Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение воздействия рекомбинантного интерлейкина-1β человека на заживление осложненной кожной раны и язвы желудка

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Изучение воздействия рекомбинантного интерлейкина-1β человека на заживление осложненной кожной раны и язвы желудка"

На правах рукописи

АЛЕКСАНДРОВ Георгий Вячеславович

ИЗУЧЕНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА-1р ЧЕЛОВЕКА НА ЗАЖИВЛЕНИЕ ОСЛОЖНЕННОЙ КОЖНОЙ РАНЫ И ЯЗВЫ ЖЕЛУДКА

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

11 АПР ¿013

Санкт - Петербург 2013

005051609

Работа выполнена в лаборатории иммунофармакологии Федерального государственного унитарного предприятия "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства Российской Федерации.

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор,

Директор Федерального государственного унитарного предприятия

"Государственный научно-исследовательский институт

особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического

агентства Российской Федерации Симбирцев Андрей Семенович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор, Заведующий лабораторией электронной микроскопии научно-исследовательского центра Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский Государственный медицинский университет имени акад. И. П. Павлова"

Министерства здравоохранения Российской Федерации, Неворотин Алексей Иосифович

Доктор медицинских наук, профессор, Заведующий кафедрой гистологии с курсом эмбриологии Федерального государственного казенного военного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Военно-медицинская академия имени. С.М. Кирова"

Министерства обороны Российской Федерации, Одинцова Ирина Алексеевна

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение Высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится 23 апреля 2013г. в Аг часов_минут на заседании

Диссертационного совета Д.001.022.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" СевероЗападного отделения Российской академии медицинских наук по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

Автореферат разослан " гл " марта 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета Доктор медицинских наук

Дыбан П.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Нарушения репаратнвных функций кожи и желудочно-кишечного тракта, а также роль цитокинов в этих процессах, являются серьезной и до конца не решенной проблемой современной клеточной биологии и медицины. Так, только трофическими язвами на фоне венозной недостаточности поражено порядка 2% трудоспособного населения развитых стран, а язвенные поражения желудка наблюдаются у 7 - 10% взрослого населения по всему миру. Во многих случаях, применение стандартных средств терапии и хирургических методов лечения, как язвенных поражений желудка, так и незаживающих кожных ран не приводят к полному выздоровлению больных, а также сопровождаются значительным количеством рецидивов.

Известно, что локальное применение рекомбинантных цитокинов и ростовых факторов в качестве агентов стимулирующих заживление в ряде случаев приводит к значительным терапевтическим успехам при лечении язвенных поражений желудка и незаживающих кожных ран, как в экспериментальных исследованиях, так и в клинической практике (Steed D., 1995; Yoshida S. et al., 2004; Wallace J. et al., 2006; Dudar G. et al., 2008; Femândez-Montequin J., 2009).

К настоящему моменту показано, что уровень IL-1 значительно повышен в успешно заживающей кожной ране (Wang J., et al., 2009). В течение репаративного процесса IL-1 как прямо, так и опосредованно через индукцию синтеза других цитокинов, может стимулировать пролиферативную и синтетическую активность всех основных клеточных типов, участвующих в процессе заживления кожной раны (Kozlowska U. et al., 1998; Maas-Szabowski N. et al., 2000; Yano S. et al., 2008). He менее важные функции принадлежат IL-1 и в поддержании гомеостаза желудочного эпителия. Известно, что IL-1 стимулирует продукцию простагландина-Е2 клетками слизистой оболочки, снижает продукцию кислоты париетальными клетками, стимулирует продукцию ростовых факторов, играющих важную роль в репарации слизистой желудка. Более того, было показано, что специфическое блокирование IL-1 в области поражения приводит к значительному замедлению в репарации экспериментальной язвы желудка (Schepp W. et al., 1998; Takahashi S. et al., 1999; Lindstrôm E. et al., 2001; Miura S. et al., 2004). Клинические данные демонстрируют значительный терапевтический эффект при системном введении IL-ip пациентам с язвенной болезнью желудка (Долгушина А., 2003). Таким образом, дальнейшее

изучение роли 1Ь-1 в процессах репарации представляется достаточно актуальной задачей имеющей важное теоретическое и практическое значение.

Цель работы: Изучение местного воздействия рекомбинантного 1Ь-1р человека на интенсивность заживления осложненной кожной раны и язвенного поражения желудка.

Задачи исследования:

1. Разработать экспериментальную модель осложненной кожной раны с использованием гидрокортизона, в качестве агента осложняющего заживление, описать морфологические изменения в развитии раневого процесса характерные для полученной модели.

2. Используя модель, изучить ранозаживляющую активность мазевой формы рекомбинантного ГИр, а также оценить воздействие цитокина на развитие раневого процесса для выяснения клеточных механизмов его ранозаживляющего действия.

3. На модели кислотной язвы желудка крысы оценить язвозаживляющую активность рекомбинантного 1Ь-1р при местном внутрижелудочном введении, выявить клеточные механизмы действия цитокина.

4. Оценить состояние лейкоцитарной формулы крови и цитологических параметров селезенки экспериментальных животных, как показателей возможного системного действия мазевой формы и раствора рекомбинантного 1Ь-1р.

Научная новизна. Разработана и подробно описана новая модель осложненной кожной раны, с использованием гидрокортизона в качестве агента замедляющего репаративный процесс. В результате исследований проведенных на разработанной модели, впервые показано выраженное ранозаживляющее воздействие рекомбинантного 1Ь-1р человека на осложненную кожную рану. Показано, что ускорение в заживлении осложненной раны происходит за счет усиления эпителизации, увеличения клеточности грануляционной ткани, а также ускорения ремоделирования грануляционной ткани под действием рекомбинантного П.-1р.

Впервые показано, что раствор рекомбинантного 1Ъ-1р, при его внутрижелудочном введении, значительно снижает площадь экспериментальной язвы желудка крысы. Одним из механизмов язвозаживляющего действия препарата является усиление лейкоцитарной инфильтрации и функциональной активности лейкоцитов в области поражения.

Эксперименты показали, что локальное применение рекомбинантного 11,-10 в составе мазевой формы или содового раствора не оказывает достоверного воздействия на массу и клеточный состав селезенки, а также формулу периферической крови экспериментальных животных, что говорит об отсутствии значимого системного эффекта выбранных доз и курсов введения препарата.

Теоретическое и практическое значение. В процессе работы создана модель осложненной кожной раны, пригодная для оценки эффективности ранозаживляющих препаратов. Результаты исследования расширяют и дополняют современные представления о роли 11,-1 в процессах регуляции гомеостаза и репарации покровного и желудочного эпителиев. Полученные данные могут послужить основой при разработке новых препаратов для лечения не заживающих кожных ран, а также язв желудка с использованием рекомбинантного 11,-10 человека.

Результаты диссертационной работы используются в работе Федерального государственного унитарного предприятия "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства Российской Федерации по созданию новых лекарственных препаратов на основе рекомбинантных цитокинов. По результатам работы получено 2 государственных патента на изобретения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Мазевая форма рекомбинантного 11,-10 человека усиливает эпителизацию и развитие грануляционной ткани на модели осложненной кожной раны мыши, что приводит к значительному увеличению интенсивности заживления.

2. Внутрижелудочное введение раствора рекомбинантного П.-10 человека приводит к значительному увеличению количества и функциональной активности лейкоцитарного инфильтрата в области поражения на модели кислотной язвы желудка крысы, эффект сопровождается значительным снижением площади поражения, по сравнению с контрольной группой.

3. Мазевая форма и раствор рекомбинантного 11,-10 не оказывают значительного воздействия на лейкоцитарную формулу крови и цитологические параметры селезенки.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на всероссийском форуме с международным участием им. Академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», Санкт-Петербург 21-24 мая 2001 г.; международной научно-практической конференции « Цитокины. Воспаление.

Иммунитет», Санкт-Петербург, 23-26 июня 2002г.; Fifth John Humphrey Advanced Summer Programme and Lecture Series in Immunology «Immunology in Health and Disease» Pushchino, Russia, 17-22 September 2002.; всероссийской конференции «Молекулярные основы иммунорегуляции иммунодиагностики и иммунотерапии», Санкт-Петербург, 23-26 июня, 2003.;У1П конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», Москва, 27-29 июня 2007.; объединенном иммунологическом форуме, Санкт-Петербург, 30 июня - 5 июля 2008г.; всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» Санкт-Петербург, 21-22 декабря 2010г.; XIV всероссийском форуме с международным участием им. Академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» 23-26 мая 2011г.

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 16 публикациях, из которых 7 статей опубликованы в журналах входящих в утвержденный ВАК перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий.

Патенты. По результатам работ получены 2 государственных патента на изобретения.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Объём диссертации составляет 153 страницы печатного текста, работа содержит 22 таблицы, 11 рисунков, 9 схем и 7 графиков. Список использованной литературы состоит из 11 отечественных и 283 зарубежных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Экспериментальные животные. В экспериментах по разработке модели осложненной кожной раны и изучению ранозаживляющего действия рекомбинантного IL-ip человека было использовано 398 белых нелинейных мышей. В экспериментах по изучению язвозаживляющего действия рекомбинантного IL-1 f? человека было использовано 53 крысы Вистар. Протоколы экспериментальных исследований, порядок анестезии и эвтаназии экспериментальных животных были одобрены на заседании Комиссии по Биоэтике при ФГУП ГОС НИИ ОЧБ от 25 января 2002 года.

Оперативные вмешательства. Кожные раны наносили на спинной поверхности мыши с помощью инструмента Acu-Punch (Acuderm inc. США). Язву

желудка крыс моделировали с помощью внутрижелудочной аппликации 60% уксусной кислоты по Tsukimi Y., Okabe S. 1994, с небольшими изменениями.

Использованные препараты. Для осложнения заживления кожных ран мышей был использован ацетат гидрокортизона (Гедеон-Рихтер, Венгрия). Рекомбинантный IL-lß человека был разработан и произведен ФГУП ГОС НИИ ОЧБ. В экспериментах с кожными ранами применяли мазевую форму препарата, содержащую 50 нанограмм IL-lß на 1 миллилитр вазелин-ланолиновой основы. В экспериментах с язвами желудка крыс применяли жидкую форму, содержащую IL-lß в дозах 10 и 100 нг на 1мл 4% раствора соды в воде.

Измерение площадей ран и язв производили по фотографиям с помощью программы ImageJ (National Institutes of Health, CLUA). Площадь кожных ран, измеряемую в течение эксперимента, выражали в процентах от исходной площади поражения, принятой за 100%. Площадь язв желудка выражали в квадратных миллиметрах.

Гистологические исследования. Кожные раны иссекали, фиксировали в жидкости Буэна и после спиртовой проводки заливали в Paraplast Plus (Sigma, США). Язвы желудка иссекали, фиксировали в 10% формалине и также заливали в Paraplast Plus. Из парапластовых блоков изготовляли срезы толщиной 5мкм так, чтобы плоскость среза проходила через центр раны или язвы перпендикулярно к ее поверхности. Срезы ран окрашивали по методу Массона, срезы язв желудка Гематоксилином - Эозином. Препараты изучали на световом микроскопе DMLB (Leica Microsystems AG, Германия). Морфометрические измерения проводили с помощью программы ImageJ. На препаратах ран измеряли длину новообразованного эпителия и ширину раны, по которым рассчитывали интенсивность эпителизации -отношение длины эпителия к ширине раны, выраженное в процентах. Количество клеток в грануляционной ткани ран просчитывали в 4-х полях зрения на каждом препарате, при увеличении в 1000 раз. На препаратах язв измеряли ширину язвенных дефектов и выражали ее в микрометрах.

Гистохимические исследования. Язвы желудка иссекали, замораживали в жидком азоте и изготовляли срезы толщиной 10 мкм. Нейтрофилы выявляли окрашиванием на миелопероксидазу с помощью 3,3'-диаминобензидин тетрагидрохлорида и перекиси водорода по рекомендациям Лойда (Лойда и др., 1982). Активированные нейтрофилы выявляли по их пероксидазной активности, окрашиванием на эндогенную перекись водорода с помощью 3,3'-диаминобензидин

тетрагидрохлорида и глюкозы по рекомендациям Dannenberg (Dannenberg А., et al., 1994). Макрофаги выявляли окрашиванием на неспецифическую эстеразу макрофагов 1-нафтилацетатом 340, с добавлением прочного синего В по рекомендациям Лойда (Лойда и др., 1982). Подсчет клеток проводили в 5 полях зрения на 5 срезах от каждого образца.

Оценка лейкоцитарной формулы крови. Взятие крови у мышей и крыс осуществляли при декапитации. Лейкоциты окрашивали кристалл-виолетом и подсчитывали в камере Горяева. Для подсчета типов лейкоцитов изготовляли мазки крови, которые окрашивали по методу Романовского. Подсчитывали 200 случайных клеток при увеличении в 1000 раз.

Оценка состояния селезенки. Селезенки взвешивали, относительный вес рассчитывали как процент от общего веса животного. Количество спленоцитов подсчитывали в камере Горяева после механической гомогенизации. Для подсчета типов спленоцитов изготовляли мазки гомогената, которые окрашивали по методу Романовского. Подсчитывали последовательно 200 случайных клеток при увеличении в 1000 раз.

Разработка модели осложненной кожной раны мыши была проведена в серии из трех экспериментов. Во всех экспериментах раны наносили всем животным по стандартной схеме.

В первом эксперименте все животные были разделены на 4 равные группы, получавшие инъекции гидрокортизона в дозах 5, 10, 25 и 40 мг на килограмм веса и контрольную группу, получавшую физиологический раствор. Инъекции проводили в день ранения (обозначен как 0-й день эксперимента) и далее ежедневно. Площадь ран измеряли в день нанесения ранения, а также на 6-й и 9-й дни эксперимента.

Во втором эксперименте животные были разделены на 2 группы, получавшую гидрокортизон в дозе 25мг/кг и контрольную, не получавшую инъекций. Гидрокортизон вводили за день до ранения и далее ежедневно. Площадь ран измеряли в день нанесения ранения, а также на 3,5,7,9 и 12-й дни эксперимента.

В третьем эксперименте схема опыта была аналогична второму эксперименту, но помимо планиметрических измерений в день нанесения ранения, а также на 3,5,7,9,11 и 13 дни эксперимента проводили забой 4-5 животных в каждой группе для взятия образцов крови, селезенки и кожных ран.

Изучение ранозаживляющего действия рекомбинантного 1Ь-1р человека на модели осложненной кожной раны мыши было проведено в серии из двух экспериментов. Раны наносили всем животным по стандартной схеме. Гидрокортизон в дозе 25мг/кг вводили всем животным за день до нанесения ранения и далее ежедневно.

В первом эксперименте животные были разделены на 2 группы. Контрольной группе со следующего дня после ранения и ежедневно на рану наносили мазевую основу без 1Ь-1. Опытной группе со следующего дня после ранения на рану наносили мазь, содержащую 50 нг/мл рекомбинантного 1Ь-1Р человека. В день нанесения ранения, а также на 3,5,7,9,11 и 13 дни эксперимента раны измеряли и забивали по 4-5 животных в каждой группе, для взятия образцов крови, селезенки и кожных ран для гистологического исследования.

Во втором эксперименте схема опыта была аналогична предыдущему эксперименту, отсутствовало гистологическое исследование.

Изучение язвозаживляющего действия рекомбинантного 1Ь-1р человека на модели язвы желудка крысы было проведено в серии из трех экспериментов. Язвы желудка индуцировали всем животным по методу ТвиИпи У., ОкаЬе Б. 1994. День индукции язвы обозначали как 0-й, все терапевтические воздействия проводили, начиная с 3-го дня после индукции язвы. Введения препаратов и растворов проводили один раз в день путем внутрижелудочного вливания через зонд, в объеме 1 миллилитр.

В первом эксперименте животные были разделены на три равные группы. Контрольная группа с 3-го по 5-й день эксперимента, ежедневно получала 1 миллилитр 4% содового раствора. Две опытные группы в те же сроки получали 1 мл 4% содового раствора, содержащего рекомбинантный 1Ь-1р в дозах 10 и 100 нг/мл соответственно. На 6-й день животных забивали, измеряли площадь язв, брали кровь и иссекали язвы.

Второй эксперимент проходил в два этапа. На первом этапе животных разделили на две группы. Контрольной группе на 3-й день эксперимента ввели 1 мл 4% содового раствора. Опытной группе в то же время ввели 1 мл 4% содового раствора, содержащего рекомбинантный 1Ь-1р в дозе 100 нг/мл. В последующие дни введения препарата не проводили. На 6-й день животных забивали, измеряли площадь язв и забирали образцы крови. На втором этапе животные также были разделены на две группы. Контрольная группа с 3-го по 5-й день эксперимента, ежедневно получала 1

мл 4% содового раствора. Опытная группа в те же сроки получала 1 мл 4% содового раствора, содержащего рекомбинантный ГЬ-1[5 в дозе 100 нг/мл. На 6-й день эксперимента животных забивали, измеряли площадь язв и брали образцы крови. В третьем эксперименте животные были разделены на три группы. Первая группа с 3-го по 5-й день эксперимента, ежедневно получала 1 мл 4% содового раствора. Вторая группа в те же сроки получала дистиллированную воду. Третья группа в те же сроки получала 1 мл 4% содового раствора, содержащего рекомбинантный 1Ь-1р в дозе 100 нг/мл. На 6-й день животных забивали и иссекали язвы для гистохимического исследования.

Статистический анализ. Сравнение данных выполняли с использованием I критерия Стьюдента и критерия Манна-Уитни. Различия считались статистически достоверными при р<0.05. Данные в таблицах представлены в виде средних значений ± ошибка среднего.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Разработка и описание модели осложненной кожной раны мыши.

Первая часть исследования была проведена для разработки модели осложненной кожной раны мыши, пригодной для тестирования ранозаживляющей активности нашего препарата.

В первом эксперименте была подобрана доза гидрокортизона в 25мг/кг достоверно замедляющую заживление кожной раны мыши при ежедневном введении. Большая доза вызывала увеличение площади раны и гибель животных, меньшие дозы не оказывали значительного эффекта на заживление ран.

Во втором и третьем экспериментах была изучена динамика заживления и гистологические изменения в ранах, а также иммунологические эффекты дозы гидрокортизона в 25 мг/кг. Планиметрические исследования показали, что в обоих экспериментах с 3-го и во все последующие дни измерений, относительная площадь ран в группе получавшей гидрокортизон, была значительно выше по сравнению с контролем (Табл. 1). Гистологическое исследование, выявило значительное снижение в интенсивности эпителизации и разрастании грануляционной ткани, под действием гидрокортизона начиная с 5-го дня эксперимента (Рис. 1). Морфометрический анализ показал достоверное снижение интенсивности эпителизации (Рис. 2.А) и количества клеток в грануляционной ткани (Рис. 2.Б). Анализ лейкоцитарной формулы крови выявил значительную лимфопению и нейтрофилию под действием гидрокортизона,

начиная с 3-го дня эксперимента (Рис.3). Анализ состояния селезенки показал достоверное снижение ее веса, а также общего количества спленоцитов, начиная с 3-го дня и на протяжении всего эксперимента. Различия в процентном соотношении различных типов спленоцитов отсутствовали.

Таблица!

Изменение площади раневой поверхности в третьем модельном эксперименте.

Дни эксперимента. Контроль Гидрокортизон

0 день 100 100

3 день 53,2±1,9 64,5±2,0 ***

5 день 35,2±2,0 50,6±2,3 ***

7 день 20,0±2,1 35,3±2,2 ***

9 день 7,6±1,8 27,2±2,3 ***

11 день 3,8±2,4 20,9±2,9 ***

13 день 0 11,5±2,8 ***

Площади ран, выражены в процентах от исходной площади. *** - различия достоверны по сравнению с контролем, р<0,001 (п=8-61).

Контрольная группа Дни Гидрокортизоновая группа

Рисунок 1. Срезы ран животных гидрокортизоновой и контрольной групп, на 5-й, 7-й, 9-й и 13-й дни эксперимента. Новообразованный эпителий отмечен грануляционная ткань -ГТ, интактная дерма - ИД; увеличение Х-160; Окраска по методу Массона.

В Гидрокортизоновая группа. □ Контрольная группа.

5 7 9 11 Дни после ранения

13

12

а

о н 300

ч а В! а 250

о а я о 200

ч о го о 150

а <и Ч О 100

» 03 50

а. 0

и

Б

■ Гидрокортизоновая группа. □ Контрольная группа.

5 7 9 11 Дни после ранения

13

Рисунок 2. А. Интенсивность эпителизации кожных ран в гидрокортизоновой (ГК) и контрольной группах в течение эксперимента. * - различия между группами достоверны, р<0,05. Б. Количество клеток в грануляционной ткани кожных ран гидрокортизоновой (ГК) и контрольной групп в течение эксперимента. * - различия между группами достоверны р<0,01.

° Контроль Лимфоциты

Гидрокортизон Лимфоциты —Гидрокортизон Нейтрофилы —^Контроль Нейтрофилы

в С

V

г а

1 §

2 з ^ -

3 I

ю х

I ® ё ч

3

о с. С

100 п

75 50 -25 ~ 0

5 7 9 11

Дни эксперимента

13

Рисунок 3. Процентное содержание нейтрофилов и лимфоцитов в периферической крови. * ■ различия между группами достоверны, р<0,01.

Таким образом, в первой части эксперимента была разработана и описана модель осложненной кожной раны мыши, с применением гидрокортизона в дозе 25мг/кг в качестве агента замедляющего заживление. Показано, что ежедневное введение гидрокортизона в выбранной дозе, значительно замедляет процессы эпителизации и роста грануляционной ткани. Кроме того, было показано, что гидрокортизон в дозе 25мг/кг снижает количество спленоцитов, вызывает лимфопению и нейтрофилию периферической крови.

Изучение ранозаживляющего действия рекомбинантного 1Ь-!р

человека на модели осложненной кожной раны мыши.

Возможность применения 1Ь-1 для стимуляции раневой репарации обусловлена целым рядом свойств цитокина, однако мощная провоспалительная активность в значительной мере ограничивает перспективы его клинического использования. Мы предположили, что нанесение мазевой формы препарата непосредственно на поверхность осложненной раны не только ускорит заживление но и не вызовет побочных реакций, которые развиваются при системном введении 1Ь-1. В серии из двух экспериментов мы оценили эффект ежедневного нанесения мазевой формы рекомбинантного II .-1Р человека в дозе 50нг/мл на интенсивность заживления ран осложненных ежедневным введением гидрокортизона в дозе 25 мг/кг. Планиметрическое исследование, проведенное в обоих экспериментах, показало, что начиная с 3-го и на все последующие дни измерений, относительная площадь ран в группе получавшей II.-ф была достоверно ниже, по сравнению с группой получавшей мазевую основу без препарата (Табл. 2).

Таблица 2

Изменение площади раневой поверхности в первом мазевом эксперименте.

Дни эксперимента. Контроль 1Ь-1(!

0 день 100 100

3 день 69,01 ±2,24 58,24±1,77***

5 день 60,55±2,32 49,57±1,97***

7 день 47,95±3,39 32,47+1,89***

9 день 30,67±3,32 17,82+2,19**

11 день 19,44±2,67 8,55±3,21*

13 день 15,47+4,00 0

Площади ран выражены в процентах от исходной площади. * - различия достоверны по сравнению с контролем, р<0,05; ** - различия достоверны по сравнению с контролем, р<0,01; *** - различия достоверны по сравнению с контролем, р<0,001; п=4-50.

Гистологическое исследование показало более интенсивное развитие эпителизации и грануляционной ткани в группе получавшей 1Ь-1Р (Рис.4). Морфометрический анализ показал выраженную тенденцию к усилению эпителизации под действием 1Ь-1р начиная с 5-го дня эксперимента. На 7-й и 13-й дни эксперимента тенденция носит статистически достоверный характер (Рис. 5.А). Подсчет количества клеток в грануляционной ткани показал достоверное увеличение

данного параметра в опытной группе по сравнению с контролем на 5-й и 9-й дни эксперимента (Рис. 5.Б).

Рисунок 4. Срезы ран животных опытной (11.-115) и контрольной групп, на 5-й и 9-й дни эксперимента. Новообразованный эпителий отмечен увеличение Х-40. Окраска по методу Массона.

3 Группа 1Ь1р. □ Контрольная группа.

5 120

В Группа 1Ыр. □ Контрольная группа.

11

Дни после ранения

7 9 Дни после ранения

Контрольная группа Дни Группа ИЛ1-Р

Анализ лейкоцитарной формулы крови выявил значительную лимфопению и нейтрофилию под действием гидрокортизона, начиная с 3-го дня эксперимента. Анализ состояния селезенки показал достоверное снижение ее веса, а также общего количества спленоцитов, начиная с 3-го дня и на протяжении всего эксперимента. Ни по одному из параметров иммунологической части исследования не было обнаружено

Рисунок 5. А. Интенсивность эпителизации кожных ран в опытной и контрольной группах в течение эксперимента. * - Различия между группами достоверны р<0,05. Б. Количество клеток в грануляционной ткани кожных ран в опытной (1Ь-1) и контрольной группах в течение эксперимента. * - различия между группами достоверны, р<0,05.

значимых различий между опытной и контрольной группами.

15 * * *

Таким образом, на втором этапе экспериментального исследования мы продемонстрировали, что ежедневная аппликация рекомбинантного 1Ь-1р в дозе 50нг/мл достоверно ускоряет заживление кожной раны мыши осложненной ежедневным введением гидрокортизона. Гистологическое исследование показало, что ускорение заживления ран происходит за счет усиления эпителизации и развития грануляционной ткани под действием 1Ь-1. Измерения цитологических параметров селезенки и лейкоцитарной формулы крови не выявили каких либо достоверных различий между группами, что позволяет говорить об отсутствии значимых системных эффектов выбранной дозы и схемы введения препарата.

Изучение язвозаживляющего действия рекомбинантного 1Ь-1р человека на модели язвы желудка крысы К настоящему моменту показан значительный терапевтический эффект при системном введение 1Ь-1р пациентам с язвенной болезнью желудка (Долгушина А. 2003), тем не менее работ по внутрижелудочному введению 1Ь-1р в качестве язвозаживляющего агента до настоящего момента не проводилось, и его прямое язвозаживляющее действие оставалось под вопросом. Мы предположили, что введение раствора 1Ь-1р непосредственно в полость желудка позволит ускорить заживление язвенного дефекта и избежать побочных реакций сопровождающих системное введение 1Ь-1.

В первом эксперименте через 3 дня после индукции язвы желудка рекомбинантный 1Ь-1р в дозах 10 и 100 нг/мл вводили интрагастрально, один раз в день, в течение трех дней. В качестве контроля был использован содовый раствор без цитокина. Измерение площадей язв на 6-е сутки показало, что размер поражений в группе получавшей 1Ь-1р в дозе 100нг/мл, был в 2,5 раза ниже по сравнению с контролем. Введение 1Ь-1р в дозе Юнг/мл не оказывало достоверного воздействия на площадь поражения (Рис. 6. Г). Гистологическое исследование (Рис. 6. А.Б.В) показало, что средняя ширина язв в группе получавшей 100 нг/мл I[.-![! (3440±349 мкм) на 30% меньше по сравнению с данным показателем в контрольной группе (4880±589 мкм). Средняя ширина язв в группе получавшей 10 нг/мл 1Ь-1р (4366±203 мкм) заметно не отличалась от показателей контрольной группы.

Во втором эксперименте была проведена оценка различных схем введения препарата. В первой части эксперимента было показано, что однократное введение

1Ь-1р в дозе 100нг/мл не оказывает значимого воздействия на площадь язвы. Во второй части эксперимента трехкратное введение 1Ь-1Р в дозе 100нг/мл, как и в первом эксперименте, привело к значительному снижению площади язвы по сравнению с контролем (Рис. 7).

Содовый раствор 1Ь-1Р - 10 нг/мл

Ш > .......

да I ШВЕННЫП ДЕФЕКТ

Ф- '

А-мо

1Ь-1Р-100 нг/мл

ЯЗВЕННЫЙ ДЕФЕКТ

1ир

Юнг

1Ь-1Р

ЮОнг

Рисунок 6. Препараты язв контрольной - А, и опытных Б, В, групп на 6-й день эксперимента. Увеличение Х-160. Края язв отмечены СЛ - слизистая оболочка, МО -мышечная оболочка. Окраска Гематоксилином - Эозином.

Г. Площади язв желудка на 6-й день эксперимента. *- различия достоверны по сравнению с контролем Р<0,05.

м 65 ■в ч я

3

о «ч

4 2

в 2 № К X

п

<и С.

и

35 30 25 20 15 10 5 0

Сода

А -I—

1Ь-1Р(100

нг/мл)

Рисунок 7. Площадь язв желудка на 6-й день эксперимента после трехкратного введения 1Ь-1|3 в дозе 100нг/мл. *- достоверно отличается от группы, получавшей содовый раствор Р<0,01.

В третьем эксперименте был проведен анализ лейкоцитарной инфильтрации

экспериментальной язвы желудка при трехкратном введение 1Ь-1Р в дозе 100 нг/мл.

Гистохимическое выявление нейтрофилов, окрашиванием на миелопероксидазу,

показало достоверное увеличение их количества в подслизистой основе у животных

опытной группы, по сравнению с группой получавшей воду.

Вода

г . » V. , *i *- •.»« • . «V ' • » f

IL-ip - 100 нг/мл

♦ gisaiMSf

Сода

»•А у« л, . »«V

r v. ■

* *

И Подслизистая □ Слизистая

IL-ip

Рисунок 8. Нейтрофилы в крае язвы на 6-й день эксперимента. Увеличение Х-640. Окраска DAB на миелопероксидазу с докрашиванием Гематоксилином. * - различия с группой получавшей воду достоверны р<0,01 (п=4-5). Вода

ji

- . - . it

fe'flfe

Сода

-л «-».л ¿jTtoiLr м

У- Г" Гд. ^ . ^ - V

IL-lp -100 нг/мл

■«.* * 9щ ~ f « TP -Л ■

• " ... - л - » / «... • .»ж

U Подслизистая П Слизистая

140 120 _ 100 S 80

а. во

40

20 0

IL-ip

Рисунок 9. Активированные нейтрофилы в подслизистой основе на 6-й день эксперимента. Увеличение Х-640. Окраска DAB на пероксидазную активность с докрашиванием Гематоксилином. * - различия с водой достоверны р<0,01.

Сравнение опытной группы с контролем, получавшим раствор соды, выявило четкую тенденцию к увеличению нейтрофильной инфильтрации подслизистой основы под действием 1Ь-1 (Рис. 8). Гистохимическое выявление активированных нейтрофилов, окрашиванием на пероксидазную активность, показало достоверное увеличение данного параметра в подслизистой основе у животных опытной группы, по сравнению с группой получавшей воду. Сравнение опытной группы с контролем, получавшим раствор соды, выявило четкую тенденцию к увеличению количества активированных нейтрофилов под действием 1Ь-1 (Рис. 9). Выявление макрофагов, выполненное окрашиванием на неспецифическую эстеразу, показало, что макрофагальная инфильтрация наблюдается в интактной ткани по краям язвы и локализуется как в собственной пластинке слизистой оболочки желудка, так и в подслизистой основе. Подсчет количества макрофагов показал выраженную тенденцию к увеличению данного показателя в опытной группе, получавшей рекомбинантный 1Ь-1р, по сравнению с группами, получавшими воду и содовый раствор (Рис.10).

Вода 4% раствор соды

Рисунок 10. Макрофаги в крае язвы на 6-й день эксперимента. Увеличение Х-640. Окраска 1-нафтилацетатом 340 и прочным синим В на неспецифическую эстеразу с докрашиванием Гематоксилином.

В первом и во втором экспериментах был проведен анализ лейкоцитарной формулы крови у животных всех групп. Подсчитывали абсолютное количество лейкоцитов, а также абсолютное и относительное количество лимфоцитов, нейтрофилов и моноцитов. Достоверных различий между экспериментальными группами ни по одному параметру обнаружено не было.

***

Таким образом, в экспериментах на модели язвы желудка было показано, что трехкратное введение рекомбинантного ГИр в дозе 100нг/мл, значительно снижает площадь язвенного дефекта. Одним из возможных механизмов противоязвенного действия является увеличение количества и функциональной активности лейкоцитов в области поражения под действием рекомбинантного 1Ь-1р. Продемонстрировано отсутствие воздействия использованных доз и схем введения II.-1, на лейкоцитарную формулу крови, что говорит об отсутствии значимого системного действия выбранной дозы и схемы введения препарата.

ВЫВОДЫ.

1. Разработана модель осложненной кожной раны мыши с использованием глюкокортикоидного гормона гидрокортизона. Показано, что введение гидрокортизона значительно замедляет эпителизацию и развитие грануляционной ткани, снижает клеточность грануляционной ткани и интенсивность формирования внеклеточного матрикса, задерживает наступление стадии ремоделирования, вызывает лимфопению и нейтрофилию крови, снижает количество спленоцитов.

2. На разработанной модели осложненной раны показано выраженное ранозаживляющее действие мазевой формы рекомбинантного 11.-1 (5 человека при ее местном применении. Ежедневное нанесение препарата ускоряло эпителизацию, стимулировало развитие грануляционной ткани, а также приближало стадию ремоделирования, что в среднем в 2 раза увеличивало скорость заживления, по сравнению с контрольной группой.

3. На модели кислотной язвы желудка у крысы показано выраженное язвозаживляющее действие рекомбинантного 11.-1 р человека, при его внутрижелудочном введении. В группе получавшей 1Ь-1 было показано значительное увеличение нейтрофильной и макрофагальной инфильтрации области поражения, а площадь язвенного дефекта была в среднем в 2,5 раза меньше по сравнению с контрольной группой.

4. Анализ лейкоцитарной формулы крови и цитологических

параметров селезенки экспериментальных животных, как показателей возможного системного действия препарата, не выявил каких либо воздействий на эти параметры со стороны использованных доз и схем введения рекомбинантного IL-lß человека.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК РФ:

1. Варюшина Е.А., Анциферова М.А., Александров Г.В., Конусова В.Г., Пигарева Н.В., Петров A.B., Симбирцев A.C. Интерлейкин-1 при местном применении повышает заживление ран у мышей на фоне введения гидрокортизона // Russian Journal of Immunology. - 2003. - V.8. - №2-3. - P. 156-164.

2. Варюшина E.A., Анциферова M.A., Александров Г.В., Минаева E.H., Пигарева Н.В., Петров A.B., Конусова В.Г., Исаева E.H., Бокованов В.Е., Котов А.Ю., Казаков A.A., Демьянов A.B., Симбирцев A.C. Модель осложненного течения раневого процесса на фоне иммуносупрессии, вызванной введением гидрокортизона // Цитокины и воспаление. - 2004. - Т.З. - №4. - С. 14-20.

3. Александров Г.В., Варюшина Е.А., Симбирцев A.C. Терапевтический эффект интрагастрального введения рекомбинантного интерлейкина-1 ß на модели язвы желудка крысы // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2006. - № 3-1 (14). - С. 305-306.

4. Варюшина Е.А., Александров Г.В., Сазонова Т.А., Симбирцев A.C. Изучение влияния местного применения рекомбинантного человеческого интерлейкина- 1 на репарацию язвенных повреждений слизистой оболочки желудка. // Цитокины и воспаление. 2012. - Т. 11. - № 1. - С. 64-69.

5. Александров Г.В., Варюшина Е.А., Сазонова Т.А. Симбирцев A.C. Внутрижелудочное введение интерлейкина-lß стимулирует заживление экспериментальной язвы желудка крысы // Российский аллергологический журнал. -2012. -№5. -Вып. 1.-С. 6-7.

6. Варюшина Е.А., Анциферова М.А., Александров Г.В., Сазонова Т.А., Симбирцев А.С Изучение регуляторной роли интерлейкина-1 в процессах местного воспаления и регенерации кожной раны // Российский аллергологический журнал. - 2012. - №5. -Вып. 1,-С. 46-47.

7. Сазонова Т. А., Варюшина Е. А., Александров Г. В., Симбирцев A.C. Изучение влияния местного применения рекомбинантного интерлейкина-lß человека на процессы репарации острых повреждений слизистой оболочки желудка крыс // Российский аллергологический журнал. - 2012. - №5. - Вып. 1. - С. 232-233.

Патенты на изобретения:

1. Пат. 2355415 Росийская Федерация, МПК7 А61Р1/04, А61К38/20. Способ лечения повреждений слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта / Г. В. Александров, Е. А. Варюшина, А. М. Ищенко, A.C. Симбирцев; ООО "Цитокин". - №2007125264/14; заявл. 04.07.2007; опубл. 10.01.2009.

2. Пат. 2361606 Российская Федерация, МПК7 А61К38/20, 61КЗЗ/10, А61К9/08, А61Р1/04. Композиция для лечения повреждений слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта / Г. В. Александров, Е. А. Варюшина, А. М. Ищенко, A.C. Симбирцев; ООО "Цитокин". -№2007125265/15; заявл. 04.07.2007; опубл. 10.01.2009. Тезисы докладов:

1. Antsiferova M., Kazakov A., Alexandrov G., Simbirtsev A. «Local and system effects of interleukin-8». Proceedings of the oral presentations on the Workshops, Fifth John Humphrey Advanced Summer Programme and Lecture Series in Immunology "Immunology in Health and Disease", September 17-22, 2002, Pushchino, Russia.

2. Александров Г., Анциферова M., Варюшина E., Казаков A. «Изучение ранозаживляющего действия рекомбинантного IL-Iß человека на модели с осложненным течением раневого процесса», Цитокины и воспаление, 2002, N 2. Т. 1, -№2.-С.158.

3. Александров Г.В., Варюшина Е. А., Симбирцев A.C. Перспективы терапевтического применения рекомбинантного интерлейкина-lß человека на модели язвы желудка у крыс // Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2(11). - №2-3. - С. 129.

4. Анциферова М.А., Александров Г.В., Варюшина Е.А., Казаков A.A. Использование модели осложненного течения раневого процесса для изучения возможности местного применения провоспалительных цитокинов // Медицинская иммунология. - 2001. - Т. 3. - № 2. - С. 346-347.

5. Варюшина Е. А., Конусова В.Г., Александров Г.В., Анциферова М.А., Котов А.Ю., Минаева E.H., Петров A.B., Пигарева Н.В., Исаева E.H., Саламатов A.B., Золотарев Д.В., Москаленко В.В., Симбирцев A.C. Изучение роли интерлейкина-lß в регуляции процессов локального воспаления и репарации // Российский аллергологический журнал. - 2007. - №3. - Приложение 1- С. 49-50.

6. Варюшина Е.А., Конусова В.Г., Котов А.Ю., Анциферова М.А., Александров Г.В., Синева С.А., Демьянов A.B., Саламатов A.B., Баринов О.В., Москаленко В.В., Петропавловская О.Ю., Тимчук Л.Э., Симбирцев A.C., Кетлинский С.А. Экспериментальное и клиническое обоснование применения интерлейкина-lß в качестве местного иммуностимулирующего и ранозаживляющего средства // Медицинская иммунология. - 2003. - Т. 5. - № 3-4. - С. 449-450.

7. Варюшина Е.А., Котов А.Ю., Анциферова М.А., Александров Г.В., Петропавловская О.Ю., Москаленко В.В., Симбирцев A.C. Ранозаживляющее и местное иммуностимулирующее действие интерлейкина-1 бета при осложненном раневом процессе // Медицинская иммунология. - 2007. - Т. 9. - С. 345.

8. Сазонова Т.А., Варюшина Е.А., Александров Г.В., Симбирцев A.C. Влияние местного применения интерлейкина-lß на процессы воспаления, репарации и инфильтрации лейкоцитами слизистой оболочки желудка крыс // Медицинская иммунология. - 2011. - Т. 13. - №. 4 - 5. - С. 331.

9. Сазонова Т.А., Варюшина Е.А., Александров Г.В., Симбирцев A.C. Изучение влияния местного применения рекомбинантного интерлейкина-lß на процессы воспаления, репарации и инфильтрации лейкоцитами слизистой оболочки желудка крыс // Медицинский академический журнал. - 2010. - Т. 10. - № 5. - с. 180.

Подписано в печать 18.03.13 Формат 60x84Цифровая Печ. л. 1.0 Тираж 100 Заказ 13/03 печать

Отпечатано в типографии «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Александров, Георгий Вячеславович, Санкт-Петербург

ФГУП «ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НИИ ОСОБО ЧИСТЫХ БИОПРЕПАРАТОВ»

ФМБА РОССИИ

На правах рукописи.

АЛЕКСАНДРОВ ГЕОРГИЙ ВЯЧЕСЛАВОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА-1 р ЧЕЛОВЕКА НА ЗАЖИВЛЕНИЕ ОСЛОЖНЕННОЙ КОЖНОЙ РАНЫ И ЯЗВЫ ЖЕЛУДКА

Специальность: 03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

^

I

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

СО

о

Очі

СО О

СО

о

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор А.С. Симбирцев.

Санкт-Петербург 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ 4

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

1.1. Белки семейства интерлейкина-1 11

1.2. Механизмы заживления кожной раны в норме и при патологии, роль цитокинов в процессе репарации 18

1.3. Механизмы защиты и заживления слизистой оболочки желудка, роль цитокинов в этих процессах 31

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 40

2.1. Экспериментальные животные 40

2.2. Оперативные вмешательства 40

2.3. Использованные препараты 43

2.4. Методы исследования 43

2.5. Экспериментальные протоколы 48

Глава 3. РАЗРАБОТКА И ОПИСАНИЕ МОДЕЛИ ОСЛОЖНЕННОЙ

КОЖНОЙ РАНЫ МЫШИ 56

3.1. Подбор дозы гидрокортизона, вызывающей достоверное снижение интенсивности заживления раны 57

3.2. Изучение динамики заживления кожной раны, осложненной введением гидрокортизона 58

3.3. Изучение морфологических изменений в ране под действием гидрокортизона 59

/ГО

3.4. Оценка иммунологических параметров и массы тела

экспериментальных животных

3.5. Обсуждение результатов 73

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ РАНОЗАЖИВЛЯЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО 1Ь-1(3 ЧЕЛОВЕКА, НА МОДЕЛИ ОСЛОЖНЕННОЙ

КОЖНОЙ РАНЫ 82

4.1. Изучение динамики заживления осложненной кожной раны, при ежедневном нанесении мазевой формы рекомбинантного 1Ь-1|3 83

4.2. Изучение морфологических изменений в осложненной ране, под действием мазевой формы рекомбинантного 1Ь-1(3 84

4.3. Оценка иммунологических параметров и массы тела экспериментальных животных 88

4.4. Обсуждение результатов 94

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ЯЗВОЗАЖИВЛЯЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ

РЕКОМБИНАНТНОГО 1Ь-1 (3 НА МОДЕЛИ ЯЗВЫ ЖЕЛУДКА КРЫСЫ 101

5.1 Подбор дозы 1Ь-1|3 оказывающей значительный эффект на заживление язвы желудка 102

5.2 Морфологическое исследование язвенных поражений желудка 103

5.3 Подбор эффективной схемы введения рекомбинантного 1Г-1{3

человека в дозе 100нг/мл 105

5.4 Анализ лейкоцитарной инфильтрации язвы желудка при трехкратном введении 11,-10 в дозе 100нг/мл 107

5.5 Анализ лейкоцитарной формулы крови 112

5.6 Обсуждение результатов 113 ВЫВОДЫ 119

СПИСОК ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ

120

ВВЕДЕНИЕ

Процесс репарации любой эпителиальной ткани опосредован двумя основными механизмами: репаративным (процесс восстановления целостности эпителиального слоя и подлежащей соединительной ткани) и иммунным (процесс подавления попавших в рану патогенов). Эти механизмы тесно связаны между собой, и в их регуляции участвует большое количество различных медиаторов, значительная часть которых является цитокинами (Clark R., 1996). Цитокины - это гетерогенная группа низкомолекулярных полипептидных медиаторов межклеточного взаимодействия секретируемых различными типами клеток и выполняющих регуляторные функции. Для цитокинов характерны плейотропность и взаимозаменяемость биологического действия, передача сигнала за счет взаимодействия со специфическими рецепторами, формирование цитокиновых сетей - когда один полипептид регулирует продукцию целого ряда других цитокинов. Связываясь с рецепторами на поверхности клеточной мембраны, цитокины регулируют активацию, дифференцировку, пролиферацию и синтетическую активность клеток-мишеней в норме и при различных патологических состояниях (Кетлинский С., Симбирцев А., 2008). Интерлейкин-1 - один из самых широко изученных полифункциональных цитокинов, был открыт в конце 20 века. Семейство интерлейкина-1 (IL-1) насчитывает 11 гомологичных белков, при этом в научной литературе под именем IL-1 чаще всего фигурируют два функционально близких члена семейства - IL-la и IL-ip, обладающие сходной биологической активностью. К настоящему моменту известно более пятидесяти различных биологических эффектов IL-1, но, безусловно, важнейшей функцией IL-1 является активация воспалительного процесса на местном и системном уровнях (Dinarello С., 2010; Симбирцев А., 2011). Помимо провоспалительной активности IL-1 выполняет целый ряд других важнейших функций, в том числе участвует в регуляции репаративных процессов, которые тесно ассоциированы с иммунным ответом.

Актуальность проблемы.

Нарушения репаративных функций кожи и желудочно-кишечного тракта, а также роль цитокинов в этих процессах, являются серьезной и до конца не решенной проблемой современной клеточной биологии и медицины. Так, по данным статистики, незаживающими язвами кожи страдают до 1,5 млн. больных сахарным диабетом, а трофическими язвами на фоне венозной недостаточности поражено порядка 2% трудоспособного населения развитых стран (Вин Ф., 1998). Язвенные поражения желудка имеют еще более широкое распространение - частота встречаемости этого заболевания составляет от 7 до 10% среди взрослого населения по всему миру. Во многих случаях, применение стандартных средств терапии и хирургических методов лечения, как язвенных поражений желудка, так и незаживающих кожных ран не приводит к полному выздоровлению больных, а также сопровождается значительным количеством рецидивов. Локальное применение рекомбинантных цитокинов и ростовых факторов в качестве агентов стимулирующих заживление в ряде случаев позволяло добиться значительных терапевтических успехов при лечении язвенных поражений желудка и незаживающих кожных ран, как в экспериментальных исследованиях, так и в клинической практике (Steed D., 1995; Yoshida S. et al., 2004; Wallace J. et al., 2006; Dudar G. et al., 2008; Fernández-Montequín J. et al., 2009).

К настоящему моменту известно, что уровень IL-1 значительно повышен в нормально заживающей кожной ране (Sato Y. Ohshima T., 2000; Wang J. et al., 2009). Кроме того, известно, что IL-1 способен как прямо, так и опосредованно через индукцию синтеза других цитокинов, стимулировать пролиферативную и синтетическую активность всех основных клеточных типов, участвующих в процессе заживления кожной раны (Kozlowska U. et al., 1998; Maas-Szabowski N. et al., 2000; Yano S. et al., 2008). Не менее важные функции принадлежат IL-1 и в поддержании гомеостаза желудочного эпителия. В ряде работ показано, что IL-1 стимулирует продукцию простагландина-Е2 клетками мукозы, снижает продукцию кислоты париетальными клетками, стимулирует продукцию ряда

ростовых факторов, играющих важную роль в репарации слизистой желудка. Более того, было показано, что специфическое блокирование 1Ь-1 в области поражения приводит к значительному замедлению в репарации экспериментальной язвы желудка (8сЬерр \У. е1 а1., 1998; ТакаЬаБЫ Э. е1 а1., 1999; Ьшс^гбт Е. е1 а1., 2001; Мшга Э. е1 а1., 2004). Клинические данные демонстрируют значительный терапевтический эффект при системном введении 1Ь-1р пациентам с язвенной болезнью желудка (Долгушина А. 2003). Таким образом, дальнейшее изучение роли 1Ь-1 в репаративных процессах является достаточно актуальной задачей, имеющей важное теоретическое и практическое значение. В связи с тем, что системное введение 1Ь-1 приводит к развитию значительных побочных эффектов, особый интерес представляет возможность местного введения препарата непосредственно в область поражения.

Цели и задачи работы.

Цель настоящего исследования заключалась в изучении местного воздействия рекомбинантного 1Ь-1(3 человека на интенсивность заживления осложненной кожной раны и язвенного поражения желудка. Для достижения этой цели нами были поставлены следующие задачи: Задачи исследования:

1. Разработать экспериментальную модель осложненной кожной раны с использованием гидрокортизона, в качестве агента осложняющего заживление, описать морфологические изменения в развитии раневого процесса характерные для полученной модели.

2. Используя модель, изучить ранозаживляющую активность мазевой формы рекомбинантного 1Ь-1р, а также оценить воздействие цитокина на развитие раневого процесса для выяснения клеточных механизмов его ранозаживляющего действия.

3. На модели кислотной язвы желудка крысы оценить язвозаживляющую активность рекомбинантного 1Ь-1|3 при местном внутрижелудочном введении, выявить клеточные механизмы действия цитокина.

4. Оценить состояние лейкоцитарной формулы крови и цитологических параметров селезенки экспериментальных животных, как показателей возможного системного действия мазевой формы и раствора рекомбинантного 1Ь-1|3.

Научная новизна.

Разработана и подробно описана новая модель осложненной кожной раны, с использованием гидрокортизона в качестве агента замедляющего репаративный процесс. В результате исследований проведенных на разработанной модели, впервые показано выраженное ранозаживляющее воздействие рекомбинантного человека на осложненную кожную рану.

Показано, что ускорение в заживлении осложненной раны происходит за счет усиления эпителизации, увеличения клеточности грануляционной ткани, а также ускорения ремоделирования грануляционной ткани под действием рекомбинантного 1Ь-1[3.

Впервые показано, что раствор рекомбинантного 1Ь-1р, при его внутрижелудочном введении, значительно снижает площадь экспериментальной язвы желудка крысы. Одним из механизмов язвозаживляющего действия препарата является усиление лейкоцитарной инфильтрации и функциональной активности лейкоцитов в области поражения.

Эксперименты показали, что локальное применение рекомбинантного 1Ь-1 (3 в составе мазевой формы или содового раствора не оказывает достоверного воздействия на массу и клеточность селезенок, соотношение субпопуляций спленоцитов, а также формулу периферической крови экспериментальных животных, что говорит об отсутствии значимого системного эффекта выбранных доз и курсов введения препарата.

Теоретическое и практическое значение работы.

В процессе работы создана модель осложненной кожной раны, пригодная для оценки эффективности ранозаживляющих препаратов. Результаты исследования расширяют и дополняют современные представления о роли 1Ь-1 в процессах регуляции гомеостаза и репарации покровного и желудочного

эпителиев. На основании полученных данных ведется разработка новых препаратов для лечения не заживающих кожных ран, а также язв желудка с использованием рекомбинантного IL-1 (3 человека.

Результаты диссертационного исследования используются в работе Гос НИИ ОЧБ по созданию новых лекарственных препаратов на основе рекомбинантных цитокинов. По результатам работы получено 2 государственных патента на изобретения.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Мазевая форма рекомбинантного IL-ip человека усиливает эпителизацию и развитие грануляционной ткани на модели осложненной кожной раны мыши, что приводит к значительному увеличению интенсивности заживления.

2. Внутрижелудочное введение раствора рекомбинантного IL-ip человека приводит к значительному увеличению количества и функциональной активности лейкоцитарного инфильтрата в области поражения на модели кислотной язвы желудка крысы, эффект сопровождается значительным снижением площади поражения, по сравнению с контрольной группой.

3. Мазевая форма и раствор рекомбинантного IL-1J3 не оказывают значительного воздействия на лейкоцитарную формулу крови и цитологические параметры селезенки.

Апробация работы.

Основные результаты диссертации были представлены и обсуждены на: всероссийском форуме с международным участием им. Академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», Санкт-Петербург 21-24 мая 2001 г.; международной научно-практической конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет», Санкт-Петербург, 23-26 июня 2002г.; Fifth John Humphrey Advanced Summer Programme and Lecture Series in Immunology «Immunology in Health and Disease» Pushchino, Russia, 17-22 September 2002.; всероссийской конференции «Молекулярные основы иммунорегуляции иммунодиагностики и

иммунотерапии», Санкт-Петербург, 23-26 июня, 2003.; VIII конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», Москва, 27-29 июня 2007.; объединенном иммунологическом форуме, Санкт-Петербург, 30 июня - 5 июля 2008г.; всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» Санкт-Петербург, 21-22 декабря 2010г.; XIV всероссийском форуме с международным участием им. Академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» 23-26 мая 2011г.

Публикации.

Основное содержание диссертации отражено в 16 публикациях, из которых 7 статей опубликованы в журналах входящих в утвержденный ВАК перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий.

Патенты.

По результатам работ получены 2 государственных патента на изобретения.

Структура и объём диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературных источников, описания основных экспериментальных методик, трех глав, содержащих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждение, общего заключения и списка использованной литературы. Объём диссертации составляет 153 страницы печатного текста, работа содержит 22 таблицы, II рисунков, 9 схем и 7 графиков. Список использованной литературы состоит из 11 отечественных и 283 зарубежных работ.

Глава 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ.

Проблема регенерации повреждений кожи и желудочно-кишечного тракта имеет чрезвычайно большое теоретическое и практическое значение и активно изучается в течение многих лет. Несмотря на ряд особенностей, связанных со спецификой тканевой организации и различным онтогенетическим происхождением, важную роль в регуляции репаративных процессов практически всех эпителиальных тканей выполняют одни и те же цитокины и ростовые факторы. Один из первых открытых цитокинов 1Ь-1 играет важнейшую роль, как в развитии местной воспалительной реакции, так и в регуляции репаративных процессов. Появляясь в области поражения одним из первых, 1Ь-1 оказывает непосредственное влияние на метаболизм клеток участвующих в репарации, а также индуцирует запуск целого каскада цитокинов и ростовых факторов необходимых для репарации поврежденной ткани.

Цель данного обзора литературных источников заключается в теоретическом обосновании перспектив использования рекомбинантного 1Ь-1(3 человека в качестве рано - язвозаживляющего агента. Для достижения этой цели, в обзоре литературы рассматриваются следующие вопросы:

1. Дан краткий обзор структуры, функций и особенностей продукции белков семейства 1Ь-1 и их рецепторов.

2. Описаны механизмы заживления кожной раны в норме, а также при ряде патологических состояний, когда заживление нарушено. Отражена роль ростовых факторов и цитокинов, в частности 1Ь-1, в процессе репарации.

3. Описаны механизмы патогенеза и заживления язвы желудка. Отражена роль ростовых факторов и цитокинов, в частности 1Ь-1, в процессе репарации.

4. На основании литературных данных определено направление собственных экспериментальных исследований.

1.1 Белки семейства интерлейкина-1.

История открытия и основные члены семейства IL-1.

Точно определить, кем и когда впервые был открыт IL-1, не представляется возможным. Разные исследователи независимо друг от друга открывали IL-1 и присваивали ему различные названия в зависимости от наблюдаемых эффектов или клеток продуцентов. Так в целом ряде ранних работ IL-1 фигурировал под названием лимфоцит-активирующий протеин (Gery I. et al., 1972; Blyden G., Handschumacher R., 1977). Термин интерлейкин-1 появился в 1979 году, когда в ходе работы международной конференции «International Lymphokine Workshop» это наименование было присвоено группе молекул синтезируемых моноцитарными клетками (Aarden L. et al., 1979). Ключевой датой в исследовании IL-1 можно назвать 1984 год, когда в двух лабораториях, независимо, были клонированы гены мышиного IL-la и человеческого IL-ip (Lomedico P. et al., 1984; Auron P. et al., 1984). К настоящему моменту семейство интерлейкина-1 насчитывает 11 гомологичных цитокинов, большая часть генов которых находится в составе второй хромосомы, в виде кластера в регионе размером 400kb (Taylor S. et al., 2002). Значительная часть членов семейства открыта в последние годы методом генетического анализа, а под именем IL-1 в научной литературе обычно фигурируют два важнейших и функционально близких члена семейства - IL-la, и IL-1J3. Не смотря на кодирование разными генами, оба белка обладают высокой гомологией в аминокислотной последовательности, связываются с одними и теми же рецепторами, а их биологическая активность практически одинакова и достаточно хорошо изучена. Еще одним ключевым членом семейства является полипептид, имеющий высокую гомологию в аминокислотной последовательности с IL-la и IL-1(3. Он эффективно конкурирует с IL-la и IL-ip за связывание с рецепторами, но это связывание не приводит к передаче сигнала. Благодаря такой функциональной особенности, этот цитокин получил на