной жидкости крыс на 1030 мин после индукции воспаления не регистрируется амидазная активность по отношению к специфическому субстрату тромбина Вместе с тем, присутствие гирудина не влияло на амидазную активность перитонеальной жидкости по отношению к специфическому субстрату АРС

Так как нами было обнаружено появление АРС и тромбина в перитонеальной жидкости крыс при воспалении, в следующей серии экспериментов мы исследовали действие АРС и других протеиназ на перитонеальные тучные клетки в норме (спонтанная активность) и при их активации индукторами дегрануляции

2. Влияние АРС на секреторную активность перитонеальных тучных клеток (в моделях спонтанной и вызванной активации)

При исследовании влияния АРС на спонтанно активированные тучные клетки крысы нами было выявлено протекторное действие фермента на клетки Установлено, что в группе клеток с низкой спонтанной активностью (13 0±3 1%) АРС в концентрациях 0 5 и 1 0 нМ вызывал достоверное снижение секреции р-гексозаминидазы на 54% и 28 4% (соответственно) относительно спонтанного уровня секреции (Р<0 05, п=7)

В группе тучных клеток с высокой спонтанной активностью (23 2±8 0%) обнаружено усиление протекторного эффекта АРС в низких концентрациях (0 5, 1 0 и 2 5 нМ, ЕС5о=0 19 нМ) на клетки достоверное снижение секреции (3-гексозаминидазы соответственно на 43 8%, 36 7% и 25 1% относительно

спонтанного уровня секреции (Р<0.05, п=6). При концентрациях АРС. ниже 0.2 нМ (0.05 и 0.Ï нМ) и выше 2.5 нМ (5.0-20 нМ) не наблюдали достоверного изменения секреции ¡З-гексадаминидазы (Рис. 2).

Рис. 2. Изменение секреции р-гексозаминидазы перитонеальными тучными клетками крысы (с разной спонтанной секрецией) под действием АРС (*Р<0.05, **Р<0.01 но отношению к спонтанной секреции (CII), п=б).

Во второй серии экспериментов исследовано влияние АРС на секрецию медиатора тучными клетками, активированными стимулятором экзоцитоза -веществом 48/80, которое непосредственно активирует G-белок и индуцирует сигнальные пути, приводящие к дегрануляции тучных клеток (Metcalfe et al., 1997). В наших экспериментах вещество 48/80 в концентрации 400 мкг/мл вызвало высокую степень дегрануляции тучных клеток, а уровень секреции [j-гексозаминидазы такими клетками составил 53,6±5.7%. Предварительная инкубация тучных клеток с АРС в диапазоне концентраций 0.5-2.5 нМ достоверно снижала вызванную веществом 48/80 секрецию р-гексозаминидазы до 47.6*0.8 - 38.3±1.7% (Р<0.01, п=6) (Рис.3). Более высокие концентрации АРС (>3 нМ) не вызывали достоверных изменений индуцированной веществом 48/80 секреции.

сп 0.5 1 2.5 3 5 9

сп 0.5 1 2.5 5 20 40

концентрация АРС, нМ

концентрация АРС. нМ

СП 48/80 0.5 1 2.5 3 5 конц-я APC, нМ +48/80

Рис. 3, Влияние АРС на вызванную веществом 48/80 секрецию р-гексозаминидазы Деритонеальными тучными клетками (*Р<0.05, * *Р<0.01 по отношению к секреции, выгнанной веществом 48/80, п=6).

В третьей серии экспериментов мы исследовали действие АРС на тучные клетки, полученные от животных с острым перитонитом, который вызывали внутрибрюпшнным введением тиогликолата Na. Для стабилизации клеток использовали антагонист Н1 гистаминовых рецепторов — кетотифен, Секреция (3-гексозаминидазы тучными клетками под действием вещества 48/80 была принята за 100%. Было показано, что в опытной группе (тучные клетки, полученные от животных с перитонитом) АРС в концентрациях 0.01, 0.05, 0.1 и 1.0 нМ снижал секрецию р-гексозаминщдаы на 30.96±8.9, 38.52±9.8, 37.93= 1.4 и 38.6з=13-35% (относительно действия вещества 48/80) (Р<0.05, п=5) (Рис.4). В контрольной группе АРС в тех же концентрациях не вызвал изменений в секреции Р-гексозаминидазы тучными клетками. Эти данные свидетельствуют в пользу нашей гипотезы о том, что АРС в низких концентрациях регулирует активность тучных клеток не только в норме, но и при воспалении (остром перитоните у крыс), блокируя секрецию медиаторов воспаления тучными клетками.

48/80 0.01 0.05 0.1 1 10

концентрация APC, нМ

Рис. 4. Действие АРС на тучные клетки, полученные от животных с острым перитонитом (вызванная веществом 48/80 секреция [î-гексозаминндазы принята за 100%, *Р<0.05, **Р<0.01 по отношению к секреции, вызванной веществом 48/80, п-5).

Так как активация свертывания крови при воспалении ведет к образованию ряда протеиназ системы гемостаза, предшествующих появлению АРС, в следующих экспериментах нами было проведено сравнение эффекта АРС с действием других протеиназ (фактора Ха и тромбина) на тучные клетки. Показано, что фактор Ха в диапазоне концентраций 0.2-45 нМ вызывал повышение секреции Р-гексоз аминидазы тучными клетками. Максимум секреции медиатора составил 40.3±8.3% при спонтанной секреции 18.7±7.3% (Р<0.05, п=8). При этом предварительная (в течение 10 минут) инкубация тучных клеток с фактором Ха не влияла на секрецию, вызванную веществом 48/80. Сравнение эффекта фактора Ха с действием тромбина на тучные клетки показало, что фактор Ха - более сильный индуктор дегрануляции, поскольку его максимальное провоспалительное действие проявляется а значительно меньших (на 2 порядка) концентрациях (ECi0 = 0.64нМ), чем действие тромбина (ЕС5о = 87нМ). Таким образом, фактор Ха, образуемый на стадии инициации свертывания крови в низких (нМ) концентрациях, еще до появления

тромбина может проявлять провоспалительную активность, стимулируя секрецию тучных клеток

Известно, что тучные клетки тонкого кишечника секретируют, наряду с катепсином G - антагонистом/агонистом PARI, триптазой - агонистом PAR2, сериновую протеиназу - дуоденазу, первоначально обнаруженную в бруннеровых железах двенадцатиперстной кишки (Zamolodchikova et al, 2000, Pemberton et al, 2002) О роли дуоденазы в воспалительных реакциях организма и регуляции активности тучных клеток перитонеальной полости нет данных Мы предположили, что дуоденаза, помимо участия в каскаде активации ферментов пищеварения, может регулировать секреторную функцию тучных клеток через активацшо рецепторов PARI Обнаружено, что дуоденаза в концентрациях 10, 8 0 и 80 нМ вызывает повышение секреции р-гексозаминидазы на 30, 69 и 159% относительно уровня спонтанной секреции (Р<0 05, п=5) Положительная дозозависимая корреляция секреции Р-гексозаминидазы от концентрации дуоденазы может указывать на ее провоспалительную активность Однако, предварительная инкубация клеток с дуоденазой (0 1-80 нМ) не влияла на секрецию, вызываемую веществом 48/80.

Итак, наши данные свидетельствуют о том, что протеиназы гемостаза -АРС, тромбин и фактор Ха и протеиназа тучных клеток - дуоденаза, участвуют в регуляции начальных стадий воспаления, вызывая повышение (тромбин, фактор Ха, дуоденаза) или снижение (АРС) секреции медиатора воспаления - Р-гексозаминидазы тучными клетками Обнаружено появление АРС и тромбина в перитонеальной полости крыс при воспалении и выявлен защитный противовоспалительный эффект низких концентраций АРС (0 01-10 нМ) на тучные клетки, полученные от животных с перитонитом

3. Механизмы действия АРС на тучные клетки

Участие рецепторов PAR в действии АРС на тучные клетки

Об участии рецепторов PAR в реализации действия протеиназы на функцию клетки может свидетельствовать изменение ответа клетки при действии инактивированной протеиназы, не способной расщеплять рецептор, а

также изменение ответа клетки на АРС после десенситизации PAR.

Для проверки предположения о действии АРС на тучные клетки через PAR получали инактивированный с помощью PMSF фермент. Инактивация АРС приводила к потере более 98% амидазной активности по отношению к специфическому хром о ген ному субстрату (pyroGlu-Pro-Arg-pNA). Обнаружено, что инактивированный АРС теряет способность регулировать активность тучных клеток и секреция ¡3-гексозамини дазы в ответ на инактивированный АРС (1нМ) составила 22.9±4.9% при спонтанной секреции - 22.8±3,7% (Рис, 5 А). В то же время активная форма АРС (1нМ) вызывала достоверное снижение секреции тучных клеток - до 14.7±3.6% (Р<0.05, п=6). Эти данные свидетельствует о действии АРС на тучные клетки через протсолитически расщепляемый рецептор (PAR), хотя не опровергают возможного вклада нерасщепляем ого рецептора EPCR в реализацию действия АРС.

акт! 1шый/mi актированный

концентрация АРС, нМ

Рис. 5. Отмена эффекта АРС (черные столбцы) ira тучные клетки после инактивации фермента (полосатый столбец) (А) или десенситизации PARI тромбином (ЮОнМ, Юмин, полосатые столбцы) (Б), *Р<0.05 по отношению к спонтанной секреции (СП), п=4.

В следующей серии опытов для выяснения подтипа PAR рецепторов, опосредующих действие АРС на тучные клетки, проводили десенситизацию

PARI тромбином. Показано, что десенситизация PARI отменяла ответ клеток на последующие предъявления АРС (Рис. S Б), при этом сохранялся ответ клеток на вещество 48/80, вызывающее дегрануляцшо клеток без участия специфических рецепторов. Так, если АРС в концентрациях 0.7-1.5 нМ вызывал достоверное снижение секреции |3 - гек соз ам ин и дазы тучными клетками относительно спонтанного уровня, то после десенситизации PARI рецепторов тромбином этот эффект при последующих предъявлениях АРС отсутствовал (Р<0.05, п=4).

Об участии рецепторов PARI в реализации действия АРС на тучные клетки также свидетельствуют эксперименты, в которых предварительная инкубация клеток с АРС (1.2 нМ) отменяла про воспалительный эффект пептида-агониста PARI (50 мкМ) (Рис. 6). Эти данные подтверждают гипотезу о регуляторном действии АРС на тучные клетки через активацию PARI,

pO.Oi

160-

АРС

PARI-АР

Рис. 6. Предварительная активация тучных клеток АРС {1.2 нМ) отменяла и ровоспал ительное действие PAR 1 - АР (50 мкМ) на клетки (*Р<0.05 - но отношению к спонтанной секреции (СП), п=4).

Выяснение типа рецептора фактора Ха на тучных клетках показало, что десенситизация PARI тромбином (ЮОнМ) не влияла на секрецию медиатора, вызванную фактором Ха (45 нМ), что свидетельствует о его действии на тучные клетки не через PARI. Предварительная обработка тучных клеток АРС (0.9 нМ)

так же не влияла на вызванную фактором Ха (2.4 нМ) секрецию В-гексозамияидазы. Возможно, рецептором фактора Ха на тучных клетках (как и на других клетках (51гико\а 2006)) является РАК2 .

Рис 7. Отмена действия дуодепаэы (полосатые столбцы) на тучные метки после десенситизации PARI тромбином (ЮОнМ, Юмин, черные столбцы), п=4.

^ 40-1

3 зо-

X 3

1 20-

3 &

10-

сп

АРС

Рис. 8. Предварительная инкубация тучных клеток с качепсином О (4мкМ) или Дуодсназой {8 нМ) отменяла защитный противовоспалительный эффект АРС (0.5 нМ, черные столбцы) на тучные клетей. * Р<0.05 - но огдашейию к спонтанной секреции (СП), я=5.

катепсан G дуоденаза АРС АРС

Рецептором на тучных клетках для дуоденазы, по-видимому, является PARI, тк блокада ферментативной активности дуоденазы с помощью SBBI (соевый ингибитор протеиназ Баумана-Бирка) привела к существенному ингибированию (на 40%) способности дуоденазы активировать тучные клетки, а десенситизация PARI рецепторов тромбином отменяла действие дуоденазы (20 нМ) на клетки (Р<0 05, п=4) (Рис 7)

Эти данные свидетельствуют о том, что действие дуоденазы на тучные клетки может реализоваться через рецептор PARI Мы предположили, что дуоденаза работает подобно катепсину G, как агонист/антагонист (терминатор) рецептора В следующих экспериментах было показано, что предварительная инкубация тучных клеток с катепсином G (4мкМ) - антагонистом рецептора PARI, или дуоденазой (8 нМ) отменяла защитный противовоспалительный эффект АРС (0 5 нМ) на тучные клетки (Рис 8)

Еще одно подтверждение действия дуоденазы на клетки, как антагониста PARI, получено в экспериментах по влиянию дуоденазы на агрегацию тромбоцитов, индуцированную пептидом PARI-АР Показано, что дуоденаза (16 и 160 нМ) снижала вызванную PARI-АР (30-100мкМ) агрегацию тромбоцитов

Таким образом, рецептором АРС на тучных клетках служит PARI и он же является рецептором дуоденазы, которая может работать подобно катепсину G - как агонист/антагонист рецептора

Вклад NO в действие АРС на секреторную активность тучных клеток

Показано, что обнаруженное нами снижение секреции Р-гексозаминидазы под действием АРС обусловлено освобождением тучными клетками эндогенного NO, тк предобработка (30 минут) тучных клеток 300 мкМ L-NAME до добавления АРС (0 5-2 5нМ) приводила к достоверному повышению в 1 5 раза секреции Р-гексозаминидазы относительно уровня секреции в присутствии АРС (Р<0 01, п=4) (Рис 9)

Вызванное APC снижение секреции медиатора тучными клетками, обработанными дегранулятором - веществом 48/80, также как обусловлено освобождением ими N0, т.к. предварительная инкубация клеток с L-NAME отменяла эффект снижения секреции Р-гексозаминидазы под действием АРС на активированные веществом 48/80 тучные клетки (Рис. 9),

концентрация АРС, нМ

Рис. 9. Предварительная инкубация тучных клеток с L-NAME (ЗООмкМ) отменяет действие Ai'C на клетки. Слева - спонтанноактивированные клетки, справа - клетки, активированные веществом 48/80, Черные столбцы - действие АРС, белые - прединкубация клеток с I.-NAME и последующее действие АРС (*Р<0.05, **Р<0.(И по отношению к контролю, П=4).

О вкладе N0 в вызванную АРС регуляцию секреции медиаторов тучными клетками свидетельствуют результаты экспериментов с клетками, полученными от животных контрольной группы (к опыту с острым воспалением), получавших кетотифен (см. выше), который блокирует освобождение оксида азота (Eliakim et al., 1995). У этих тучных клеток АРС (в эффективных протекторных концентрациях (0.5-1пМ)) не вызвал изменений в секреции р-гексозаминидазы.

По-видимому, АРС, подобно тромбину (Stnikova et al., 1999), может

вызывать аутокринную регуляцию освобождения N0 тучными клетками Наши данные подтверждают предположение о том, что рецепторы PAR на клетках-мишенях служат сенсорами протеиназ и вовлекаются в сопряжение процессов свертывания крови и воспаления (Strukova, 2006)

4. Влияние АРС на процесс заживления экспериментальной язвы желудка у крыс

Недавно показано, что АРС стимулирует пролиферацию клеток в культуре кератиноцитов [Xue et al, 2005], вызывает ускорение заживления кожных ран у крыс, стимулируя ангиогенез, реэпителизацию и ингибируя воспаление [Jackson et al, 2005] и блокирует воспалительные ответы слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки у экспериментальных животных [Isobe et al, 2004]

Наши эксперименты показали, что АРС, подобно пептиду-агонисту PARI (PARI-АР), при однократном внутрижелудочном введении может ускорять заживление экспериментальной язвы желудка Анализ образцов ткани желудка в очаге язвообразования на 3 сутки после операции показал, что у животных опытной группы, которьм вводили АРС уже на 3 сутки эксперимента воспалительная реакция и отек были менее выражены по сравнению с контролем Наблюдалось увеличение клеток с признаками фибробластической дифференцировки, что свидетельствует об ускоренном созревании предшественников фибробластов, мигрирующих в раневую зону У животных, которым вводили АРС, содержание нейтрофилов было в 2 раза ниже, а фибробластов более чем в 1 5 раза выше, чем в контроле (Р<0 05, п=3)

На 7 день после операции в грануляционной ткани животных, которым вводили АРС, преобладали четко ориентированные фибробластические элементы Количество нейтрофилов было снижено в 2 3 раза, а количество фибробластов увеличено в 1 5 раза по сравнению с контролем (Р<0 05, п=3) (Рис 10)

не игра филы макрофаги фиб роб ласты нейтрофилы макрофаги фи Б роб ласты

Рис. 10. Морфологические изменения подслюистой оболочки желудка на 3 (слева) и 7 (справа) сутки эксперимента (гематоксилин, эозин, ув. х400). Вверху - опытная (АРС), внизу - контрольная группа. Диаграммы отражают клеточный состав модслизистой оболочки желудка на 3 (слева) и 7 (справа) сутки эксперимента. Черные столбцы - физ. раствор (п=3), белые - АРС (п=3), *Р<0.05 по сравнению с контролем.

Таким образом, на модели экспериментальной ацетатной язвы желудка показано, что АРС при однократном внутри желудочном введении блокирует воспалительные ответы, сокращая фазу воспаления и сдвигая фазу пролиферации на более ранние сроки, что приводит к ускорению заживления язвы желудка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, установлено, что активированный протеин С может регулировать активность тучных клеток В модели спонтанной и вызванной активации перитонеальных тучных клеток крысы (iv vitro) показано, что АРС дозозависимо в узком диапазоне низких концентраций (нМ) блокирует секрецию медиаторов воспаления тучными клетками Действие АРС на тучные клетки реализуется через активацию PARI, поскольку десенситизация тромбиновых PARI рецепторов на тучных клетках отменяет вызванное АРС снижение секреции (î-гексозаминидазы О действии АРС через расщепляемые рецепторы PAR свидетельствуют данные о том, что инактивированный PMSF АРС, лишенный протеолитической активности, не имитирует действие фермента Показана высокая специфичность активации PARI тучных клеток АРС (ЕС50=О 19нМ) Установлено, что противовоспалительное действие низких концентраций АРС на тучные клетки, обусловлено усилением генерации N0, о чем свидетельствует отмена защитного действия АРС в присутствии L-NAME -ингибитора образования N0 Показано, что действие низких концентраций АРС на тучные клетки блокируют эндогенные протеиназы катепсин G и протеииаза желудочно-кишечного тракта - дуоденаза, которая активирует тучные клетки через рецепторы PARI

На модели острого экспериментального воспаления у крыс обнаружено появление в перитонеальной полости сериновых протеиназ - АРС и тромбина, и выявлен противовоспалительный ответ перитонеальных тучных клеток, полученных от животных с острым перитонитом на низкие (пМ-нМ) концентрации АРС Обнаружено, что при экспериментальной ацетатной язве желудка у крыс АРС, введенный однократно, сокращает фазу воспаления и сдвигает фазу пролиферации на более ранние сроки, что приводит к ускорению заживления язвы желудка

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о новой функции АРС - регуляции активности тучных клеток, что существенно расширяет представления о противовоспалительных свойствах АРС

ВЫВОДЫ

1 На модели острого экспериментального перитонита у крыс установлено, что индукция воспаления сопровождается появлением в перитонеальной полости тромбина и АРС Максимальная концентрация тромбина наблюдается на 10-й минуте, АРС - на 120-й минуте воспаления Перитонеальные тучные клетки, полученные от животных с острым воспалением, отвечают на низкие концентрации АРС (0 05-1 ОнМ) снижением секреции (3-гексозаминидазы

2 Показано, что активированный протеин С проявляет противовоспалительную активность в модели спонтанной и вызванной активации перитонеальных тучных клеток крысы АРС дозозависимо в диапазоне низких концентраций блокирует спонтанную, вызванную веществом 48/80 и агонистами PARI секрецию р-гексозаминидазы тучными клетками

3 Установлено, что действие АРС на тучные клетки реализуется через PARI, поскольку десенситизация PARI рецепторов тромбином отменяла вызванное низкими концентрациями АРС (<2 5 нМ) снижение секреции Р-гексозаминидазы, инактивированный PMSF АРС не имитировал действие фермента на тучные клетки, и АРС модулировал дегрануляцию тучных клеток, вызванную тромбином и PARI-АР

4 Предобработка тучных клеток катепсином G или дуоденазой, которая, как показано, активирует тучные клетки через рецепторы PARI, отменяет защитный противовоспалительный эффект низких концентраций АРС на тучные клетки

5 Противовоспалительное действие низких концентраций АРС на перитонеальные тучные клетки, обусловлено усилением генерации NO, о чем свидетельствует отмена защитного действия АРС в присутствии L-NAME

6 На модели экспериментальной ацетатной язвы желудка у крыс показано, что АРС при однократном введении ускоряет заживление язвы, сокращая фазу воспаления и сдвигая на более ранние сроки фазу пролиферации

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Макарова A M, Киселева Е В , Умарова Б А, Струкова С M Участие рецептора активируемого протеиназой (PARI) в регуляторных функциях тромбина при воспалении // Научные труды I Съезда физиологов СНГ, под редакцией Р И Сепиашвили M Медицина-здоровье 2005 , Т 1 , с 13-14

2 Макарова А М., Киселева Е В , Умарова Б А, Струкова С M Тромбин регулирует активность клеток, участвующих в воспалении через PAR рецепторы // Материалы Всероссийской конференции «Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром Современные достижения» Москва 2005 , с 65-66

3 Русанова А В , Макарова A M, Марквичева Е А , Грандфис К, Струкова С M Пептид - агонист рецептора тромбина как новый антиульцерогенный фактор // Материалы международной конференции «Биотехнология и медицина» Москва 2006, с 217

4 Русанова А В , Макарова А.М, Струкова С M, Марквичева Е А, Горбачева JIР , Сташевская К С , Васильева Т В , Сидорова Е И , Беспалова Ж Д , Грандфис К Пептид -агонист рецептора тромбина, иммобилизованный в микросферы, ускоряет репаративные процессы в модели язвы желудка у крыс //Бюлл эксп биол мед 2006 Т 142 №7 с 42-46

5 Макарова AM., Русанова AB, Горбачева JIP, Умарова Б А, Струкова СМ Влияние активированного протеина С на секреторную активность перитонеальных тучных клеток крысы //Бюлл эксп биол мед, 2006 Т 142 №10 с 382-385

6 Макарова А.М, Русанова А В , Замолодчикова Т С , Румш Л Д , Струкова С M Агонисты PAR-рецепторов - модуляторы процессов воспаления и репарации тканей // Материалы XIII Международной конференции и дискуссионного научного клуба «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» Украина, Гурзуф 2006 с 232-234

7 Makarova А , Zamolodchikova Т S , Rumsh L D , Smirnov M , Strukova S APC and duodenase can control an inflammation via the PARs on mast cells // 18th International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis Proteolysis USA, San-Diego 2006 p 178-179

8 Markvicheva E , Stashevskaya К, Strukova S , Prudchenko I, Rusanova A , Makarova A , Vasilieva T , Bespalova J , Grandfils Ch Biodegradable microparticles loaded with thrombin receptor agonist peptide for gastric ulcer treatment in rats //J Drug Del Sei Tech, 2006 V 16 (4) P 321-325

9 Сташевская К С , Марквичева E А , Струкова С M, Русанова А В , Макарова A M, Горбачева JI Р , Прудченко И А , Зубов В П , Грандфис К Биодеградируемые микрочастицы с иммобилизованным пептидом для заживления ран // Биомедицинская химия, 2006 Т 52 (1) с 83-94

10 Макарова А.М, Горбачева Л Р , Русанова Л В , Струкова С М Роль рецептора PARI в протекторном противовоспалительном действии активированного протеина С // Материалы III Всероссийской конференции «Клиническая 1емостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием) Москва. 2007 с 132-133

11 Струкова С М , Горбачева Л Р , Сторожевых Т П , Макарова A.M., Иншвата С Нейропротекторные и противовоспалительные свойства агонистов рецепторов, активируемых протеиназами // Материалы III Всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореотогия в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием) Москва 2007 с 231

12 Макарова AM., Замолодчикова ТС, Румш ЛД, Струкова СМ Дуоденаза активирует перитонеальные тучные клетки крысы через рецепторы 1-типа, активируемые протеиназами // Биоорг Хим , 2007 №4 (в печати)

13 Макарова AM, Горбачева ЛР, Замолодчикова ТС, Румш ЛД, Смирнов М, Струкова С М Роль рецептора PARI в протекторном действии активированного протеина С при неиммуннои активации тучных клеток // Биомедицинская Химия 2007 (в печати)

14 Макарова AM., Замолодчикова ТС, Румш ЛД, Струкова СМ Новые противовоспалительные функции активированного протеина С // Материалы XX Съезда Физиологического общества им И П Павлова Москва 2007 (в печати)

15 Макарова А М., Горбачева Л Р, Замолодчикова Т С , Румш Л Д, Струкова С М Разнонаправленное действие сериповых протеиназ - активированного протеина С и дуоденазы па тучные клетки // Материалы VI симпозиума «Химия протеолитических ферментов» Москва 2007 (в печати)

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01 12 99 г Подписано к печати 03 04 2007 г Формат 60x90 1/16 Услпечл 1,5 Тираж 100 экз Заказ 165 Тел 939-3890 Тел/Факс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им МВ Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Макарова, Анастасия Михайловна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Участие протеиназ гемостаза в сопряжении процессов свертывания крови и воспаления.

1.1. Свертывание крови при воспалении.

1.2. Активация PAR рецепторов специфическими и неспецифическими протеиназами.

1.3. PAR-опосредованные механизмы передачи внутриклеточных сигналов.

Глава 2. Физиологические функции активированного протеина С.

2.1. Структурные особенности протеина С, образование АРС.

2.2. Антикоагулянтные и противовоспалительные свойства АРС.

Глава 3. Протекторное действие АРС при воспалении и репарации тканей.

3.1. Механизмы неиммунной активации тучных клеток.

3.2. Вклад N0 в секреторную активность тучных клеток.

3.3. Механизмы заживления язвы желудка.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 4. Материалы и методы исследования.

Глава 5. Участие протеиназ гемостаза в ответах организма на острое воспаление.

5.1. Индекс дегрануляции тучных клеток, как характеристика воспаления.

5.2. Динамика появления протеиназ системы гемостаза в перитонеальной жидкости при воспалении.

5.3. Блокада гирудином активности тромбина в перитонеальной жидкости.

Глава 6. Влияние АРС на секреторную активность перитонеальных тучных клеток.

6.1. Влияние АРС на секрецию тучных клеток с разной функциональной активностью.

6.2. Исследование активации тучных клеток, полученных от крыс с острым перитонитом.

6.3. Сравнение эффектов АРС с действием других протеиназ на секреторную функцию тучных клеток.

Глава 7. Механизмы действия АРС и других протеиназ на тучные клетки.

7.1. Участие рецепторов PAR в действии АРС на тучные клетки.

7.2. Роль PARI в действии фактора Ха и дуоденазы на тучные клетки.

7.3. Дуоденаза, как агонист/антагонист PARI рецепторов тучных клеток.

7.4. Вклад N0 в действие АРС на секреторную активность тучных клеток.

7.5. Влияние активации тучных клеток PAR1-AP или АРС, на АДФ-вызванную агрегацию тромбоцитов.

Глава 8. Влияние АРС и PAR1-AP на процесс заживления экспериментальной язвы желудка у крыс.

8.1. Кинетика высвобождения PARI-АР из микрокапсул.

8.2. Влияние инкапсулированного PAR1-AP на процесс заживления экспериментальной язвы желудка.

8.3. Влияние АРС на процесс заживления экспериментальной язвы желудка.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Протекторное действие активированного протеина С при воспалении и репарации тканей"

Актуальность проблемы

При повреждении тканей активируются процессы свертывания крови и воспаления, образуется ряд протеиназ, в том числе сериновые протеиназы системы гемостаза - тромбин, фактор Ха (фХа) и активированный протеин С (АРС). Тромбин - ключевой прокоагулянт, поскольку превращает фибриноген в фибрин - основу тромба, активирует факторы V, VIII, XI, XIII свертывания крови. Связывая рецепторы, активируемые протеиназами (PARI и PAR4), тромбин индуцирует агрегацию тромбоцитов, активацию клеток крови, соединительной ткани и запускает процессы воспаления (Coughlin 2000, 2005; Струкова 2001, 2006). Вместе с тем, тромбин регулирует свертывание крови по механизму отрицательной обратной связи, поскольку связывает на эндотелии нерасщепляемый рецептор -тромбомодулин и превращает протеин С в антикоагулянт - активированный протеин С. АРС, в свою очередь инактивирует факторы Va и Villa, участвующие в образовании протромбина, и тем самым блокирует процесс тромбообразования (Esmon 2003, 2005).

В последнее время активно развивается представление о противовоспалительном и антиапоптотическом действии АРС на эндотелиальные клетки и моноциты, а также о его протекторном действии при системном воспалении и сепсисе (Joyce et al., 2004; Mosnier, Griffin 2006). Показано взаимодействие АРС с двумя мембранными рецепторами - эндотелиальным рецептором протеина С (EPCR) (Esmon 2000) и PARI эндотелия (Reiwald, Ruf 2005; Feistritzer et al., 2006). Рецепторы PARI экспрессируются всеми клетками, вовлекаемыми в процессы свертывания крови, воспаления и репарации тканей, что позволяет предполагать их участие в осуществлении острых защитных реакций организма и в патогенезе хронических процессов (Macfarlane et al., 2001; Струкова 2001, 2006). В связи с этим весьма актуальным является изучение рецептор-опосредованных механизмов противовоспалительного действия АРС.

Известно, что при воспалении активируются тучные клетки и освобождают широкий спектр провоспалительных медиаторов, в том числе гистамин, (3-гексозаминадазу, протеазы, цитокины, оксид азота (NO) и др. (Metcalfe et al., 1997). NO регулирует активность тучных клеток, повышая уровень цГМФ, секрецию медиаторов и ингибируя агрегацию тромбоцитов (Bunnett 2006). Тучные клетки тонкого кишечника секретируют дуоденазу (ЕС 3.4.21) - сериновую протеиназу, обнаруженную в слизистой двенадцатиперстной кишки, которая помимо участия в активации протеиназ пищеварения, может играть роль в воспалении (Pemberton et al., 2002).

Роль APC и других сериновых протеиназ в механизмах, ответственных за запуск, развитие и/или регуляцию воспалительных и репаративных процессов в тканях еще не достаточно исследована, хотя известно, что повышается экспрессия PAR на поверхности клеток, участвующих в основных этапах репарации тканей (воспалении, пролиферации клеток и созревании ткани) (Струкова 2001). Ранее в нашей лаборатории было установлено PARI-опосредованное действие тромбина и пептидов - агонистов PARI (PARI-АР) на тучные клетки и выявлена аутокринная регуляция оксидом азота ответа тучных клеток (Strukova et al., 1996, 1999). На модели острого перитонита у крыс было показано усиление секреции медиаторов тучными клетками в ответ на действие тромбина и PARI-АР, что свидетельствует о дополнительной экспозиции PARI на тучных клетках в условиях воспаления (Dugina et al., 2003). Иммобилизованный в полимерные матрицы PARI-АР ускоряет заживление кожных ран (у мышей и крыс), что подтверждает регуляторную функцию агонистов PARI при воспалении - первой фазе заживления ран (Strukova et al., 2001, 2002; Дугина и др., 2004). Однако до настоящего времени не было исследовано влияние АРС на активность тучных клеток при воспалении. В связи с этим изучение участия тучных клеток в реализации противовоспалительного действия APC, а также влияние АРС на процесс заживления экспериментальной язвы желудка представляется весьма актуальным и перспективным.

Цели и задачи исследования.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать динамику появления протеиназ системы гемостаза (фХа, тромбина, АРС) в перитонеальной жидкости (на модели острого воспаления у крыс).

2. Изучить влияние АРС на секреторную активность перитонеальных тучных клеток в моделях спонтанной и вызванной активации. Оценить влияние АРС на активность тучных клеток, полученных от крыс с острым перитонитом.

3. Исследовать PAR- опосредованные механизмы действия АРС на тучные клетки.

4. Исследовать действие АРС на процесс заживления экспериментальной язвы желудка.

Научная новизна работы. На модели острого воспаления у крыс впервые обнаружено появление сериновой протеиназы системы гемостаза - АРС, вслед за появлением тромбина в перитонеальной жидкости.

Впервые показано, что противовоспалительное действие АРС может реализовываться через регуляцию активности тучных клеток. В моделях спонтанной и вызванной активации перитонеальных тучных клеток выявлено, что АРС дозозависимо в узком диапазоне низких концентраций блокирует секрецию медиаторов воспаления тучными клетками. Кроме того, впервые показано протекторное влияние АРС на секреторную активность тучных клеток, полученных от крыс с острым воспалением.

Впервые установлено, что действие АРС на тучные клетки реализуется через активацию PARI рецепторов, поскольку их десенситизация тромбином предотвращает вызываемое АРС снижение секреции Р-гексозаминидазы, а инактивированный АРС не имитирует действие фермента на тучные клетки. Показано, что действие АРС на тучные клетки блокируется катепсином G и протеиназой желудочно-кишечного тракта и тучных клеток - дуоденазой, которая, как установлено, стимулирует секрецию медиаторов воспаления перитонеальными тучными клетками через PARI. Показано, что регуляция секреторной активности тучных клеток АРС обусловлена усилением генерации эндогенного оксида азота, о чем свидетельствует отмена защитного действия АРС в присутствии L-NAME -ингибитора образования N0.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты данного исследования имеют важное как теоретическое, так и практическое значение. Полученные данные расширяют представления о механизмах защитных функций активированного протеина С в процессах воспаления. Нами обнаружено появление протеиназ системы гемостаза (тромбина и АРС) в перитонеальной жидкости на модели острого воспаления у крыс. Впервые выявлено противовоспалительное действие АРС на перитонеальные тучные клетки в норме и при воспалении. Показано, что АРС блокирует секрецию медиаторов воспаления тучными клетками через высокоспецифичную активацию PARI рецептора и аутокринную регуляцию оксидом азота ответа тучных клеток.

Имеют практическое значение данные о том, что АРС, подобно пептиду-агонисту PARI, иммобилизованному в полимерные микрочастицы, способен ускорять (после однократного внутрижелудочного введения) заживление экспериментальной язвы желудка. Создание нового класса антиульцерогенных препаратов на основе АРС и пептидов-агонистов PARI представляется перспективным в связи с их высокой эффективностью.

Апробация материалов диссертации. Основные результаты работы были доложены на I Съезде физиологов СНГ (Россия, Дагомыс, 2005), Всероссийской конференции «Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром. Современные достижения» (Россия, Москва, 2005), Международной конференции «Биотехнология и медицина» (Россия, Москва, 2006), XIII Международной конференции и дискуссионном научном клубе «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Крым, Гурзуф, 2006), 18-м Международном конгрессе по фибринолизу и протеолизу (USA, San-Diego, 2006), заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ (Россия, Москва, 2006), III Всероссийской научной конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Россия, Москва, 2007), VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Россия, Москва, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ (в том числе 6 статей).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах и включает введение, обзор литературы, описание объекта и методов исследования, результаты, обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы (содержит 246 источников). Работа иллюстрирована 47 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Макарова, Анастасия Михайловна

выводы

1. На модели острого экспериментального перитонита у крыс установлено, что индукция воспаления сопровождается появлением в перитонеальной полости тромбина и АРС. Максимальная концентрация тромбина наблюдается на 10-й минуте, АРС - на 120-й минуте воспаления. Перитонеальные тучные клетки, полученные от животных с острым воспалением, отвечают на низкие концентрации АРС (0.05 - 10 нМ) снижением секреции Р-гексозаминидазы.

2. Показано, что активированный протеин С проявляет противовоспалительную активность в модели спонтанной и вызванной активации перитонеальных тучных клеток крысы. АРС дозозависимо в диапазоне низких концентраций блокирует спонтанную, вызванную веществом 48/80 и агонистами PARI секрецию Р-гексозаминидазы тучными клетками.

3. Установлено, что действие АРС на тучные клетки реализуется через PARI рецептор, поскольку десенситизация PARI рецепторов тромбином отменяла вызванное низкими концентрациями АРС (0.5 - 2.5 нМ) снижение секреции Р-гексозаминидазы, инактивированный PMSF АРС не имитировал действие фермента на тучные клетки, и АРС модулировал дегрануляцию тучных клеток, вызванную тромбином и PARI-АР.

4. Предобработка тучных клеток катепсином G или дуоденазой, которая, как показано, активирует тучные клетки через рецепторы PARI, отменяет защитный противовоспалительный эффект низких концентраций АРС на тучные клетки.

5. Противовоспалительное действие низких концентраций АРС (< 2.5 нМ) на перитонеальные тучные клетки, обусловлено усилением генерации NO, о чем свидетельствует отмена защитного действия АРС в присутствии L-NAME.

6. На модели экспериментальной ацетатной язвы желудка показано, что АРС при однократном введении ускоряет заживление язвы желудка, сокращая фазу воспаления и сдвигая на более ранние сроки фазу пролиферации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, установлено, что активированный протеин С может регулировать активность тучных клеток. В модели спонтанной и вызванной активации перитонеальных тучных клеток крысы показано, что АРС дозозависимо в узком диапазоне низких концентраций (нМ) блокирует секрецию медиаторов воспаления тучными клетками. Действие АРС на тучные клетки реализуется через активацию PARI, поскольку десенситизация тромбиновых PARI рецепторов на тучных клетках отменяет вызванное АРС снижение секреции Р-гексозаминидазы. О действии АРС через расщепляемые рецепторы PAR свидетельствуют данные о том, что инактивированный PMSF АРС, лишенный протеолитической активности, не имитирует действие фермента. Показана высокая специфичность активации PARI тучных клеток АРС (ЕС50 = 0.19 нМ). Установлено, что противовоспалительное действие низких концентраций АРС на тучные клетки, обусловлено усилением генерации N0, о чем свидетельствует отмена защитного действия АРС в присутствии L-NAME - ингибитора образования N0. Показано, что действие низких концентраций АРС на тучные клетки блокируют эндогенные протеиназы: катепсин G и протеиназа желудочно-кишечного тракта - дуоденаза, которая активирует тучные клетки через рецепторы PARI.

На модели острого экспериментального воспаления у крыс обнаружено появление в перитонеальной полости сериновых протеиназ - АРС и тромбина, и выявлен противовоспалительный ответ перитонеальных тучных клеток, полученных от животных с острым перитонитом на низкие (пМ - нМ) концентрации АРС. Обнаружено, что при экспериментальной ацетатной язве желудка у крыс АРС, введенный однократно, сокращает фазу воспаления и сдвигает фазу пролиферации на более ранние сроки, что приводит к ускорению заживления язвы желудка.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о новой функции АРС -регуляции активности тучных клеток, что существенно расширяет представления о противовоспалительных свойствах АРС.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Макарова, Анастасия Михайловна, Москва

1. Воспаление: Руководство для врачей. // Под ред. Серова В.В., Паукова1. B.C. М.: Медицина. 1995.

2. Дугина Т.Н., Киселева Е.В., Чистов И.В., Умарова Б.А., Струкова С.М. Рецепторы семейства PAR связующее звено процессов свертывания крови и воспаления. // Биохимия. 2002. Т.67 (1). С. 77-87.

3. Дугина Т.Н., Киселева Е.В., Ланге М.А., и др. // Бюлл. экспер. биол. мед. 2004. Т. 138. С. 463-466.

4. Киселева Е.В., Дугина Т.Н., Глуза Э., Струкова С.М. Роль рецепторов семейства PAR в активации тучных клеток крысы в норме и при остром воспалении. // Рос. Физиол. Журн. им. И.М. Сеченова. 2004. Т.87 (11). С. 1527-1533.

5. Макарова A.M., Русанова A.B., Горбачева Л.Р., Умарова Б.А., Струкова

6. C.М. Влияние активированного протеина С на секреторную активность перитонеальных тучных клеток крысы. // Бюлл. эксп. биол. мед. 2006. Т. 142. № 10. С. 382-385.

7. Струкова С.М. В книге «Воспаление» (под ред. Серова В.В., Паукова

8. B.C.). // М.: Медицина. 1995. С. 52 -81.

9. Струкова С.М., Киреева Е.Г., Дугина Т.Н. Механизмы взаимодействия тромбина с клетками. Взаимодействие тромбина с клетками эндотелия, тучными и другими. // Вестник МГУ. Биология. 1997. № 1. С. 8-13.

10. Струкова С.М., Дугина Т.Н., Чистов И.В., Марквичева Е.А., Купцова

11. C.B., Колокольчикова Е.Г., Румш Л.Д., Зубов В.П., Глуза Э. // Биоорган. Химия. 1998. Т. 24. С. 288-292.

12. Струкова С.М., Чистов И.В., Умарова Б.А., Дугина Т.Н., Сторожевых Т.П., Пинелис В.Г., Глуза Э. Модуляция активности тучных клеток пептидом-агонистом рецептора тромбина: роль оксида азота // Биохимия. 1999. Т. 64. С. 70-78.

13. Струкова С.М. Тромбин регулятор процессов воспаления и репарации тканей // Биохимия. 2001. Т. 66. С. 14-27.

14. Струкова С.М. Роль тромбоцитов и сериновых протеиназ в сопряжении свертывания крови и воспаления. // Биохимия. 2004. Т. 69. С. 1314-1331.

15. Умарова Б.А., Дугина Т.Н., Шестакова Е.В., Глуза Э., Струкова С.М. Активация тучных клеток крысы при стимуляции рецептора, активируемого протеазой (PARI). // Бюлл. экспер. биол. мед. 2000. №5. С. 370-373.

16. Умарова Б.А., Струкова С.М., Базазьян Г.Г., Хлебникова Т.Г., Колокольчикова Е.Г. Состояние популяции тучных клеток крыс при экспериментальном атеросклерозе. // Бюлл. эксп. биол и мед. 1987. №3. С. 366-369.

17. Шаехова Н.В., Попов Г.К., Астахова J1.B., Лалаян Т.В. Роль микроокружения спинномозговых нервов в формировании болевой чувствительности. // Известия Челябинск, научн. центра. 2001. Вып. 4 (13). С.77-81.

18. Alderton W.K., Cooper С.Е., Knowles R.G. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition. // Biochem J. 2001. V.357. P. 593-615.

19. Aim A.K., Norstrom E., Sundelin J., and Nystedt S. Stimulation of proteinase activated receptor-2 causes endothelial cells to promote blood coagulation in vitro. // Thromb. Haemost., 1999. V.81. P. 984-988.

20. Aridor M. Raimilevich G., Beaven M.A., Sagi-Eisenberg R. Activation of exocytosis by the heterotrimeric G protein Gi3. Science. 1993 V.262 (5139). P.1569-1572.

21. Artuc M., Hermes В., Algermissen В., and Henz B.M. Expression of prothrombin, thrombin and its receptors in human scars. // Exp Dermatol. 2006. V.15 (7). P.523-529.

22. Aruoma O.I. Nutrition and health aspects of free radicals and antioxidants. // Food Chem Toxicol. 1994. V. 32. P.671-83.

23. Bachli E.B., Pech C.M., Johnson K.M., Johnson D.J., Tuddenham E.G., and McVery J.H. Factor Xa and thrombin, but not factor Vila, elicit specific cellular responses in dermal fibroblasts. //J. Thromb. Haemost. 2003. V. 1. P. 1935-1944.

24. Balazs A.B., Fabian A.J., Esmon Ch.T., and Mulligan R.C. Endothelial protein С receptor (CD201) explicitly identifies hematopoietic stem cells in murine bone marrow. // Blood. 2006. V.107, № 6. P.2317-2321

25. Baldwin A.S. Jr. The NF-kappa В and I kappa В proteins: new discoveries and insights. // Jr. Ann. Rev. Immunol. 1996. V. 14. P. 649-681.

26. Befus A.D. Mast cells are that polymorphic. // Reg. Immunol. 1989. V. 2. P.176-187.

27. Befus D., Mowat C., Gilchrist M., Hu J., Solomon S., and Bateman A. Neutrophil defensins induce histamine secretion from mast cells: mechanisms of action. // J. Immunol. 1999. V. 163. P. 947-953.

28. Bidri M., Ktorza S., Vouldoukis I., Le Goff L., Debre P., Guillosson J. J., Arock M. Nitric oxide pathway is induced by Fe epsilon RI and up-regulated by stem cell factor in mouse mast cells. // Eur. J. Immunol. 1997. V. 27. P. 2907-2913.

29. Bredt D.S., Snyder S.H. Nitric oxide, a novel neuronal messenger. // Neuron. 1992. V. 8.P. 3-11.

30. Bischoff S.C. Role of mast cells in allergic and non-allergic immune responses: comparison of human and murine data. // Nature reviews. 2007. V.7. P93-104.

31. Böhm S.K., Khitin L.M., Grady E.F., Aponte G., Payan D.G., and Bunnett N.W. Mechanisms of desensitization and resensitization of proteinase-activated receptor-2 //J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 22003-22016.

32. Bradford M.M. A rapid sensitive method for the principle of protein-dye binding. // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

33. Brass L.F. Thrombin receptor antagonists: a work in progress // Coron Artery Dis. 1997. V. 8. P. 49-58

34. Brooks A.C., Whelan C.J., Purcell W.M. Reactive oxygen species generaton and histamine release by activated mast cells: modulation by nitric oxide synthase inhibition. //Br J Pharmacol. 1999. V. 128. P. 585-590.

35. Bunnett N.W. Protease-activated receptors: how proteases signal to cells to cause inflammation and pain. // Semin Thromb Hemost. 2006. V. 32. P. 39-48.

36. Caerer E., Cornelissen I., Kataoka H., Duong D.N., Zheng Y-W., Coughlin S.R. Roles of protease-activated receptors I a mouse model of endotoxemia. // Hemost, Thromb. and Vascular biology. 2006. V. 107. № 10. P.3912-3921.

37. Camerer E., Huang W., and Coughlin, S.R. Tissue factor- and factor X-dependent activation of protease-activated receptor 2 by factor Vila. // Proc. Natl. cad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 5255-5260.

38. Camerer E., Kataoka H., Kahn., Lease K., Coughlin S.R. Genetic evidence that protease activated receptors mediate factor Xa signaling in endothelial cells. // J. Biol.Chem. 2002. V. 277. P. 16081-16087.

39. Chen Y.H., Pouyssegur J., Courtneidge S.A., and Van Obberghen-Schilling E. Activation of Src family kinase activity by the G protein-coupled thrombin receptor in growth-responsive fibroblasts. // J Biol Chem 1994. V. 269. P. 27372-27377.

40. Cheng T., Liu D., Griffin J.H., Fernandez J.A., Castellino F., Rosen E.D., Fukudome K., and Ziokovic B.V. Activated protein C blocks p53-mediated apoptosis in ischemic huijian brain endothelium and is neuroprotective. // Nat Med. 2003. V.9. P. 338342.

41. Christopherson K.S., Bredt D.S. Nitric oxide in excitable tissues: physiological roles and disease. //J. Clin. Investig. 1997. V. 100. P. 2424-2429.

42. Coleman J.W. Nitric oxide: a regulator of mast cell activation and mast cellmediated inflammation. // Clin Exp Immunol. 2002. V. 129. P. 4-10.

43. Connolly A.J., Suh D.Y., Hunt T.K., and Coughlin S.R. Mice lacking the thrombin receptor, PARI, have normal skin wound healing. Am J Pathol. 1997. V.151. P. 1199-1204.

44. Coughlin S.R. How the protease thrombin talks to cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 11023-11027.

45. Coughlin S.R. Protease-activated receptors and platelet function. // Thromb. Haemost. 1999. V. 82. P. 353-356.

46. Coughlin S.R. Thrombin signalling and proteaseactivated receptors. // Nature. 2000. V. 407. P. 258-264.

47. Coughlin S.R. Protease-activated receptors in vascular biology. // Thromb. Haemost. 2001. V. 86. P. 298-307.

48. Coughlin S.R. Protease-activated receptors in hemostasis, thrombosis and vascular biology // J Thromb Haemost. 2005. V. 3(8). P. 1800-1814.

49. Craps L.P., Ney U.M. Ketotifen: current views on its mechanism of action and their therapeutic implications. // Respiration. 1984. V.45 (4). P.411-421.

50. Cumashi A., Ansuini H., Celli N., De Blasi A., O'Brien P.J., Brass L.F., and Molino M. Neutrophil proteases can inactivate human PAR3 and abolish the co-receptor function of PAR3 on murine platelets. // Thromb Haemostasis. 2001. V.85. P. 533-538.

51. Dahlbahck B., Stenflo J. The protein C anticoagulant system. In: Stamatoyannopoulos G., Majerus P.W., Perlmutter R.M., Varmus H., eds. The molecular Basis of Blood Diseases. // 3rd edn. Philadelphia: W.B. Saunders Co. 2001. P. 614-656.

52. Dahlbahck B., Stenflo J. Vitamin K-dependent proteins in blood coagulation. In: Stamatoyannopoulos G., Majerus P.W., Perlmutter R.M., Varmus H., eds. The molecular Bais of Blood Diseases, 3rd edn. Philadelphia: W.B. Saunders Co., 2001: 579— 613.

53. Dahlback B., and Villoutreix B.O. Regulation of Blood Coagulation by the Protein C Anticoagulant Pathway. // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2005. V. 25. P. 13111320.

54. Damiano B.P., D'Andrea M.R., de Garavilla L., Cheung W.M., and Andrade-Gordon P. Increased expression of protease activated receptor-2 (PAR-2) in balloon-injured rat carotid artery. // Thromb. Haemost. 1999. V. 81. P. 808-814.

55. De Candia E., Hall S.W., Rutella S., Landolfi R., Andrews R.K., and De Cristofaro R. Binding of thrombin to glycoprotein lb accelerate the hydrolysis of Par-1 on intact platelets. // J Biol Chem. 2001. V. 276. P. 4692-4698.

56. Dery 0., Corvery C.U., Steinhoff M., Bunnett N.W. Proteinase-activated receptors: novel mechanisms of signaling by serine proteases. // Am J Physiol. 1998. V. 274. P. C1429-C1452.

57. Derian C.K., Damiano B.P., D'Andréa M.R., Andrade-Gordon P. Thrombin regulation of cell function through protease-activated receptors: implications for therapeutic intervention. // Biochemistry (Mosc). 2002. V.67 (1). P. 56-64.

58. Donovan F.M., Pike C.J., Cotman C.W., and Cunningham DD. Thrombin induces apoptosis in cultured neurons and astrocytes via a pathway requiring tyrosine kinase and RhoA activities. // J Neurosci. 1997. V.17. P. 5316-5326.

59. Dugina T.N., Kiseleva E.V., Glusa E., Strukova S.M. Activation of mast cells induced by agonists of proteinase-activated receptors under normal conditions and during acute inflammation in rats. // Eur. J. Pharmacol. 2003. V. 471(2). P. 141-147.

60. Eastmond N.C., Banks E.M., Coleman J.W. Nitric oxide inhibits IgE-mediated degranulation of mast cells and is the principal intermediate in IFN-gamma -induced suppression of exocytosis. // J Immunol. 1997. V. 159. P.1444-1450.

61. Eliakim R., Karmeli F., Okon E., and Rachmilewitz D. Ketotifen ameliorates capsaicin-augmented acetic acid-induced colitis. // Digestive Diseases and Sciences. 1995. V.40. №3 P.503-509.

62. Esmon C.T. Thrombomodulin as a model of molecular mechanisms that modulate protease specificity and function at the vessel surface. // Faseb J .1995. V. 9. P. 946-955.

63. Esmon C.T., Xu J., Gu J.M., Qu D., Laszik Z., Ferrell G., Steams-Kurosawa D., Kurosawa S., Taylor F.B., and Esmon N.L. Endothelial protein C receptor. // Thromb. Haemost. 1999. V.82. P. 251-258.

64. Esmon C.T. APC resistance, oral contraceptive therapy and deep vein thrombosis: settled and unsettled problems // Haematologica. 2000. V. 84. P. 254-259.

65. Esmon C.T. Protein C anticoagulant pathway and its role in controlling microvascular thrombosis and inflammation. // Crit Care Med. 2001. V. 29. P. S48-S51.

66. Esmon C.T. The endothelial cell protein C receptor. // Thromb Haemost. 2000. V.83. P.639-643.

67. Esmon C.T. The protein C pathway. // Chest. 2003. V. 124. P. 26S-32S.

68. Esmon C.T. Coagulation inhibitors in inflammation. // Inflammation and Haemostasis. 2005. V. 33. P. 401-405.

69. Esmon C.T. Is APC activation of endothelial cell PARI important in severe sepsis?: No. //J. Thrombosis and Haemostasis. 2005. V.3. P. 1910-1911.

70. Faust S.N., Levin M., Harrison O.B., Goldin R.D., Lockhart M.S., Kondaveeti S., Lassik Z., Esmon C.T., Heyderman R.S. Disfunction of endothelial protein C activation in Severe meningococcal Sepsis. // N. Engl J Med. 2001. V.345. P. 408-416.

71. Feistritzer C., Riewald M. Endothelial barrier protection by activated protein C through PARI-dependent sphingosine 1-phosphate receptor-1 crossactivation. // Blood. 2005. V.105. P. 3178-3184.

72. Fisher M., Fernandez J.A., Ameriso S.F., Xie D., Gruber A., Paganini-Hill A., Griffin J.H. Activated protein C resistance in ischemic stroke not due to factor V arginine506-glutamine mutation. // Stroke. 1996. V.27 P. 1163-1166.

73. Forsythe P., Gilchrist M., Kulka M., Befus A.D. Mast cells and nitric oxide: control of production, mechanisms of response. // Int. Immunopharmacol. 2001. V.l (8). P.1525-1541.

74. Friedrich U., Blom A.M., Dahlba'ck B., Villoutreix B.O. Structural and energetic characteristics of the heparin-binding site in antithrombotic protein C. // J Biol Chem. 2001. V. 276. P. 24122-24128.

75. Fuentes-Prior P, Iwanaga Y, Huber R, Pagila R, Rumennik G, Seto M, Morser J, Light DR, Bode W. Structural basis for the anticoagulant activity of the thrombin-thrombomodulin complex. //Nature 2000. V. 404. P. 518-525.

76. Fukudome K., Esmon C.T. Identification, cloning, and regulation of a novel endothelial cell protein C/activated protein C receptor. // J Biol Chem. 1994. V.269. P. 26486-26491

77. Gabbasov Z.A., Popov E.G., Gavrilov I.Y., and Pozin E.Y. Platelet aggregation: the use of optical density fluctuations to study microaggregate formation in platelet suspension. // Thromb. Res. 1989. V. 54. P. 215-223.

78. Gaboury J.P., Niu X., and Kubes P. Nitric oxide inhibit numerous features of mast cell-induced inflammation. // Circulation. 1996. V.93. P. 318-324.

79. Gaboury J., Woodman R.C., Granger D.N., Reinhardt P. and Kubes P. Nitric oxide prevents leukocyte adherence: role of superoxide. // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 1993. V. 265. P. H862-H867.

80. Galli S.J., Zsebo K.M. and Geissler E.N. The kit ligand, stem cell factor. // Adv. Immunol. 1994. V. 55. P. 1-96.

81. Galli S.J. Mast cells and basophils. //Curr. Opin. Hematol. 2000. V. 7. P. 3239.

82. Galli S.J., Kalesnikoff J., Grimbaldeston M.A., Piliponsky A.M., Williams C.M.M., and Tsai M. Mast cells as "tunable" effector and immunoregulatory cells: recent Advances // Annu. Rev. Immunol. 2005. V. 23. P. 749-786.

83. Galligan L., Livingstone W., Volkov Y., Hokamp K., Murphy C., Lawler M., Fukudome K., and Smith 0. Characterization of protein C receptor expression in monocytes. // Br J Haematol. 2001. V.l 15. P.408-414.

84. Gallimore M., Friberger P. Chromogenic peptide substrate assays and their clinical appications // Blood Rev. 1991. N5. P. 117-127.

85. Gerlitz B., Grinnell B.W. Mutation of protease domain residues Lys37-39 in human protein C inhibits activation by the thrombomodulin-thrombin complex without affecting activation by free thrombin. // J Biol Chem 1996. V. 271. P. 22285-22288.

86. Gilchrist M., Savoie M., Nohara O., Wills F.L., Wallace J.L., and Befiis A.D. // Nitric oxide synthase and nitric oxide production in in v/vo-derived mast cells. // J. of Leukocyte Biology 2002. V. 71. P. 618-624.

87. Gilchrist M., McCauley S.D., Befiis A.D. Expression, localization and regulation of nitric oxide synthase (NOS) in human mast cell lines: effects on leukotriene production. // Blood. 2004. Epub Mar 25 V. 104. P. 462-469.

88. Gilfillan A.M. and Tkaczyk Ch. Integrated signalling pathways for mast-cell activation. // Nature reviews. 2006. V.6. P.218-230.

89. Glusa E., and Adam C. Endothelium-dependent relaxation induced by cathepsin G in porcine pulmonary arteries. // Br. J. Pharmacol. 2001. V. 133. P. 422-428.

90. Guo H, Liu D, Gelbard H, Cheng T, Insalaco R, Fernandez JA, Griffin JH, Zlokovic BV.Activated protein C prevents neuronal apoptosis via protease activated receptors 1 and3. //Neuron. 2004. V.41. P.563-572.

91. Hogaboam C., Befus A., and Wallace J. Modulation of rat mast cell reactivity by IL-1 beta. Divergent effects on nitric oxide and platelet-activating factor release. // J. Immunology. 1993. V.151. P.3767-3774.

92. Hollenberg M.D. Physiology and Pathophysiology of Proteinase-Activated Receptors (PARs): Proteinases as Hormone-Like Signal Messengers: PARs and More. // J Pharmacol Sci. 2005. V.97. P.8 13.

93. Hollenberg M.D., and Compton S.J. International Union of Pharmacology. XXVIII. Proteinase-activated receptors // Pharmacol. Rev. 2002. V. 54. P. 203-217.

94. Hou L., Howells G.L., Kapas S., Macey M.G. The protease-activated receptors and their cellular expression and function in blood-related cells. // Br J Haematol. 1998. V. 101. P. 1-9.

95. Hoxie J.A., Ahuja M., Belmonte E., Pizarro S., Parton R., and Brass L.F. Internalization and recycling of activated thrombin receptors. // J Biol Chem. 1993. V. 268. P.13756-13763.

96. Huang C., Sali A., and Stevens R.L. Regulation and function of mast cell proteases in inflammation. //J. Clin. Immunol. 1998. V. 18. P. 169-183.

97. Iikura M., Takaishi Т., Hirai K., Yamada H., Iida M., Koshino Т., and Morita Y. Exogenous nitric oxide regulates the degranulation of human basophils and rat peritoneal mast cells. // Int. Arch. Allergy Immunol. 1998. V. 115. P. 129-136.

98. Isobe H., Okajima K., Harada N., Liu W., Okabe H. Activated protein С reduces stress-induced gastric mucosal injury. // J Thromb Haemost. 2004. V. 2. P. 313320.

99. Joyce D.E., Gelbert L., Ciaccia A., DeHoff В., and Grinnell B.W. Gene Expression Profile of Antithrombotic Protein С Defines New Mechanisms Modulating Inflammation and Apoptosis // J. of Biological Chemistry. 2001. V. 276. P. 11199-11203.

100. Joyce D.E., Nelson D.R., Grinnell B.W. Leukocyte and endothelial cell interactions in sepsis: relevance of the protein С pathway. // Crit Care Med 2004. V. 32. P. S280-S286.

101. Kahn M.L., Nakanishi-Matsui M., Shapiro M.J., Ishihara H., and Coughlin S.R. Protease-activated receptors 1 and 4 mediate activation of human platelets by thrombin. // J Clin Invest. 1999. V.103. P. 879-887.

102. Kanwar S., Wallace J.L., Befus D., Kubes P. Nitric oxide synthesis inhibition increases epithelial permeability via mast cells. // Am J Physiol. 1994. V. 266. P. G222-G229.

103. Kaplan A.P. Chemokines, chemokine receptors and allergy. // Arch. Allergy Immunol. 2001. V. 124. P. 423-431.

104. Karin M., and Ben-Neriah Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control ofNF-kB activity. //Ann. Rev. Immunol., 2000 V. 18. P. 621-663.

105. Kawabata A. Gastrointestinal functions of proteinase-activated receptors. // Life Sci. 2003. V. 74. P. 247-254.

106. Kawabata A., Kuroda R., Nagata N., Kawao N., Masuko T., Nishikawa H., and Kawai K. In vivo evidence that protease-activated receptors 1 and 2 modulate gastrointestinal transit in the mouse. // Br J Pharmacol. 2001. V. 133. P. 1213-1218.

107. Kelley J.L., Chi D.S., Abou-Auda W., Smith K., and Krishnaswamy G. The molecular role of mast cells in atherosclerotic cardiovascular disease. // Mol. Med. Today, 2000. V. 6. P. 304-308.

108. Kitajima I., Kawahara K., Nakajima T., Soejima Y., Matsuyama T., Maruyama I. Nitric oxide-mediated apoptosis in murine mastocytoma. Biochem Biophys Res Commun. 1994. V. 204. P. 244-251.

109. Kong W., McConalogue K., Khitin L.M., Hollenberg M.D., Payan D.G., Böhm S.K., and Bunnett N.W. Luminal trypsin may regulate enterocytes through proteinase-activated receptor 2. // Proc Natl Acad Sei USA. 1997. V. 94. P. 8884-8889.

110. Koranteng R.D., Dearman R.J., Kimber I., Coleman J.W. Phenotypic variation in mast cell responsiveness to the inhibitory action of nitric oxide. Inflamm. Res. 2000. V.49. P. 240-246.

111. Krishnamurti C., Young G.D., Barr C.F., Colleton C.A., Alving B.M. Enhancement of tissue plasmin activator-induced fibrinolysis by activated protein C in endotoxin-treated rabbits. // J Lab Clin Med. 1991. V. 118. P. 523-530.

112. Kulka M., Befiis A.D. The dynamic and complex role of mast cells in allergic disease. // Arch Immunol Ther Exp (Warz). 2003. V.51. P. 111-120.

113. Kurosawa S., Esmon C.T., and Steams-Kurosawa D.J. The soluble endothelial protein C receptor binds to activated neutrophils: involvement of proteinase-3 and CD1 lb/CD18. // J. Immunol. 2000. V. 165. P. 4697-4703.

114. Laszik Z., Mitro A., Taylor F.B., Jr., Ferrell G., and Esmon C.T. Human protein C receptor is present primarily on endothelium of large blood vessels: implications for the control of the protein C pathway. // Circulation. 1997. V. 96. P. 3633-3640.

115. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. //Nature. 1970. Aug 15. V. 227 (5259). P. 680-685.

116. Levi M., Keller T.T., van Gorp E., and ten Cate H. Infection and inflammation and the coagulation system. // Cardiovasc. Res. 2003. V. 60. P. 26-39.

117. Levi M., Poll T., Büller H.R. Bidirectional Relation Between Inflammation and Coagulation// Circulation. 2004. V. 109. P. 2698-2704.

118. Lindahl U., Pejler G., Bogwald J., and Seljelid R. A prothrombinase complex of mouse peritoneal macrophages. // Arch. Biochem. Biophys., 1989. V.273. P.180-188.

119. Lindahl U. What else can 'Heparin' do? // Haemostasis. 1999. V.29. P. 38-47.

120. Lindner J.R., Kahn M.L., Coughlin S.R., Sambrono G.R., Schauble E., Bernstein D., Foy D., Afezi-Mogham A., and Ley K. Delayed onset of inflammation in protease-activated receptor-2-deficient mice. // J. Immunol. 2000. V.165. P.6504-6510.

121. Lindmark E., Tenno T., and Siegbahn A. Role of platelet P-selectin and CD40 ligand in the induction of monocytic tissue factor expression. // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., 2000. V.20. P.2322-2328.

122. Ludeman M.J., Kataoka H., Srinivasan Y., Esmon N., Esmon C.T. and Coughlin S.R. PARI cleavage and signaling in response to activated protein C and thrombin. // J Biol Chem. 2005. V. 280. P. 13122-13128.

123. Macfarlane S.R., Seatter M.J., Kanke T., Hunter G.D., Plevin R. Proteinase-activated receptors. // Pharmacol Rev. 2001. V.53. P.245-282.

124. Mach F., Schonbeck U., Sukhova G.K., Atkinson E., and Libby P. Reduction of atherosclerosis in mice by inhibition of CD40 signalling. // Nature. 1998. V. 394. P. 200-203.

125. Macias W.L., Dhainaut J.F., Yan S.C., Helterbrand J.D., Seger M., Johnson G.III, and Small D.S. // Clin. Pharmacol. Ther. 2002. V.72. P.391-402.

126. Macko R.F., Ameriso S.F., Gruber A., Griffin J.H., Fernandez J.A., Barndt R., Quismorio F.P.Jr, Weiner J.M., Fisher M. Impairments of the protein C system and fibrinolysis in infection-associated stroke. // Stroke. 1996. V.27. P. 2005-2011.

127. Macko R., Killewich L„ Fernandez J.A., Cox D.K., Gruber A., Griffin J.H. Brain specific protein C activation during carotid artery occlusion in humans. // Stroke. 1999. V. 30 P. 542-545

128. Major C.D., Santulli R.J., Derian C.K., Andrade-Gordon P. Extracellular mediators in atherosclerosis and thrombosis: lessons from thrombin receptor knockout mice. //Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2003 V. 23. P. 931-939.

129. Mann K.G., Brummel K., and Butenas S. What is all that thrombin for? // J. Thromb. Haemost. 2003. V.l. P.1504-1514.

130. Masini E., Mannioni P.F., Pistelli A., Salvemini D., and Vane. Impairment of the L-arginine-nitric oxide pathway in mast cells from spontaneously hypertensive rats. // J. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. V. 177. P. 1178-1182.

131. Mather T., Oganessyan V., Hof P., Huber R., Foundling S., Esmon C., Bode W. The 2.8 A crystal structure of Gla-domainless activated protein C. // Embo J 1996. V. 15. P. 6822-6831.

132. McCauley S.D., Gilchrist M., Befus A.D. Nitric oxide: a major determinant of mast cell phenotype and function // Mem Inst Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro. 2005. V. 100 (Suppl.I): P. 11-14.

133. Metcalfe D.D., Baram D. and Mekori Y.A. Mast cells. // Physiol. Rev. 1997. V. 77. P. 1033-1079.

134. Mirz H., Schmid V.A., Deria C.K., Jest J., and Baho W.F. // Blood. 1997. V.90. P. 3914-3922.

135. Mizutani A., Okajima K., Uchiba M., et al. Activated protein C reduces ischemia/reperfusion-induced renal injury in rats by inhibiting leukocyte activation. // Blood. 2000. V.95. P.3781-3787.

136. Molino M., Barnathan E.S., Numerof M., Clark J., Dreyer M., Cumashi A., Hoxi J.A., Schechter N., Woolkalis M., and Brass L.F. Interactions of mast cell tryptase with thrombin receptors and PAR-2. // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 4043-4049.

137. Mosnier L.O. and Griffin J.H. Inhibition of staurosporineinduced apoptosis of endothelial cells by activated protein C requires protease activated receptor-1 and endothelial cell protein C receptor. // J Biochem. 2003. V. 373. P. 65-70.

138. Mosnier L.O. and Griffin J.H. Protein C anticoagulant activity in relation to anti-inflammatory and anti-apoptotic activities. // Frontiers in Bioscience. 2006. V. 11. P. 2381-2399.

139. Morrow J.D., Oates J.A., Roberts L.J. 2nd, Zackert W.E., Mitchell T.A., Lazarus G., and Guzzo C. Increased formation of thromboxane in vivo in humans with mastocytosis. //J. Invest. Dermatol. 1999. V. 113. P. 93-97.

140. Murakami K, Okajima K, Uchiba M, et al. Activated protein C attenuates endotoxin-induced pulmonary vascular injury by inhibiting activated leukocytes in rats. // Blood. 1996. V. 87. P.642-647.

141. Nakamura M., Gabazza E.C., Imoto I., Yano Y., Taguchi O., Horiki N., Fukudome K., Suzuki K. and Adachi Y. Anti-inflammatory effect of activated protein C in gastric epithelial cells. // J. Thrombosis and Haemostasis. 2005. V. 3. P. 2721-2729.

142. Nakanishi-Matsui M., Zheng Y.W., Sulciner D.J., Weiss E.J., Ludeman M.J., and Coughlin S.R. //Nature. 2000. V. 404. P. 609-613.

143. Naldini A., Carney D.H., Pucci A., Pasquali A., Carraro F. Thrombin regulates the expression of proangiogenic cytokines via proteolytic activation of protease-activated receptor-1. // Gen. Pharmacol. 2000. V. 35(5). P.255-259.

144. Nathan C.F., Hibbs J.B. Role of nitric oxide synthesis in macrophage antimicrobial activity. // Curr. Opin. Immunol. 1991. V.3. P. 65-70.

145. Nelken N.A., Soifer S.J., O'Keefe J., Vu T.K., Charo I.F., Coughlin S.R. Thrombin receptor expression in normal and atherosclerotic human arteries. // J Clin Invest. 1992. V. 90. P. 1614-1621.

146. Nguyen M., Arkell J., and Jackson C. J. Activated protein C directly activates human endothelial gelatinase A. // J Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 9095-9098.

147. Nguyen T.D., Moody M.W., Steinhoff M., Okolo C., Koh D.S., and Bunnett N.W. Trypsin activate pancreatic duct epithelial cell ion channels through proteinase-activated receptor-2. // J Clin Invest. 1999. V.103. P. 261-269.

148. Nishikawa H., Kawabata A., Kuroda R., Nishida M., and Kawai K. Characterization of protease-activated receptors in rat peritoneal mast cells. // Japan J. Pharmacol. 2000. V.82. P. 74-77.

149. Nohara 0., Kulka Mio, Dery R.E., Wills F.L., Hirji N.S., Gilchrist M„ Befus A.D. Regulation of CD8 expression in mast cells by exogenous or endogenous nitric oxide. //JImmunol. 2001. V. 204. P. 5935-5939.

150. Nystedt S., Emilsson K., Wahlestedt C., Sundelin J. Molecular cloning of a potential proteinase activated receptor. // Proc Natl Acad Sci USA. 1994. V.91. P.9208-9212.

151. Oganesyan V., Oganesyan N., Terzyan S., Qu D., Dauter Z., Esmon N.L., Esmon C.T. The crystal structure of the endothelial protein C receptor and a bound phospholipid. J Biol Chem. 2002. V.277. P.24851-24854.

152. Oka S., Gabazza E.C., Taguchi Y., Yamaguchi M., Nakashima Sh., Suzuki K., Adachi Y. and Imoto I. Role of activated protein C on Helicobacter pylori-assosiated gastritis. // Infect Immun. 2000. V. 68 P. 2863-69.

153. Okabe H.S., Roth J.L., Pfeiffer C.J. A method for experimental, penetrating gastric and duodenal ulcers in rats. Observations on normal healing. // Amer. J. of Digestive disease. 1971. V.16 (3). P.277-284

154. Ossovskaya V.S., Bunnet N.W. Protease-activated receptors: contribution to physiology and disease. // Physiol Rev. 2004. V.84. P. 579-621.

155. O'Sullivan S. On the role of PGD2 metabolites as markers of mast cell activation in asthma//Acta Physiol. Scand. Suppl. 1999. V. 644. P. 1-74.

156. Palmer R.M., Ferrige A.G., Moncada S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. // Nature 1987. V. 327. P. 524526.

157. Pejler G. Procoagulant and anticoagulant activities of resident and inflammatory peritoneal cells // Inflamm. Res. 1999. V. 48. P. 344-350.

158. Pemberton A.D., Zamolodchikova T.S., Scudamore C.L., Chilvers E.R., Miller H.R. and Walker T.R. Proteolytic action of duodenase is required to induce DNA synthesis in pulmonary artery fibroblasts // Eur. J. Biochem. 2002. V. 269. P. 1171-1180.

159. Pierce K.L., Lefkowitz R.J. Classical and new roles of P-arrestins in the regulation of G-protein-coupled receptors. // Nature Reviews. Neuroscience. 2001. V. 2. P.727-733.

160. Plescia J., and Altieri D. Activation of Mac-1 (CD1 lb/CD 18)-bound factor X by released cathepsin G defines an alternative pathway of leucocyte initiation of coagulation. // Biochem. J. 1996. V.319. P. 873-879.

161. Pletnev V.Z., Zamolodchikova T.S., Pangborn W.A. and Daux W.L. Crystal structure of bovine duodenase, a serine protease, with dual trypsin and chymotrypsin-like specificities // Proteins. 2000. V. 41. P. 8-16.

162. Ravanti L. and Kahari V.M. Matrix metalloproteinases in wound repair (review). // Int. J Mol. Med. 2000. V. 6. P. 391-407.

163. Rezaie A.R. Exosite-dependent regulation of the protein C anticoagulant pathway. // Trends in Cardiovascular Medicine. 2003. V. 13. P. 8-15.

164. Riewald M., Petrovan R.J., Donner A., Mueller B.M., Ruf W. Activation of Endothelial Cell Protease Activated Receptor 1 by the Protein C Pathway. // Science. 2002. V. 296. P. 1880-1882.

165. Riewald M., Petrovan R.J., Donner A., Ruf W. Activated protein C signals through the thrombin receptor PARI in endothelial cells.// J. Endotoxin. Res. 2003. V. 9. P. 317-321.

166. Riewald M. and Ruf W. Mechanistic coupling of protease signaling and initiation of coagulation by tissue factor. // Proc Natl Acad Sci USA. 2001. V.98. P.7742-7747.

167. Riewald M. and Ruf W. Protease-activated Receptor-1 Signaling by Activated Protein C in Cytokine-perturbed Endothelial Cells Is Distinct from Thrombin Signaling. // J. of Biological Chemistry. 2005. V. 280. P. 19808-19814.

168. Ruf W., Dorfleutner A., Riewald M.J. Specificity of coagulation factor signaling // J. Thromb. Haemost. 2003. V. 1. P. 1495-1503.

169. Ruf W. Protease-activated receptor signaling in the regulation of inflammation. // Crit Care Med. 2004. V. 32. P. S287-S292.

170. Saito T. and Bunnett N.W. Regulation of Neuronal Function // NeuroMolecular Medicine. 2005. V.7. P.79-99.

171. Sambrano G.R., Huang W., Faruqi T., Mahrus S., Craik C., and Coughlin S.R. Cathepsin G activate protease-activated receptor-4 in human platelets. // J Biol Chem. 2000. V. 275. P. 6819-6823.

172. Schechter N.M., Brass L.F., Lavker R.M., and Jensen P.J. Reaction of mast cell proteases tryptase and chymase with protease activated receptors (PARs) on keratinocytes and fibroblasts. // J. Cell Physiol. 1998. V. 176. P. 365-373.

173. Scheffer G.L., Flens M.J., Hageman S., Izquierdo M.A., Shoemaker R.H., Scheper R.J. Expression of the vascular endothelial cell protein C receptor in epithelial tumour cells. // Eur J Cancer. 2002. V. 38. P. 1535-1542.

174. Okajima K., Koga S., Kaji M., Inoue M., Nakagaki T., Funatsu A., Okabe H., Takatsuki K., Aoki N. Effect of protein C and activated protein C on coagulation and fibrinolysis in normal human subjects. // Thromb Haemost 1990. V.63. P. 48-53

175. Slungaard A., Key N.S. Platelet factor 4 stimulates thrombomodulin protein C-activating cofactor activity. A structure-function analysis. // J Biol Chem. 1994. V. 269. P. 25549-25556

176. Slungaard A. Platelet factor 4 modulation of the thrombomodulin-protein C system. // Crit Care Med. 2004. V.32. P. S331-S335.

177. Stiernberg J., Redin W.R., Warner W.S., Carney D.H. The role of thrombin and thrombin receptor activating peptide (TRAP-508) in initiation of tissue repair // Thromb. Haemost. 1993 V.70. P.158-162.

178. Steinhoff M., Corvera C.U., Thoma M.S., Kong W., McAlpine B.E., Caughey

179. G.H., Ansel J.C., and Bunnett N.W. Proteinase-activated receptor-2 in human skin: tissue distribution and activation of keratinocytes by mast cell tryptase. // Exp. Dermatol. 1999. V.8. P.282-294.

180. Steinhoff M., Vergnolle N., Young S.H., Tognetto M., Amadesi S., Ennes

181. Strukova S.M., Dugina T.N., Khlgatian S.V., Redkozubov A.E., Redkozubova G.P., and Pinelis V.G. Thrombin-mediated events implicated in mast cell activation. // Semin. Thromb. Hemost. 1996. V.22. P. 145-150.

182. Strukova S.M., Chistov I.V., Umarova B.A., Dugina T.N., Storozhevykh, T.P. Pinelis V.G., and Glusa E. Modulation of Mast Cell Activity by a Peptide Agonist of the Thrombin Receptor: Role of Nitric Oxide. // Biochemistry. 1999. V. 64. P. 658-664.

183. Strukova S.M., Dugina T.N., Chistov I.V. Lange M., Markvicheva E.A., Kuptsova S., Zubov V.P., Glusa E. Immobilized thrombin receptor agonist peptide accelerates wound healing in mice. // Clin. Appl. Thromb. Hemost. 2001. V.7, P. 325-329.

184. Strukova S. Blood coagulation-dependent inflammation. Coagulation-dependent inflammation and inflammation-dependent thrombosis // Front. Biosci. 2006. V. 11. P. 59-80.

185. Takano S., Kimura S., Ohdama S. and Aoki N. Plasma thrombomodulin in health and diseases. // Blood. 1990. V. 76. P. 2024-2029.

186. Tarnawski A.S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing // Dig. Dis. Sci. 2005. V.50. P. S24-S33.

187. Taylor Jr, F.B., Peer G.T., Lockhart M.S., Ferrell G. and Esmon C.T. Endothelial cell protein C receptor plays an important role in protein C activation in vivo. //Blood. 2001. V. 97. P. 1685-1688.

188. Thon I.L., Uvnas B. Degranulation and histamine release, two consecutive steps in the response of rat mast cells to compound 48/80. // Acta. Physiol. Scand. 1967. V. 71(4). P. 303-315.

189. Uehara A., Muramoto K., Takada H., and Sugawara S. Neutrophil serine proteinases activate human nonepithelial cells to produce inflammatory cytokines through protease-activated receptor 2. // J Immunol. 2003. V. 170. P. 5690-5696.

190. Uchiba M., Okajima K., Oike Y., et al. Activated protein C induces endothelial cell proliferation by mitogen- activated protein kinase activation in vitro and angiogenesis in vivo. // Circ Res. 2004. V.95. P.34-41.

191. Valent P., Sillaber C., Baghestanian M., Bankl H.C., Kiener H.P., Lechner K. and Binder B.R. What have mast cells to do with edema formation, the consecutive repair and fibrinolysis? // Int.Arch Allergy Immunol. 1998. V. 115(1). P. 2-8.

192. Van de Wouwer M., Collen D., Conway E. Thrombomodulin protein C -EPCR system: integrated to regulate coagulation and inflammation. // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2004. V. 24. P. 1374.

193. Vergnolle N. Proteinase-activated receptor-2-activating peptides induce leukocyte rolling, adhesion, and extravasation in vivo. // J. Immunol., 1999. V. 163. P. 5064-5069.

194. Vergnolle N. Review article: proteinase-activated receptors: novel signals for gastrointestinal pathophysiology // Aliment Pharmacol Ther. 2000.V. 14. P. 257-266.

195. Villoutreix B.O., Covell D.G., Blom A.M., Wallqvist A., Friedrich U., Dahlback B. Screening the molecular surface of human anticoagulant protein C: A search for interaction sites. // J. of Computer-Aided Molecular Design. 2001. V. 15. P. 13-27.

196. Vu T.K., Hung D.T., Wheaton V.I., Coughlin S.R. Molecular cloning of a functional thrombin receptor reveals a novel proteolytic mechanism of receptor activation. //Cell. 1991. V. 64. P.1057-1068.

197. Wedemeyer J., Tsai M., and Galli S.J. Roles of mast cells and basophils in innate and acquired immunity. // Curr. Opin. Hematol. 2000. V.12. P. 624-631.

198. Wills F.L., Gilchrist M., Befus A.D. Interferon-gamma regulates the interaction of RBL-2H3 cells with fibronectin through production of nitric oxide. // Immunology. 1999. V.97. P.481-489.

199. Witt I. Test systems with synthetic peptide substrates in haemostaseology // Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1991. N29. P.355-374.

200. Xu W.F., Andersen H., Whitmore T.E., Presnell S.R., Yee D.P., Ching A., Gilbert T., Davie E.W., and Foster D.C. Cloning and characterization of human protease-activated receptor 4. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998. V. 95. P.6642-6646.

201. Xue M., Campbell D. and Jackson Ch.J. Protein C is an autocrine rowth factor for human skin keratinocytes. // J. of Biological Chemistry. Published on February 9,2007.

202. Xue M., Thompson P., Kelso I., and Jackson C. Activated protein C stimulates proliferation, migration and wound closure, inhibits apoptosis and upregulates MMP-2 activity in cultured human keratinocytes. // Exp Cell Res. 2004. V.299. P. 119127.

203. Yang P.C., Berin M.C., Yu L., and Perdue M.H. Mucosal pathophysiology and inflammatory changes in the late phase of the intestinal allergic reaction in the rat. // Am J Pathol 2001. V.158. P. 681-690.

204. Yeadon M., Price R. Induction of calcium-independent nitric oxide synthase by allergen challenge in sensitized rat lung in vivo. // Br. J. Pharmacol. 1995. V.116. P. 2545-2546.

205. Zamolodchikova T.S., Sokolova E.A., Lu D., end Sadler J.E. Activation of recombinant proenteropeptidase by duodenase // FEBS Lett. 2000. V. 466. P. 295-299.

Информация о работе

Макарова, Анастасия Михайловна
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.13

Диссертация

Протекторное действие активированного протеина С при воспалении и репарации тканей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы