Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протеиназы нейтрофилов в скелетных мышцах крыс при мышечной деятельности

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Протеиназы нейтрофилов в скелетных мышцах крыс при мышечной деятельности"

¿¿У . ^ Г V»,

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Р Г Б ОД На правах рукописи

УСЕНКО Татьяна Николаевна

ПРОТЕИНАЗИ НЕЙТРОФИЛОВ В СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦАХ КРЫС ПРИ МЫЗЕЧНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ

ОЗ. 00. 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1994

Работа выполнена в отделе биохимии спорта Научно-Исследовательского института физической культуры, Санкт-Петербург.

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор В. А. Рогознин.

Официальные оппоненты : доктор медицинских наук, профессор

И. Г. Щербак; кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

0. Ю. Янковский.

Ведущее учреждение - Институт экспериментальной медицины Российской АМН.

Защита состоится " " 1994 г. в часов на

заседании специализированного / -" совета К 063.57.09 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199164, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, ауд 90.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. Á М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан " " 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

А Г. Марков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Известно, что интенсивная мышечная дея- ■ тельность ( НМД) сопровождается локальными повреждениями мышечных волокон (Hagerman et. al., 1983; Gutteridge, Hallivel 1990). При этом в кровь выходят белки скелетных мышц (Kielblack et. al., 1979; Чайковский и др., 1987;). Влияние, которое оказывает ИМД, сказывается не только на усиления выхода мышечных белков, но и на их деградации. В данном процессе наряду с протеиназами собственно мышц могут принимать участие и ферменты немышечного происхождения, хотя данный факт не нашел еще своего полного подтверждения (Bird et. al., 1980). В последние годы появились работы, указывающие на появление лейкоцитов, в том числе нейтрофилов (НФ), в тканях скелетных мышц (СМ) после ИМД (Armstrong et. al., 1983). В мышцах был обнаружен маркерный фермент НФ - миелопероксидаза (МПО) (Цыпленксв, 1988). По-видимому, в данном случае можно говорить об участии лейкоцитов в поддержании структурно-функционального гсмео-стаза ткани СМ. Лейкоциты, вероятно, инфильтруют очаги ишемнчес-ного повреждения мышц, возникающие в процессе усиленной мышечной деятельности, и участвуют в их элиминации. При этом может иметь место ' и поражение компонентами • НФ нормально функционирующих миоцитов. ' Повреждение НФ ткани во многом зависит от действия вырабатываемых этими клетками активных форм кислорода (АФК), а также белков, заключенных в гранулах. Среди них в первую очередь выделяют МПО, катионные белки и различные протеиназы, в частности,-эластазу и катепсин G (Jaesçhke et. al., 1992; Andersen et. al., 1993). Известно, что данные ферменты в ряде случаев могут не только выступать В' качестве защитных факторов организма, но при увеличении их протеолитической активности они способны усиливать воспалительные процессы, протекающие в тканях (Mendis et. al., 1990; Gabrielescu, 1992, ). Вполне вероятно, что попадающие в мышцы после ИМД протеиназы НФ, включаясь в общий протеолиз, участвуют в метаболических реанциях СМ в период их восстановления. В то же время в тесном кооперативном взаимодействии с другими компонентами НФ протеиназы могут оказывать повреждающее действие на мышечные волокна. Настоящая работа посвящена изучению протеиназ НФ ткани СМ после КМД в качество одного из факторов, определяющих повреждение мышечной ткани. ' ~

Цель работы. Цель настоящей работы заключалась в исследовании влияния однократной ИМД на активность нейтральных протеиназ НФ в тканях СМ с. помощью антисыворотки (АС) к нейтрофилам, а такте изучение возможного влияния, оказываемого НФ, на мышечную ткань. Задачи исследования. 1. Получить АС к" НФ крыс. Отработать процедуру использования этой АС для снижения притока НФ в ткани СМ после однократной ИМД

2. Изучить динамику активности нейтральных протеиназ НФ в экстрактах смешанных СМ после однократной ИМД с помощью АС к НФ. В связи с чем определить условия для выявления активности нейтральных протеиназ НФ в СМ.

3. Изучить влияние АС к.НФ на активность нейтральных протеиназ в СМ различного типа метаболизма после однократной ИМД .

4. Исследовать динамику появления катепсина G НФ крыс в ткани СМ. В связи с чем выделить этот фермент из НФ и получить к нему антитела.

5. Исследовать in vitro воздействие НФ на СМ ш. soleus для оценки возможного участия НФ и их ферментов, в частности протеиназ, в повреждении миоцитов и деградации мышечных белков. Научная новизна и практическая значимость работы. Изучение

влияния однократной ИЦД на активность нейтральных протеиназ в ткани СМ с помощью антин^йтрофильной сыворотки выявило наличие протеолитической активности, принадлежащей протеиназам НФ. Введе-• ние крысам АС к НФ после ИМД способствовало снижению уровня активности нейтральных протеиназ в СМ задних конечностей.

Установлено, что однократная ИМД приводит к повышению активности нейтральных протеиназ, определяемой по гидролизу ФИТЦ-казеина, & мышечных волокнах с различным типом метаболизма. При этом введение АС к -НФ способствует снижению данной активности в , мышцах как с гликолитическим, так и с оксидативным типом ¡метаболизма.

Исследована динамика появления катепсина G ( KG) НФ крыс' в СМ - m.-soleus. Обнаружено присутствие фермента - не только на разных . этапах отдыха после ИЩ но и в мышцах крыс, находившихся в . состоянии покоя.

; Исследовано взаимодействие НФ с мышечной тканью ш. soleus in . .v.¿tго. Установлено, что в начальный период инкубации ( 1 ч) ...происходит увеличение активности мышечных ферментов крэатинкиназы

(КЮ и аспартатаминотрансферазы (АсАТ) в инкубационной среде при совместной инкубации ш. зо1еиэ и НФ. При дальнейшей инкубации имеет место подавление их активности. В этом процессе участвуют ферменты НФ - МПО и протеиназы.'

При инкубации ш. зо1еиз, изолированных из крыс, предварительно подвергнутых однократной ИМД и после введения им АС к НФ, обнаружен меньший выход мышечных ферментов КК и АсАТ, а также креатина в инкубационную среду в сравнении с мышцами, полученными из животных, которым АС К НФ не вводилась. При добавлении в инкубационную среду активированных НФ имеет место инактивация мышечных ферментов - КК и АсАТ и увеличение, выхода креатина.

Установлено, что при инкубации НФ с препаратами ферментов КК и АсАТ в большей степени подвергается инактивирующему влиянию со стороны НФ - КК. АсАТ - фермент, более устойчивый к повреждающему действию компонентов НФ.

Практическая значимость работы заключается в разработке флуо-риметрического метода и метода Вестерн-блотинга, позволяющих выявлять протеиназы, привносимые в СМ НФ, а также ' в получении препарата катепсина в, антител к катепсину Б и АС к НФ крыс, что позволило создать методику не только для.выявления протеиназ НФ в СМ, но и для исследования участия. НФ в метаболических процессах, протекающих в мышцах в. восстановительный период после однократной ИМД Применение данных методов может позволить изучать воздействие НФ не только, на СМ, но и на другие ткани. Положения, выносимые на защиту

1. Использование АС к НФ позволяет снизить содержание лейкоци-

■ тарных клеток в крови и' уменьшить их приток в СМ после однократной ИМД что обусловливает ее применение, для изучения влияния НФ на метаболизм СМ.

2. Однократная ИМД вызывает увеличение активности нейтральных протеиназ в СМ. Снижение протеолитической активности под влиянием вводимой животным АС к НФ свидетельствует об определенном включении протеолитических ферментов НФ в общий баланс протеиназ СМ после однократной ИМД. Обнаруженное присутствие катепсина й в тканях ш. Бо1еиз как до однократной ИМД так и после нее может указывать на возможное участие протеиназ НФ в метаболических процессах, протекающих в мышцах.

3. Обнаруженное после однократной ИМД снижение активности нейт:

ральных протеиназ после введения АС к НФ имеет несто как в гликолитических, так и в оксидативных мышечных волокнах. 4. Совместная инкубация m. sol eus и НФ выявила увеличение активности КК и АсАТ в инкубационной среде. Более продолжительная инкубация мышц с НФ приводит к инактивации мышечных ферментов, КК и АсАТ. Подобное снижение активности ферментов в присутствии НФ вызвано деятельностью ферментов НФ, в том числе протеиназ.

. Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на аспирантских конференциях • научно- исследовательского института физической культуры Санкт-Петербурга в 1991, 1992 гг., всесоюзной конференции "Физическая работоспособность и питание", Санкт-Петербург, 1992, III международном конгрессе "Травма,, шок, сепсис", Мюнхен, Германия, 1994.

Публикации. Результаты исследования опубликованы в 4-х статьях и 1-х тезисах доклада.

Структура и объдм работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы. Работа содержит 149 страниц машинописного текста, 14 таблиц и 15 рисунков. Список литературы включает 211 наименований, в том числе 162 на английском языке.

МАТЕРИАЛЫ К МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводились на белых беспородных крысах-самцах .массой 180-240 г.

НФ крыс выделяли, используя оптимизированный метод (Цыпленков,' 1988). Подсчет лейкоцитов в крови проводили в камере Горяева. Содержание отдельных классов лейкоцитов оценивали микроскопически в мазках, окрашенных красителем Май- Грюнвальда. АС к НФ крыс получали путем иммунизации кроликов (Vaitukaitis et. al. . 1971).

В качестве физической нагрузки использовали плавание крыс при температуре воды 30-32°С с грузом равным 8-9% массы тела до отказа животных от работы (аэробно- анаэробный режим). Для снижения в крови НФ животным опытной группы сразу и через 12 ч после мышечной деятельности внутрибршинно вводили 1 мл АС к НФ. Животные контрольной группы получали Инъекции равных объемов физиологичес-.

кого раствора. Через 6, 12 и 24 ч после нагрузки животных декапитировали и выделяли СМ задних конечностей

Исследовали два типа СМ задних конечностей крысы: икроножную (ш. soleus), содержащую преимущественно оксидативные волокна и белую часть четырехглавой мышцы бедра (га. quadriceps). состоящую, в основном, из гликолитических волокон. Экстракты мышц получали, используя 0,05 M Трис-HCl буфер, pH 7,4, содержащий 0,25 M сахарозы, -2 мМ ИазЭДТА и 0,3% бромида цетилтриыэтиламмония (ЦТАБ). Соотношение буфер: ткань составило 5:1 (объем: вес). Дополнительно дважды экстрагировали осадок соответственно втрое и вчетверо меньшим объемом буфера. Образцы центрифугировали (40 мин, 10000 g), и экстракты каждого образца ткани объединяли.

Эксперименты in vitro проводили на изолированной из задних конечностей крыс икроножной мышце m. soleus. Совместную инкубацию m. soleus с НФ проводили в растворе Хенкса без фенолового красного при температуре 37° С в течение в ч.. Для активации НФ использовали зимозан, опсонизированный смешанной сывороткой крыс и суспендированный в растворе Хенкса в концентрации 10 мг мл'V Общий объем системы равнялся 6 мл, . концентрация НФ составляла й- 10^ клеток- мл" В качестве контрольной системы использовали инкубацию и. soleus. В процессе иннубации через 0, 1, 3, 6 и 8 ч отбирали аликвоты инкубационной среды объемом 0. 6 мл.

КатепсИн G из НФ крыс выделяли по схеме, основанной на ранее опубликованных методах (Кокрянов и др. 1983; Bjork, Ohlsson, 1990). Антисыворотку, к катепсину G, получали в результате 10-недельной иммунизации кроликов. В качестве антигена использовали катепсин G, выделенный из НФ кркс.

Выделение катепсина G из экстрактов икроножной мышцы ш. soleus проводили методом иммунопреципитации (Fu, 1992). Выявление катепсина G в экстрактах га. soleus проводили методом Вестерн- иммунобло-гичга. Аффиноочищенные антитела, связанные с катепсином G на нитроцеллюлозной мембране, выявляли в два этапа при помощи вторых антител, меченных щелочной фосфатазой.

Электрофорез проводили двумя способами: с 30% мочевиной - на этапе характеристики полученного из НФ ' препарата катепсина G (Johnson et. al., 1983); с ДСН - на этапе выявления катепсина G в CM (Laemmly, 1970), используя прибор фирмы "Hoefer" (США).

Активность нейтральных протейназ определяли с помощью флуори-

метрических методов с использованием в качестве субстратов ФИТЦ-казеин (Назаров, 1990); субстрат для эластаз©подобных ферментов -Z-ала-про-ала-МСА ( Гершкович, Кибирев, 1988), а также флуоресками-новым методом по свободным аминогруппам (Nakai et. al., 1974) и по освобождению эндогенного тирозина (McDonald, Chen, 1965). Анализ ферментативной активности катепсина G на этапе его выделения выполняли с помощью методики (Hummel, 1959), анализ эластазной активности с помощью методики (Visser, Blont, 1972).

Активность КК и содержание креатина определяли методом (Петрова, Лыэлова, 1985), активность АсАТ, используя за основу методы (Yatsidis, 1960; Reitman, Frankel, 1957). Оценку перокси-дазной активности нейтрофилов проводили с помощью включения 125j в белок кислотонерастворимой фракции. В этом случае в инкубационную среду вносили 6-10^ ими мин' 1 Na125I.

Концентрацию белка определяли методом (Lowry et. al., 1951).

Математическую и статистическую обработку результатов проводили на микрокалькуляторе HP-97 (Hewlett-Packard, США). Экспериментальные данные обрабатывали статистически для уровня достоверности 95%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Использование антинейтрофильной сыворотки для снижения уровня нейтрофилов в крови и уменьшения их притока в скелетные мышцы крыс. ■ С . целью поддержания низкого уровня НФ в крови крыс использовали АС к НФ. Для ее получения при иммунизации кроликов пользовались очищенным препаратом перитонеальных лейкоцитов, состоящим на 80% из НФ, доля жизнеспособности которых составляла 90%. Разработанный подход, позволяющий поддерживать низкий уровень НФ в крови в течение 24 ч состоял в 2- х разовом введении АС к НФ по 1 мл через 0 ч и 12 ч. ha рис. 1 представлено изменение содержание НФ в крови под действием вводимой антисыворотки. Уровень НФ в крови после введения АС к НФ уменьшался в 4 раза.

Следует отметить, что данная АС снижала также и уровень лимфоцитов, но в значительно меньшей степени. При этом через 24 ч после введения АС к . НФ концентрация лимфоцитов возвращалась к исходному значению, в то время, как количество НФ оставалось на низком уровне.

Рис. 1. Влияние введения АС к НФ на содержание в крови крыс НФ. По оси абсцисс - время после первога введения АС (ч), по оси ординат - количество НФ в крови (Ю'^л"1). Стрелки указывает время введения АС (0 ч и 12. ч). * - достоверные отличия от исходного уровня (р<' 0. 05).

Таким образом, полученная АС к НФ при 2- х разовом введений ее по 1 мл через О ч и 12 ч позволяла поддерживать низкий уровень НФ в крови в течение 24 ч и уменьшить их миграцию в ткани.

2. Развитие и характеристика иммунологического выявления катепсина 0 нейтроФилов в скелетных мышцах крыс. Препарат катеп-сина О был получен из перитонеальных НФ крыс с использованием методов экстракции с помощью ЦТАБ, ионно-обменной хроматографии и гель-фильтрации. После очистки был получен препарат, 90% активности которого оказалось связано с активностью катепсина в и 10% -с активностью эластазы. Выход катепсина й составил 50%. В результате иммунизации кроликов этим препаратом получили антисыворотку, взаимодействующую с выделенным препаратом катепсина б в реакции встречной иммунодиффузии.

Метод Вестерн-иммуноблотинга при использовании полученных антител позволил выявить катепсин в в экстрактах СМ крыс после предварительно проведенного выделения фермента из мышц методом иммунопреципитации (Ги, 1992). При этом специфическое окрашивание было обнаружено как в экстрактах СМ крыс после ИМД так в ткани покоящихся животных (не подвергавшихся ИМД).

3. Влияние актисыворотки к нейтроФилам на активность нейтральных протеиназ в скелетных мышцах задних конечностей крыс после НМД. Использование АС к НФ, позволяющее снизить приток лейкоцитарных клеток в СМ, дало возможность исследовать активность протеиназ, привносимых в мышцы НФ. Исследование протеолитической активности на различных этапах экстракции белков из СМ задник конечностей крыс с помощью буфера, содеряащего ЦТАВ, способствующему экстрагированию катиониых белков, к которым относятся и протеиназы НФ, в частности катеясин G и эластаза (English, Andersen, 1974) позволило, установить следующее. Наибольшее значение протеиназкой активности в СМ через 24 ч после НМД по гидролизу ФИТЦ- казеина достигается после 3 экстракций (13. 7±1. 8 мкгФИТЦ- ч"1 - мг"1 белка). При этом отмечалось также значительное уменьшение активности протеиназ в СМ крыс под действием вводимой АС к НФ ( сразу и через 12 ч после ИМД 4.52+0.09 мкгФИТЦ- ч"1- мг"1 белка). Основываясь на этих данных во всех последующих экспериментах проводили 3 последовательные экстракции ткани СИ

В таблице 1 приведены результаты по анализу ¿шличт^с: :.:стс дами протеолитической активности в экстрактах СМ задних конечностей контрольных (введение физиологического раствора) опытных (введение АС к НФ) крыс через 24 ч после НМД Отмечено снижение протеолитической активности в экстрактах СМ животных, которым была введена АС к НФ. Наиболее существенное снижение протеолитической активности на 59% было обнаружено при использования в качестве субстрата - ФИТЦ-казеина.

При анализе динамики изменения активности нейтральных протеиназ в смешанном экстракте СМ после ЙМД было установлено, что имеет место постепеннее возрастание активности, определяемой по гидролизу ФИТЦ- казеина, в течение 24 ч отдыха. Так, через 24 ч протеиназная активность в СМ превышала контрольный уровень (1.7+0.2 мкгФИТЦ ч~ L мг~1 белка - до НД) в 5 раз (8.6+0.4 мкгФИТЦ- ч"1- белка). Эти данные подтверждают описанное в

литературе увеличение активности прстеолитических процессов н мышцах в восстановительный период после ИНД (Сопл et. al., 1982, Назаров, 1990). Введение АС к КФ предотвращало увеличение прогеи-назнок активности, определяемой по гидролизу ФИТЦ- казеина при pi! 7. 4. Так, через 24 ч после ЙМД активность нейтральных протеиназ в

НФ достоверно уменьшалась на

- И -

59/1 В данный промежуток времени (через 24 ч отдыха после однократней ИМД) в ткани СМ было обнаружено значительнее содержа-" кие маркерного фермента НФ ШЗ, что может также указывать на приток НФ » их компонентов в мышцы после нагрузки (Цыпленков, 1908). Таким образом, можно предположить, что значительная. часть активности протекназ, обнаруживаемая по гидролизу ФИТЦ-казеина при рН 7. 4, в экстракте СМ задних конечностей крыс при --использовании буфера для экстракции, содержащего ЦТАВ, к 24 ч отдыха после ИВД имеет лейкоцитарное, гласным образом, нейтрсфильнсе происхождение.

Таблица 1.

Активность нейтральных йротеиназ в экстрактах СМ через 24 ч после НМД при введении крысам АС к НФ. (X +5Е).

Методы определения протеиказяой активности Контроль Опыт (АС к НФ) % снижения от контрольной группы

ФИТЦ-казеин в качестве субстрата (мкгФИТЦ-ч"1 -мг"1 белка), п=26. 8. 60+0. 39 3. 50+1. 22" 59

Субстрат для эластазы - Z-ала-яво-ала-SCA (мкггаСА 5. 10+0. 22 мин"1!«-"1 белка) (10z), п=17. 3. 90+0. 05* 24

По первичным аминогруппам (число ГШо-групп-ч ■ мг" белка) ИО""15}, П=17. 6. 25+0. 04 5. 33+0. 03* 15

По освобождения эндогенного тирозина (мкг-мин~ ■ мг~ белка) (10), п=12. 0. 38+0. 02 0. 28 ±0. 02 25

* - достоверный отличия от соответствующего контроля р<0. 05.

4. Влияние введения крьсам знтисыворотки к нектвофилам на зктизность нейтральных протеияаз в СМ различного метаболического типа после !ГМД Результаты проведенного эксперимента представлены в таблице 2.

В ответ на нагрузку уровень протеолитической активности, определяемой па гидролизу ФКТЦ-казеина при рН 7. 4, возрастал так в сксилатквннх, так и в гликолитических мышечных волокнах. Введение ^ опытной группе тавотных АС к НФ после ИМД предотвращало увеличение

активности в икроножной мышце (ю. soleus) в среднем на '50%, в четырехглавой мышце бедра (ш. quadriceps) в среднем на 40%. Это может указывать на появление протеиназ НФ после однократной НМД (аэробно-анаэробный режим) в мышечных волокнах с различным типом метаболизма.

Таблица 2.

Влияние ИМД и введения АС к НФ на активность нейтральных протеиназ (мкгФИТЦ ч"1- мг"1 белка) в мышцах различного типа метаболизма (X ± SE).

Тип метаболизма мышечных волокон Срок определения активности протеиназ

До ИМД п=4 После ИМД

6 'ч (п=4) 12 Ч (п=6) 24 ч (п=6)

оксидативный (га. soleus красные волокна)

контроль 1. 6±0. 1 4. 9±0. 7 *1 4. 8±0. 7"1 5. 2+0. 2 '1

опыт (АС к НФ) 3. и±и. 1 ¿j. -J Ю. 1 о о о '2

гликолитический

(m. quadriceps белые волокна)

контроль 2. 4±0. 4 8. 9±0. 8"1 4. 4±0. З"1 5. 8+0. З"1

опыт (АС к НФ) 5. 5±0.' 7 3. 2±0. 9 3. 1±0. 2'2

*1 - достоверные отличия от активности протеиназ до НМД р<0. 05, *2 - достоверные отличия „от активности протеиназ в контрольных группах (после ИМД) р<0. 05,

Подтверждение присутствия протриназ НФ в тканях СМ было получено также в опытах in vitro при инкубации и. soleus, извлекаемых из крыс через 24 ч после ИМД Измерение протеолитической активности проводили в инкубационной среде. Как в контроле (введение физиологического раствора), так и в опыте (введение АС к НФ) активность была обнаружена в инкубационной среде через 3 ч инкубации и нарастала в течение в ч вплоть до завершения инкубации. Введение антинейтрофильной сыворотки приводило к снижению уровня протеинаэной активности в инкубационной среде по сравнению с контрольными группами в среднем на 50%.

Таким образом, использование АС к НФ способствовало снижений

активности нейтральных протеиназ после ИМД в мышечных волокнах различного типа метаболизма.

5. Изучение взаимодействия нейтроФилов со скелетной мышцей ш. sol eus in vitro. Механизм взаимодействия НФ с различными объектами, как правило, изучается в модельных экспериментах (Mavier et. al.; Gera, Lichtenstein, 1991; Ward, 1991). В связи с этим Исследование влияния, оказываемое НФ на мышечную ткань ^проводили на изолированной CM m. sol eus in vitro. Эксперименты были поставлены как на ш. sol eus, изолированной из СМ покоящихся животных, так и на ш. soleus, извлеченной из крыс, предварительно подвергнутых ИМД Это давало возможность более полно изучить воздействие, оказываемое НФ. По изменению активности мышечных ферментов КК и AcAT, а также по содержанию креатина в инкубационной среде судили о действии НФ на мышечную ткань. Данные ферменты выступали в качестве маркеров повреждения СМ (Schuster et. al. , 1979; Booth, Watson, 1985; . Kanter et. al. , 1968). fía примере активности нейтральных протеиназ и включения радиоактивного йода в кислото-нерастворимую фракцию анализировали действие деструктивного потен. циала лейкоцитарных клеток.

Данные эксперимента представлены на рис. 2 и в таблицах 3, 4.

-а ...............в ........с

Рис. 2. Динамика активности АсАТ в инкубационной среде при инкубации изолированных m. soleus СМ интактных крыс (не подвергавшихся ИМЯ). X ± SE, п=28. А - контроль (инкубация т. soleus), В - опыт (инкубация т. soleus с активированными зимозаном НФ), С -. опыт (инкубация ш. soleus с неактивированными НФ). По оси абсцисс - время инкубации (ч), по оси ординат - активность (МЕ мл" ■10¿). ' - достоверные отличия активности АсАТ от контроля, р< 0. 05.

Активность мышечных ферментов КК и АсАТ в инкубационной среде, содержащей одни НФ, не обнаруживалась, что позволяло относить активности этих ферментов только на счет выхода их из ; ш. soleus. Инкубация m. soleus в присутствии как активированных, так и неактивированных НФ вызывала увеличение в среднем на 55% активности АсАТ, отмеченное через 1 ч инкубации, что может указывать на усиление выхода мышечных белков из миоцитов вследствие повреждающего действия НФ (увеличение активности КК было недостоверным). Дальнейшая инкубация изолированных ш. soleus как с активированными НФ, так и с неактивированными НФ приводила к достаточно быстрому снижению активности Kh" ( в среднем в 5 раз к 3 ч инкубации) и менее быстрому АсАТ (в среднем в 2 раза к 3 ч инкубации). Снижение активности мышечных ферментов в присутствии НФ может свидетельствовать об участии компонентов НФ, в частности протеиназ . (активность КК в присутствии катепсина G НФ крыс снижалась в В раз) в инактивации и возможно деградации высвобожда-ющихсн их мке; бедке« В исследованиях, проведенных на чистых препаратах ферментов, было показано, что активность кн в присутствии НФ снижается через 30 мин инкубации в 14 раз, в то время, ■ как активность АсАТ уменьшалась к этому времени в 1.8 раза, что указывает на "меньшую устойчивость КК к повреждающему действию НФ. При этом следует заметить, что НФ подавляют активности мышечных ферментов в отсутствии зимозана, ' Главным образом, посредством выбрасываемых при секреторной дегрануляции катионных белков, в том числе протеиназ, а при активации опсониэированным сывороткой зимозаном еще И посредством производимых этими клетками активных форм кислорода (Ward, 1991). ' МПО, продуцируя гипохлорит И0С1, также может вносить'существенный вклад в повреждающее действие НФ (Цыпленков, 1988). ■

Подтверждение факта, свидетельствующего о повреждающем действии НФ на ткани СМ и на мышечные белки-ферменты, было получено в экспериментах, проводимых in vitro на ш. soleus, изолированных из крыс через 24 ч отдыха после ИМД ( табл. 3, 4). При этом группе животных сразу и через 12 ч отдыха после ИМД вводили АС к НФ (опыт 1). В другом случае при инкубации изолированных m. soleus (после . ИМД) в' инкубационную среду дополнительно вносили активированные зимозаном НФ (опыт 2), что усиливало воздействие, оказываемое НФ • на ткани СМ.

Таблица 3. ч

Активность АсАТ в инкубационной среде при инкубации ra. soleus, ' изолированных из СМ крыс через 24 ч отдыха после и ИНД (X + SE, МЕ-мг'1, ii=18).

Время инку- . Инкубационные системы

бации, ч контроль ОПЫТ 1 опытх2

1 0. 500+0. 007 . 0. 130±0. 009' 0. б00+0. 007 V

3 0. 480±0. 014 0. 200±0. 002* 0. 450±0. 007

6 0. 340±0. 009 0. 250±0. 007 ' 0. 260±0. 009 "

8 0. 280±0. 009 0. 200±0. 002 ' 0. 130+0.007' ,

Примечание: контроль - инкубация m. soleus, изолированных ' из СМ крыс через 24 ч после ИМД опыт 1 - инкубация m. soleus, изолированных из СМ крыс через 24 ч после ИМД (АС к НФ введена сразу и через 12 ч после ИМД), опыт 2 - инкубация ш. soleus, изолированных из СМ крыс через 24 ч после ИМД с активированными эимозаном НФ. *■- достоверные отличия от контроля, р<0. 05.

Таблица 4.

Содержание креатина ( 102, мг мл"1) в инкубационной среде при инкубации m. soleus, изолированных из СМ крыс через 24 ч отдыха после ИМД (X ± SE, п=18).

Время инку- Инкубационные системы

бации, ч контроль опыт 1 опыт 2

1 5. 0±0. 5 6. 0±0. 5 7. 0±0. 5 *

3 20.0+0.7 16. 0±0. 7' 27. 0±0. 9*

6 36.0±1. 2 34. 0±1.4 45. 0±1.2*

8 51. 0±2. О 45. 0±2. О*, . 46. 0+1.2*

См. примечание к табл. 3.

В результате снижения уровня НФ в ткани СМ после введения опытной группе животных АС к НФ после ИМД (табл.3 и 4, опыт 1), происходило уменьшение активности АсАТ и содержания креатина в инкубационной среде по сравнению с контролем (аналогичное наблюдали и для КК). При этом уровень активности АсАТ ' в инкубационной среде в опытных группах через 3 ч инкубации был ниже в 2 раза, через 6 ч и 8 ч- на 58%. Содержание креатина в инкубационной среде падало в среднем на 53% Активность КК

уменьшалась на 46% к 1 ч инкубации и на 29% - к'З ч инкубации. Подобные данные яогут указывать на снижение выхода мышечных белков и креатина из СМ после ИМД в отсутствии повреждающего действия НФ.

При дополнительном воздействии НФ на ш. soleus,. изолированных из СМ' крыс, предварительно подвергнутых ИМД (табл.3, опыт 2), обнаружили увеличение активности АсАТ ■ в инкубационной среде через 1 ч инкубации с последующей инактивацией фермента (аналогичное наблюдали и в случае КЮ. Кроме того, в течение 6 ч инкубации уровень креатина в системе с активированными НФ и га. soleus был выше в среднем в 1, 3 раза по сравнению с контролем (табл.4, опыт 2), что скорее всего может указывать на усиление проницаемости миоцитов, приводящее к выходу креатина, вызванному НФ.

Таким ' образом, можно заключить, что появляющиеся в СМ лейкоциту, в частности НФ, привнося свой деструктивный потенциал (АФК, МЛО, катионные белки, протеиназы), способны по-видимому не только участвовать в элиминации пораженного в результате ИМД участка мышцы, по могут тгкхе и повреждать мышечные волокна. В то же время эти компоненты могут принимать участие в деградации мышечных белков, влияя тем самым на метаболизм СМ в период отдыха после ИМД Протеиназы НФ, включаясь в общий баланс протеиназ СМ, могут вовлекаться в метаболические процессы в восстановительный период после ИМД

• • ВЫВОДЫ.

1. Получена и охарактеризована АС к НФ. Отработана процедура использования АС к НФ, позволяющая уменьшить ^количество НФ в крови и снизить их приток в СМ после нагрузки.

2. Однократная ИМД вызывает усиление протеолитических процессов в СМ, достигающее наибольшего значения, по гидролизу ФЦТЦ-казеина при рН 7. 4 и субстрата для эластазоподобных ферментов (Z- ала- про- ала- МСА) при рН 8 к 24 ч отдыха (предельный срок наблюдения). Введение АС к НФ приводит к снижению активности нейтральных протеиназ, определяемой по гидролизу обоих субстратов.

4. Установлено, что однократная ИМД вызывает усиление активности . нейтральных протеиназ, определяемой по гидролизу ФИТЦ-казеина, в мышечных волокнах с различным типом метаболизма. Введение АС к НФ приводит к снижению протеолитической

активности как в гликолитических, так и в оксидативных мышечных волокнах.

5. Методом Вестерн иммуноблотинга было показано присутствие фермента НФ - катепсина G - в тканях СМ. Катепсин G обнаружен в СМ крыс m. sol eus не только после нагрузки, но и в покое.

6. Совместная инкубация изолированных CM m. sol eus и НФ приводит к инактивации высвобождающихся из мышцы ферментов КК и АсАТ. Установлено, что снижение активности АсАТ происходит после ее увеличения в присутствии НФ в начальный период инкубации.

7. Инкубация активированных НФ с m. sol eus, изолированных из СМ крыс, предварительно подвергшихся однократной ИМД приводит к увеличению содержания креатина и активности АсАТ в инкубационной среде в начальный период инкубациии с последующей инактивацией мышечных ферментов. Инкубация ш. sol eus, изолированных из СМ крыс после введения им АС к НФ, приводит к уменьшению активности КК и АсАТ И снижению содержания креатина в инкубационной среде.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕНЕ ДИССЕРТАЦИЙ

1. Петрова Т. Е , Морозов 3. И. Механизмы подавления нейтрофи-лами активности креатинкиназы и аспартатаминотрансферазы скелетных мышц крыс // Б'юлл. эксперим. бйол. медиц. - 1-992.- N12,- С. 603-605.

2. Петрова Т. Е Протеиназы нейтрофилов в скелетных мышцах крыс после интенсивной мышечной деятельности // Материалы всесоюзной конференции "Физическая работоспособность и питание" СПб: НИИФКСПб, 1992,- С. 133-135.

3. Морозов В. И., Петрова Т. Н. Активность протеиназ нейтрофилов в скелетных мышцах крыс после мышечнбй'деятельности // Укр. биохим. журн. - 1993,- Т. 65, N4,- С. 40-44.

4. Матюшичев В. Б., Морозов В. И., Соколов И. Н., Петрова Т. Н., Султан М. С. Изменение проницаемости клеточных мембран куриных миобластов в первичной культуре при контакте с нейтрофилами крыс //Цитология. - 1994.-Т. 36, N2. - С. 169-173. -,

5. Morosov V. I. , Petrova T. N. Neutrophil antiserum results in proteolytic activity decrease in loaded muscles of rats // Intensive Care Medicine. - 1994. -V. 20, Suppl. 1. - S 38.

ФАП 3.47 т.80 4.05.94