PAR-зависимая регуляция активности тучных клеток при воспалении

Русанова, Анна Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
PAR-зависимая регуляция активности тучных клеток при воспалении
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "PAR-зависимая регуляция активности тучных клеток при воспалении"

На правах рукописи

Русанова Анна Викторовна

РАК-ЗАВИСИМАЯ РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ТУЧНЫХ КЛЕТОК ПРИ ВОСПАЛЕНИИ

03.03.01 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 1 ОПТ 2010

Москва-2010

004611252

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, заведующий - профессор A.A. Каменский

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Светлана Михайловна Струкова

доктор биологических наук, профессор кафедры физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Владимир Борисович Кошелев

доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой нормальной и патологической физиологии ГУНИ ФФМ МГУ имени М. В. Ломоносова

Елена Георгиевна Колокольчикова

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник НИИ скорой помощи имени Н. В. Склифосовского

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

ГУ НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН

Защита диссертации состоится 01 ноября 2010 года в 15 час. 30 мин, на заседании диссертационного совета Д 501.001.93 при Биологическом факультете Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы д. 1, строение 12, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова

Автореферат разослан 01 октября 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Одной из фундаментальных проблем современной физиологии является понимание механизмов действия протеиназ гемостаза в воспалительных и репаративных процессах. Основные усилия направлены на выяснение механизмов запуска и развития воспалительных процессов после травматического повреждения тканей с целью поиска путей быстрого и эффективного восстановления функций клеток и тканей. При повреждении тканей помимо индукции воспаления и свертывания крови, активируется целый ряд протеиназ системы гемостаза, в том числе фактор Ха (фХа), тромбин и активированный протеин С (APC) [Esmon, 2005; Strukova, 2006; Jackson, Xue, 2008].

В настоящее время тромбин рассматривают как регулятор важных физиологических и патофизиологических процессов, часто разнонаправленных. Так, например, при связывании с рецепторами, активируемыми протеиназами (PAR) на поверхности клеток-мишеней [Coughlin, 2000; Strukova, 2006; Martorell et al., 2008], тромбин вызывает агрегацию тромбоцитов, повышение проницаемости клеток эндотелия, экспрессию Р-селектина в эндотелиоцитах, адгезию лейкоцитов, проявляя свое провоспалительное влияние. Вместе с тем, тромбин обладает противовоспалительными и пролиферативными свойствами, активируя высвобождение факторов роста, стимулируя деление эпителиальных, гладкомышечных и др. клеток, а также индуцируя образование оксида азота (NO), препятствующего агрегации моноцитов и тромбоцитов на поверхности эндотелия. Одним из важнейших результатов действия тромбина является активация протеина С. Активированная форма протеина С (АРС) относится к классу сериновых протеиназ и обладает сильным противовоспалительным потенциалом. Функции фХа - сериновой протеиназы, которая превращает протромбин в тромбин, вне гемостаза, к настоящему моменту малоизученны.

В последнее время активно развивается представление о противовоспалительном и антиапоптотическом действии АРС на эндотелиальные клетки, моноциты, нейроны и др. клетки, а также о его защитном действии при системном воспалении и сепсисе [Mosnier, Griffin, 2006; Xue et al., 2009; Jackson et al., 2009; Gorbacheva et al., 2010]. Показано взаимодействие APC с двумя мембранными рецепторами на эндотелии -эндотелиальным рецептором протеина С (EPCR) и PARI [Riewald, Ruf, 2005; Feistritzer et al., 2006; Mosnier, Griffin, 2006].

PARs относятся к суперсемейству семидоменных трансмембранных рецепторов, сопряженных с G-белками. PARs отличаются уникальным механизмом активации, опосредованной протеолитическим расщеплением одной пептидной связи во внеклеточном домене рецептора. При этом освобождается новый N-концевой участок рецептора, так называемый

«привязанный лиганд», представляющий собой агонист рецептора. Взаимодействие «привязанного лиганда» с доменом второй внеклеточной петли рецептора запускает активацию клеток. Агонистами PARs являются сериновые протеиназы, в том числе каскада свертывания крови, а так же ряд синтетических пептидов, гомологичных по структуре «привязанному лиганду» [Струкова, 2004; Дугина и др. 2004; Coughlin, 2005; Steinhoff et al, 2005; Ossovskaya, Burnett, 2004; Hollenberg et al., 2005].

Известны четыре члена семейства PAR: PARI, 3 и 4 - рецепторы тромбина и PAR2 - рецептор трипсина, триптазы тучных клеток, факторов свертывания крови - Ха и Vila в комплексе с тканевым фактором (TF) [Hollenberg, Compton, 2002; Hollenberg et al., 2005; Steinhoff et al., 2005]. PARs широко экспрессируются в клетках основных защитных тканей организма: эпителии, эндотелии сосудов и др., что позволяет предположить их участие в осуществлении острых защитных реакций при воспалении и репарации тканей и в патогенезе хронических процессов [Steinhoff et al.,2004; Olianas et al., 2007; Nickel et al., 2006; Jackson, Xue, 2008].

Известно, что при воспалении активируются тучные клетки, которые высвобождают широкий спектр противовоспалительных медиаторов, в том числе гистамин, (3-гексозаминадазу, протеазы, цитокины, NO и др. [Макарова и др., 2006; Church et al., 2008, Peiler et al., 2010]. К настоящему моменту роль ключевых сериновых протеиназ в механизмах, ответственных за запуск, развитие и/или регуляцию воспалительных и репаративных процессов в тканях исследована еще не достаточно. Так, известно, что в клетках, участвующих в основных этапах репарации тканей, таких как воспаление, пролиферация клеток и созревание ткани, повышается экспрессия PARs и увеличивается число рецепторов на поверхности клеточной мембраны [Steinhoff et al.,2005; Strukova, 2006, Shpacovitch et al., 2010]. Кроме того, ранее в нашей лаборатории было установлено PARl-опосредованное действие тромбина и пептидов - агонистов PARI (PAR1-AP) на тучные клетки и выявлена аутокринная регуляция оксидом азота ответа тучных клеток [Strukova et al., 1996, 1999; Dugina et al., 2003]. На модели острого перитонита y крыс было показано усиление секреции медиаторов тучными клетками в ответ на действие PARI-АР, что свидетельствует о дополнительном экспонировании PARI на мембране тучных клетках в условиях воспаления [Dugina et al., 2003]. Показано, что иммобилизованный в полимерные матрицы PARI-АР, ускоряет заживление кожных ран, что подтверждает регуляторную функцию агонистов PARI при воспалении - первой фазе заживления ран [Strukova et al., 2001; Дугина и др., 2004]. Показано, что действие АРС на тучные клетки реализуется через активацию PARI, поскольку их десенсетизация тромбином предотвращает, вызванное АРС, снижение секреции Р-гексозаминидазы [Макарова и др., 2006]. Механизмы протекторного или повреждающего действия протеиназ гемостаза при остром воспалении мало изучены. Также не ясно участие PAR в активации

транскрипционных факторов тучных клеток.

В процессе гибели/выживаемости эндотелиальных, тучных, моноцитов и других клеток, участвующих в воспалении, пролиферации, ангиогенезе и др. вовлекается транскрипционный фактор NF-кВ (семейство пяти ДНК-связывающих белков, включая NF-KBp65 (RelA)). Получены данные о том, что активация NF-кВ в моноцитах и клетках эндотелия, которая ведет к фосфорилированию и деградации его ингибитора 1кВ и транслокации субъединиц NF-кВ в ядро, вносит вклад как в гибель клеток при воспалении, так и в выживаемость клеток, повышая экспрессию как про- так и антиапоптотических генов [Levi et al., 2004; Joyce et al., 2001; Lawrence, 2010].

Роль PAR рецепторов в действии тромбина и АРС на выживаемость и гибель тучных клеток при развитии острого воспаления изучена не достаточно. Отсутствуют систематические данные о влиянии фактора Ха, тромбина и АРС на секрецию гистамина перитонеальными тучными клетками в норме и при воспалении, о рецепторном механизме действия протеиназ гемостаза на эти клетки в норме и при воспалении, и об их влиянии на активность транскрипционного фактора NF-кВ в перитонеальных тучных клетках. Данные о протекторном действии агонистов PAR при повреждении тканей, в том числе при язве желудка, разрознены и противоречивы.

Таким образом, исследование роли ключевых протеиназ гемостаза, а также рецепторов, активируемых протеиназами, в воспалительных процессах представляется весьма актуальным и перспективным как для фундаментальной физиологии, так и для практической медицины.

Цель исследования

Выяснение механизмов действия ключевых протеиназ гемостаза (фактора Ха, тромбина и активированного протеина С) как регуляторов активности тучных клеток на ранних стадиях острого перитонита. Задачи исследования:

1. Изучить кинетику появления эндогенных протеиназ гемостаза на начальных этапах развития острого воспаления и сравнить с появлением медиаторов воспаления - IL-lß и IL-6.

2. Исследовать влияние ключевых протеиназ гемостаза на секреторную активность перитонеальных тучных клеток в норме и при остром воспалении.

3. Выяснить роль PAR в секреторном ответе тучных клеток на протеиназы гемостаза в норме и при остром воспалении.

4. Исследовать роль транскрипционного фактора NF-кВ в ответе тучных клеток при остром воспалении и при действии на клетки агонистов и антагонистов PAR.

5. Исследовать влияние агонистов и антагонистов PAR на выживание перитонеальных тучных клеток при развитии острого воспаления.

6. Исследовать протекторное действие агонистов PARI в моделях острого

воспаления, стресса, кожных ран у мышей и язвы желудка у крыс. Научная новизна

Впервые обнаружено:

• маркеры воспаления - IL-1(3 и IL-6 появляются в перитонеальной полости и в тучных клетках крыс на начальных этапах развития острого экспериментального воспаления; однократное внутрибрюшинное введение АРС при остром воспалении снижает секрецию IL-ip и IL-6 тучными клетками;

• фактор Ха (в пМ концентрациях) активирует перитонеальные тучные

клетки крыс, повышая секрецию гистамина, а в высоких концентрациях (нМ) блокирует секрецию медиатора, стабилизируя тучные клетки. Эти эффекты фХа реализуются через два рецептора -PARI и PAR2;

• антагонисты PARI и PAR2 рецепторов (в низкой концентрации)

стабилизируют тучные клетки, полученные от животных с острым воспалением, блокируя секрецию гистамина и активацию транскрипционного фактора NF-kB;

• тромбин и АРС (в нМ концентрациях) защищают тучные клетки от

гибели, блокируя активацию транскрипционного фактора NF-kB и транслокацию NF-KBp65 в ядро;

• однократное внутрибрюшинное введение АРС (нМ) снижает секрецию

медиаторов воспаления из тучных клеток, полученных от животных, подвергшихся иммобилизационному стрессу;

• агонисты PARI (АРС, пептид - агонист PARI (PAR1-AP),

модифицированный пептид - агонист PARI (WPAR1-AP)) проявляют противовоспалительное и ранозаживляющее действие на модели экспериментальной язвы желудка у крыс. Агонисты PARI в низких концентрациях (нМ), освобождаясь из полимерных носителей, супрессируют фазу воспаления и сдвигают фазу пролиферации на более ранние сроки, ускоряя заживление экспериментальной язвы желудка у крыс.

Теоретическая и практическая значимость

низких концентраций и противовоспалительное действие высоких концентраций фактора Ха. Показано, что агонисты PARI (APC и пептиды -агонисты PARI) в низких концентрациях и при однократном введении ускоряют заживление экспериментальной язвы желудка у крыс.

Данные о прямом цитопротекторном действии протеиназ гемостаза могут служить основой для разработки новых подходов к лечению воспалительных процессов и создания на базе агонистов и антагонистов рецепторов PAR препаратов с противовоспалительными, противоапоптотическими и репаративными свойствами.

Апробация работы

Основные результаты работы были доложены на Всероссийской конференции "Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром" (Россия, Ярославль, 2005); XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2006» (Россия, Москва, 2006); Международной конференции «Биотехнология и медицина» (Россия, Москва, 2006); III Всероссийской научной конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Россия, Москва, 2007); Всероссийской конференция с международным участием «Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению» (Россия, Москва, 2008); II съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (Молдова, г. Кишинэу, 2008); IV Всероссийской научной конференции с международным участием «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Россия, Москва, 2009); VII научной конференции с международным участием «Гемореология и микроциркуляция» (Россия, Ярославль, 2009); XXIIst Congress of ISTH (USA, Boston, 2009); Всероссийской конференции с международным участием «Тромбозы, кровоточивость, ДВС - синдром: современные подходы к диагностике и лечению» (Россия, Москва, 2009); на заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ (Россия, Москва, 2010).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 26 печатных работ (в том числе 8 статей) в отечественной и зарубежной печати.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 148 страницах и включает введение, обзор литературы, описание объекта и методов исследования, результаты, обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы (содержит 247 источника). Работа иллюстрирована 51 рисунками и 3 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали самцов белых беспородных крыс, весом 25 0-3 5 Ог (п=480). Все эксперименты с животными выполняли в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF) и декларацией о гуманном отношении к животным.

Определение содержания АРС, тромбина и фХа в перитонеальной жидкости крыс с острым воспалением. Острое воспаление у крыс вызывали внутрибрюшинным введением 40%-го раствора тиогликолата Na в дозе 4г/кг веса (тела) животного. За основу была взята методика индукции перитонита по G.Pejler [Pejler, 1999]. В исследуемые временные точки (через 15,30,60,90, 120 и 210 мин) после инициации перитонита крыс декапитировали, отбирали перитонеальную жидкость, отделяли клетки центрифугированием и отбирали аликвоты надосадочной жидкости для определения содержания общего белка (микробиуретовый метод) [Гончарова и др., 1994], активности тромбина, АРС, фХа и содержания цитокинов IL-lß, IL-6. Определяли амидолитическую активность тромбина по гидролизу специфического хромогенного субстрата N-p-Tos-Gly-Pro-Arg-p-NA (S2238), активность АРС - по гидролизу pyroGlu-Pro-Arg-p-NA (S2366) и активность фХа - по гидролизу N-benzoyl-Ile-Gly-Arg-pNA (S2222), регистрируя освобождение р-нитроанилида спектрофотометрически (при /.=405 нм) на приборе Униплан-М. Количество ферментов пересчитывали на общее содержание белка в пробе.

Индекс дегрануляции (ИД) тучных клеток [по методу Шаехова и др., 2001] оценивали по отношению числа дегранулированных клеток к общему числу тучных клеток (в камере Горяева) по формуле: ИД= Д/(Д+Н), где Д -число дегранулированных тучных клеток, H - неактивированных тучных клеток.

Анализ цитокинов IL-lß и IL-6 в перитонеальной жидкости и во фракциях тучных клеток (105 клеток) осуществляли с помощью наборов Rat IL-lß and IL-6 ELISA Development Kit (PeproTech, США) в соответствии с протоколом, предложенньм производителем.

Исследование влияния агонистов и антагонистов PARI на секреторную активность ПТК. Тучные клетки выделяли из перитонеальной полости крыс по методу Thon, Uvnas (1967) в нашей модификации. После стимуляции перитонеальных тучных клеток (ПТК) агонистами рецептора PARI (АРС, тромбин, фактор Ха, PAR1-AP) или блокирования рецепторов PARI и PAR2 тучных клеток антагонистами PARs и добавления исследуемых в-в или сбалансированного раствора (в контроле), отбирали аликвоты для определения содержания гистамина по методу Shore et al. (1971). Оптическую плотность измеряли на спектрофлуориметре Thermo Fluoroscan Ascent при 460 нм, возбуждая при 355 нм. Количество секретированного гистамина

вычисляли по формуле: % секреции = А/(А+В)-100%, где А - содержание медиатора в супернатанте, В - в осадке.

Оценка выживаемости тучных клеток МТТ анализом. МТТ 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide) восстанавливается в формазан в митохондриях живых клеток [Castoldi et al., 1998]. Водный раствор МТТ добавляли в клеточную среду (105 клеток), до конечной концентрации 0,5 мг/мл и инкубировали клетки 2 часа при 37 °С. Затем пробы центрифугировали, среду удаляли и добавляли к осадку диметилсульфоксид (DMSO, "Sigma") для растворения формазанов. Оптическую плотность измеряли при 620 нм в плашечном ридере Ascent (США). Оценивали результаты в процентах по отношению к контролю.

Определение NF-KBp65 иммуноферментным анализом. Анализ №-кВр65 в ядерной и цитоплазматической фракциях осуществляли с помощью набора NF-KBp65-ELISA (Biosource, Германия) в соответствии с протоколом, предложенным производителем. Для выделения ядерной и цитоплазматической фракций клетки (105 клеток) собирали, промывали и концентрировали центрифугированием. Полученный осадок ресуспензировали, инкубировали, добавляли 10% тритон-ХЮО и центрифугировали. Супернатант, содержащий цитоплазматическую фракцию, замораживали (-80°С), а осадок суспензировали в экстракционном буфере в присутствии ингибиторов протеиназ и центрифугировали (13000 об/мин). Супернатант и ядерную фракцию собирали и замораживали (-80°С). Содержание NF-KBp65 в пробе рассчитывали на мг белка в мл. Белок определяли по методу Бредфорд.

Ацетатная модель язвообразования. Ацетатную язву вызывали у крыс по модифицированному методу Окабе [Okabe et al., 1971]. Беспородным крысам-самцам (весом от 250 до 300 г) под эфирным наркозом вскрывали брюшную полость, обнажали желудок и на серозную поверхность пилорического отдела желудка апплицировали ледяную уксусную кислоту. Брюшную полость обрабатывали пенициллином, зашивали, шов обрабатывали йодом. Через 2 часа в желудок при помощи зонда вводили исследуемые агонисты PARI. Гистологические срезы поврежденной ткани желудка на 3 и 7 сутки после ранения окрашивали гематоксилином и эозином. Интенсивность репаративного процесса в слизистом слое желудка оценивали по процентному содержанию маркеров воспаления (макрофаги и нейтрофилы) и маркера пролиферации (фибробласты), и ангиогенеза.

Модель заживления кожных ран у мышей. Эксперименты по заживлению ран проводили на самцах мышей. Животным под эфирным наркозом удаляли участок кожи (5 мм) в области холки. Непосредственно после ранения апплицировали на рану микрочастицы сополимера молочной и гликолевой кислот с инкапсулированными пептидами PARI-АР или WPAR1-AP (500 мкМ) в 1% альгинате Na, или полиэлектролитные каррагинан/хитозановые микрокапсулы с растительным экстрактом

подорожника и календулы (10 мг экстракта в 100 мг капсул). Раны контрольной группы мышей покрывали 1% альгинатом Na. Гистологические срезы поврежденной ткани кожи на 3 и 7 сутки после ранения окрашивали гематоксилином и эозином. Интенсивность репаративного процесса в коже оценивали по процентному содержанию макрофагов, нейтрофилов (маркеров воспаления) и фибробластов (маркера пролиферации).

Модель иммобилизационного стресса. Самцам беспородных крыс внутрибрюшинно вводили АРС (0,02 мкг/кг) и через 30 мин. вызывали стресс, иммобилизацией в течение 1 часа. Далее выделяли тучные клетки и исследовали их секреторную активность по освобождению гистамина (см. выше).

Статистическую обработку данных проводили, используя параметрический t-критерий Стьюдента в программе MS Excel и Origin Graph. Результаты представлены как средние значения из 4-5 независимых экспериментов ± стандартная ошибка среднего. Различия считали достоверными при значении р<0.05, п - количество животных в эксперименте.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Функции протеиназ гемостаза в развитии острого экспериментального воспаления (перитонита) у крыс.

До настоящего времени вопрос о взаимосвязи процессов свертывания крови и воспаления остается открытым. Не выяснено как протеиназы гемостаза влияют на иммунокомпетентные клетки, в том числе тучные, при воспалительных реакциях. Среди многочисленных систем медиаторов, активирующихся при воспалении, важная роль принадлежит сериновым протеиназам системы свертывания крови [ЫсЦп^оп е1 а1., 2000; Струкова, 2001; ВсЬоептакегБ е1 а1., 2004; Бако, ВиппеИ, 2005]. Сенсорами протеиназ гемостаза на клетках-мишенях, вовлекаемых в воспалительный процесс, служат рецепторы РАЕэ, которые могут модулировать ответы клеток, включая ответы тучных клеток соединительнотканного типа [Дугина и др., 2002; Со1щЫт, 2005; НоИепЬещ е1 а1., 2008]. Тучные клетки секретируют широкий спектр провоспалительных, вазоактивных медиаторов, ростовых факторов, про- и антикоагулянтов имеющих разнообразные биологические функции, благодаря которым они играют важную роль в клеточных «ансамблях», вовлекающихся в процессы воспаления, свертывания крови и репарацию тканей. В данной работе предпринята попытка выяснить механизмы РАЯ-зависимой активации перитонеальных тучных клеток крыс в норме и активированных при экспериментальном воспалении.

1.1. Динамика появления 1Ь-1В и 1Ь-6 на ранних этапах развития острого воспаления.

Известно, что воспаление приводит к активации тучных клеток и высвобождению ими провоспалительных медиаторов: гистамина, цитокинов (1Ь-1, 1Ь-6, 1Ь-8 и др.), хемокинов, РАБ, и др. Так, секреция гистамина, культивируемыми тучными клетками человека, приводила к активации высвобождения цитокинов: 1Ь-1, 1Ь-6, 1Ь-8, 1Ь-10 и 1Ь-13 [вита ег а1., 2009; ^/аз1ад1 й а1., 2010]. 1Ь-1|3, освобождаемый тучными клетками, стимулировал секрецию 1Ь-6 [СЫ еЬ а1., 2004; Капс1еге-Кг2уЬо\узка а1., 2006]. В нашей работе установлено, что острое экспериментальное воспаление (перитонит) у крыс приводит к повышению концентрации 1Ь-1(3 и 1Ь-6 в тучных клетках и в перитонеальной жидкости. В перитонеальной жидкости мы определяли содержание общего 1Ь-1р и 1Ь-6. который может секретироваться и другими клетками, участвующими в воспалении (нейтрофилами, макрофагами, эпителиальными клетками и др.). Содержание цитокинов возрастало в анализируемые промежутки времени от 30 мин до 4 часов (рис. 1). Вклад тучных клеток в секрецию 1Ь-1Р и 1Ь-6 по сравнению с другими клетками (нейтрофилами, макрофагами, эпителиальными клетками и др.), участвующими в воспалительных процессах, составлял более 50% от суммарного количества цитокинов, секретируемых клетками в перитонеальную полость крыс при воспалении.

0,5

1,5

время, часы

08 тучных «леи™ |в перитонеальной жидкости

0,5

08 тучных клетках I

1,5 4

время,часы :перитонеальной жидкости

Рис. 1. Содержание 1Ь-1Й (А) и 1Ь-6 (Б) в тучных клетках и перитонеальной жидкости крыс при развитии острого воспаления (0-4 часа).

*р<0.01 - по сравнению с контролем (0 мин воспаления); #р<0.05 - по сравнению с концентрацией 1Ь-1В и 1Ь-б в тучных клетках, (п=4).

1.2. Кинетика появления протеиназ гемостаза (тромбина, АРС и фактора Ха) при остром экспериментальном воспалении.

Известно, что при воспалении фенотип эндотелиальных клеток меняется из тромборезистентного в прокоагулянтный и провоспалительный [Strukova, 2006, Levi, 2010]. Активируются проферменты свертывания крови в активные сериновые протеиназы. Ранее в нашей лаборатории было показано увеличение проницаемости эндотелия сосудов тонкого кишечника и появление тромбина в перитонеальной полости крыс впервые 30 мин острого воспаления [Киселева и др., 2004]. Мы предположили, что другие протеиназы гемостаза - фактор Ха, предшествующий тромбину и АРС, образуемый при активации тромбином, связанным с ТМ эндотелия сосудов, из профермента -протеина С - могут проникать в очаг острого воспаления из кровотока, вследствие нарушения проницаемости сосудов. Нами установлено, что индукция экспериментального воспаления у крыс сопровождалась появлением в перитонеальной полости не только тромбина, но также АРС. Максимум активности тромбина наблюдали на 15-й и 90-й минутах воспаления, Мы предположили, что первый пик появления тромбина на 15 мин может быть обусловлен повышением проницаемости эндотелия сосудов и выходом тромбина из сосудистого русла. Второй пик тромбина на 90 мин может быть обусловлен активацией протеиназы в перитонеальной жидкости, т.к. известно, что в моноцитах есть аппарат для синтеза проферментов гемостаза и их активации. С появлением тромбина, связано обнаруженное нами повышение активности АРС с максимумом на 30-й и 120-й минутах развития воспаления, т.к. тромбин активирует PC в форму АРС. (рис. 2). О тесной связи воспаления и свертывания свидетельствует тот факт, что пик генерации тромбина на 90-й минуте совпадает с максимумом дегрануляции тучных клеток, что подтверждает ранее полученные данные, свидетельствующие о том, что тромбин может усиливать активацию тучных клеток при воспалении [Дугина и др., 2002].

Таким образом, острое экспериментальное воспаление приводит к появлению в перитонеальной жидкости протеиназ гемостаза - тромбина и АРС, активации перитонеальных тучных клеток и освобождению ими провоспалительных цитокинов (IL-lp и IL-6). АРС может вносить вклад в стабилизацию тучных клеток.

2. Влияние протеиназ гемостаза (тромбина, АРС и фХа) на секреторную активность перитонеальных тучных клеток крыс в норме, при остром воспалении и роль PAR в ответах клеток.

Тучные клетки наряду с типичными иммунными рецепторами, экспрессируют рецепторы, активируемые протеиназами (PAR) [D'Andréa et al, 1998, Shpacovitch et al., 2008] и секретируют в ответ, как на иммунные, так и неиммунные стимулы целый ряд медиаторов воспаления.

время, мин .

□фиа,раствор |тиошш>лат □физ.растмр |тисгшшг Р 1

Рис. 2. Кинетика появления тромбина (А) и АРС (Б) в перитонеальной жидкости крыс при развитии острого воспаления (15-210 мин).

*р<0.05 - по сравнению с контролем (введение физ. раствора); #р<0.05 - по сравнению с 15-ой минутой воспаления, (п=3-7).

Однако механизмы взаимодействия протеиназ системы гемостаза с тучными клетками изучены недостаточно. Наличие на тучных клетках рецепторов PARs отвечает за их реактивность в отношении протеиназ (тромбина и др.) и определяет вклад тучных клеток в сопряжение процессов воспаления и свертывания [Струкова 2001; Strukova, 2006]. В нашей лаборатории ранее было установлено, что действие тромбина и пептидов-агонистов PARI на тучные клетки реализуется через рецептор PARI и выявлена аутокринная регуляция оксидом азота ответа активированных тучных клеток на PARI-АР [Strukova et al., 1996, 1999; Умарова и др., 2000]. Однако тонкие механизмы действия тромбина на тучные клетки еще не изучены.

2.1. Влияние протеиназ гемостаза (тромбина, АРС и фактора Ха) на секреторную активность перитонеальных тучных клеток в норме и участие рецепторов PAR в действии протеиназ.

Результаты наших исследований показали, что фактор Ха системы гемостаза, образуемый на стадии инициации свертывания крови, в очень низких (пМ) концентрациях, еще до появления тромбина, может проявлять провоспалительную активность, стимулируя секреторную функцию тучных клеток, а в более высоких концентрациях (400 нМ) фХа снижает секрецию гистамина (рис. 3). С помощью антагонистов PARI и PAR2 было доказано, что фактор Ха проявляет провоспалительные свойства, действуя через PAR2, а противовоспалительные свойства - через два подтипа рецепторов - PARI и

PAR2 (рис. 3). В отличие от тучных, эндотелиальных и гладкомышечных клеток сосудов фХа активировал фибробласты через PARI, а не через PAR2 [Blanc-Brude et al., 2005]. В работе Borensztajn et al [2008] показано, что фХа РАЯ2-опосредованным механизмом стимулировал пролиферацию, миграцию и дифференцировку фибробластов в миофибробласты, что могло играть роль в прогрессировании фиброза тканей.

Рис. 3. Влияние фактора Ха (0,08 и 400 нМ) и антагонистов PARI (0.2 мкМ SCH 79797) и PAR2 (0.1 мкМ PAR-3888-PI) на секрецию гистамина тучными клетками.

-------уровень спонтанной активности клеток; *Р<0.05 по отношению к спонтанной

секреции клеток; #Р<0.05 по отношению к действию фактора Ха, п=8.

Тромбин в низких концентрациях (<10 нМ) разнонаправлено влиял на перитонеальные тучные клетки в зависимости от их состояния. Так, тромбин не оказывал влияния на тучные клетки с низкой спонтанной активностью, но стабилизировал спонтанно активированные клетки, снижая секрецию гистамина. В высоких концентрациях тромбин (>10 нМ) усиливал секрецию медиаторов тучных клеток вне зависимости от состояния клеток (рис. 4). С помощью специфического ингибитора PARI нами доказано, что провоспалительное действие высоких концентрации тромбина на тучные клетки реализуется через активацию PARI рецепторов, хотя нельзя исключить участие и других рецепторов (рис. 4).

Другая протеиназа - АРС, регулировала активность тучных клеток крысы, как в норме, так и при их активации неиммунными стимулами (такими как вещество 48/80, высокие концентрации тромбина и др.), снижая секрецию медиаторов воспаления. АРС в узком диапазоне низких концентраций проявлял противовоспалительное действие, снижая секрецию медиаторов ф-гексозаминидазу и гистамин) тучными клетками с разной спонтанной активностью.

+ фХа

45 40

. 35

It t

1 30

I» ■

b 20

R ■

í 15

J 10 5

1 hMThr 10hM Thr ICOhMThr *antPAR1

+Thr

1 hM Thr

lOuMThr 100нМThr

Рис. 4. Влияние тромбина (1-100 нМ) и антагониста PARI (0.2 мкМ SCH 79797) на секрецию гистамина тучными клетками с разной спонтанной активностью.

......спонтанный уровень секреции тучных клеток; *Р<0.05 по отношению к спонтанной

секреции клеток; #Р<0.05 по отношению к действию 100 нМ тромбина, п=9.

Более того, АРС эффективно снижал секрецию гистамина, вызванную дегранулятором - веществом 48/80 или высокими концентрациями тромбина (рис. 5). С помощью специфических антагонистов PARI было показано, что противовоспалительное действие АРС на тучные клетки реализуется через активацию PARI рецепторов, хотя нельзя исключить участие и других рецепторов, например EPCR. Однако данные о присутствии EPCR на тучных клетках отсутствуют в настоящее время. Полагают, что АРС проявляет противовоспалительные свойства, как через активацию только PARI эндотелия [Ludeman et al., 2005] или только EPCR [Esmon, 2005; Xue et al., 2009] эндотелия, так и через активацию обоих рецепторов PARI - EPCR на кератиноцитах человека и эндотелиальных клетках [Xue et al., 2007; Riewald, Ruf, 2005; Bae et al., 2007].

При действии антагонистов PARI и PAR2 на тучные клетки показано, что неселективный пептидный антагонист PARI (cha-cha) в концентрации 0,1 мкМ, селективный антагонист PARI (SCH 79797) в концентрации 0,2 мкМ и антагонист PAR2 (PAR-3888-PI) в концентрациях 0,1-1,3 мкМ, не оказывали влияния на секрецию гистамина тучными клетками в норме, но при этом блокировали действие агонистов PARI (тромбина, АРС) или PAR2 (фХа). В концентрациях 1 - 1000 мкМ антагонисты повышали секрецию гистамина. Можно предположить, что антагонисты PARI и PAR2 рецепторов, вероятно, благодаря своим структурным особенностям, а именно наличию ароматического кольца и кластера с положительно заряженными аминокислотами, в высоких концентрациях являются неселективными активаторами тучных клеток, подобно веществу 48/80.

(Si

................

I *

!«■ rh

i A

I 30 ■

S 20 •

¡10.

О -I—-—I—--

0,1 нМ APC 1 нП APC

Рис. 5. Влияние низких концентраций АРС (0,1-1 нМ) на секрецию гистамина тучными клетками с высокой спонтанной активностью или активированные, высокими концентрациями тромбина (10-100 нМ).

.....спонтанный уровень секреции тучных клеток; *Р<0.05 по отношению к спонтанной

секреции клеток; #Р<0.05 по отношению к действию тромбина, п=7-13.

Есть данные о том, что АРС может активировать как PARI, так и PAR2 рецепторы на эндотелии сосудов. Для проверки предположения о том, что АРС в низких концентрациях проявляет противовоспалительный эффект только через PARl-опосредованный механизм, в следующей серии экспериментов мы исследовали влияние АРС на секрецию гистамина тучными клетками, активированными пептидами - агонистами PARI и PAR2 (PARI-АР и PAR2-AP). АРС в концентрации 5 нМ снижал секрецию гистамина на фоне действия высоких концентраций пептидов-агонистов PARI и PAR2 (рис. 6). Блокирование антагонистом PAR2 не отменяло защитного действия АРС, а антагонистом PARI - предотвращало защитное действие АРС (рис. 6). Это свидетельствует о том, что защитный эффект АРС осуществляется через PARI, но не через PAR2 - опосредованный механизм.

2.2. Влияние АРС на секреторную активность иеритонеальных тучных клеток, активированных в модели острого воспаления и участие рецепторов PAR в действии АРС.

Известно, что помимо антикоагулянтного действия, АРС обладает противовоспалительным действием на эндотелий, которое проявляется в снижении продукции цитокинов, хемокинов, адгезивных молекул, факторов роста и ряда транскрипционных факторов, что приводит к подавлению начальных стадий воспаления и отвечает за его противовоспалительный эффект при системном воспалении и сепсисе [Струкова, 2004;

45 40

t .

■ 30

г» >

- 20

■

Ï"

JL-

МАРС

10 иМ '1 нМ Thr АРС

50 нМ Ч нМ Thr АРС

МОнМЧнМ Thr АРС

; SO-

iî 40 ■

h 30

и ■

г°

110 о

«у

У J> J A

# #

/ J

f t V

tPARI-AP +APC /

/ /

+PAR1-AP «S

+PAR1-AP +APC +PAR1-AP

Рис. 6. Влияние низких концентраций APC (5 нМ) и антагонистов PARI (0.2 мкМ SCH 79797) и PAR2 (0.1 мкМ PAR-3888-PI) на секрецию гистамина тучными клетками, активированными высокими концентрациями пептвдами-агонистами PARI и PAR2 (100 мкМ).

......спонтанный уровень секреции тучных клеток; *Р<0.05 по отношению к спонтанной

секреции клеток, #Р<0.05 по отношению к действию пептидов-агонистов PARI и PAR2, п=10.

Nakamura et al., 2005]. В нашей работе показано, что 30-и минутное экспериментальное острое воспаление приводило к активации тучных клеток и к увеличению секреции гистамина на 40 % по сравнению с нормой (рис. 7). АРС стабилизировал тучные клетки, полученные от животных с острым перитонитом, реализуя свое действие через PARI - опосредованный механизм (рис. 7). Антагонисты PARI и PAR2 рецепторов, также как и АРС, снижали секрецию гистамина из тучных клеток, полученных от животных с острым перитонитом (рис. 7). Можно предполагать, что провоспалительные протеазы (триптаза, химаза тучных клеток) через PAR2, а большие концентрации тромбина, образующиеся при воспалении, через PARI, не могли активировать тучные клетки при блокаде рецепторов антагонистами. При воспалении, видимо, дополнительно экспонируются преформированные PARs и тем самым усиливается ответ тучных клеток при действии агонистов [Dugina et al., 2003]. Это согласуется с данными о том, что увеличивается экспрессия PARI в участках повреждения сосуда, а также в области атеромы [Dery, 1998]. В ранних работах показано, что воспалительные стимулы (IL-1а, TNF-а, LPS) увеличивают экспрессию PAR2, но не PARI в культуре эндотелиальных клеток человека [Nystedt, 1994]. В нашей лаборатории на модели перитонита было показано усиление секреторного ответа тучных клеток на тромбин и

PARI-АР [Dugina et al., 2003]. so

;o ВО -

+APC

Рис. 7. Влияние APC (0,1-5 нМ) и антагонистов PARI (0.2 мкМ SCH 79797) и PAR2 (1 мкМ PAR-3888-PI) на секрецию гистамина тучными клетками, полученными от крыс с острым воспалением (30 мин).

*Р<0.05 по отношению к спонтанной секреции клеток, п=8.

з. Влияние агонистов и антагонистов PAR на выживание перитонеальных тучных клеток при развитии острого воспаления и роль транскрипционного фактора NF-кВ тучных клеток в воспалительном ответе.

В процессы регуляции гибели тучных, эндотелиальных, глиальных, нейронов и других клеток, участвующих в воспалении, пролиферации, ангиогенезе и др., вовлекается транскрипционный ядерный фактор -кВ (NF-кВ), который представляет собой семейство белков, включая субъединицу NF-KBp65 [Strukova, 2006; Song et al., 2009]. Полагают, что одним из основных механизмов действия АРС на клетки эндотелия и лейкоциты является регуляция активации NF-кВ и ингибирование продукции провоспалительного цитокина - TNF-a [Xue et al, 2007, Nielson et al, 2007, Song et al., 2009]. Транскрипционный фактор NF-кВ контролирует экспрессию множества генов, которые играют критическую роль в выживаемости клеток, клеточных циклах, иммунных ответах, ангиогенезе. Мы показали, что острое воспаление приводит к транслокации субъединицы NF-KBp65 в ядро тучных клеток крысы. Этот процесс может приводить к активации генов, ответственных за синтез проапоптотических факторов и гибель клеток. АРС в низких концентрациях (0,1-5 нМ) через PARI супрессировал активацию NF-кВ и запуск провоспалительных и проапоптотических механизмов (рис. 8). Эти результаты согласуются с данными литературы, где было показано, что АРС блокирует транслокацию NF-кВ в ядро эндотелиальных клеток и лейкоцитов

и, как следствие, ингибирует экспрессию адгезивных молекул, цитокинов,

предотвращает апоптоз и модулирует выживаемость клеток [Joyce et al., 2001 ; Levi et al., 2004]. Полагают, что одним из основных механизмов действия АРС на клетки эндотелия сосудов мозга и лёгких, моноциты, фибробласты, нейроны и др., является ингибирование им продукции и функций провоспалительного цитокина - TNF-a, и активации NF-кВ [Таока et al., 1998; Joyce et al., 2001; Isobe et al., 2004; Okajima, 2004; Xue et al., 2007; Nielsen et al., 2007; Gorbacheva et al., 2010]. При тяжелом системном воспалении (менингококковой инфекции и сепсисе) для лечения больных предлагают использовать рекомбинантные препараты активированного протеина С (дротрекогин альфа) [Bernard et al., 2001]. До последнего времени полагали, что в основе антивоспалительного действия АРС лежит усиление барьерной функции эндотелия, что является решающим при лечении препаратами АРС больных сепсисом [Feistritzer, Riewald, 2005; Finigan et al., 2005]. В нашей работе показана возможность реализации антивоспалительного действия АРС через стабилизацию тучных клеток.

□остроевоспаление нМАРС бремя.часы

□острое воспаление It S нМ АРС

Рис. 8. Влияние АРС (1 и 5 нМ) на выживаемость и транслокацию NF-KBp65 в ядро тучных клеток после индукции острого воспаления (0-4 часа). *Р<0.05 по сравнению контрольной группой животных (0 мин. воспаления); #Р<0.05 по сравнению с соответствующей группой животных с острым воспалением, п=10.

4. Протекторное действие агонистов PARI в моделях острого воспаления, стресса, кожных ран у мышей и язвы желудка у крыс. Известно, что АРС может снижать продукцию цитокинов (в частности IL-10, IL-6, IL-8), адгезивных молекул (Р- и Е-селектинов, ICAM-1, VCAM-1) и других провоспалительных молекул, факторов роста и ряда транскрипционных факторов в клетках эндотелия, лейкоцитах, макрофагов, что приводит к подавлению начальных стадий воспаления [Bernard et al., 2001 ; Ely et al., 2003; Esmon, 2003; Струкова, 2004; Ossovskaya, Bunnet, 2004; Levi et

al., 2004; Feistritzer et al., 2006].

4.1. Протекторное действие APC в экспериментальной модели острого воспаления у крыс.

На модели острого воспаления (перитонита) мы показали, что однократное внутрибрюшинное введение АРС уменьшало синтез IL-6 в тучных клетках и дальнейшее его высвобождение в перитонеальную полость (рис. 9). Подобная картина наблюдалась и с освобождением IL-1(3.

4.2. Влияние АРС на секреторную активность псритонеальных тучных клеток при иммобилизационном стрессе.

Известно, что ментальный и окислительный стрессы вызывают повышение проницаемости тонкого кишечника и другие воспалительные ответы, в которых вероятно участвуют медиаторы воспаления, освобождаемые клетками иммунной системы, в том числе тучными клетками [Vergnolle, 2008]. Мы показали, что однократное внутрибрюшинное введение АРС снижает секрецию медиаторов из тучных клеток, полученных от животных, подвергшихся иммобилизационному стрессу. 500 450 400 350 | 300

\ 250 (0

Л 200

150 100 50 0

0 0,5 1,5 4

время, часы

Рис. 9. Влияние АРС на динамику появления IL-6 в тучных клетках и перитонеальной жидкости крыс при развитии острого воспаления (0-4 часа).

Столбики: белые - животные с острьм воспалением (о.в.) (ГЬ-6 в тучных клетках) (п=4), черные - опыт (о.в.) (введение АРС, IL-6 в тучных клетках) (п=4), светло-серые - животные с острьм воспалением (о.в.) (IL-6 в перитонеальной жидкости) (п=4), темно-серые - опыт (о.в.) (введение АРС, IL-6 в перитонеальной жидкости) (п=4). *р<0.05 по сравнению с контрольной группой животных (о.в.).

4.3. Влияние модифицированного пептида-агониста рецептора тромбина (WPAR1-AP) на динамику заживления кожных ран у мышей.

Воспаление является первой фазой заживления ран. Неоднократно

предпринимались попытки использовать тромбин и его пептидные фрагменты как факторы роста при заживлении ран [Carney, 1992; Stienberg., 1993]. В нашей лаборатории было показано, что препараты пептидов-агонистов PARI, иммобилизованные в микрочастицы, ускоряют заживление экспериментальных кожных ран у мышей [Дугина и др., 2004]. АРС и PAR1-AP ингибируют воспаление и способствуют заживлению кожных ран, стимулируя ангиогенез и реэпителизацию тканей [Jackson et al., 2005]. Мы показали, что модифицированный пептид - агонист рецептора тромбина (WPAR1-AP) включается в воспалительную и пролиферативную фазы заживления кожных ран, очевидно, регулируя функции клеток в очаге повреждения и ускоряя заживления ран у мышей.

4.4. Сравнительная характеристика действия агонистов PARI (PAR1-AP, WPAR1-AP, АРС) на процесс заживления ацетатной язвы желудка у крыс.

Известно, что АРС модулирует воспалительные ответы слизистой оболочки кишечника, желудка и двенадцатиперстной кишки при экспериментальной эрозии у животных [Faioni et al., 2004; Isobe et al., 2004], но механизм этих процессов изучен не достаточно. Показана генерация АРС и его противовоспалительная роль при инфицировании желудка Н. pylori [Nakamura et al., 2005]. Активация PARI рецепторов АРС приводит стимуляции пролиферации и миграции культивируемых кератиноцитов [Santulli et al., 1995; Xue et al., 2004] и фибробластов [Chen et al., 1994]. Показано, что плазмин, тромбин и PARI-АР вызывают экспрессию фибробластами мышей богатого цистеином ангиогенного белка Суг-61, вовлекаемого в процессы ангиогенеза и заживления ран [Pendurthi et al., 2002]. Местная аппликация тромбина и PARI-АР на операционную рану усиливает ангиогенез и ускоряет заживление ран у крыс [Strukova et al., 2001; Carney et al., 1992]. Однако y нокаутных по PARI мышей не обнаружено участия агонистов PARI в ускорении заживления ран [Connolly et al., 1997]. Вопрос о роли PARs в хронических или инфекционных заболеваниях ЖКТ еще не решен окончательно [Vergnolle, 2008].

На модели экспериментальной язвы желудка у крыс нами установлено противовоспалительное и ранозаживляющее действие агонистов PARI (АРС, PAR1-AP и WPAR1-AP), инкапсулированных в биодеградабельные микрочастицы или гель (рис. 10). Агонисты PARI в очень низких концентрациях, освобождаясь из полимерных носителей, супрессировали фазу воспаления и сдвигали фазу пролиферации на более ранние сроки, ускоряя заживление экспериментальной язвы желудка у крыс (рис. 10).

100

А 500 , Б

5 50 5 40 * 30 29 10

|б0

450 400 ! 350 I 300 о 250

S 200

¡S 150

маркеры пролиферации

маркеры воспаления

Рис. 10 Изменение содержания маркеров воспаления (А) и пролиферации (Б) под действием агонистов PARI на 3 сутки эксперимента.

1 '- контроль (физ.раствор); 2 - введение PAR1-AP; 3 - введение WPAR1-AP; 4 - введение АРС.

А - суммарное количество нейтрофилов и макрофагов в % от контроля; Б - количество фибробластов в % от контроля; n=3-l 1.

В нашей работе установлено, что острое экспериментальное воспаление приводит к появлению в перитонеальной жидкости протеиназ гемостаза -тромбина и АРС, активации перитонеальных тучных клеток и освобождению ими провоспалительных цитокинов (IL-ip и IL-6). Пик появления тромбина на 90 минуте воспаления совпадает с пиком дегрануляции тучных клеток и предшествует пику появления активированного протеина С (АРС), который может вносить вклад в стабилизацию тучных клеток. Результаты наших исследований показали, что тромбин в низких концентрациях (<10 нМ) разнонаправлено влияет на перитонеальные тучные клетки в зависимости от их состояния. Так тромбин в низких концентрациях не оказывал влияния на тучные клетки с низкой спонтанной активностью, но стабилизировал спонтанно активированные клетки, снижая секрецию медиатора воспаления -гистамина. В высоких концентрациях тромбин (>10 нМ) усиливал секрецию медиаторов тучных клеток вне зависимости от состояния клеток. С помощью специфических ингибиторов PARI показано, что провоспалительное действие тромбина на тучные клетки реализуется через активацию PARI рецепторов. Другая протеиназа - АРС регулировала активность тучных клеток крысы, как в норме, так и при их активации неиммунными стимулами (такими как вещество 48/80, высокие концентрации тромбина и др.), снижая секрецию медиаторов воспаления. АРС в узком диапазоне низких концентраций

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

проявлял противовоспалительное действие, снижая секрецию медиаторов ф-гексозаминидазу и гистамин) тучными клетками с разной спонтанной активностью. Противовоспалительное действие АРС на тучные клетки реализуется через активацию PARI рецепторов. Фактор Ха системы гемостаза, образуемый на стадии инициации свертывания крови, в очень низких (нМ) концентрациях, еще до появления тромбина может проявлять провоспалительную активность, стимулируя секреторную функцию тучных клеток, а в более высоких концентрациях (400 нМ) - снижает секрецию гистамина. Фактор Ха проявляет провоспалительные свойства через рецептор, а противовоспалительные свойства - через два рецептора - PARI и PAR2. Антагонисты PARI и PAR2 рецепторов, благодаря своим структурным особенностям, а именно наличию ароматического кольца и кластера с положительно заряженных аминокислот, в высоких концентрациях являются неселективными активаторами тучных клеток крысы, подобно веществу 48/80. Обнаружено, что 30 минутное экспериментальное острое воспаление приводило к активации тучных клеток и к увеличению секреции гистамина на 40% по сравнению с нормой. АPC стабилизировал тучные клетки, полученные от животных с острым перитонитом, реализуя свое действие через PARI -опосредованный механизм. Антагонисты PARI и PAR2 рецепторов в низких концентрациях, также как и АРС, снижали секрецию гистамина из тучных клеток, полученных от животных с острым перитонитом. Мы показали, что острое воспаление приводит к транслокации субъединицы NF-KBp65 в ядро тучных клеток. Этот процесс приводит к активации генов, ответственных за синтез проапоптотических факторов и гибель клеток. АРС в низких концентрациях (0,1-5 нМ) супрессирует через PARI активацию NF-кВ и запуск провоспалительных и проапоптотических механизмов. На модели острого воспаления мы показали, что однократное внутрибрюшинное введение АРС блокирует синтез IL-1(3 и IL-6 в тучных клетках и дальнейшее их высвобождение в перитонеальную полость. Однократное внутрибрюшинное введение АРС снижает секрецию медиаторов из тучных клеток, полученных от животных подвергшихся иммобилизационному стрессу. Модифицированный пептид - агонист рецептора тромбина (WPAR1-AP) включается в воспалительную и пролиферативную фазы заживления ран, очевидно, регулируя функции клеток в очаге повреждения и ускоряя заживления кожных ран у мышей. На модели экспериментальной язвы желудка у крыс нами установлено противовоспалительное и ранозаживляющее действие агонистов PARI (АРС, PAR1-AP и WPAR1-AP), инкапсулированных в биодеградабельные микрочастицы или гель. Агонисты PARI в очень низких концентрациях, освобождаясь из полимерных носителей, супрессировали фазу воспаления и сдвигали фазу пролиферации на более ранние сроки, ускоряя заживление экспериментальной язвы желудка у крыс.

ВЫВОДЫ

1. Острое воспаление приводит к появлению в перитонеальной жидкости протеиназ гемостаза - тромбина и активированного протеина С (АРС), активации перитонеальных тучных клеток, освобождению ими провоспалительных цитокинов (IL-ip и IL-6) . Пик появления тромбина совпадает с пиком дегрануляции тучных клеток и предшествует пику появления АРС.

2. Действие протеиназ гемостаза (фактора Ха, тромбина и АРС) на секрецию медиаторов воспаления тучными клетками реализуется через PAR-опосредованные механизмы.

3. Противовоспалительное действие низких концентраций АРС (<5 нМ) и тромбина (<10 нМ) и провоспалительное действие высоких концентраций тромбина (>10 нМ) в норме и при воспалении реализуется через PARI рецептор.

4. Фактор Ха (в пМ концентрациях) активирует перитонеальные тучные клетки крыс, повышая секрецию гистамина, а в высоких концентрациях (400 нМ) блокирует секрецию медиатора, стабилизируя тучные клетки. Провоспалительные эффекты фХа реализуются через PAR2, а противовоспалительные - через два рецептора - PARI и PAR2.

5. Тромбин и АРС (в нМ концентрациях) через PAR-зависимый путь защищают тучные клетки от гибели при остром воспалении, блокируя активацию транскрипционного фактора NF-кВ и транслокацию №-кВр65 в ядро. Антагонисты PARI и PAR2 рецепторов (в низкой концентрации) стабилизируют тучные клетки, полученные от животных с острым воспалением, блокируя секрецию гистамина и активацию транскрипционного фактора NF-kB.

6. Однократное внутрибрюшинное введение АРС снижает секрецию цитокинов (IL-113 и IL-6) тучными клетками крыс при остром воспалении и секрецию гистамина и В-гексозаминидазы тучными клетками при иммобилизационном стрессе.

7. На модели язвы желудка у крыс установлено противовоспалительное и ранозаживляющее действие агонистов PARI - активированного протеина С (АРС), пептида - агониста PARI-АР, модифицированного пептида -агониста WPAR1-AP. Агонисты PARI в очень низких концентрациях ингибируют фазу воспаления и сдвигают фазу пролиферации на более ранние сроки, ускоряя заживление экспериментальной язвы желудка у крыс.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Русапова A.B., Макарова A.M., Струкова С.М., Марквичева Е.А., Горбачева JI.P., Сташевская К.С., Васильева Т.В., Сидорова Е.И., Беспалова Ж.Д., Грандфис К. Пептид -агонист рецептора тромбина, иммобилизованный в микросферы, ускоряет репаративные процессы в модели язвы желудка у крыс. // Бюлл.эксп.биол.и мед. -2006. т. 142 (7), с. 42-46.

2. Макарова A.M., Русанова A.B., Горбачева JI.P., Умарова Б.А., Струкова С.М. Влияние активированного протеина С на секреторную активность перитонеальных тучных клеток крысы. // Бюлл.эксп.биол. и мед. -2006. т. 142 (10), с. 382-385.

3. К.С. Сташевская, Е.А. Марквичева, С.М. Струкова, A.B. Русанова, A.M. Макарова, Л.Р. Горбачева, И.А. Прудченко, В.П. Зубов, К Грандфис. Биодеградируемые микрочастицы с иммобилизованным пептидом для заживления ран. // Биомед.химия - 2006. 52 (1), с. 83-94.

4. Markvicheva Е, Stashevskaía К, Strukova S, Prudchenko I, Rusanova A, Makarova A, Vasilieva T, Bespalova J, Grandfis K. Biodegradable microparticles loaded with thrombin receptor agonist peptide for gastric ulcer treatment in rats. // J.Drug Del.Sci.Tech. - 2006.16 (4), P. 321-325.

5. Rusanova A., Makarova A., Gorbacheva L., Vasilieva T., Markvicheva E., Grandfis Ch., Bespalova J., Umarova В., Strukova S. Thrombin receptor agonist peptide as a novel antiulcerogenic factor. // New aspects of biotechn. and medc., Nova Science Publ., Inc.New York, chap. 11, pp 93-101, 2007.

6. Бородина Т.Н., Румш Л.Д., Куничев C.M., Сухоруков Г.Б., Воротсов Г.Н., Фельдман Б.М., Русанова A.B., Васильева Т.В., Струкова С.М., Марквичева В.А. Включение экстрактов лекарственных растений в биодеградабельные микрокапсулы. // Биомед. Химия -2007. 53(6), с. 662-671.

7. A.B. Русанова, Л.Д. Румш, М.Д. Смирнов, С.М. Струкова. Протекторное действие активированного протеина С на тучные клетки. // Сборник статей «ПРОБЛЕМЫ РЕГУЛЯЦИИ ВИСЦЕРАЛЬНЫХ ФУНКЦИЙ» - 2008, г. Минск, Беларусь, с. 175-181.

8. A.B. Русанова, Т.В. Васильева, М.Д. Смирнов, С.М. Струкова. Тучные клетки как мишень антивоспалительного действия АРС. // Цитокины и воспаление - 2009. т. 8, №3, стр. 48-54.

9. Русанова A.B., Струкова С.М., Умарова Б.А., Горбачева Л.Р., Сидорова Е.И., Васильева Т.В., Марквичева Е.А., Грандфис К. Протекторное действие пептида-агониста рецептора тромбина (PARI-АР) в модели язвы желудка у крыс. // Мат. Всерос. конф. "Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром". Ярославль (12-14 окт. 2005), с.91-93.

10. A.B. Русанова, Б.А. Умарова, Л.Р. Горбачева, Т.В. Васильева, М.А. Ланге, К. Грандфис, Е.А. Марквичева, С.М. Струкова. PARI - агонист пептид, биоинкапсулированный в микрочастицы, вызывает ускорение репарации тканей на модели язвы желудка у крыс. // Научные труды I Съезда физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 19-23 сент. 2005), Т 2, N505, С.178.

11. Русанова A.B. Протекторное действие инкапсулированного пептида - агониста рецептора тромбина (PARI-АР) в модели язвы желудка у крыс. // Тезисы докладов XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов -2006», (12-15 апр. 2006), стр.192.

12. Русанова A.B., Макарова A.M., Марквичева Е.А., Грандфис К., Струкова С.М. Пептид -агонист рецептора тромбина, как новый антиульцерогенный фактор. // Материалы Московской международной конференции Биотехнология и медицина (14-17 марта 2006), стр. 217.

13. Макарова A.M., Русанова A.B., Замолодчикова Т.С., Румш Л.Д.., Струкова С.М. Агонисты PAR-рецепторов - модуляторы процессов воспаления и репарации тканей. // Тезисы XIV Международной конференции и дискуссионный научный клуб «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии

IT+M&Ec'». Гурзуф, стр. 232-234.

14. Макарова A.M., Горбачева Л.Р., Русанова A.B., Васильева Т.В, Струкова С.М. Протекторное действие активированного протеина С при воспалении и репарации тканей. // Тезисы XV Международной конференции и дискуссионный научный клуб «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии 1Т+М&Ес'2007». Гурзуф, стр. 286-287.

15. Марквичева Е.А., Сташевская К.С., Бородина Т.Н., Русанова A.B., Струкова С.М., Косачева Т.П., Фельдман Б.М., Ворожцов Г.Н., Румш Л.Д. Включение биологически активных веществ в биодеградируемые микрочастицьЛмикрокапсулы и их применение для репарации тканей. // Тезисы XV Международной конференции и дискуссионный научный клуб «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии 1Т+М&Ес'2007». Гурзуф, стр. 308-309.

16. Русанова A.B., Макарова A.M., Горбачева Л.Р., Марквичева Е.А., Струкова С.М. Протекторное действие инкапсулированного пептида - агониста рецептора тромбина (PAR1-AP) в модели язвы желудка у крыс. // Материалы третьей всероссийской научной конференции с международным участием «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии», (1-3 февраля 2007), стр.209-210.

17. Макарова A.M., Горбачева Л.Р., Русанова A.B., Струкова С.М. Роль рецептора PAR I тучных клеток в противовоспалительном действии активированного протеина С. // Материалы третьей всероссийской научной конференции с международным участием «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии», (1-3 февраля 2007), стр.132-133.

18. A.V. Rusanova, A.M. Makarova, T.V. Vasilieva, S.M. Strukova, Z.D. Bespalova. PAR 1 agonists accelerate ulcer healing in rats. // Abs XXIst Congress of ISTH, Geneva 2007, July 6-12, Abs.P-M-067.

19. A.B. Русанова, Л.Р. Горбачева, С.М. Струкова. Протекторное действие активированного протеина С при заживлении ацетатной язвы у крыс. // VI Всероссийская конференция с международным участием, посвященная 50-летию открытия А. М. Уголевым мембранного пищеварения «МЕХАНИЗМЫ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ВИСЦЕРАЛЬНЫХ СИСТЕМ»,30 сентября-2 октября 2008, Санкт-Петербург, с. 56.

20. A.B. Русанова, Л.Р. Горбачева, С.М. Струкова. Противовоспалительное действие активированного протеина с на тучные клетки. // Всероссийская конференция с международным участием «Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению», 16-18 октября 2008, г. Москва, с.106-107.

21. Русанова A.B., Струкова С.М. Агонисты рецептора тромбина PAR 1 (PARI -АР, WPAR1-AP и АРС) как новые антиульцерогенные факторы. II Научные труды II Съезда физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека», 29-31 октября 2008, г. Кишинэу, Молдова, с.37.

22. A.B. Русанова, С.М. Струкова. Влияние активированного протеина С (АРС) на секреторную функцию тучных клеток крысы при остром воспалении и стрессе. // Материалы четвертой всероссийской научной конференции с международным участием «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии», 4-6 февраля 2009, стр.428-429.

23. Русанова A.B., Васильева Т.В., Смирнов М.Д, Струкова С.М. Антивоспалительное и антиульцерогенное действие активированного протеина С. // Материалы седьмой научной конференции с международным участием «Гемореология и микроциркуляция», 12-15 июня 2009, стр.153.

24. Rusanova A, Ishiwata S, Strukova S. Activated protein С inhibits histamine release and activation of NFkB in mast cell from rats under normal conditions and acute inflammation. // Abs XXIIst Congress of ISTH, Boston 2009, July '10-17, Journal of Thrombosis and Haemostasis; Volume 7, Supplement 2: Abstract PP-MO-875.

25. Русанова А.В., Струкова С.М. Вклад тучных клеток в реализацию противовоспалительного действия АРС. // Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Тромбозы, кровоточивость, ДВС - синдром: современные подходы к диагностике и лечению», 26-28 ноября 2009, стр. 101-102.

26. Русакова А.В, Кассарина Н.В, Михайлова А.Г, Румш Л.Д, Струкова С.М. Влияние активированного протеина С (АРС) и энтеропептидазы (ЭП) на секреторную функцию тучных клеток. // Тезисы докладов XXI Съезда физиологического общества им. И. П. Павлова, 19-25 сентября 2010, г. Калуга, стр.525.

Заказ №76. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палпха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Русанова, Анна Викторовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Механизмы воспаления, репарации тканей и сопряжение этих процессов с активацией свертывания крови.

1.1. Воспаление и его механизмы.

1.1.1. Свертывание крови при воспалении.

1.1.2. Участие тучных клеток в воспалительной реакции.

1.2. Репарация тканей и ее механизмы.

Глава 2. Участие протеиназ гемостаза (фактора Ха, тромбина и АРС) в регуляции процессов свертывания крови и воспаления.

2.1. Ключевые протеиназы гемостаза (фактор Ха, тромбин и АРС) и их полифункциональность.

2.1.1. Фактор Ха и его свойства.

2.1.2. Тромбин и его свойства.

2.1.3. Активированный протеин С и его свойства.

2.2. Рецепторы, активированные протеиназами, ключевое звено в регуляции клеточных процессов сериновыми протеиназами.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 3. Материалы и методы исследования.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 4. Функции протеиназ гемостаза в развитии острого экспериментального воспаления (перитонита) у крыс.

4.1. Динамика появления интерлейкинов (IL-1В и IL-6) на ранних этапах развития острого воспаления.

4.2. Дегрануляция перитонеальных тучных клеток как характеристика воспаления.

4.3. Кинетика появления протеиназ гемостаза (тромбина, АРС и фактора Ха) при остром экспериментальном воспалении.

Глава. 5. Влияние протеиназ гемостаза (тромбина, АРС и ф Ха) на секреторную активность перитонеальных тучных клеток крыс в норме, при остром воспалении и роль PAR в ответах клеток.

5.1. Влияние протеиназ гемостаза (тромбина, АРС и фактора Ха) на секреторную активность перитонеальных тучных клеток в норме.

5.2. Участие рецепторов PAR в механизмах действия протеиназ гемостаза (фактора Ха, тромбина и АРС) на активность перитонеальных тучных клеток в норме.

5.3. Влияние АРС на секреторную активность перитонеальных тучных клеток, активированных в модели острого воспаления и участие рецепторов PAR в действии АРС.

Глава. 6. Влияние агонистов и антагонистов PAR на выживаемость перитонеальных тучных клеток при развитии острого воспаления и роль транскрипционного фактора NF-кВ в воспалительном ответе.

Глава. 7. Протекторное действие агонистов PARI в моделях острого воспаления, стресса, кожных ран у мышей и язвы желудка у крыс.

7.1. Протекторное действие АРС в экспериментальной модели острого воспаления у крыс.

7.2. Влияние АРС на секреторную активность перитонеальных тучных клеток при иммобилизационном стрессе.

7.3. Влияние модифицированного пептида-агониста рецептора тромбина (WPAR1-АР) и растительного экстракта (Plantago + Calendula) на динамику заживления кожных ран у мышей.

7.4. Влияние активированного протеина С (АРС) на динамику заживления ацетатной язвы у крыс.

7.5. Сравнительная характеристика действия агонистов рецептора тромбина 1 (PAR1-АР, WPAR1-AP, АРС) и растительного экстракта на процесс заживления ацетатной язвы желудка у крыс.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "PAR-зависимая регуляция активности тучных клеток при воспалении"

Актуальность проблемы

Одной из фундаментальных проблем современной физиологии является понимание механизмов действия протеиназ гемостаза в ходе воспалительных и репаративных процессов в тканях. Основные усилия направлены на выяснение механизмов запуска и развития воспалительных процессов после травматического повреждения тканей с целью поиска путей быстрого и эффективного восстановления функций клеток и тканей. При повреждении тканей активируются процессы воспаления и свертывания крови, образуется целый ряд протеиназ системы гемостаза, в том числе — фактор Ха (фХа), тромбин и активированный протеин С (APC) [Esmon, 2005; Strukova, 2006; Jackson, Xue, 2008].

В настоящее время тромбин рассматривают как регуляторный полифункциональный фактор важных физиологических и патофизиологических процессов. Взаимодействуя со своими рецепторами на клетках-мишенях, он вызывает агрегацию тромбоцитов, .повышение проницаемости эндотелия, экспрессию Р-селектина на эндотелиоцитах, адгезию лейкоцитов, проявляя, таким образом, свое провоспалительное влияние. Вместе с тем, тромбин обладает противовоспалительными и пролиферативными свойствами, активируя высвобождение факторов роста, пролиферацию клеток эпителия, гладкомышечных и др. клеток, образование оксида азота (NO), который блокирует адгезию моноцитов и тромбоцитов к эндотелию. Важным аспектом действия тромбина является активация протеина С (PC) - превращение его в АРС, сериновую протеиназу с сильным противовоспалительным потенциалом. Тромбин реализует свое действие на клетки через рецепторы, активируемые протеиназами (PARs) [Coughlin, 2000; Strukova, 2006; Martorell et al., 2008]. Функции другой сериновой протеиназы свертывания крови — фХа, вне гемостаза мало изучены.

В последнее время активно развивается представление о противовоспалительном и антиапоптотическом действии АРС на эн д отели ал ьные клетки, моноциты, нейроны и др. клетки, а также о его протекторном действии при системном воспалении и сепсисе [Mosnier, Griffin, 2006; Xue et al., 2009; Jackson et al., 2009; Gorbacheva et al., 2010]. Показано взаимодействие APC с двумя мембранными рецепторами на эндотелии -эндотелиальным рецептором протеина С (EPCR) и PARI [Riewald, Ruf, 2005; Feistritzer et al., 2006; Mosnier, Griffin, 2006].

PARs относятся к суперсемейству семидоменных трансмембранных рецепторов, сопряженных с G-белками. PARs отличаются уникальным механизмом активации, вследствие протеолитического расщепления одной пептидной связи во внеклеточном домене рецептора. При этом освобождается новый N-концевой участок рецептора, так называемый «привязанный лиганд» - агонист рецептора. Взаимодействие «привязанного лиганда» с доменом второй внеклеточной петли рецептора запускает активацию клеток. Агонистами PARs являются сериновые протеиназы, в том числе участники каскада свертывания крови, а так же ряд синтетических пептидов, гомологичных по структуре «привязанному лиганду» [Струкова, 2004; Дугина и др. 2004; Coughlin, 2005; Steinhoff et al, 2005; Ossovskaya, Bunnett, 2004; Hollenberg et al., 2005]. Известны четыре члена семейства PAR: PARI, 3 и 4 - рецепторы тромбина и РAR2 - рецептор трипсина, триптазы тучных клеток, факторов свертывания крови - Ха и Vila в комплексе с тканевым фактором (TF) [Hollenberg, Compton, 2002; Hollenberg et al., 2005; Steinhoff et al., 2005]. PARs широко экспрессируются в клетках основных защитных тканей организма: эпителии, эндотелии сосудов и др., что позволяет предполагать их участие в осуществлении острых защитных реакций и патогенезе хронических процессов при воспалении и репарации тканей [Steinhoff et al.,2004; Olianas et al., 2007; Nickel et al., 2006; Jackson, Xue, 2008].

Известно, что при воспалении активируются тучные клетки и освобождают широкий спектр провоспалительных медиаторов, в том числе гистамин, [}-гексозаминадазу, протеазы, цитокины, NO и др. [Макарова и др., 2006; Church et al., 2008]. Роль ключевых сериновых протеиназ в механизмах, ответственных за запуск, развитие и/или регуляцию воспалительных и репаративных процессов в тканях еще не достаточно исследована, хотя известно, что повышается экспрессия PARs на поверхности клеток, участвующих в основных этапах репарации тканей (воспалении, пролиферации клеток и созревании ткани) [Steinhoff et al.,2004; Strukova, 2006]. Ранее в нашей лаборатории было установлено PARI-опосредованное действие тромбина и пептидов - агонистов PARI (PARI-АР) на тучные клетки и выявлена аутокринная регуляция оксидом азота ответа тучных клеток [Strukova et al., 1996, 1999; Dugina et al., 2003]. На модели острого перитонита у крыс было показано усиление секреции медиаторов тучными клетками в ответ на действие PARI-АР, что свидетельствует о дополнительном экспонировании PARI на тучных клетках в условиях воспаления [Dugina et al., 2003]. Показано, что иммобилизованный в полимерные матрицы PARI-АР, ускоряет заживление кожных ран, что подтверждает регуляторную функцию агонистов PARI при воспалении - первой фазе заживления ран [Strukova et al., 2001; Дугина и др., 2004]. Показано, что действие АРС на тучные клетки реализуется через активацию PARI, поскольку их десенситизация тромбином предотвращает вызываемое АРС снижение секреции р-гексозаминидазы [Макарова и др., 2006]. Механизмы протекторного или повреждающего действия протеиназ гемостаза при остром воспалении мало изучены. Также не ясно участие PAR в активации транскрипционных факторов тучных клеток.

В процессе гибели/выживаемости эндотелиальных, тучных, моноцитов и других клеток, участвующих в воспалении, пролиферации, ангиогенезе и др. вовлекается транскрипционный фактор NF-кВ (семейство пяти ДНК-связывающих белков, включая NF-KBp65 (RelA)). Получены данные о том, что активация NF-кВ в моноцитах и клетках эндотелия, которая ведет к фосфорилированию и деградации его ингибитора IkBs и транслокации субъединиц NF-кВ в ядро, вносит вклад как в гибель клеток при воспалении, так и в выживание клеток, повышая экспрессию антиапоптотических генов [Levi et al., 2004; Joyce et al., 2001].

Роль PAR рецепторов в действии тромбина и АРС на выживаемость и гибель тучных клеток при развитии острого воспаления изучена не достаточно. Имеется мало данных о влиянии фактора Ха, тромбина и АРС на секрецию гистамина перитонеальными тучными клетками в норме и при воспалении. О рецепторном механизме действия протеиназ гемостаза на эти клетки в норме и при воспалении, их влиянии на активность транскрипционного фактора NF-кВ в перитонеальных тучных клетках.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось выяснение механизмов действия ключевых протеиназ гемостаза (фХа, тромбина и АРС) как регуляторов активности тучных клеток на ранних стадиях острого перитонита.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить кииетику появления эндогенных протеиназ гемостаза на начальных этапах развития острого воспаления и сравнить ее с появлением медиаторов воспаления - IL-1 р и IL-6.

3. Выяснить роль PAR в секреторном ответе тучных клеток на действие протеиназ гемостаза в норме и при остром воспалении.

6. Исследовать протекторное действие агонистов PARI в моделях острого воспаления, стресса, кожных ран у мышей и язвы желудка у крыс.

Научная новизна работы

Впервые обнаружено, что:

• маркеры воспаления - IL-ip и IL-6 появляются в перитонеальной полости и в тучных клетках крыс на начальных этапах развития острого экспериментального воспаления; однократное внутрибрюшинное введение АРС при остром воспалении снижает секрецию IL-ip и IL-6 тучными клетками;

• фактор Ха (в пМ концентрациях) активирует перитонеальные тучные клетки крыс, повышая секрецию гистамина, а в высоких концентрациях (нМ) блокирует секрецию медиатора, стабилизируя тучные клетки. Эти эффекты фХа реализуются через два рецептора - PARI и PAR2;

• антагонисты PARI и PAR2 рецепторов (в низкой концентрации (<1 мкМ)) стабилизируют тучные клетки, полученные от животных с острым воспалением, блокируя секрецию гистамина и активацию транскрипционного фактора NF-kB;

• тромбин и АРС (в нМ концентрациях) защищают тучные клетки от гибели, блокируя активацию транскрипционного фактора NF-kB и транслокацию NF-KBp65 в ядро;

• однократное внутрибрюшинное введение АРС снижает секрецию медиаторов воспаления из тучных клеток, полученных от животных, подвергшихся иммобилизационному стрессу;

• агонисты PARI (АРС, пептид — агонист PARI, модифицированный пептид -агонист WPAR1-AP) проявляют противовоспалительное и ранозаживляющее действие на модели экспериментальной язвы желудка у крыс. Агонисты PARI в очень низких концентрациях (нМ), освобождаясь из полимерных носителей, супрессируют фазу воспаления и сдвигают фазу пролиферации на более ранние сроки, ускоряя заживление экспериментальной язвы желудка у крыс.

Теоретическая и практическая значимость работы

Важность работы для фундаментальной физиологии и практической медицины обусловлена необходимостью понимания механизмов действия протеиназ гемостаза при воспалении. Выявлен NF-кВ-зависимый механизм протекторного действия низких концентраций АРС и тромбина на тучные клетки при остром воспалении. Обнаружено провоспалительное действие низких концентраций и противовоспалительное действие высоких концентраций фактора Ха. Показано, что агонисты PARI (АРС и пептиды -агонисты PARI) в низких концентрациях и при однократном введении ускоряют заживление экспериментальной язвы желудка у крыс.

Данные о прямом цитопротекторном действии протеиназ гемостаза могут служить основой для разработки новых подходов к лечению воспалительных процессов и создания на базе агонистов и антагонистов PAR препаратов с противовоспалительными, противоапоптотическими и репаративными свойствами. Апробация материалов диссертации

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 26 печатных работ (в том числе 8 статей) в отечественной и зарубежной печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах и включает введение, обзор литературы, описание объекта и методов исследования, результаты, обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы (содержит 247 источника). Работа иллюстрирована 51 рисунками и 3 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Русанова, Анна Викторовна

выводы

5. Тромбин и АРС (в нМ концентрациях) через PAR-зависимый путь защищают тучные клетки от гибели при остром воспалении, блокируя активацию транскрипционного фактора NF-кВ и транслокацию NF-KBp65 в ядро. Антагонисты PARI и PAR2 рецепторов (в низкой концентрации) стабилизируют тучные клетки, полученные от животных с острым воспалением, блокируя секрецию гистамина и активацию транскрипционного фактора NF-kB.

6. Однократное внутрибрюшинное введение АРС снижает секрецию цитокинов (IL-1В и IL-б) тучными клетками крыс при остром воспалении и секрецию гистамина и В-гексозаминидазы тучными клетками при иммобилизационном стрессе.

7. На модели язвы желудка у крыс установлено противовоспалительное и ранозаживляющее действие агонистов PARI — активированного протеина С (АРС), пептида - агониста PARI-АР, модифицированного пептида - агониста WPAR1-AP. Агонисты PARI в очень низких концентрациях ингибируют фазу воспаления и сдвигают фазу пролиферации на более ранние сроки, ускоряя заживление экспериментальной язвы желудка у крыс.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В нашей работе установлено, что острое экспериментальное воспаление приводит к появлению в перитонеальной жидкости протеиназ гемостаза - тромбина и АРС, активации и дегрануляции перитонеальных тучных клеток и освобождению ими провоспалительных цитокинов (IL-ip и IL-6). Пик появления тромбина на 90-й минуте воспаления совпадает с пиком дегрануляции тучных клеток и предшествует пику появления активированного протеина С (АРС), который может вносить вклад в стабилизацию клеток. Фактор Ха системы гемостаза, образуемый на стадии инициации свертывания крови, в очень низких (пМ) концентрациях, еще до появления тромбина может проявлять провоспалительную активность, стимулируя секреторную функцию тучных клеток, а в более высоких концентрациях (80-400 нМ) - снижает секрецию медиатора - гистамина. Фактор Ха проявляет провоспалительные свойства через PAR2, а противовоспалительные свойства - через два рецептора - PARI и PAR2. Результаты наших исследований показали, что тромбин в низких концентрациях (<10 нМ) разнонаправлено влияет на перитонеальные тучные клетки (ПТК) в зависимости от их состояния. Так, тромбин не оказывал влияния на ПТК с низкой спонтанной активностью, но стабилизировал спонтанно активированные клетки, снижая секрецию медиатора воспаления - гистамина. В высоких концентрациях тромбин (>10 нМ) усиливал секрецию медиаторов ПТК вне зависимости от состояния клеток. С помощью специфических ингибиторов PARI показано, что провоспалительное действие тромбина на тучные клетки реализуется через активацию PARI рецепторов. Другая протеиназа - АРС регулировала активность ПТК крысы, как в норме, так и при их активации неиммунными стимулами такими как вещество 48/80, высокие концентрации тромбина и др.), снижая секрецию медиаторов воспаления. АРС в узком диапазоне низких концентраций проявлял противовоспалительное действие, снижая секрецию медиаторов ф-гексозаминидазы и гистамина) тучными клетками с разной спонтанной активностью.

Противововоспалительное действие АРС на тучные клетки реализуется через активацию

PARI рецепторов. Антагонисты PARI и PAR2 рецепторов, благодаря своим структурным особенностям, а именно наличию ароматического кольца и кластера положительно заряженных аминокислот, в высоких концентрациях являются неселективными активаторами ПТК крысы, подобно веществу 48/80. Обнаружено, что 30-и минутное экспериментальное острое воспаление приводило к активации тучных клеток и к увеличению сеТсреции гистамина на 40% по сравнению с нормой. АРС стабилизировал

ПТК, полученые от животных с острым перитонитом, реализуя свое действие через

PARl-опосредованный механизм. Антагонисты PARI и PAR2 рецепторов, также как и

126

APC, снижали секрецию гистамина из ПТК, полученных от животных с острым перитонитом. Мы впервые показали, что острое воспаление приводит к транслокации субъединицы NF-KBp65 в ядро тучных клеток. Этот процесс приводит к активации генов, ответственных за синтез проапоптотических факторов и гибель клеток. АРС в низких концентрациях (0,1-5 нМ) супрессирует через PARI активацию NF-кВ и запуск провоспалительных и проапоптотических механизмов. На модели острого воспаления мы показали, что однократное внутрибрюшинное введение АРС блокирует синтез IL-1(3 и IL-6 в ПТК и дальнейшее их высвобождение в перитонеальную полость. Однократное внутрибрюшинное введение АРС снижает секрецию медиаторов из ПТК, полученных от животных, подвергшихся иммобилизационному стрессу. Модифицированный пептид-агонист рецептора тромбина (WPAR1-AP) включается в воспалительную и пролиферативную фазы заживления ран, очевидно, регулируя функции клеток в очаге повреждения и ускоряя заживления кожных ран у мышей. На модели экспериментальной язвы желудка у крыс нами установлено противовоспалительное и ранозаживляющее действие агонистов PARI (АРС, PAR1-AP и WPAR1-AP), инкапсулированных в биодеградабельные микрочастицы или гель. Агонисты PARI в очень низких концентрациях (нМ), освобождаясь из полимерных носителей, супрессировали фазу воспаления и сдвигали фазу пролиферации на более ранние сроки, ускоряя заживление экспериментальной язвы желудка у крыс.

Таким образом установлено, что ключевые протеиназы гемостаза (фактор Ха, тромбин и АРС) вносят существенный вклад в регуляцию PAR-зависимой активности тучных клеток при остром воспалении и репарацию тканей при их повреждении.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Русанова, Анна Викторовна, Москва

1. Балезина О.П., Герасименко Н.Ю., Дугина Т.Н., Струкова С.М. Особенности нейротропного действия тромбина // Успехи физиол. наук. 2004. 35(3) — С. 37-49.

2. Гончарова Н.Ю., Зеленина Е.В., Аврамова J1.B. II изозим гексокиназы имеет участок, ответственный за взаимодействие фермента с митохондриальными мембранами. // Биохимия 1994. 6. - С. 826-838.

3. Горбачева JI.P., Сторожевых Т.П., Пинелис В.Г., Ишивата С., Струкова С.М. Модуляция тромбином и фактором Ха выживаемости гиппокампальных нейронов // Биохимия. 2006. 71(10). - С. 1338-1346.

4. Дериан С.К., Демиано Б.П., Д'Андре М.Р., Андраде-Гордон П. Регуляция тромбином клеточной функции через рецепторы, расщепляемые протеиназами: применение для терапии // Биохимия. 2002. 67(1). - С. 66-76.

5. Дугина Т.Н., Киселева Е.В., Чистов И.В., Умарова Б.А., Струкова С.М. Рецепторы семейства PAR связующее звено процессов свертывания крови и воспаления. // Биохимия. - 2002. 67(1). - С. 77-87.

6. Киселева Е.В., Сторожевых Т.П., Пинелис В.Г., Глуза Е., Струкова С.М. Участие тромбина в активации нейронов гиппокампа крысы // Бюлл.эксп.биол.мед. 2004. 134(5). -С. 519-523.

7. Колодзейская М.В., Соколовская Л.И., Волков Г.Л. Роль А-цепи в функционировании активного центра а-тромбина человека (обзор) // Биохимия. — 2008. 73(3).-С. 293-301.

8. Макарова A.M., Русанова A.B., Горбачева Л.Р., Умарова Б.А., Струкова С.М. Влияние активированного протеина С на секреторную активность перитонеальных тучных клеток крысы // Бюлл. эксп. биол. мед. 2006. 142(10). - С. 382-385.

9. Мейл Д., Бростофф Дж., Рот Д. Б., Ройт А. Иммунология // Изд. «Логосфера», Москва-2007.w i \

10. Пастушенков JI.B., Пастушенков А. Л., Пастушенков B.J1. Лекарственные растения. Лениздат, 1990.

11. Русанова А. В., Васильева Т. В., Смирнов М. Д., Струкова С.М. Тучные клетки как мишень антивоспалительного действия АРС // Цитокины и воспаление — 2009. 8(3). С. 48-54.

12. Струкова С.М. Роль тромбоцитов и сериновых протеиназ в сопряжении свертывания крови и воспаления // Биохимия. 2004. 69. - С. 1314-1331.

13. Струкова С.М. Тромбин регулятор процессов воспаления и репарации тканей. -Биохимия. - 2001. 66. - С. 14-27.

14. Струкова С.М., Дугина Т.Н., Киреева Е.Г и др. Регуляция тромбоцитостимулирующей и других активностей тромбина // Вестн. АМН СССР. 1991. 1.-С. 28-33.

15. Струкова С.М., Киреева Е.Г., Дугина Т.Н. Механизмы взаимодействия тромбина с клетками. Взаимодействие тромбина с клетками эндотелия, тучными и другими. // Вестник МГУ. Биология. 1997. 1. - С. 8-13.

16. Струкова С.М., Серейская A.A., Осадчук Т.В. Структурные основы специфичности тромбина // Усп. совр. биол. 1989. 107. - С. 41-54.

17. Струкова С.М., Чистов И.В., Умарова Б.А., Дугина Т.Н., Сторожевых Т.П., Пинелис В.Г., Глуза Э. Модуляция активности тучных клеток пептидом-агонистом рецептора тромбина: роль оксида азота. // Биохимия. 1999. 64(6). - С. 790-799.

18. Умарова Б.А., Дугина Т.Н., Шестакова Е.В., Глуза Э., Струкова С.М. Активация тучных клеток крысы при стимуляции рецептора, активируемого протеазой (PARI). // Бюлл. экспер. биол. мед. 2000. 5. - С. 370-373.

19. Умарова Б.А., Струкова С.М., Шапиро Ф.Б., Коган А.Е., Кулиева С.В. Участие тромбина в активации секреции гепарина тучными клетками при иммобилизационном стрессе у крыс. // Бюлл.экспер.биол.мед. 1997. 2. - С. 143-145.

20. Шаехова Н.В., Попов Г.К., Астахова Л.В., Лалаян Т.В. Роль микроокружения спинномозговых нервов в формировании болевой чувствительности. // Известия Челябинск, науч. центра. 2001. 4 (13). - С. 77-81.

21. Abraham Е., Laterre P., Garg R., Levy Н., Talwar D., Trzaskoma M.S., et al. Drotrecogin Alfa (Activated) for adults with severe sepsis and a low risk of death // N Engl J Med. 2005. 353. - P.1332-1341.

22. Ando S., Otani H., Yagi Y., Kawai K., Araki H., Fukuhara Sh., Inagaki Ch. Proteinase-activated receptor 4 stimulation-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells // Resp. Res. 2007. - P. 8-31.

23. Aridor M., Raimilevich G., Beaven M.A., Sagi-Eisenberg R. Activation of exocytosis by the heterotrimeric G protein Gi3. // Science. 1993. 262 (5139). - P. 1569-1572.

24. Artuc M., Hermes B., Algermissen B. and Henz B.M. Expression of prothrombin, thrombin and its receptors in human scars. // Exp Dermatol. 2006. 15(7). - P. 523-529.

25. Ayala Y.M., Cantwell A.M., Rose T., Bush L.A., Arosio D., Di Cera E. Molecular mapping of thrombin-receptor interactions // Proteins. 2001. 1;45(2). - P. 107-16.

26. Bachli E.B., Pech C.M., Johnson K.M., Johnson D.J., Tuddenham E.G., and McVery J.H. Factor Xa and thrombin, but not factor Vila, elicit specific cellular responses in dermal fibroblasts // J. Thromb. Haemost. 2003. 1. - P. 1935-1944.

27. Bae JS., Yang L., Rezaie AR. Receptors of the protein C activation and activated protein C signaling pathways are colocalized in lipid rafts of endothelial cells. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2007. 104(8). - P. 2867-72.

28. Balazs A.B., Fabian A.J., Esmon Ch.T., and Mulligan R.C. Endothelial protein C receptor (CD201) explicitly identifies hematopoietic stem cells in murine bone marrow // Blood. 2006. 107(6).-P. 2317-2321.

29. Beg A.A., Sha W.C., Bronson R.T., Ghosh S., Baltimore D. Embryonic lethality and liver degeneration in mice lacking the RelA component of NF-kB // Nature. 1995. 376. - P. 167-70.

30. Bernard G.R., Vincent J.-.L, Laterre P.-F., LaRosa S.P., Dhainaut J.-F., Lopez-Rodriguez A., et al. Efficacy and safety of recombinant human activated protein C for severe sepsis // N Engl J Med.- 2001. 344. P. 699-709.

31. Birukova A. A., Birukov K. G., Smurova K., Adyshev D., Kaibuchi K., Alieva I., Garcia J. G. N., Verin A. D. Novel role of microtubules in thrombin-induced endothelial barrier dysfunction // FASEB J. 2004. 18. - P. 1879-1890.

32. Bischoff S.C. Role of mast cells in allergic and non-allergic immune responses: comparison of human and murine data. // Nature reviews. 2007. 7. - P. 93-104.

33. Blanc-Brude O.P., Archer F., Leoni P., Derian C., Bolsover S., Laurent G.J., Chambers R.C. Factor Xa stimulates fibroblast procollagen production, proliferation, and calcium signaling via PARI activation//Exp Cell Res. -2005. 10;304(1). P. 16-27.

34. Bock P. E., Panizzi P., Verhamme I. M. A. Exosites in the substrate specificity of blood coagulation reaction // J Thromb Haemost. 2007. 5(1). - P. 81-94.

35. Bohuslav J., Chen L.-f., Kwon H., Mu Y., Greene W.C. p53 Induces NF-kB Activation by an IkB Kinase-independent Mechanism Involving Phosphorylation of p65 by Ribosomal S6 Kinase 1 // J Biol Chem. 2004. 279; 25(18). - P. 26115-26125.

36. Borensztajn K., Stiekema J., Nijmeijer S., Reitsma P., Peppelenbosch M., Spek A. Factor Xa Stimulates Proinflammatory and Profibrotic Responses in Fibroblasts via Protease-Activated Receptor-2 Activation // AJP 2008. 172(2). - P. 309-320.

37. Bradford M.M. A rapid sensitive method for the principle of protein-dye binding. // Anal. Biochem. 1976. 72. - P. 248-254.

38. Brohi K., Cohen M.J., Ganter M.T., Matthay M.A., Mackersie R.C., Pittet J.F. Acute traumatic coagulopathy: initiated by hypoperfusion: modulated through the protein C pathway? // Ann Surg. 2007. 245(5). - P. 812-8.

39. Buresi M.C., Buret A.G., Hollenberg M.D., Mac Naughton W.K. Activation of proteinase activated receptor 1 stimulates epithelial chloride secretion through a unique MAP kinase- and cyclooxygenase- dependent pathway // FASEB J. 2002. 16. - P. 1515-1525.

40. Bushell T. The emergence of proteinase-activated receptor-2 as a novel target for the treatment of inflammation-related CNS disorders // J Physiol. 2007. 581. -P. 7-16.

41. Camerer E., Huang W., Coughlin S.R. Tissue factor- and factor X-dependent activation of protease-activated receptor 2 by factor Vila // PNAS. 2000. 97(10). - P. 5255-5260.

42. Chen Y.H., Pouyssegur J., Courtneidge S.A. and Van Obberghen-Schilling E. Activation of Src family kinase activity by the G protein-coupled thrombin receptor in growth-responsive fibroblasts. // J Biol Chem. 1994. 269. - P. 27372-27377.

43. Cheng T., Liu D., Griffin J.H., Fernandez J.A., Castellino F., Rosen E.D., et al. Activated protein C blocks p53-mediated apoptosis in ischemic human brain endothelium and is neuroprotective //Nat Med. 2003. 9. - P. 338-342.

44. Chien E.K., Sweet L., Phillippe M., Marietti S., Kim T.T., Wolff D.A., Thomas L., Bieber E. Protease-activated receptor isoform expression in pregnant and nonpregnant rat myometrial tissue // J Soc Gynecol Investig. 2003. 10(8). - P. 460-8A

45. Church M., Shute J., Sampson A. Mast cells derived mediators. // Elsevier Health Sciences-2008. 13.-P. 189-213.

46. Cirino G., Cicala C., Bucci M.R., Sorrentino L., Maraganore J.M., Stone S.R. Thrombin functions as an inflammatory mediator through activation of its receptor. // J Exp Med. 1996. 183.-P. 821-827.

47. Cirino G., Napoli C., Bucci M.R., Cicala C. Inflammation-coagulation network: are serine protease receptors the knot? // Trends Pharmacol Sci. 2000. 21(5). - P. 170-172.

48. Coelho A.M., Ossovskaya V., Bunnett N.W. Proteinase-activated receptor-2: physiological and pathophysiological roles // Curr Med Chem Cardiovasc Hematol Agents. -2003. 1(1).-P. 61-72.

49. Connolly A.J., Suh D.Y., Hunt T.K., and Coughlin S.R. Mice lacking the thrombin receptor, PARI, have normal skin wound healing. // Am J Pathol. 1997. 151. - P. 1199-1204.

50. Coughlin S.R. How the protease thrombin talks to cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1999. 96.-P. 11023-11027.

51. Coughlin S.R. Protease-activated receptors and platelet function // Thromb. Haemost. -1999. 82.-P. 353-356.

52. Coughlin S.R. Protease-activated receptors in hemostasis, thrombosis and vascular biology // J Thromb Haemost. 2005. 3(8). - P. 1800-1814.

53. Coughlin S.R. Protease-activated receptors in the cardiovascular system // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 2002. 67. - P. 197-208.

54. Coughlin S.R. Protease-activated receptors in vascular biology // Thromb. Haemost. -2001.86.-P. 298-307.

55. Coughlin S.R. Thrombin signaling and protease activated receptors // Nature. 2000. 407. , - P. 258-264.

56. Dahlback B., Villoutreix B.O. Regulation of Blood Coagulation by the Protein C Anticoagulant Pathway Novel Insights Into Structure-Function Relationships and Molecular Recognition// Arterioscler Thromb Vase Biol.-2005. 25.-P. 1311-1320.

57. Dahlbahck B., Stenflo J. The protein C anticoagulant system // In: Stamatoyannopoulos G., Majerus P.W., Perlmutter R.M., Varmus H., eds. The molecular Basis of Blood Diseases, 3rd edn. Philadelphia: W.B. Saunders Co. 2001. P. 614-656.

58. De'ry O., Corvera C.U., Steinhoff M., Bunnett N.W. Proteinase-activated receptors: novel mechanisms of signaling by serine proteases // Am. J. Physiol. 1998. 274 (43). - P. C1429-C1452.

59. Dejana E, Del Maschio A. Molecular organization and functional regulation of cell to cell junctions in the endothelium. // Thromb Haemost. 1995. 74(1). P. 309-12.

60. Dhainaut J.F., Marin N., Mignon A., Vinsonneau C: Hepatic response to sepsis: interaction between coagulation and inflammatory processes // Crit Care Med. — 2001. 29. P. S42-S47.

61. Dugina T.N., Kiseleva E.V., Glusa E., Strukova S.M. Activation of mast cells induced by agonists of proteinase-activated receptors under normal conditions and during acute inflammation in rats // Eur. J. Pharmacol. 2003. 471(2). - P. 141-147.

62. Ely E.W., Laterre P.F., Angus D.C., et al. Drotrecogin alfa (activated) administration across clinically important subgroups of patients with severe sepsis // Crit Care Med. 2003. 31. -P. 12-19.

63. Esmon C. T. Thrombomodulin as a model of molecular mechanisms that modulate protease specificity and function at the vessel surface. // Faseb J. 1995. 9. - P. 946-955.

64. Esmon C.T. Does inflammation contribute to thrombotic events? // Haemostasis. 2000. 30(2). - P. 34-40.

65. Esmon C.T. Is APC activation of endothelial cell PARI important in severe sepsis?: No. // J. Thrombosis and Haemostasis. 2005. 3. - P. 1910-1911.

66. Esmon C.T. The protein C pathway // Chest. 2003. 124. - P. 26S-32S.

67. Esmon C.T., Gu J-M, Xu J, Qu D, Stearns-Kurosawa D J., Kurosawa S.H. Regulation and functions of the protein C anticoagulant pathway // Haematologica 1999. 84. - P. 363-368.

68. Faust S.N., Levin M., Harrison O.B., Goldin R.D., Lockhart M.S., Kondaveeti S., Laszik Z., Esmon C.T., Heyderman R.S: Dysfunction of endothelial protein C activation in severe meningococcal sepsis//N Engl JMed. -2001. 345. P. 408-416.

69. Feistritzer C., Lenta R., Riewald M. Protease-activated receptors-1 and -2 can mediate endothelial barrier protection: role in factor Xa signaling // J Thromb Haemost. 2005. 3. - P. 2798-805.

70. Feistritzer C., Riewald M. Endothelial barrier protection by activated protein C through PARI-dependent sphingosine 1-phosphate receptor-1 crossactivation // Blood. 2005. 105. - P. 3178-3184.

71. Fukudome K., Esmon C.T. Identification, cloning, and regulation of a novel endothelial cell protein C/activated protein C receptor // J Biol Chem. 1994. 269. - P. 26486-26491.

72. Galli S.J., Kalesnikoff J., Grimbaldeston M.A., Piliponsky A.M., Williams C.M.M., and Tsai M. Mast cells as "tunable" effector and immunoregulatory cells: recent Advances // Annu. Rev. Immunol. 2005. 23. - P. 749-786.

73. Galli S.J., Zsebo K.M. and Geissler E.N. The kit ligand, stem cell factor. // Adv. Immunol. 1994. 55. - P. 1-96.

74. Galligan L., Livingstone W., Volkov Y., Hokamp K., Murphy C., Lawler M., Fukudome K., and Smith O. Characterization of protein C receptor expression in monocytes // Br J Haematol. -2001. 115. P.408-414.

75. Ganopolsky J.G., Castellino F.J: A protein C deficiency exacerbates inflammatory and hypotensive responses in mice during polymicrobial sepsis in cecal ligation and puncture model //Am J Pathol.-2004. 165.-P. 1433-1446.

76. Gilfillan A.M. and Tkaczyk Ch. Integrated signaling pathways for mast-cell activation. // Nature reviews. 2006. 6. - P. 218-230.

77. Gorbacheva L., Pinelis V., Ishiwata S., Strukova S., Reiser G. Activated protein C prevents glutamate- and thrombin-induced activation of nuclear factor-kappa B in cultured hippocampal neurons. //Neuroscience 2010. 165(4).-P. 1138-46.

78. Grand R.J., Turnell A.S., Grabham P.W. Cellular consequences of thrombin-receptor activation // Biochem J. 1996. 313. - P. 353-68.

79. Griffin J.H., Fernandez J.A., Mosnier L.O., Liu D., Cheng T., Guo H., Zlokovic B.V. The promise of protein C // Blood Cells Mol Dis. 2006. 36(2). - P. 211-6.

80. Guma M., Ronacher L., Liu-Bryan R., Takai S., Karin M., Corr M. Caspase 1-Independent Activation of Interleukin-1 in Neutrophil-Predominant Inflammation. // ARTHRITIS & RHEUMATISM 2009. 60(12). - P. 3642-3650.

81. Haley M., Xizhong C., Minneci P.C., Deans K.J., Natanson C., Eichacker P.Q. Recombinant human activated protein C in sepsis: assessing its clinical use // Am J Med Sci. -2004. 328.-P. 215-219.

82. Hayden M.S., Ghosh S. Signaling to NF-kappaB // Genes Dev. 2004. 15; 18(18). - P. 2195-224.

83. Heikkila H., Latti S., Leskinen M., Hakala J., Kovanen P., Lindstedt K. Activated Mast Cells Induce Endothelial Cell Apoptosis by a Combined Action of Chymase and Tumor Necrosis Factor-a // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2008. 28. - P. 309-314.

84. Heuer J.G., Sharma G.R., Gerlitz B., Zhang T., Bailey D.L., Ding C., Berg D.T., Perkins D., Stephens E.J., Holmes K.C., Grubbs R.L., Fynboe K.A., Chen Y.F., Grinnell B., Jakubowski136

85. J.A. Evaluation of protein C and other biomarkers as predictors of mortality in a rat cecal ligation and puncture model of sepsis // Grit Care Med. 2004. 32. - P. 1570-1578.

86. Hertzberg M. Biochemistry of factor X. // Blood Rev. 1994. 8(1). - P. 56-62.

87. Ho W.C., Dickson K.M., Barker P.A. Nuclear Factor-KB Induced by Doxorubicin Is Deficient in Phosphorylation and Acetylation and Represses Nuclear Factor-KB-Dependent Transcription in Cancer Cells // Cancer Res. 2005. 65(10). - P. 4273-81.

88. Hoffmann J.N., Vollmar B., Laschke M.W., Fertmann J.M., Jauch K-W., Menger M.D. Microcirculatory alterations in ischemia-reperfusion injury and sepsis: effects of activated protein C and thrombin inhibition // Critical Care. 2005. 9(4). - P. S33-S37.

89. Hollenberg M., Compton S.J. Proteinase Activated Receptors // Pharmacol.Rev. 2002. 54.-P. 203-217.

90. Hollenberg M.D., Houle S. Proteinases as hormone-like signal messengers // Swiss Med Wkly. -2005. 23; 135(29-30). P. 425-32.

91. Huntington J.A. Molecular recognition mechanisms of thrombin // J Thromb Haemost. -2005. 3.-P. 1861-72.

92. Isobe H., Okajima K., Harada N., Liu W., Okabe H. Activated protein C reduces stress-induced gastric mucosal injury in rats by inhibiting the endothelial cell injury // J Thromb Haemost. 2004. 2. - P. 313-20.

93. Jackson C., Xue M. Activated protein C—An anticoagulant that does more than stop clots // IJBCB 2008. 40. - P. 2692-2697.

94. Jackson M., Smith M., Smith S., Jackson C., Xue M., Little S. Activation of Cartilage Matrix Metalloproteinases by Activated Protein C // ARTHRITIS & RHEUMATISM 2009. 60(3).-P. 780-791.

95. Jacques S.L., Kuliopulos A. Protease-activated receptor-4 uses dual prolines and an anionic retention motif for thrombin recognition and cleavage // Biochem J. 2003. 376. - P. 733-740.

96. Jin G., Hayashi T., Kawagoe J., Takizawa T., Nagata T., Nagano I., Syoji M., Abe K. Deficiency of PAR-2 gene increases acute focal ischemic brain injury // J Cereb Blood Flow Metab. 2005. 25(3). - P. 302-13.

97. Joyce D.E., Gelbert L., Ciaccia A., DeHoff В., Grinnell B.W. Gene expression and profile of antithrombotic protein с defines new mechanisms modulating inflammation and apoptosis // J Biol Chem. 2001. 276. - P. 11199-11203.

98. Joyce D.E., Grinnell B.W. Recombinant human activated protein С attenuates the inflammatory response in endothelium and monocytes by modulating nuclear factor-кВ // Crit Care Med. -2002. 30(1). P. S288-S292.

99. Joyce D.E., Nelson D.R., Grinnell B.W. Leukocyte and endothelial cell interactions in sepsis: relevance of the protein С pathway // Crit Care Med. 2004. 32. - P. S280-S286.

100. Kahn M.L., Nakashini Matsui M., Shapiro M.J., Ishihara H., Coughlin S.R. Protease-activated receptors 1 and 4 mediate activation of human platelets by thrombin // J.Clin.Invest. -1999. 103. P. 879-889.

101. Kahn M.L., Zheng Y.W., Huang W., et al. A dual thrombin receptor system for platelet activation//Nature. 1998. 394. - P. 690-694.

102. Kandere-Grzybowska K., Kempuraj D., Cao J., Cetrulo C., Theoharides T. Regulation of IL-1-induced selective IL-6 release from human mast cells and inhibition by quercetin. // British J. of Pharmacol. 2006. 148. - P. 208-215.

103. Kanke Т., Takizawa Т., Kabeya M., Kawabata A. Physiology and pathophysiology of proteinase activated receptors (PARs): PAR 2 as a potential therapeutic target //J. Pharmoc. Sci.-2005. 97.-P. 38-42.

104. Karin M., Ben-Neriah Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-kB activity // Ann. Rev. Immunol. 2000. 18. - P. 621-663.

105. Kawabata A. PAR2: structure, function and relevance to human diseases of the gastric mucosa. // Cambr.univ.press. 2002. P. 1462-3994.

106. Kovanen P.T. Mast cells and degradation of pericellular and extracellular matrices: potential contributions to erosion, rupture and intraplaque haemorrhage of atherosclerotic plaques // Cardiovas. Bios. 2007. 35(5). - P. 857-861.

107. Kulka M., Befus A.D. The dynamic and complex role of mast cells in allergic disease. // Arch Immunol Ther Exp (Warz) 2003. 51. - P. 111 -120.

108. Kurosawa S., Esmon C.T., Stearns-Kurosawa D.J. The soluble endothelial protein C receptor binds to activated neutrophils: involvement of proteinase-3 and CDllb/CD18 // J. Immunol. 2000. 165. - P. 4697-4703.

109. Levi M., Keller T.T., van Gorp E., and ten Cate H. Infection and inflammation and the coagulation system. // Cardiovasc. Res. 2003. 60. - P. 26-39.

110. Levi M., Poll T., Buller H.R. Bidirectional Relation Between Inflammation and Coagulation. // Circulation. 2004. 109. - P. 2698-2704.

111. Lindahl U., Pejler G., Bogwald J., and Seljelid R. A prothrombinase complex of mouse peritoneal macrophages. // Arch. Biochem. Biophys. 1989. 273. - P. 180-188.

112. Lindmark E., Tenno T., and Siegbahn A. Role of platelet P-selectin and CD40 ligand in the induction of monocytic tissue factor expression. // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2000. 20. - P. 2322-2328.

113. Ludeman M.J., Kataoka H., Srinivasan Y., Esmon N., Esmon C.T. Coughlin S.R. PARI cleavage and signaling in response to activated protein C and thrombin. // J Biol Chem. 2005. 280. - P. 13122-13128.

114. Luo W., Wang Y., Reiser G. Protease-activated receptors in the brain: receptor expression, activation, and functions in neurodegeneration and neuroprotection. // Brain Res Rev. 2007. 56. - P. 331-345.

115. Lust M., Vulcano M., Danese S. The protein C pathway in inflammatory bowel disease: the missing link between inflammation and coagulation. // Trends Mol Med. 2008. 14(6). - P. 237-44.

116. Macfarlane S.R., Seatter M.J., Kanke T., Hunter G.D., Plevin R. Proteinase-activated receptors. // Pharmacol Rev. 2001. 53. - P. 245-282.

117. Major C.D., Santulli R.J., Derian C.K., Andrade-Gordon P. Extracellular mediators in atherosclerosis and thrombosis: lessons from thrombin receptor knockout mice. // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2003. 23. - P. 931-939.

118. Martorell L., Martinez-Gonzales J., Rodriguez C. Thrombin and protease-activated receptors (PARs) in atherothrombosis. // Thromb Haemost. 2008. 99. - P. 305-315.

119. Maruotti N., Crivellato E., Cantatore F., Vacca A., Ribatti D. Mast cells in rheumatoid arthritis. // Clin Rheumatol. 2007. 26. - P. 1-4.

120. Mather T., Oganessyan V., Hof P., Huber R., Foundling S., Esmon C., Bode W. The 2.8 A crystal structure of Gla-domainless activated protein C. // Embo J 1996. 15. - P. 6822-6831.

121. McLaughlin J.N., Shen L., Holinstat M., Brooks J.D., DiBenedetto E., Hamm H.E. Functional Selectivity of G Protein Signaling by Agonist Peptides and Thrombin for the Protease-activated Receptor-1. // J Biol Chem. 2005. 280(26) - P. 25048-25059.

122. McLean K.s Schirm S., Johns A., Morser J., Light D.R. FXa-induced responses in vascular wall cells are PAR-mediated and inhibited by ZK-807834. // Thromb Res. 2001. 103(4)-P. 281-97.

123. Metcalfe D.D., Baram D. and Mekori Y.A. Mast cells. // Physiol. Rev. 1997. 77. - P. 1033-1079.

124. Minhas N., Xue M., Fukudome K., Jackson C. Activated protein C utilizes the angiopoietin/Tie2 axis to promote endothelial barrier function. // The FASEB J. 2010. 24. - P. 873-881.

125. Mizutani A., Okajima K., Uchiba M., Noguchi T. Activated protein C reduces ischemia reperfusion-induced renal injury in rats by inhibiting leukocyte activation. // Blood. 2000. 95. -P. 3781-3787.

126. Molino M., Barnathan E.S., Numerof M., Clark J., Dreyer M., Cumashi A., Hoxi J.A., Schechter N., Woolkalis M., Brass L.F. Interactions of mast cell tryptase with thrombin receptors and PAR-2. // J. Biol. Chem. 1997. 272. - P. 4043-4049.

127. Moore K.L., Andreoli S.P., Esmon N.L., Esmon C.T., Bang N.U. Endotoxin enhances tissue factor and suppresses thrombomodulin expression of human vascular endothelium in vitro. //J Clin Invest. 1987. 79. - P. 124-130.

128. Moore K.L., Esmon C.T., Esmon N.L. Tumor necrosis factor leads to the internalization and degradation of thrombomodulin from the surface of bovine aortic endothelial cells in culture. //Blood.- 1989. 73.-P. 159-165.

129. Mosnier L.O., Griffin J.H. Protein C anticoagulant activity in relation to antiinflammatory and anti-apoptotic activities. // Front Biosci. 2006. 1(11). - P. 2381-99.

130. Mosnier L.O., Zlokovic B.V., Griffin J.H. The cytoprotective protein C pathway. // Blood.-2007. 109.-P. 3161-3172.

131. Murakami K., Okajima K., Uchiba M. Activated protein C attenuates endotoxin-induced pulmonary vascular injury by inhibiting activated leukocytes in rats. // Blood. 1996. 87. - P. 642-647.

132. Nakamura M., Gabazza E.C., Imoto I., Yano Y., Taguchi O., Horiki N., Fukudome K., Suzuki K., Adachi Y. Anti-inflammatory effect of activated protein C in gastric epithelial cells. // J Thromb Haemost.- 2005. 3. P. 2721-9.

133. Nakanishi-Matsui M, Zheng YW, Sulciner DJ, Weiss EJ, Ludeman MJ, Coughlin SR. PAR3 is a cofactor for PAR4 activation by thrombin. // Nature. 2000. 6; 404(6778). - P. 60913.

134. Nelken N.A., Soifer S.J., O'Keefe J., Yu T.K., Charo I.F., Coughlin S.R. Thrombin receptor expression in normal and atherosclerotic human arteries. // J Clin Invest. 1992. 90. - P. 1614-1621.

135. Nguyen M., Arkell J., and Jackson C. J. Activated protein C directly activates human endothelial gelatinase A. // J Biol. Chem. 2000. 275. - P. 9095-9098.

136. Nielsen J.S., Larsson A., Rix T., Nyboe R., Gjedsted J., Krog J., Ledet T., Tonnesen E. The effect of activated protein C on plasma cytokine levels in a porcine model of acute endotoxemialntensive. // Care Med. 2007. 33(6). - P. 1085-93.

137. Noorbakhsh F., Vergnolle N., Hollenberg M.D., Power Ch. Proteinase-activated receptors in the nervous system. // Nature rev. 2003. 4. - P. 981-990.

138. Nystedt S., Emilsson K., Wahlestedt C., Sundelin J. Molecular cloning of a potential proteinase activated receptor. // Proc Natl Acad Sci USA. 1994. 91. - P.9208-9212.

139. Oganesyan V., Oganesyan N., Terzyan S., Qu D., Dauter Z., Esmon N.L., Esmon C.T. The crystal structure of the endothelial protein C receptor and a bound phospholipid. // J Biol Chem. 2002. 277. - P. 24851-24854.

140. Oka S., Gabazza E.C., Taguchi Y., Yamaguchi M., Nakashima Sh., Suzuki K., Adachi Y. and Imoto I. Role of activated protein C on Helicobacter pylori-assosiated gastritis. // Infect Immun. 2000. 68 - P. 2863-69.

141. Okabe H.S., Roth J.L., Pfeiffer C.J. A method for experimental, penetrating gastric and duodenal ulcers in rats. Observations on normal healing. // Amer. J. of Digestive disease. 1971. 16(3). - P.277-284.

142. Okajima K. Prevention of endothelial cell injury by activated protein C: the molecular mechanism(s) and therapeutic implications. // Curr Vase Pharmacol. 2004. 2(2). - P. 125-33.

143. Okajima K., Koga S., Kaji M., Inoue M., Nakagaki T., Funatsu A., Okabe H., Takatsuki K., Aoki N. Effect of protein C and activated protein C on coagulation and fibrinolysis in normal human subjects. // Thromb Haemost. 1990.19; 63(1). - P. 48-53.

144. Olejar T., Matej R., Zadinova M., Pouckova P. Proteinase-activated receptor-2 expression on cerebral neurones after radiation damage: immunohistochemical observation in Wistar rats. // Int J Tissue React. 2002. 24(3). - P. 81-8.

145. Olson E.E., Lyuboslavsky P., Traynelis S.F., McKeon R.J. PAR-1 deficiency protects against neuronal damage and neurologic deficits after unilateral cerebral hypoxia/ischemia. // J Cereb Blood Flow Metab. 2004. 24. - P. 964-971.

146. Ossovskaya V.S., Bunnett N.W. Protease-activated receptors: contribution to physiology and disease. // Physiol Rev. 2004. 84. - P. 579-621.

147. Pe'rez-Casal M., Downey C., Fukudome K., Marx G., Toh Ch. H. Activated protein C induces the release of microparticle-associated endothelial protein C receptor // Blood. 2005. 105.-P. 1515-1522.

148. Pejler G. Procoagulant and anticoagulant activities of resident and inflammatory peritoneal cells // Inflamm. Res. 1999. 48. - P. 344-350.

149. Pejler G., Abrink M., Ringvall M., Wernersson S. Mast Cell Proteases // Advances in Immunology 2007. 95(13). - P. 167-255.

150. Qu D., Wang Y., Esmon N.L., Esmon C.T. Regulated endothelial protein C receptor shedding is mediated by tumor necrosis factor-a converting enzyme/ADAM17 // J Thromb Haemost. 2006. 4 - P. 1-8.

151. Rauch B.H., Millette E., Kenagy R.D., Daum G., Clowes A.W. Thrombin- and Factor Xa-Induced DNA Synthesis Is Mediated by Transactivation of Fibroblast Growth Factor Receptor-1 in Human Vascular Smooth Muscle Cells // Circ Res. 2004. 94. - P. 340-345.

152. Ravanti L. and Kahari V.M. Matrix metalloproteinases in wound repair (review). // Int. J Mol. Med. 2000. 6. - P. 391-407.

153. Regan M., Barbul A., Schlag G., Redl H. Eds.Wound Healing, New-Yourk, Springer Verlag, 1994, 1(8).

154. Remick D.G. Pathophysiology of sepsis // Am J Pathol. 2007. 170(5). - P. 1435-44.

155. Rezaie A.R. Exosite-dependent regulation of the protein C anticoagulant pathway // Trends in Cardiovascular Medicine. 2003. 13. - P. 8-15.

156. Riewald M., Ruf W. Protease-activated receptor-1 signaling by activated protein C in cytokine-perturbed endothelial cells is distinct from thrombin signaling // J Biol Chem. 2005. 280.-P. 19808-19814.

157. Rocha S., Garrett M.D., Campbell K.J., Schumm K., Perkins N.D. Regulation of NF-jB and p53 through activation of ATR and Chkl by the ARF tumour suppressor // The EMBO J. -2005. 24.-P. 1157-1169.

158. Rohatgi T., Sedehizade F., Reymann K.G., et al. Protease-activated receptors in neuronal development, neurodegeneration, and neuroprotection: thrombin as signaling molecule in the brain//Neurosci. -2004. 10. P. 501-512.

159. Ruf W. Protease-activated receptor signaling in the regulation of inflammation // Crit Care Med. 2004. 32. - P. S287-S292.

160. Ruf W., Dorfleutner A., Riewald M. Specificity of coagulation factor signaling // J ThrombHaemost. — 2003. l.-P. 1495-1503.

161. Saito T., Bunnett N. W. Protease-Activated Receptors // NeuroMol. Med. 2005. 7. - P. 79-99.

162. Sambrano G.R., Huang W., Faruqi T., Mahrus S., Craik C., and Coughlin S.R. Cathepsin G activate protease-activated receptor-4 in human platelets // J Biol Chem. 2000. 275. - P. 6819-6823.

163. Scheffer G.L., Flens M.J., Hageman S., Izquierdo M.A., Shoemaker R.H., Scheper R.J. Expression of the vascular endothelial cell protein C receptor in epithelial tumour cells // Eur J Cancer. 2002. 38. - P. 1535-1542.

164. Schoenmakers S., Reitsma P., Spek A. Blood coagulation factors as inflammatory mediators. // Blood Cells Mol Dis. 2004. 32(2). - P. 325-33.

165. Schwartz L., Austen K., Wasserman S. Immunologic release of P-hexosaminidase and P-glucuronidase from purified rat serosal mast cells. // J Immunol. 1979. 123(4). - P. 1445-1450.

166. Shore P. A. The chemical determination of histamine. Methods // Biochem. Anal. Suppl. -1971. P. 89-97.

167. Slungaard A. Platelet factor 4 modulation of the thrombomodulin-protein C system // Crit Care Med. 2004. 32. - P. S331-S335.

168. Sokolova E., Reiser G. Prothrombin/thrombin and the thrombin receptors PAR-1 and PAR-4 in the brain: localization, expression and participation in neurodegenerative diseases // Thromb Haemost. 2008. 100(4). - P. 576-81.

169. Song D, Ye X, Xu H, Liu S. Activation of endothelial intrinsic NF-{kappa}B pathway impairs protein C anticoagulation mechanism and promotes coagulation in endotoxemic mice. // Blood. 2009. \1\\ 14(12). - P. 2521-9.

170. Steinhoff M., Vergnolle N., Young S.H. Agonists of proteinase-activated receptor-2 induce inflammation by a neurogenic mechanism //Nature Medicine. 2000. 6. - P.151-158.

171. Stiernberg J., Redin W.R., Warner W.S., Carney D.H. The role of thrombin and thrombin receptor activating peptide (TRAP-508) in initiation of tissue repair // Thromb. Haemost. 1993 70. - P.158-162.

172. Striggow F., Riek-Burchardt M., Kiesel A., et al. Four different types of protease-activated receptors are widely expressed in the brain and up-regulated in hippocampus by severe ischemia //Eur J Neurosci. 2001. 14.-P. 595-608.

173. Strukova S. Blood coagulation-dependent inflammation. Coagulation-dependent inflammation and inflammation-dependent thrombosis // Front Biosci. 2006. 11. - P. 59-80.

174. Strukova S., Gorbacheva L., Storozhevykh T., Pinelis V., Smirnov M. Factor Xa protects cultured hippocampal neurons from glutamate toxicity. // J Thromb Haemost 2006. 4. - P. 1409-10.

175. Strukova S.M., Chistov I.V., Umarova B.A., Dugina T.N., Storozhevykh, T.P. Pinelis V.G., and Glusa E. Modulation of Mast Cell Activity by a Peptide Agonist of the Thrombin Receptor: Role of Nitric Oxide. // Biochemistry. 1999. 64. - P. 658-664.

176. Strukova S.M., Dugina T.N., Chistov I.V. Lange M., Markvicheva E.A., Kuptsova S., Zubov V.P., Glusa E. Immobilized thrombin receptor agonist peptide accelerates wound healing in mice // Clin. Appl. Thromb. Hemost. 2001. 7. - P. 325-329.

177. Strukova S.M., Dugina T.N., Khlgatian S.V., Redkozubov A.E., Redkozubova G.P., and Pinelis V.G. Thrombin-mediated events implicated in mast cell activation. // Semin. Thromb. Hemost. 1996. 22. - P. 145-150.

178. Stubbs M.T., Bode W. A player of many parts: the spotlight falls on thrombin's structure // Thromb Res. 1993. 69(1). - P. 1-58.

179. Swift S., Leger A.J., Talavera J., Zhang L., Bohm A., Kuliopulos A. Role of the PARI Receptor 8th Helix in Signaling The 7-8-1 receptor activation mechanism // J Biol Chem. -2006. 281(7).-P. 4109-4116.

180. Takano S., Kimura S., Ohdama S. and Aoki N. Plasma thrombomodulin in health and diseases. // Blood. 1990. 76. - P. 2024-2029.

181. Taoka Y., Okajima K., Uchiba M., Murakami K., Harada N., Johno M., Naruo M. Activated Protein C Reduces the Severity of Compression-Induced Spinal Cord Injury in Rats by Inhibiting Activation of Leukocytes // J. Neurosci. 1998. 18(4). - P. 1393-1398.

182. Tarnawski A.S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing // Dig. Dis. Sci. 2005. 50. - P. S24-S33.

183. Thon I.L., Uvnas B. Degranulation and histamine release, two consecutive steps in the response of rat mast cells to compound 48/80. // Acta. Physiol. Scand. 1967. 71(4). - P. SOS-SIS.

184. Toltl L., Swystun L., Pepler L., Liaw P. Protective effects of activated protein C in sepsis. // Thromb Haemost- 2008. 100. P. 582-592.

185. Ubl J.J., Sergeeva M., Reiser G. Desensitisation of protease-activated receptor-1 (PAR-1) in rat astrocytes: evidence for a novel mechanism for terminating Ca2+ signalling evoked by the tethered ligand // J Physiol. 2000. 1; 525(2). - P. 319-30.

186. Uehara A., Muramoto K., Takada H., and Sugawara S. Neutrophil serine proteinases activate human nonepithelial cells to produce inflammatory cytokines through protease-activated receptor 2 // J Immunol. 2003. 170. - P. 5690-5696.

187. Van de Wouwer M., Collen D., Conway E. Thrombomodulin protein C - EPCR system: integrated to regulate coagulation and inflammation. // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2004. 24. -P. 1374.

188. Vergnolle N. Protease-activated receptors and inflammatory hyperalgesia // Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro. 2005. 100(1). - P. 173-176.

189. Vergnolle N. Proteinase-activated receptors (PARs) in infection and inflammation in the gut. // IJBCB 2008. 40. - P. 1219-1227.

190. Vergnolle N. Review article: proteinase-activated receptors-novel signals for gastrointestinal pathophysiology // Aliment Pharmacol Ther. 2000. 14. - P. 257-266.

191. Vergnolle N., Ferazzini M., D'Andrea M,R„ Buddenkotte J„ Steinhoff M. Proteinase-activated receptors: novel signals for peripheral nerves // Trends Neurosci. 2003. 26. - P.496-500.

192. Versteeg H.H., Spek C.A., Richel D.J., Peppelenbosch M.P. Coagulation factors Vila and Xa inhibit apoptosis and anoikis // Oncogen. 2004. 15; 23(2). - P. 410-7.

193. Villegas-Mendez A, Monies R, Ambrose LR, Warrens AN, Laffan M, Lane DA. Proteolysis of the endothelial cell protein C receptor by neutrophil proteinase 3. // J Thromb Haemost. 2007. 5(5). - P. 980-8.

194. Vu T.K., Hung D.T., Wheaton V.I., et al. Molecular cloning of a functional thrombin receptor reveals a novel proteolytic mechanism of receptor activation // Cell. 1991. 64. - P. 1057-1068.

195. Wang H., Babic A., Mitchell H., Liu K., Wagner D. Elevated soluble ICAM-1 levels induce immune deficiency and increase adiposity in mice. // The FASEB J. 2005. 7. — P. 1-18.

196. Wang H., Reiser G. Thrombin signaling in the brain: the role of protease-activated receptors // Biol Chem. 2003. 384. - P. 193-202.

197. Wang H., Ubl J.J., Strieker R., et al. Thrombin (PAR-l)-induced proliferation in astrocytes via MAPK involves multiple signaling pathways // Am J Physiol Cell Physiol. 2002. 283.-P. 1351-1364.

198. Xu H., Gonzalo J.A., St Pierre Y., Williams I.R., Kupper T.S., Cotran R.S., Springer T.A., Gutierrez-Ramos J.C. Leukocytosis and resistance to septic shock in intercellular adhesion molecule 1-deficient mice // J Exp Med. 1994. 180(1). - P. 95-109.

199. Xu J., Qu D., Esmon N.L., Esmon C.T. Metalloproteolytic Release of Endothelial Cell Protein C Receptor // J Biol Chem. 2000. 275(8):25. - P. 6038-6044.

200. Xue M., Campbell D., Jackson CJ. Protein C is an autocrine growth factor for human skin keratinocytes // J Biol Chem. 2007b. 4;282(18). - P. 13610-6.

201. Xue M., March L., Sambrook P.N., Fukudome K., and Jackson C. J. EPCR is overexpressed in RA synovium and mediates the anti-inflammatory effects of APC in RA monocytes. // Ann Reum Dis. 2007c. 66(12). - P. 1574-80.

202. Xue M., Smith M., Little C., Sambrook P., March L., Jackson C. Activated protein C mediates a healing phenotype in cultured tenocytes. // J. Cell Mol Med. 2009. 13(4). - P. 74957.

203. Xue M., Thompson P., Kelso I., and Jackson C. Activated protein C stimulates proliferation, migration and wound closure, inhibits apoptosis and upregulates MMP-2 activity in cultured human keratinocytes // Exp Cell Res. 2004. 299. - P. 119-127.

204. Zeng W., Matter W.F., Yan S.B. et al.: Effect of drotrecogin alfa (activated) on human endothelial cell permeability and Rho kinase signaling // Crit Care Med. 2004. 32. - P. S3 02-S308.

Информация о работе

Русанова, Анна Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.03.01

Диссертация

PAR-зависимая регуляция активности тучных клеток при воспалении - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы