Пространственная организация фотосинтетической активности и транспорта протонов в возбудимой растительной клетке

Крупенина, Наталия Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Пространственная организация фотосинтетической активности и транспорта протонов в возбудимой растительной клетке
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Пространственная организация фотосинтетической активности и транспорта протонов в возбудимой растительной клетке"

На правах рукописи,

00344Э66Э

КРУПЕНИНА Наталия Анатольевна

ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И

ТРАНСПОРТА ПРОТОНОВ В ВОЗБУДИМОЙ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКЕ

03 00 02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2008

003449669

Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета имени М В Ломоносова

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Александр Александрович Булычев

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Махир Джафар оглы Мамедов,

доктор биологических наук, профессор Юрий Владимирович Балнокин

Ведущая организация

институт биофизики клетки РАН г Пущино Московской области

Защита состоится « 2008 г в ^ ч СЮ мин на

заседании Диссертационного совета Д501 001 96 при кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета имени М В Ломоносова по адресу 119991, г Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, ауд «Новая»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М В Ломоносова

Автореферат разослан

ПОДПИСЬ РУКИ ЗАВЕРЯЮ

ЗАВ. КАНЦЕЛЯРИИ БИ0Л0ГИЧЕС1

Ученый секретарь ДиссертациошкГго совета, доктор биологических наук, профессор

ТЕ Кренделева

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1 1 Актуальность проблемы

Явления электрической возбудимости характерны для многих растительных клеток, по их физиологическая роль известна далеко не полностью Клетки некоторых мхов, водорослей и высших растений способны генерировать потенциалы действия (ПД) в ответ на освещение (Булычев и др , 1983, Trebacz & Zawadski, 1989), охлаждение (Pyatygm et al, 1992), ожог, механические, химические и элскт рнческие воздействия (Shepherd et al, 2002) Распространяющиеся ПД запускают тургорные движения у листьев Mimosa и насекомоядных растений (Sibaoka, 1969), вызывают остановку движения цитоплазмы в клетках харовых водорослей, у жгутиковых простейших импульсная электрическая активность вовлечена в механизмы фото- и хемотаксиса и регуляцию клеточной подвижности (Litvm et al, 1978) Предполагают, что электрические сигналы запускают ответные реакции клетки и целого растения на изменения окружающей среды Электрическая сигнализация, возможно, участвует в формировании системной устойчивости растения (Wildon et al, 1992), а также в процессах осмотической регуляции

Недавно установлено, что локальный ожог листа одуванчика или мимозы вызывает распространяющееся по листу понижение фотосинтетической активности (Koziolek et al, 2003, Schreiber et al, 2003), которое у мимозы коррелирует с распространением электрического импульса В настоящее время остается неизвестным, каким образом электрические сигналы, возникающие на плазматической мембране растительной клетки, могут регулировать фотосинтетическую активность хлоропластов Важную роть, по-видимому, играют потоки Са2+ и Н"1 между средой, цитоплазмой и хлоропластами, поскольку Са2+ участвует в возбуждении и внутриклеточной сигнализации, а протоны вовлечены в процессы фотосинтеза Механизмы такой регуляции приобретают особый интерес в связи с пространственной гетерогенностью мембранного транспорта ионов Н+ и фотосинтетической активности (Siebke & Weis, 1995, Bulychev et al, 2001, Baker et al, 2001, Bulychev k Vredenberg, 2003) Неизвестно, зависит ли такая гетерогенность от электрического возбуждения плазматической мембраны Перечисленные вопросы рассмотрены в данной работе

Исследования взаимосвязи мембранных процессов и фотосинтеза на листьях высших растений осложняются тем, что лист — это сложная си-

сгема, состоящая из многих клеток и тканей, отличающихся по способности к фотосинтезу и проведению возбуждения Механизмы и функциональную роль ПД растений удобно изучать на харовых водорослях, эволюционно близких к высшим растениям (Lewis & McCourt, 2004), которые наряду с возбудимостью проявляют такие важные биологические функции, как фотосинтез, активный транспорт Н+, движение цитоплазмы и способность к самоорганизации на уровне одиночной клетки

1 2 Цель и задачи исследования

Цель работы заключалась в исследовании влияния электрического возбуждения плазматической мембраны на неоднородное пространственное распределение рН и фотосинтетической активности по длине клетки Chara

Для осуществления данной цели были поставлены следующие задачи

/ Изучить влияние ПД на светозависимое пространственное распределение потоков Н+ через плазмалемму интернодальных клеток водоросли Chara corallma

/ Изучить влияние ПД на квантовый выход фотохимической активности фотосистемы II (ФСИ), нефотохимическое тушение флуоресценции и фотосинтегическое выделение кислорода на микроучастках клетки Chara при разных интенсивностях света

/ Изучить зависимость флуоресценции хлорофилла от присутствия в среде ионофоров, влияющих на уровень Са24 в цитоплазме и трансмембранный градиент рН в тилакоидах хлоропластов

/ Исследовать влияние потенциала действия на флуоресценцию хлорофилла и активность ФСК при разных модификациях электроно-транспортной цепи фотосинтеза

1 3 Научная новизна работы

Впервые изучено влияние электрического возбуждения плазматической мембраны на транспорт протонов через плазмалемму и фотосинтетический метаболизм одиночной растительной клетки Обнаружено, что ПД оказывает сильное влияние на пространственную организацию потоков Н+ на плазмалемме, которое проявляется во временном сглаживании периодического профиля рН Показано, что одновременно с выравниванием неоднородного профиля рН ПД приводит к усилению гетерогенности

в профилях эффективного квантового выхода первичпых фотопроцессов ФСП и нефотохимического тушения флуоресценции хлорофилла а Установлено, что ПД-индуцированное тушение флуоресценции имеет энергозавис имую природу, т е связано с формированием ДрН на тилакоидных мембранах

Впервые выявлена способность ПД скрывать пути трансмембранного проникновения двухвалентного положительно заряженного акцептора метшшиологепа из наружной среды внутрь хлоропластов с преодолением двух мембранных барьеров, создаваемых плазмалеммой и оболочкой хлоропласта Полученные в данной работе результаты дополняют список новых ранее неизвестных последствий генерации ПД в растительной клетке

1 4 Научно-практическая ценность работы

Результаты диссертации расширяют представления о регуляторных механизмах, посредством которых электрические сигналы, возникающие на плазматической мембране растительных клеток, вызывают переходные изменения фогошшешческои активности хлоропластов

Полученные данные по влиянию потенциала действия на проникновение метилвиологена (МВ2+) в клетку имеют важный практический аспект, тк МВ2+ является известным гербицидом (паракват), действующим на фотосистему I (ФС1) хлоропластов, и могут быть использованы в биотехнологических целях при разработке методов эффективного применения гербицидов

1 5 Апробация работы

Результаты работы были представлены на III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004 г), международных конференциях молодых ученых «Ломоносов» (Москва 2004, 2005 гг), юбилейной конференции, посвященной 70-летию академика В П Скулачева «Российская биоэнергетика от молекул к клегке» (Москва, 2005 г), международном биофизическом конгрессе (Монпелье, 2005 г), конференции, посвященной памяти проф M В Гусева «Физиология микроорганизмов в природе и экспериментальных системах» (Москва, 2006 г), международной конференции в честь проф Джима Барбера «Photosynthesis m the post-genomic era Structure and function of photosy&tems» (Пущино, 2006 г ), 9-и международной летней школе по биофизике «Supramolecular structure and function» (Ровинь,

2006 г), 14-й международной конференции «Математика Компьютер Образование» (Пущино, 2007 г), международном симпозиуме «Modern spectroscopy methods m studying structure and function of biopolymers m biology and medicine» (Дубна, 2007 г), 6-м европейском биофизическом конгрессе (Лондон, 2007 г), 14-м международном конгрессе по фотосинтезу (Глазго, 2007 г), а также научных семинарах кафедры биофизики биологического факультета МГУ и факультета молекулярной физиологии растений и биофизики университета г Вюрцбург (Германия)

1 6 Публикации

По материалам диссертации опубликовано 24 работы, из них 12 статей в отечественных и зарубежных рецензируемых журналах

1 7 Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы Par бота проиллюстрирована рисунками, список литературы включает источника

2 ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили клетки харовой водоросли Chara coralhna Klem ex Willd, выращиваемой в аквариумах в лабораторных условиях (рассеянное дневное освещение, 20-22°С) Отдельные междоузлия длиной около 6 см и диаметром около 0 9 мм, не содержащие заметных кальциевых отложений, отрезали от основной оси таллома и помещали в искусственную прудовую воду (ИПВ), содержащую 0 1 мМ КС1, 1 0 мМ NaCI и 0 1 мМ СаС1г, и выдерживали до начала опыта не менее суток

В работе использованы следующие методы

/ Для идентификации кислых и щелочных зон использовали сурьмяные рН-микроэлектроды в стеклянной изоляции с диаметром торцевой рабочей части 10-20 мкм Для измерения продольных профилей рН камеру с клеткой перемещали относительно неподвижного электрода со скоростью около 150 мкм/с Разность потенциалов между рН-микроэлектродом и хлорсеребряным электродом сравнения из-

меряли электрометрическим усилителем VAJ-51 и регистрировали с помощью аналого-цифрового преобразователя CED 1401plus (Великобритания) и программы WmWCP

/ Микрофлуориметрические измерения флуоресценции и анализ флуоресцентных изображений ¡слетки Chara осуществляли методом насыщающих световых импульсов (Goh et al, 1999, Schreiber, 2004) с помощью флуориметров Microscopy РАМ и Imagmg-PAM, соответственно Эффективный квантовый выход фотохимической активности ФСН (AF/F'm) и коэффициент нефотохимического тушения (jYPQ) рассчитывали по формулам (Genty et al, 1989, Van Kooten & Snel, 1990)

p' — p a p p - p>

Y' = —^_- = — NPO = —_—21

x fi pi ' pi

m A 7n m

где F,„ и F'm — максимальные уровни флуоресценции, вызываемые насыщающим световым импульсом после темновой адаптации и на фоне постоянного действующего света, соответственно, a F — фактический уровень флуоресценции на действующем свету

/ Локальную концентрацию Ог у поверхности клетки измеряли с помощью открытого платинового электрода диаметром 100 мкм в стеклянной изоляции Потенциал Pt-катода по отношению к Ag/AgCl-электроду устанавливали на уровне 0 65 В

/ Измерения мембранного потенциала проводили с помощью капиллярных микроэлектродов из стекла «пирекс», заполненных 1 М раствором КС1 Разность потенциалов между клеткой и наружной средой измеряли электрометрическим усилителем VAJ-51

/ Для электростимуляции клетки применяли внеклеточные платиновые электроды, изолированные от измерительной цепи Клетку возбуждали одиночными прямоугольными импульсами тока силой около 10 мкА и длительностью 150-200 мс

/ Окислительно-восстановительные переходы хлорофилла реакционного центра Р700 регистрировали по разности изменений поглощения на длинах волн 810 нм и 870 им (Д Лзю) Для измерений использовали систему регистрации РАМ-101 в сочетании с двухволновым эмиттерно-детекгорным блоком ED-P700DW

Для ослабления интенсивности света использовали стеклянные нейтральные светофильтры Влияние ингибиторов и кофакторов оценивали после периода инкубации от 0 5 до 3 ч

3 ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3 1 Пространственная неоднородность распределения pH у поверхности клетки и активности фотосинтеза в слое хлоропластов

Междоузлия харовых водорослей, находясь на свету, формируют чередующиеся по длине клетки кольцевые зоны выделения и поглощения протонов — кислые и щелочные зоны, соответственно (Lucas & Nucitelli, 1980, Toko et al, 1985) Эти зоны отражают неравномерное светозави-симое распределение активных Н+-насосов плазмалеммы и участков с высокой проводимостью для протонов Предположение о связи пространственной неоднородности pH вдоль поверхности клетки Chara при освещении с неравномерным распределением фотосинтетической активности в слое хлоропластов было высказано в работе (Plieth et al, 1994) и нашло прямое подтверждение в работах Булычева, Черкашина и соавторов (2000-2002 гг) Было показано, что фотохимическая эффективность ФСН и скорость нециклического переноса электронов в хлороп ластах щелочных участков клетки значительно ниже, чем кислых Причины этих различий были изучены более подробно в данной работе При этом исходили из предположения, что низкая фотохимическая эффективность ФСП в щелочных зонах может быть связана как с ослаблением фотохимического тушения, так и с повышенным нефотохимическим тушением флуоресценции в этих участках клетки По измерениям Fm и F'm методом насыщающих импульсов можно оценивать степень нефотохимической диссипации поглощенной энергии света в тепло Безразмерный коэффициент NPQ является удобной характеристикой нефотохимического тушения флуоресценции хлорофилла, так как он не зависит от возможных различий в плотности хлоропластов в разных участках клетки, в отличие от параметров F'mn Fm

Одновременные измерения профилей pH и NPQ по длине клетки показали, что низкий квантовый выход ФСИ и низкая скорость нециклического переноса электронов в щелочных областях клетки связаны с повышенным уровнем тепловых потерь в этих зонах (рис 1А)

Возрастание тепловых потерь у зеленых растений при переходах свет-

Рис. 1. (А) Одновременные измерения продольного профиля pH (пунктирная линия) и NPQ (сплошная лилия) клетки Chara coraUina, освещаемой по всей длине синим светом с интенсивностью 28 мкмоль/(м2-с). (Б) Световые кривые NPQ в щелочной (1,4) и кислой (2,3) зонах в контрольных условиях (1,2) и в присутствии 4 мкМ нигерищша (3,4).

темнота служит механизмом защиты от избытка свега. В основе нефотохимического тушения флуоресценции лежат несколько механизмов (Ruban & Horton, 1995; Müller et ai, 2001): энергозависимое тушение çe, связанное с формированием градиента протонов (ДрН) на мембранах тилакоидов (ТМ); изменения в распределении поглощаемой световой энергии между ФСН и ФС1 («state transition»); а также фотоингибиро-вание ФСП. Эти типы NPQ различаются по скорости темновой релаксации, причем наиболее быстрое восстановление F 'т (в течение минут) характерно для ДрН-зависимого тушения.

В работе показано, что зависимости стационарных значений NPQ от интенсивности света (фотосинтетически активная радиация, ФАР) хорошо описываются распределением Больцмана как для кислых, так и для щелочных участков клетки. Световые зависимости NPQ, измеренные в щелочных участках клетки, смещены но отношению к таковым для кислых участков в сторону низких интенсивностей света (рис. 1Б, кривые 1 и 2). Крутизна перехода на световых кривых NPQ, измеренных в данной работе, была значительно выше, чем в аналогичных опытах с целыми листьями. Одна из причин этих различий связана с равномерным освещением тонкого слоя хлоропластов в клетке Chara и с резкими перепадами освещенности для хлоропластов в листе (на поверхности и в глубине листа).

Действие протонофоров на параметры флуоресценции часто ис-

пользуют для идентификации ДрН-зависимой составляющей NPQ (Ruban & Horton, 1995) В наших опытах нигерицин (индуктор К+/Н+ обмена), практически полностью снимал нефотохимическое тушение во всем исследованном интервале ФАР (рис 1Б) Аналогичное снятие тушения наблюдали в присутствии моненсина, индуцирующего обмен протонов на одновалентные катионы (данные не показаны) Снятие NPQ при действии этих ионофоров свидетельствует о том, что наблюдаемое тушение флуоресценции является энергозависимым (цг) и связано с образованием градиента концентрации Н+ на мембране тилакоидов Результаты показывают, что хлоропласты разных участков освещенной клетки отличаются по величине ДрН, причем более высокий градиент рН характерен для хлоропластов в области щелочных зон

3 2 Влияние потенциала действия на потоки Я+ через плазмалемму

На рис 2 показана пространственно-временная диаграмма наружного рН, полученная путем последовательных измерений продольных профилей рН до и после генерации ПД Измерения проводили методом сканирующего микрозондирования (Bulychev et al, 2001) Из рисунка видно, что в невозбужденной клетке профиль рН включал периодические щелочные пики большой амплитуды Генерация ПД, вызванная коротким импульсом электрического тока, приводила к временному сглаживанию (на 10-20 мин ) и последующему восстановлению профиля рН Генерация второго ПД через 40 мин после первого возбуждения приводила к повторному сглаживанию профиля и его медленному восстановлению

ПД-индуцированное сглаживание периодического профиля рН обусловлено значительным понижением рН в щелочных обласгях клетки и небольшим возрастанием рН в кислых зонах На рис 3 показаны кинетики изменения рН в различных областях клетки Chara

Видно, что изменения рН в обеих зонах достигали экстремума примерно в равное время и были обратимыми Несмотря на значительные различия в изменениях рН в кислой и щелочной зоне, сдвиги концентрации Н+ в этих зонах при возбуждении сопоставимы по порядку величины По-видимому, после генерации ПД прекращаются встречно направленные трансмембранные потоки Н+ в кислых и щелочных зонах, что и приводит к сглаживанию профиля рН по длине клетки В основе изменений рН может лежать повышение концентрации Са2+ в цитоплазме ([Ca2+Jr2/Í) во время ПД (Lunevsky et al, 1983) и вызванная этим модуляция транспортных систем плазмалеммы Известно, что возрастание

Рис. 2. Обратимое сглаживание периодического профиля рН у поверхности клетки Chara corallina после генерации ПД. Стрелками обозначены моменты времени t = 0 и t = 40 мин., когда ПД был вызван импульсами электрического тока длительностью около 150 мс.

5 10 15

Время, мин

5 10 15 20

Время, мин

Рис. 3. Обратимое изменение рН в щелочной (А) и в кислой (Б) зонах у поверхности клетки Chara corallina после генерации ПД. Стрелками-молниями на этом и нижеследующих рисунках обозначены моменты генерации ПД.

|Саактивирует Са2+-зависимые белки, действие которых направлено па ионные каналы и насосы, в том числе и на Н+-АТФазу плазма-леммы. Измерения мембранного потенциала (МП) показали, что после однократного возбуждения МП переходит на гиперполяризованяый уровень (рис. 4). Наблюдаемую полярность смещения МП и направление сдвигов рН после ПД нельзя объяснить только подавлением или акти-

вацией электрогенного Н+-насоса в кислых зонах, так как подавление насоса вызывало бы деполяризацию клетки, а его активация привела бы к снижению рН в кислой зоне Известно, что повышение [Са~' \су1 клеток Chara активирует К+-каналы плазмалеммы (Plieth et al, 1998), что, в свою очередь, должно нарушать локальные круговые токи, связанные с трансмембранным переносом Н+ или ОН~ В связи с этим, можно предполагать, что гиперполяризация плазмалеммы и снижение рН в щелочной зоне после ПД обусловлены быстрым уменьшением Н+-проводимости плазмалеммы в зонах с высоким рН и сдвигом потенциала плазмалеммы в сторону равновесного К+-потенциала

Время, мин

Рис 4 Гиперполяризация плазмалеммы, вызванная генерацией ПД в щелочном участке клетки Chara corallma Стадии быстрой деполяризации (до потенциала ~ 0 ыВ) и последующей репсетяризации выходят за выбранную шкалу напряжений и на рисунке не представлены

Временный сброс установившегося распределения рН по поверхности клетки при генерации ПД может иметь адаптационное значение для ха-ровых водорослей после сильных волнений воды, деформации зарослей и повреждения отдельных побегов При грубых механических воздействиях, нарушающих ориентацию клетки по отношению к источнику света и распределение теней от окружающих побегов, такое обновление профиля рН, запускаемое генерацией ПД в сочетании с процессами самоорганизации, может способствовать оптимизации фотосинтеза, так как приводит профили локальной концентрации СОг в соответствие с условиями освещения клетки

3 3 Влияние ПД на флуоресценцию хлорофилла, фотохимическую эффективность ФСП и нефотохимическое тушение флуоресценции

В работе установлено, что электрическое возбуждение клетки сильно воздействует на ее фотосинтетическую активность Влияние ПД на фотохимическую активность ФСП определяется по изменению параметра который в условиях постоянного освещения служит показателем скорости нециклического транспорта электронов, а также по изменениям концентрации Ог у поверхности клетки (рис 5А) Выявленное сходство кинетических кривых изменений 'т и тока р()г электрода

говорит о том, что оба сигнала — оптический и электродный — отражают торможение нециклического потока электронов и замедление фотосинтетического выделения О2 Генерация ПД сопровождалась также значительным (до 50-60%) снижением уровня максимальной флуоресценции Р'т На рис 5Б показаны ПД-индуцированные изменения Р'т в щелочном участке клетки, которые, как правило, были намного больше таковых в кислых зонах В наших опытах уровень Р'т при возбуждении клетки мог опускаться в пределе до уровня ¥'т, наблюдаемого на ярком свету

Рис 5 (А) Изменение тока кислородного электрода (кривая 1) и AF/F'm (кривая 2) в щелочной зоне при генерации ПД (Б) Падение максимальной флуоресценции F'm, вызванное ПД (кривая 1), сопровождаемое падением рН (кривая 2) в щелочном участке клетки Chara coralhna Режим освещения показан на диаграмме по оси абсцисс светлые полосы обозначают периоды освещения (28 мкмоль/(м2 с)), черная — период темноты Стрелки-молнии указывают момент генерации ПД, простые стрелки — моменты выключения и включения света

Быстрая темповая релаксации тушения F 'т (время релаксации порядка 100 с), обусловленного ПД (рис 5Б) характерна для энергозависимого нефотохимического тушения q¡¡ Очевидно, можно исключить «state transition» и фотоингибирование ФСИ в качестве возможной причины тушения F'm, поскольку тушение флуоресценции, вызываемое переходом из состояния 2 в состояние 1 или фотоингибированием, развивается значительно медленнее, чем изменения F'm, наблюдаемые в наших опытах (рис 5Б)

Кроме того, амплитуда индуцируемых возбуждением изменений F'm и AF/F 'т в щелочных участках клетки для широкого диапазона ФАР была комплементарна зависимости F 'т от интенсивности света в покое Наибольшие изменения F'm и AF/F 'т наблюдали на слабом свету, при котором уровень F'm был высоким, а величина NPQ низкой (рис 6) Повышение интенсивности освещения приводило к усилению дв (возрастание NPQ, снижение FJ и к параллельному ослаблению изменений F'm, вызываемых генерацией ПД На ярком свету це достигало максимального уровня, в этих условиях генерация ПД не оказывала эффекта на F'm Комплементарное соотношение между тушением F'm, индуцированным светом и потенциалом действия (рис 6), быстрая темповая релаксация ПД-индуцированного тушения NPQ (рис 5Б), а также чувствительность светозависимого тушения F'm к действию протонофора (рис 1Б) позволяют заключить, что торможение фотосинтеза (снижение AF/F'm) и повышение доли тепловых потерь (снижение F'm) связаны с временным повышением ДрН на тилакоидных мембранах после ПД

Учитывая более сильное подавляющее влияние ПД на фотосинтетическую активность хлоропластов в щелочных участках клетки Chara, можно было предположить, что генерация ПД приведет к усилению неоднородности в профиле AF/F'm и NPQ в отличие от сглаживания неоднородного профиля рН (рис 2) Это предположение было подтверждено с помощью метода Imaging-PAM, позволяющего следить за изменениями параметров флуоресценции отдельных клеток харовых водорослей Из рис 7 видно, что ПД приводит к значительному усилению гетерогенности в слое хлоропластов по длине интернодалыюй клетки Chara coralhna

Противоположное влияние ПД на неоднородные профили рН и ДF/F'm хорошо видно из рис 8 в левой части рисунка неоднородное распределение после ПД временно исчезает, а в правой, напротив, усиливается На первый взгляд, усиление гетерогенного распределения па-

О 20 40 60 80 100 Интенсивность света, отн ед

Рис 6 Зависимости относительного изменения после генерации ПД (кривая 1) и ЛГР<Э при стационарном освещении (кривая 2) от интенсивности света Интенсивность света 100 отн ед соответств) ет потоку квантов 30 ыкмопь/(м2 с) На кривой 1 показаны стандартные ошибки среднего дая измерений на разных клетках (п = 4—7) Кривая 2 потучена в эксперименте на одной клетке

раметров флуоресценции при выравнивании рН в апопласте кажется неожиданным, так как профили рН и фотосинтетической активности четко скоординированы в покоящейся клетке на свету и исчезают одновременно при затемнении клетки Однако, координация между локальным рН у поверхности клетки и фотосинтетической активностью может быть нарушена при различных воздействиях, например, после инъекции в клетку фосфорилированного пептида, препятствующего физиологическому взаимодействию 14-3-3 белков с Н+-АТФазой плазмалеммы (Ви1усЬеу а1, 2005) Несмотря на то, что изменения рН и параметров АР/Р'т и Р'т происходят в одном временном интервале, связь между этими процессами неполная Оба процесса, вероятно, имеют общие ранние и различающиеся поздние стадии Об этом свидетельствует тот факт, что генерация ПД в темноте не оказывает влияния на параметры флуоресценции и в то же время вызывает снижение рН Об этом же говорит и возможность наблюдения вызываемых ПД сигналов рОг в условиях, когда щелочные зоны еще не восстановились после ПД

Возрастание [Са2+]чь являющееся центральным событием в электрическом возбуждении растительной клетки (Ьипеуэку е£ а1, 1983, Тага\уа, 2003), может запускать цепи процессов, нарушающих как потоки Н+ на плазмалемме, так и фотосинтетические процессы в хлоропластах С це-

Рис. 7. Влияние ПД на пространственные профили (А) фотохимической эффективности ФСП (L\F/F'm) и (Б) коэффициента нефотохимического тушения (NPQ) в клетке Chara corallina. Точка отсчета времени t = 0 соответствует моменту генерации ПД. Цветовые шкалы в нижней части рисунков кодируют значения AF/F'm и NPQ, умноженные на 100.

Время, мин Время, с

Рис. 8. Двухмерные пространственно-временные диаграммы ПД-индуцировашшх изменений профилей рН (А) н Д/1'//'1 'т (Б).

лью проверить возможную роль Са2+ в ПД-индуцированных изменениях параметров флуоресценции, наблюдаемых в наших опытах, было исследовано влияние ПД и ионофора А23187 на световые кривые нефотохимического тушения МРС^ (рис. 9).

Генерация ПД приводила к смещению световых кривых МРС} в сторону более низких ФАР в щелочных участках клетки (рис. 9А) и вызывала аналогичный сдвиг в кислых участках (данные не показаны). Вследствие смещения световых кривых после ПД значения NPQ в определенном диапазоне ФАР резко возрастали, что проявлялось в виде тушения Р'т после ПД. Это означает, что ПД понижает порог ФАР, достаточный для появления МРС^. После обработки клетки ионофором А23187, индуктором электронейтрального Са2+/Н+ обмена, световые кривые АГРС} как в

щелочных, так и в кислых участках клетки сдвигались в сторону более низких интенсивностеи света (рис 9Б)

Рис 9 (А) Световые кривые коэффициента нефотохимического тушения (NPQ), измеренные в щелочном участке клетки Chara coraüma до (кривая 1) и после (кривая 2) возбуждения и в кислом участке покоящейся клетка (кривая 3) (Б) Световые кривые NPQ в щелочном (кривые 1,2) и кислом (кривые 3,4) участках клетки в контрольных условиях (кривые 1,3) и после добавления 10 мкМ ионофора А23187 (кривые 2,4)

Существенно, что этот сдвиг аналогичен смещению световых кривых, наблюдаемому после генерации ПД Эти результаты в сочетании с известными данными о способности ионофора А23187 повышать концентрацию Са2+ в цитоплазме растительных клеток подтверждают предположение о том, что смещение световых кривых NPQ под влиянием ПД связано с повышением уровня Са2+ в цитозоле Полученные результаты указывают на участие Са2+ в ПД-индуцированных изменениях флуоресценции и позволяют предложить схему влияния ПД на фотосинтетический метаболизм и потоки Н+, которая будет рассмотрена ниже

3 4 Влияние ПД на проницаемость мембран клетки и хлоропластов в присутствии метилвиологена

Снижение максимальной флуоресценции F'm под влиянием ПД проявляется только на свету, что позволяет предполагать зависимость этого эффекта от фотосинтетического транспорта электронов и способности хилакоидов к энергизации (формированию ДрН) Это предположение было проверено с помощью ингибиторов и кофакторов переноса электронов

Fm'

AJU

PH NPQ

Fm'

1200

1 2

1000

0 8

800

o o

Время мин

О 20 40 60 80 100 Интенсивность света мкмоль м? с1

Рис. 10. (А) Влияние ПД на F'm (тонки) и рН (лшшя) в щелочной зоне у поверхности клетки Chara coralltna в контроле и в присутствии 2 икМ диурона (на вставке) (Б) Световые кривые коэффициента нефотохичшческого тушения NPQ в контрольных условиях (кривая 1) и после обработки клетки 1 3 мкМ диуроном (кривая 2)

В контрольных условиях энергозависимое тушение флуоресценции це устанавливается при повышении ФАР (рис 1Б), а также возникает и обратимо исчезает после генерации ПД в освещенных клетках Chara (рис 5Б, 10А) Обработка клеток диуроном полностью устраняла возникновение qе на ярком свету (рис 10Б) и при генерации ПД (рис 10А, вставка) Активация циклического транспорта электронов при совместном действии диурона и феназинметосульфата (ФМС) восстанавливала тушение q¡¡, связанное с повышением ФАР, но не восстанавливала тушение qE при генерации ПД Это свидетельствует о том, что высокий уровень F'm и создание ДрН за счет ФМС-зависимого потока электронов не достаточны для развития ПД-индуцировагиюго тушения F'm Очевидно, что влияние ПД на флуоресценцию и первичные реакции ФСК проявляется лишь при наличии нециклического потока электронов

Это наблюдение находит подтверждение о опытах с искусственным акцептором электронов метилвиологеном (паракват, МВ2+) Метилвио-логен принимает электроны от железо-серных центров на акцепторной стороне ФС1, конкурируя с природным акцептором ферредоксином Восстановление МВ2+, в отличие от фиксации СО2, не связано с потреблением АТФ и поэтому значительно усиливает энергизацию тилакоидов, что проявляется в высоком соотношении АТФ/АДФ, усилении нефотохимического тушения и светорассеяния (Salvucci et al, 1987, Neuhaus & Sitt,

Присутствие в наружном растворе МВ2+ в концентрации 0 83 мМ не

1989)

1400

3 0

1200

А Ц в*»»4?

' ^ [

2 520-

1000

и.

800-

600-

400-

2 4 6 Время, мин

0 20 40 60 80 100 Интенсивность света, мкмоль м2 с1

Рис. 11. (А) Изменения фя>оресценции при генерации ПД в контрольных условиях (кривая 1) и в среде с 0 83 мМ МВ2+ (кр1шая 2) (Б) Световые кривые пефотохимического тушения в присутствии 0 2 ч\1 МВ2+ до (кривая 1) и после генерации ПД (кривая 2) Световая кривая АТР(), измеренная до добавления МВ2+ (данные не показаны), практически не отличалась от кривой 1

оказывало влияния на уровень F 'т в щелочной зоне в течение 30 мин По-видимому, отсутствие у клетки в покое характерного тушения в присутствии МВ2+ обусловлено наличием двух мембранных барьеров (плазмалеммы и мембранной оболочки хлоропласта) на пути проникновения МВ2+ в хлоропласты Вместе с тем, генерация ПД после однократного электрического стимула вызывала необратимое снижение Р'т большой амплитуды — до 65% от исходного уровня (рис 11 А) Это тушение было особенно заметно в области низких ФАР, при которых в норме тушение отсутствует (рис 11Б)

О проникновении МВ2+ в хлоропласты судили также по кинетике сигналов ДЛ81о, отражающих изменения редокс-состояния пигмента ФС1 Р700 В контроле (рис 12, кривая 1) форма индукционной кривой ДЛ8ю включала два пика окисления Р700 Стадию промежуточного восстановления Р700+ объясняют притоком электронов от ФСИ после восстановления пластохинона, а вторая волна окисления отражает снятие ограничении для переноса электронов на акцепторной стороне ФС1 (ЭеЬапзкег е1 а1, 2003, 2005) Известно, что фотоокисление Р700 в листьях после темновои адаптации происходит быстрее в присутствии МВ2+, чем в отсутствие экзогенного акцептора, поскольку МВ2+ снимает ограничения для переноса электронов в акцепторной части ФС1, которые существуют в норме после темновой адаптации Измерения ин-

1 2

: \ I \

í ; I \

i \ I \

,\/ I * / I

^ V i ЧУ i

УчМ 'w*.

* I

J Ал/Л 3 4

° I / í ¡ '

* 41 / > i m 1 \ I I

3 ! 'w V ¡ ;

O Oj^^slV ^w^J

I + A

2 с

Рис. 12. Кинетические кривые окисления хлорофилла Р700 в клетках Chara corallina при действии импульса белого света интенсивности 150 мкмоль/(м2-с) после 5-минутпой темповой адаптации в различных условиях: состояние покоя в отсутствие МВ2+ (кривая 1), после однократной генерации ПД в отсутствие МВ2Н' (кривая 2), на протяжении 30-минутной инкубации покоящихся клеток в присутствии 0.2 мМ МВ2+ (кривая 3), после однократной генерации ПД в присутствии 0.2 мМ МВ2+ (кривая 4). Возрастание поглощения на 810 нм по сравнению с поглощением на 870 нм (ДДзщ) соответствует повышению содержания окисленной формы Р700+. Кривые фогоокисдения представляют собой усредненные сигналы четырех клеток. Стрелками показаны моменты включения 2.5-секундных импульсов снега.

Аукционных кривых ДЛ810 (рис. 12) наглядно показывают, что МВ2+, присутствующий во внешней среде, остается биологически неактивным до момента нанесения первого возбуждающего (надпорогового) стимула. Генерация ПД в отсутствие МВ21~ пе оказывала заметного влияния на фотоиндуцированные сигналы ДА$ю в последующий 30-минутный период. Следовательно, быстрое фотоокисление Р700 после генерации ПД в присутствии МВ2+ связано с повышением доступнос ти этого акцептора в строме хлоропластов, а не с торможением активности ФСИ после ПД, которое проявляется и при отсутствии в среде МВ2+.

Низкая проницаемость биологических мембран для окисленного МВ2+ связана с его электрическим зарядом. Для облегчения проникновения МВ2+ в клетки используют различные приемы, такие как длительная (на протяжении полусуток) инкубация, обработка растительного материала детергентами, активное перемешивание листовых высечек на мешалке. Хотя ПД-индуцированное поступление МВ2+ в клетку не вызывает сомнений, вопрос о том, каким образом ПД стимулирует проникновение

МВ2+ в хлоропласгы в настоящее время остается неясным По-видимому, существенную роль играют ионные каналы плазмалеммы, активируемые при возбуждении Они либо пропускают МВ24 наряду с основным видом ионов, либо изменяют концентрацию природных ионов (например, Са2+), влияющих на проницаемость оболочки хлоропласта для МВ2+ При этом следует учитывать, что МВ2+ эффективен даже в очень низких концентрациях — около 40 нМ (Neuhaus & Sitt, 1989), причем при длительном освещении содержание МВ2+ не истощается, так как он работает как катализатор Восстановленная форма окисляется кислородом воздуха с образованием Н2О2, которая в дальнейшем расщепляется до воды Поэтому даже разовое проникновение небольшой порции МВ2+ может оказаться достаточным для кардинальной модификации электронных потоков в хлоропласте

3 5 Заключение

В ходе проведенного исследования было показано, что генерация одиночного потенциала действия вызывает глубокие и продолжительные изменения фотосинтетического метаболизма и транспорта протонов на плазмалемме клеток Chara coralhna Было показано, что генерация одиночного ПД в ответ на короткий электрический стимул вызывает обратимое сглаживание неоднородного профиля рН у поверхности освещенной клетки за счет временной остановки трансмембранных потоков Н+, опосредованных Н+-АТФазой и каналами пассивной проводимости В отличие от неоднородного профиля рН, который выравнивается после генерации ПД, функциональная гетерогенность в слое хлоропластов усиливается после возбуждения клетки Это связано с тем, что влияние ПД на квантовый выход фотохимических реакций ФСН, скорость нециклического переноса электронов и нефотохимическое тушение флуоресценции хлорофилла проявляется в разной мере у хлоропластов щелочных и кислых областей клетки Chara coralhna Впервые установлено, что генерация ПД открывает доступ для проникновения двухвалентного катиона метилвиологена из среды в строму хлоропластов и переключает поток электронов с основного пути на восстановление искусственного акцептора

Предполагаемый механизм влияния ПД на потоки Н+ и активность фотосинтеза схематично показан на рис 13 Получено подтверждение того, что наблюдаемые изменения активности фотосинтеза при ПД обусловлены повышением [Са2+] в цитоплазме Полученные данные свиде-

Рис. 13. Предполагаемая схема влияния ПД на потоки Н+ и активность фотосинтеза в возбудимой растительной клетке. Генерация ПД повышает уровень [Са24^; в связи с открыванием Са2+-каналов плазмалеммы (1) и высвобождением Са^+ из внутриклеточных депо (2)- Возрастание [Ca2+Jeyi активирует Са2+ -связывающие белки, действие которых направлено на ионные каналы и насосы плазмалеммы (3). Увеличение [Са:повышает уровень Са2+ в строме хлоропластов, так как на свету в мембранах оболочки функционирует транслокатор, обеспечивающий поступление Ca2 h в егрому (4) (Mnto et al.. 1982; Kreimer et al., 1985). Повышенный уровень Ca2+ в строме подавляет реакции цикла Кальвина (5) (Wolosiuk et al., 1982; Johnson et al, 2006), снижая потребление АТФ в темновых стадиях фотосинтеза. При этом, по-видимому, тормозится синтез АТФ, возрастает АрН на ГМ (6) и нефотохимическое тушение флуоресценции (7), что приводит к замедлению потока электронов ло ЭТЦ. Эти изменения находят отражение в снижении AF/F'm и F'm. Последующее восстановление обоих параметров, вероятно, связано с удалением избытка Ca2* из стромы в люмен системой Са2+/Н+ обмена, локализованной на ТМ (8) (Ettinger et al, 1999). Такой обмен может реактивировать реакции цикла Кальвина, понизить ДрН на ТМ (9) и, соответственно, и ослабить нефотохимическое тушение (10). Предполагаемая цепь процессов в случае с МВ2+ — более короткая: МВ2+ проникает в клетку по Са2+-каналам плазмалеммы, активируемым во время ПД (И)- Попадая в хлоропласта (12), МВ2+ вызывает быструю и необратимую энергизацию тилакоидов и возрастание NPQ.

тельствуют о влиянии ионных потоков, связанных с генерацией ПД, на транспорт электронов в хлоропластах и защиту клетки от избытка световой энергии.

4 ВЫВОДЫ

1 Одновременные измерения продольных профилей внеклеточного рН и флуоресценции хлорофилла в клетках Chara coralhna выявили, что низкая скорость нециклического потока электронов в хлоропла-стах щелочных участков клетки по сравнению с хлоропластами кислых участков связана с повышенным нефотохимическим тушением возбужденных состояний в ФСП

2 С помощью рН микроэлектродов и метода сканирующего зондирования обнаружено сглаживание светозависимого гетерогенного профиля рН у поверхности клеток Chara после генерации потенциала действия, что свидетельствует о долговременной инактивации Н+-транспортных систем плазмалеммы, ответственных за выведение и поглощение протонов в кислых и щелочных участках клетки, соответственно

3 Анализ флуоресцентных изображении интактных клеток Chara в покое и при возбуждении показал, что, в отличие от распределения рН в апопласге, неоднородные профили нефогохимического тушения и квантовой эффективности ФСП не только не сглаживаются после генерации ПД, но и становятся более контрастными

4 Быстрая темповая релаксация нефотохимического тушения, вызываемого генерацией ПД, комплементарность между светозависимым тушением F 'т и амплитудои сдвигов F 'т после генерации ПД, а также чувствительность светозависимого тушения F 'т к действию про-тонофоров свидетельствуют о том, что тушение флуоресценции при электрическом возбуждении плазмалеммы является энергозависимым и обусловлено возрастанием АрН на мембране тилакоидов

5 Сходное влияние генерации ПД и Са2+-ионофора А23187 на световые кривые NPQ указывает на то, что подавление фотосинтеза и усиление нефотохимического тушения возбужденных состояний в ФСП после импульсной деполяризации возбудимой мембраны опосредовано повышением уровня Са2+ в цитоплазме

6 Анализ флуоресценции хлорофилла ФСП и индукционных изменении рсдокс-состояния фотоактивного пигмента ФС1 Р700 позволил установить, что акцептор метилвиологен (МВ2+) не проникает в хло-ропласты покоящейся клетки Chara, однако попадает в пластиды

сразу же после генерации ПД на электровозбудимой мембране и переключает фотосинтетический поток электронов с ССЬ-завиеимого пути на восстановление МВ2+

7 Полученные результаты раскрывают влияние ионных потоков, связанных с генерацией ПД, на транспорт электронов в хлоропластах, защиту клетки от избытка световой энергии и светозависимую циркуляцию протонов на уровне плазмалеммы

5 СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ

1 А А Булычев, Н А Камзолкина (Крупенина), С Мюллер, А А Чер-кашии, А Б Рубин Временное сглаживание периодического профиля рН в клетках харовой водоросли после генерации потенциала действия // Доклады академии наук, 2004, 396, 109-112

2 A A. Bulychev, N A. Kamzolkina (Krupenma), J Luengviriya, А В Rubm, S С Muller Effect of a single excitation stimulus on photosynthetic activity and light-dependent pH banding m Char a cells // J Membr Biol, 2004, 202, 11-19

3 N A Kamzolkina (Krupenma), A A Bulychev Action potential in Chara cells affects the thylakoid pH gradient and photosynthetic electron flow // Em Biophys J, Proceedings of 15th IUPAB & 5th EBSA International Biophysics Congress, Montpelher, 2005, 34(6), 583

4 А А Булычев, H А Камзолкина (Крупенина), А Б Рубин Влияние электрического возбуждения плазмалеммы на активность фотосистемы II и нефотохимическое тушение в хлоропластах клеточных доменов Chara corallina // Доклады академии наук, 2005, 401, 546549

5 А А Булычев, Н А Камзолкина (Крупенина), С Мюллер Роль физико-химических неоднородностей среды и слоя хлоропластов в формировании транспортных доменов плазмалеммы у клеток Chara corallina // Биологические мембраны, 2005, 22, 363-369

6 А А Булычев, Н А Камзолкина (Крупенина) Влияние потенциала действия на фотосинтез и пространственно распределенные потоки Н+ в клетке и хлоропластах Chara corallina // Физиология растений, 2006, 53, 1-10

7 A A Bulychev, N A Kamzolkina (Krupenma) Differential effects of plasma membrane electric excitation on H+ fluxes and photosynthesis in characean cells // Bioelcctrochemistry, 2006, 69, 209-215

8 H А Крупенина, А А Булычев Межклеточные взаимодеиствия у водоросли Chara corallina, опосредованные локальными сдвигами рН // Материалы международной научной конференции памяти

проф MB Гусева «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах», Москва, 2006, стр 25-26

9 N A Krupemna, A A Bulychev Different responses of photosynthetic apparatus to action potential in high and low light // Eur Biophys J, Proceedings of 6th EBSA & British Biophysical Society Congress, London, 2007, 36, S130

10 N A Krupenina, A A Bulychev Effect of action potential on photosynthesis and proton transport in the plant cell // Photosynthesis Research, Proceedings of ЦШ International Congress on Photosynthesis, Glasgow, 2007, 1, 305

11 A Eremm, A A Bulychev, N A Krupemna, T Mair, M J В Hauser, R Stannarius, S С Muller, А В Rubm Excitation-mduced dynamics of external pH pattern in Chara corallma cells and its dependence on external calcium concentration // Photochem Photobiol Sci, 2007, 6, 103-109

12 N A Krupemna, A A Bulychev Action potential m a plant cell lowers the light requirement for non-photochemical energy-dependent quenching of chlorophyll fluorescence // Biochim Biophys Acta, 2007, 1767, 781-788

13 AA Булычев, H А Крупенина Влияние потенциала действия на фотосинтез и транспорт протонов в растительной клетке // Доклады ТСХА, 2007, 279, 213-216

14 А А Булычев, Н А Крупенина Потенциал действия открывает доступ для проникновения заряженного кофактора в хлоропласты клеток Chara corallma // Физиология растений, 2008, 55, 192-201

15 N A Krupenina, A A Bulychev Effect of action potential on photosynthesis and proton transport m the plant cell //In press J F Allen el al, eds Photosynthesis Energy from the Sun Utth International Congress on Photosynthesis 2008, Dordrecht Springer

16 N A Krupenina, A A Bulychev, R Roelfsema, U Schreiber Action potential in Chara cell intensifies spatial patterns of photosynthetic electron flow and non-photochemical quenching in parallel with inhibition of pH banding // Photochem Photobiol Sci, 2008, 7, 681688

Подписано в печать 10 сентября 2008 г

Формат 60x90/16

Объем 1,5 п i

Тираж 100 экз

Заказ № 110908145

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт» ИНН/КПП 7728572912X772801001

Адрес 117292, г Москва, м Дмитрия У тьянова, д 8 кор 2 Тел 740-76-47, 125-22-73 " http //www umverpnnt ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Крупенина, Наталия Анатольевна

Принятые сокращения

1 Введение

2 Обзор литературы

2.1 Транспорт Н+ в клетках растений.

2.2 Взаимосвязь фотосинтетических и мембранных процессов.

2.3 Элекгрическое возбуждение растительной клетки в связи с его влиянием на фотосинтез и механизмы защиты от фотоповреждения.

2.4 Клетки харовых водорослей — классический объект мембранной биологии

3 Материалы и методы

3.1 Объект и среда.

3.2 Микроэлектродные измерения рН.

3.3 Визуализация динамики изменения рН на границе клетки с использованием красителя тимолового синего.

3.4 Измерение флуоресценции хлорофилла.

3.4.1 Метод насыщающих световых импульсов.

3.4.2 Микрофлуориметрические измерения.

3.4.3 Анализ флуоресцентных изображений Ди МРС] (метод 1тар1^-РАМ).

3.5 Возбуждение клетки.

3.6 Регистрация мембранного потенциала

3.7 Измерение концентрации кислорода.

3.8 Регистрация изменений поглощения хлорофилла Р

4 Результаты

4.1 Пространственная неоднородность распределения рН у поверхности клетки и активности фотосинтеза в слое хлоропластов.

4.1.1 Светозависимое распределение Н+-транспортных систем плазмалеммы и активности ФСП

4.1.2 Пространственная координация между рНо и энергозависимым нефотохимическим тушением флуоресценции в ФСИ.

4.2 Влияние ПД на потоки Н+ через плазмалемму.

4.2.1 Обратимое выравнивание неоднородного профиля рН0 после генерации ПД.

4.2.2 Пространственно-временная динамика изменений рН0 при возбуждении, выявляемая из анализа цифровых изображений п методом сканирующего рН зонда.

4.2.3 Генерация ПД имитирует влияние темпового отключения фотосинтеза на рНо и мембранный потенциал клетки Chara.

4.2.4 Влияние интенсивности света на ПД-индуцированные изменения рН

4.2.5 Зависимость ПД-индуцированных изменений рНо от наружной концентрации Са2+ '.

4.3 Влияние ПД на флуоресценцию хлорофилла, фотохимическую активность ФСП и нефотохимическое тушение флуоресценции.

4.3.1 Влияние ПД на флуоресценцию хлорофилла и фотосинтетическую активность хлоропластов.

4.3.2 Влияние ПД на фотосинтетическое выделение кислорода.

4.3.3 Природа нефотохимического тушения, вызываемого генерацией ПД

4.3.4 Потенциал действия усиливает функциональную неоднородность в слое хлоропластов.

4.3.5 Сходное влияние ПД и ионофора А23187 на световые кривые NPQ

4.3.6 ПД-индуцированные изменения F'm и AF/F'm проявляются только на свету.

4.3.7 Влияние ПД на флуоресценцию зависит от нециклического потока электронов.

4.4 Влияние ПД на проницаемость мембран клетки и хлоропластов дня экзогенного акцептора метилвиологена.

4.4.1 Влияние ПД на эффективность первичных фотопроцессо? в ФСП в норме и в присутствии метилвиологена.

4.4.2 Световые кривые NPQ в покое и после электрического возбуждения у клеток, обработанных метилвиологеном.

4.4.3 Индукционные изменения редокс-состояния Р700 в покое и после ПД у клеток, обработанных метилвиологеном.

4.4.4 Фотоиндуцированные изменения МП клетки Chara и их модификация после генерации ПД в присутствии метилвиологена.

4.4.5 Влияние метилвиологена на потенциал действия.

5 Обсуждение

5.1 Пространственная неоднородность клеток Chara corallina и ее связь с фотосинтезом

5.2 Влияние ПД на периодический профиль рН и фотосинтетическую активность хлоропластов.

5.3 Облегченное проникновение метилвиологена в хлоропласты при генерации

5.4 Предполагаемая схема влияния ПД на фотосинтез и потоки Н+ в клетке Chara corallina.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Пространственная организация фотосинтетической активности и транспорта протонов в возбудимой растительной клетке"

Проблема возникновения структурно-функциональной гетерогенности в исходно гомогенной ткани является одной из важных проблем биологии. Так, в индукционный период в листьях растений отмечено появление областей с разной активностью фотосинтеза (Baker et aL, 2001; Siebke & Weis, 1995а,b); у Elodea canadensis неоднородность транспорта протонов на свету связана с различной активностью фотосинтеза верхней и нижней стороны листа (Elzenga к, Prins, 1989). Пространственная координация активности ионных насосов и каналов, характерная для многих растительных клеток и тканей, выражена особенно сильно у харовых водорослей и проявляется на свету в виде чередующихся по длине клетки изменений рН в примембранных слоях среды и активности фотосинтеза. Несмотря на большой интерес к процессам самоорганизации биологических систем и регуляции мембранного транспорта, механизмы возникновения и функциональная роль этого явления в настоящее время изучены недостаточно. Известно, что свет, поглощаемый хлоро-пластами в процессах фотосинтеза, служит основным фактором возникновения функциональных доменов. Наряду с этим не исключены и другие механизмы, регулирующие пространственно-временную координацию функциональной активности. Представляется вероятным, что процессы генерации и проведения электрического возбуждения тоже оказывают влияние на функциональную гетерогенность растительных клеток.

Явления электрической возбудимости характерны для множества растительных клеток. Клетки некоторых мхов, водорослей и высших растений способны генерировать потенциалы действия (ПД) в ответ на освещение (Bulychev & Turovetsky, 1983), охлаждение (Pyatygin et al., 1992), ожог, механические, химические и электрические воздействия (Shepherd et al., 2002). Распространяющиеся ПД запускают тургорные движения у листьев Mimosa и насекомоядных растений; вызывают остановку движения цитоплазмы в клетках харовых водорослей; у жгутиковых простейших импульсная электрическая активность вовлечена в механизмы фото- и хемотаксиса и регуляцию клеточной подвижности (Litvin et al., 1978). Предполагают, что электрические сигналы запускают ответные реакции клетки и целого растения на изменения окружающей среды. Электрическая сигнализация, возможно, участвует в формировании системной устойчивости растения (Wildonet al., 1992), а также в процессах осмотической регуляции.

Недавно установлено, что локальный ожог листа одуванчика или мимозы вызывает распространяющееся по листу понижение фотосинтетической активности (Koziolek et al., 2003; Schreiber et al., 2003), которое у мимозы коррелирует с распространением электрического импульса. В настоящее время остается неизвестным, каким образом электрические сигналы, возникающие на плазматической мембране растительной клетки, могут регулировать фотосинтетическую активность хлоропластов. Важную роль, по-видимому, играют потоки Са2+ и Н+ между средой, цитоплазмой и хлоропластами, поскольку Са2+ участвует в возбуждении и внутриклеточной сигнализации, а протоны вовлечены в процессы фотосинтеза.

Исследования взаимосвязи мембранных процессов и фотосинтеза на листьях высших растений осложняются тем, что лист — это сложная система, состоящая из многих клеток и тканей, отличающихся но способности к фотосинтезу и проведению возбуждения. Механизмы и функциональную роль ПД растений удобно изучать на харовых водорослях, эволюционно близких к высшим растениям (Lewis & McCourt, 2004), которые наряду с возбудимостью и способностью к самоорганизации проявляют такие важные биологические функции, как фотосинтез, активный транспорт Н+ и движение цитоплазмы на уровне одиночной клетки.

В связи с вышесказанным, цель работы заключилась в исследовании влияния электрического возбуждения плазматической мембраны на неоднородное пространственное распределение pH и фотоспнтетической активности по длине клетки Chara.

Для осуществления данной цели были поставлены следующие задачи:/ Изучить влияние ПД на свегозависимое пространственное распределение потоков Н+ через плазмалемму интернодальных клеток водоросли Chara corallina./ Изучить влияние ПД на квантовый выход фотохимической активности ФСП, нефотохимическое тушение флуоресценции и фотосинтетическое выделение кислорода на микроучастках клетки Chara при разных интенсивностях света./ Изучить зависимость флуоресценции хлорофилла от присутствия в среде ионофо-ров, влияющих на уровень Са2+ в цитоплазме и трансмембранный градиент pH в тилакоидах хлоропластов./ Исследовать влияние потенциала действия на флуоресценцию хлорофилла и активность ФСП при разных модификациях электронотранспортной цепи фотосинтеза.

Глава 2Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Крупенина, Наталия Анатольевна

Заключение

В настоящей диссертационной работе было проведено исследование влияния электрического возбуждения на пространственную организацию потоков Н+ на плазмалемме и активность фотосинтеза на уровне одиночной растительной клетки. Способность харовых водорослей к образованию на свету функционально различных доменов по длине клетки позволила полнее охарактеризовать пространственную неоднородность клеточного метаболизма в покое и при возбуждении.

В ходе проведенного исследования было показано, что генерация одиночного потенциала действия вызывает глубокие и продолжительные изменения фотосинтетического переноса электронов по ЭТЦ и транспорта протонов на плазмалемме клеток Chara corallina. Показано, что генерация одиночного ПД в ответ на короткий электрический стимул вызывает обратимое сглаживание неоднородного профиля рН у поверхности освещенной клетки за счет временной остановки трансмембранных потоков Н+, опосредованных Н+-АТФазой и каналами пассивной проводимости. В отличие от неоднородного профиля рН, который выравнивается после генерации ПД, функциональная гетерогенность в слое хлоропластов усиливается после возбуждения клетки. Это связано с тем, что влияние ПД на квантовый выход фотохимических реакций ФСН, скорость нециклического переноса электронов и нефотохимическое тушение флуоресценции хлорофилла проявляется в разной мере у хлоропластов щелочных и кислых областей клетки Chara corallina. Была выяснена природа нефотохимического тушения флуоресценции при электрическом возбуждении плаз-малеммы. Показано, что наблюдаемое тушение является энергозависимым и связано с возрастанием ДрН на мембране тилакоидов.

Получено подтверждение в пользу того, что наблюдаемые изменения активности фотосинтеза при ПД обусловлены повышением [Са2+] в цитоплазме. Эти данные свидетельствуют о влиянии ионных потоков, связанных с генерацией ПД, на транспорт электронов в хлоропластах и защиту клетки от избытка световой энергии.

Впервые установлено, что генерация ПД открывает доступ для проникновения двухвалентного катиона метилвиологена из среды в строму хлоропластов и переключает поток электронов с основного пути на восстановление искусственного акцептора. Эти данные свидетельствуют о том, что доставка МВ2+ к мишеням его действия в хлоропластах in situ, и, соответственно, эффективность этого гербицида могут зависеть от электрических импульсов, распространяющихся по растению. Полученные в данной работе результаты расширяют представления о регуляторных механизмах, посредством которых электрические сигналы плазмалеммы вызывают изменения фотосинтетической активности хлоро-пластов, а также дополняют список новых, ранее неизвестных последствий генерации ПД в растительной клетке.

Глава 7 Выводы

1. Одновременные измерения продольных профилей внеклеточного рН и флуоресценции хлорофилла в клетках Chara corallina выявили, что низкая скорость нециклического потока электронов в хлоропластах щелочных участков клетки по сравнению с хлоропластами кислых зон связана с повышенным нефотохимическим тушением возбужденных состояний в ФСН.

2. С помощью рН микроэлектродов и метода сканирующего зондирования обнаружено сглаживание светозависимого гетерогенного профиля рН у поверхности клеток Chara после генерации потенциала действия, что свидетельствует о долговременной инактивации Ы+^гранспортных систем плазмалеммы, ответственных за выведение и поглощение протонов в кислых и щелочных участках клетки, соответственно.

3. Анализ флуоресцентных изображений пнтактных клеток Chara в покое и при возбуждении показал, что, в отличие от распределения рН в апопласте, неоднородные профили нефотохимического тушения и квантовой эффективности ФСП не только не сглаживаются после генерации ПД, но и становятся более контрастными.

4. Быстрая темновая релаксация нефотохимического тушения, вызываемого генерацией ПД, комплементарность между светозависимым тушением F'm и амплитудой сдвигов F 'т после генерации ПД, а также чувствительность светозависимого тушения F'm к действию протонофоров свидетельствуют о том, что тушение флуоресценции при электрическом возбуждении плазмалеммы является энергозависпмым и обусловлено возрастанием ДрН на мембране тилакоидов.

5. Сходное влияние генерации ПД и Са2+-нонофора А23187 на световые кривые NPQ указывает на то, что подавление фотосинтеза и усиление нефотохимического тушения возбужденных состояний в ФСИ после импульсной деполяризации возбудимой мембраны опосредовано повышением уровня Са2+ в цитоплазме.

6. Анализ флуоресценции хлорофилла ФСИ и индукционных изменений редокс состояния фотоактивного пигмента ФС1 Р700 позволил установить, что акцептор мети-лвиологен (МВ2+) не проникает в хлоропласты покоящейся клетки Chara, однако попадает в пластиды сразу же после генерации ПД на электровозбудимой мембране и переключает фотосинтетический поток электронов с ССЬ-зависимого пути на восстановление МВ2+.

7. Полученные результаты раскрывают влияние ионных потоков, связанных с генерацией ПД, на транспорт электронов в хлоропластах, защиту клетки от избытка световой энергии и светозависимую циркуляцию протонов на уровне плазмалеммы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Крупенина, Наталия Анатольевна, Москва

1. B.K. Андрианов, A.A. Булычев, Г.А. Курелла, Ф.Ф. Литвин. О связи фотоиндуцирован-ных изменений потенциала покоя с наличием хлоропластов в клетках Nitella. Биофизика,15, 190-191, 1970.

2. В.К. Андрианов, A.A. Булычев, Г.А. Курелла, Ф.Ф. Литвин. Влияние света на потенциал покоя и активность катионов К+, Н+, Na+ в вакуолярном соке клеток Nitella. Биофизика,16, 1031-1036, 1971.

3. В.А. Бобров, В.М. Юрин, Л.Г. Яглова, Г.А. Курелла. Электрические и термодинамические свойства Н+-АТФазных каналов электрогенной помпы на плазмалемме клеток Nitella. Физиология растений, 26(6), 1193-1202, 1979.

4. A.A. Булычев, П. ван ден Вейнгард, А. де Бур. Пространственная координация активности хлоропластов и плазмалеммы в клетках Chara и ее нарушение при инактивации белков 14-3-3. Биохимия, 70, 68-76, 2005а.

5. A.A. Булычев, H.A. Камзолкина. Влияние потенциала действия на фотосинтез и пространственно распределенные потоки Н+ в клетке и хлоропластах Chara corallina. Физиология растений, 53(1), 5-14, 2006.

6. A.A. Булычев, H.A. Камзолкина, С. Мюллер. Роль физико-химических неоднородностей среды и слоя хлоропластов в формировании транспортных доменов плазмалеммы у клеток Chara corallina. Биологические мембраны, 22(5), 363-369, 2005b.

7. A.A. Булычев, H.A. Крупенина. Потенциал действия открывает доступ для проникновения заряженного кофактора в хлоропласты клеток Chara corallina. Физиология растений, 55(2), 192-201, 2008а.

8. A.A. Булычев, H.A. Крупенина. Облегченное проникновение метилвпологена в хлоропласты in situ при генерации электрического импульса па возбудимой мембране растительной клетки. Биологические мембраны, 25(5), 343-351, 2008b.

9. A.A. Булычев, A.A. Черкашин, В. Вреденберг, A.B. Рубин, B.C. Зыков, С.Х. Мюллер. Флуоресценция и фотосинтетическая активность хлоропластов в кислых и щелочных зонах клеток Chara corallina. Физиология растений, 48, 384-391, 2001.

10. A.A. Булычев, A.A. Черкашин, А.Б. Рубин. Изучение пространственной координации фотосинтеза и транспорта Н+ в клетках Char a corallina с использованием общего и локального освещения. Физиология растений, 51(1), 5-12, 2004.

11. A.A. Булычев, A.A. Черкашин, А.Б. Рубин, С.Х. Мюллер. Распределение кислых и щелочных зон на поверхности клеток Chara corallina при стационарном и локальном освещении. Физиология растений, 49(6), 805-813, 2002.

12. Н.Г. Бухов. Динамическая световая регуляция фотосинтеза. Физиология растений, 51(6), 825-837, 2004.

13. B.А. Опритов, С.С. Пятыгии, В.Г. Регивин. Биоэлектрогенез у высших растений. М.: Наука, 1991.

14. Д. Ремиш, A.A. Булычев. Влияние освещения на pH среды у поверхности одиночного изолированного хлоропласта. Биофизика, 34, 445-449, 1989.

15. A.A. Черкашин, A.A. Булычев, А.Б. Рубин. Динамика фотосинтетической эффективности в формирующихся транспортных доменах илазмалеммы Chara corallina. Доклады академии наук, 386(5), 699-702, 2002.

16. К. Arens. Physiologische Multipolaritat der Zelle von Nitella Wahrend der Photosynthese. Protoplasma, 33, 295-300, 1939.

17. S.M. Assmann. Signal transduction in guard cells. Annu. Rev. Cell Biol., 9, 345-375, 1993.

18. T.J. Avenson, J.A. Cruz, D.M. Kramer. Modulation of energy-dependent quenching of excitons in antennae of higher plants. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 101, 5530-5535, 2004.

19. N.R. Baker, R. Oxborough, T. Lawson, J.I.L. Morison. High resolution imaging of photosynthetic activities of tissues, cells and chloroplasts in leaves. J. Exp. Bot., 52, 615-621, 2001.

20. J. Barber, B. Andersson. Too much of a good thing: light can be bad for photosynthesis. Trends Biochem. Sei, 17, 61-66, 1992.

21. M.J. Beilby. Calcium in plant action potentials. Plant Cell Environ., 7, 415-421, 1984.

22. M.J. Beilby, T. Mimura, T. Shimmen. The proton pump, high pH channels, and excitation: voltage clamp studies of intact and perfused cells of Nitellopsis obtusa. Protoplasma, 175, 144-152, 1993.

23. G.N. Berestovsky, A.A. Kataev. Voltage-gated calcium and Ca2+-activated chloride channels and Ca2+ transients: voltage-clamp studies of perfused and intact cells of Char a. Eur. Biophys. J., 34, 973-986, 2005.

24. M.A. Bisson, N.A.Walker. Control of passive permeability of the Chara plasmalemma. J. Exp. Bot, 33, 520-532, 1982.

25. M.A. Bisson, N.A. Walker. The Chara plasmalemma at high pH. Electrical measurements show rapid specific passive uniport of H+ or Oil". J. Membr. Biol., 56(1), 1-7, 1980.

26. M. Borowitzka, A.W.D. Larkum. Calcification in the green alga Halimeda: III The sources of inorganic carbon for photosynthesis and calcification and a model of the mechanism of calcification. J. Exp. Bot., 27, 879-893, 1976.

27. C. Brownlee, A.R. Taylor. Algal calcification and silification. Encyclopedia of Life Sciences, Macmillan Publishers Ltd., Nature Publishing Group, 1-6, 2002.

28. A.A. Bulychev, A.A. Cherkashin, A.B. Rubin, W.J. Vredenberg, V.S. Zykov, S.C. Müller. Comparative study on photosynthetic activity of chloroplasts in acid and alkaline zones of Chara corallina. Bioelectrochemistry, 53, 225-232, 2001a.

29. A.A. Bulychev, N.A. Kamzolkina. Differential effects of plasma membrane electric excitation on H+ fluxes and photosynthesis in eharacean cells. Bioelectrochemistry, 69, 209-215, 2006.

30. A.A. Bulychev, M.M. Niyazova, V.B. Turovetsky. Electro-induced changes of chlorophyll fluorescence in individual intact chloroplasts. Biochim. Biophys. Acta, 850, 218-225, 1986.

31. A.A. Bulychev, V.B. Turovetsky. Light-triggered changes in membrane potential of Anthoceros puTictatus and their relation to activation of chloroplast ATPase. J. Exp. Bot., 34,1181-1188, 1983.

32. A.A. Bulychev, W.J. Vredenberg. Enhancement of the light-triggered electrical response in plant cells following their deenergization with uncouplers. Physiol. Plant., 94, 64-70, 1995.

33. A.A. Bulychev, S.V. Zykov, A.B. Rubin, S.C. Müller. Transitions from alkaline spots to regular bands during pH pattern formation at the plasmalemma of Chara cells. Eur. Biophys. J., 32, 144-153, 2003.

34. D.J. Burritt, S. Mackenzie. Antioxidant metabolism during acclimation of Begonia x erythrophylla to high light levels. Ann. Bot., 91, 783-794, 2003.

35. W.P. Chen, P.H. Li. Chilling-induced Ca2+ overload enhances production of active oxygen species in maize (Zea mays L.) cultured cells: the effect of abscisic acid treatment. Plant Cell Environ., 24, 791-800, 2001.

36. A.R. Crofts, C.T. Yerkes. A molecular mechanism for ^-qucnching. FEES Lett., 352, 265-270, 1994.

37. H. Dau. Short-term adaptation of plants to changing light intensities and its relation to photosystem II photochemistry and fluorescence emission. J. Photochem. Photobiol., 26, 3-27, 1994.

38. E. Davies. Electrical signals in plants: facts and hypotheses. A.G. Volkov (Ed,.), Plant Electrophysiology. Theory and Methods, §17, 407-422, 2006.

39. A.H. De Boer. Plant 14-3-3 proteins assist ion channels and pumps. Biochem. Soc. Transact., 30(4), 416-421, 2002.

40. P. De Nisi, M. Dell'Orto, L. Pirovano, G. Zocchi. Calcium-dependent phosphorylation regulates the plasma-membrane H+-ATPase activity of maize (Zea mays L.) roots. Planta, 209, 187- >194, 1999.

41. A. Dorn, M.H. Weisenseel. Growth and the current pattern around internodal cells of Nitella flexilis L. J. Exp. Bot., 35(152), 373-383, 1984.

42. H. Dziubiriska, K. Trgbacz, T. Zawadski. The effect of excitation on the rate of respiration in the liverwort Conocephalurn conicum. Physiol. Plant., 75, 417-423, 1989.

43. J.T.M. Elzenga, H.B.A. Prins. Light-induced polar pH changes in leaves of Elodea canadiens. Plant Physiol, 91(1), 62-67, 1989.

44. W.F. Ettinger, A.M. Clear, K.J. Fanning, M.L. Peck. Identification of Ca2+/H+ antiport in the plant chloroplast thylakoid membrane. Plant Physiol, 119, 1379-1385, 1999.

45. J.A. Feijo, J. Sainhas, G.R. Hackett, J.G. Kunkel, P.K. Hepler. Growing pollen tubes possess a constitutive alkaline band in the clear zone and a growth-dependent acidic tip. J. Cell Biol., 144(3), 483-496, 1999.

46. H. Felle, A. Bertl. Light-induced cytoplasmic pH changes and their interrelation to the activity of the electrogenic proton pump in Riccia fluitans. Biochim. Biophys. Acta, 848, 176-182, 1986.

47. G.P. Findlay. Voltage-clamp experiments with Nitella. Nature, 191, 812-814, 1961.

48. J. Fisahn, U.-P. Hansen, W.J. Lucas. Reaction kinetic model of a proposed plasma membrane two-cycle H+-transport system of Char a corallina. Proc. Natl. Acad. 3d. USA, 89, 32613265, 1992.

49. Foissner. Microfilaments and microtubules control the shape, motility, and subcellular distribution of cortical mitochondria in characean internodal cells. Protoplasma, 224, 145-157, 2004.

50. J. Fromm. Long-distance electrical signaling and physiological functions in higher plants. A.G. Volkov (Ed.), Plant Electrophysiology. Theory and Methods, §12, 269-285, 2006.

51. J. Fromm, S. Lautner. Electrical signals and their physiological significance in plants. Plant Cell Environ., 30, 249-257, 2007.

52. S. A. Frost Shartzer, J. Fisahn, W.J. Lucas. Simultaneous measurement of extracellular current and membrane potential of Chara corallina internodal cells during light-induced modulation of H+ transport. C.R. Acad. 3d. Paris, Ser.3, 315, 247-254, 1992.

53. M. Fujimoto, Y. Matsumura, N. Satake. General properties of antimony microelectrode in comparison with glass microelectrode for pH measurement. Jap. J. Physiol., 30, 491-508, 1980.

54. B. Genty, J.M. Briantais, N.R. Baker. The relationship between the quantum yield of photosynthetic electron transport and quenching of chlorophyll fluorescence. Biochim. Biophys. Acta, 990, 87-92, 1989.

55. M.T. Giardi, A. Cona, B. Geiken, T. Kugzera, J. Masojidek, A.K. Mattoo. Long-term drought stress induces structural and functional reorganization of photosystem II. Planta, 199, 118— 125, 1996.

56. C.-H. Goh, P. Dietrich, R. Steinmeyer, U. Schreiber, H.-G. Nam, R. Hedrich. Parallel recordings of photosynthetic electron transport and K+ channel activhy in single guard cells. Plant J., 32, 623-630, 2002.

57. C.-H. Goh, U. Schreiber, R. Hedrich. New approach to monitoring changes in chlorophyll a fluorescence of single guard cells and protoplasts in response to physiological stimuli. Plant Cell Environ., 22, 1057-1070, 1999.

58. A. Hager. Role of the plasma membrane H+-ATPase in auxin-induced elongation growth: historical and new aspects. J. Plant Res., 116, 483-505, 2003.

59. J. Harbinson, C.L. Hedley. Changes in P700 oxidation during the early stages of the induction of photosynthesis. Plant Physiol., 103, 649-660, 1993.

60. A.B. Hope. The action potential in cells of Chara. Nature, 191, 811-812, 1961.

61. A.B. Hope, G.P. Findlay. The action potential in Chara. Plant Cell Physiol., 5, 377-379, 1964.

62. A.B. Hope, N.A. Walker. Physiology of Giant Algal Cells. Cambridge University Press, London, 1975.

63. C.H. Johnson, R. Shingles, W.F. Ettinger. Regulation and role of calcium fluxes in the chloroplast. R.R. Wise et al. (eds.), The Structure and Function of Plastids, 403-416, 2006.

64. D.L. Jones, L.V. Kochian, S. Gilroy. Aluminum induces a decrease in cytosolic calcium concentration in BY-2 tobacco cell cultures. Plant Physiol., 116, 81-89, 1998.

65. N. Kamiya. Physical and chemical basis of cytoplasmic streaming. Anna. Rev. Plant. Physiol 32, 205-236, 1981.

66. A. Kanazawa, D.M. Kramer. In vivo modulation of nonphotochemical exciton quenching {NPQ) by regulation of the chloroplast ATP synthase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(20), 12789-12794, 2002.

67. G. Kawamura, M. Tazawa. Rapid light-induced potential change in Chara cells stained with neutral red in the absence of internal Mg-ATP. Plant Cell Physiol., 21(4), 547-559, 1980.

68. M. Kikuyama, M. Tazawa. Ca2+ ion reversibly inhibits the cytoplasmic streaming of Nitella. Protoplasma, 113, 241-243, 1983a.

69. M. Kikuyama, M. Tazawa. Transient increase of intracellular Ca2+ during excitation of tonoplast-free Chara cells. Protoplasma, 117, 62-67, 1983b.

70. T. Kinoshita, M. Nishimura, K. Shiinazaki. Cytosolic concentration of Ca2+ regulates the plasma membrane H+-ATPase in guard cells of fava bean. Plant Cell, 7, 1333-1342, 1995.

71. T. Kinoshita, K. Shimazaki. Blue light activates the plasma membrane H+-ATPase by phosphorylation of the C-terminus in stomatal guard cells. EMBO J., 18, 5548-5558, 1999.

72. U. Kishimoto, T.-A. Ohkawa. Shortening of Nitella internode during excitation. Plant Cell Physiol., 7, 493-497, 1966.

73. H. Kitasato. The influence of H+ on the membrane potential and ion fluxes of Nitella. J. Gen. Physiol., 52, 60-87, 1968.

74. C. Klughammer, U. Schreiber. Measuring P700 absorbance changes in the near infrared spectral region with a dual wavelenght pulse modulation system. G. Gar ah (ed.), Photosynthesis: Mechanisms and Effects, 4357-4360, 1998.

75. K. Köhler, H.-J. Geisweid, W. Simonis, W. Urbach. Changes in membrane potential and resistance caused by transient increase of potassium conductance in the unicellular green alga Eremospbaera viridis. Planta, 59, 165-171, 1983.

76. C. Koziolek, T.E.E. Grams, U. Schreiber, R. Matyssek, J. Fromm. Transient knockout of photosynthesis mediated by electrical signals. New Phytol., 161, 715-722, 2003.

77. G. Kreimer, M. Melkonian, E. Latzko. An electrogenic uniport mediates light-dependent Ca2+ influx into intact spinach chloroplasts. FEBS Lett., 180(2), 253-258, 1985.

78. N.A. Krupenina, A.A. Bulychev. Action potential in a plant cell lowers the light requirement for non-photochemical energy-dependent quenching of chlorophyll fluorescence. Biochim. Biophys. Acta, 1767, 781-788, 2007.

79. S. Lautner, T.E.E. Grams, R. Matyssek, J. Fromm. Characteristics of electrical signals in poplar and responses in photosynthesis. Plant Physiol., 138, 2200-2209, 2005.

80. A. Lewis, R.M. McCoui t. Green algae and the origin of land plants. Amer. J. Botany, 91(10), 1535-1556, 2004.

81. F.F. Litvin, O.A. Sineshchekov, V.A. Sineshchekov. Photoreceptor electric potential in the phototaxis of the alga Haematococcus pluvialis. Nature, 271, 476-478, 1978.

82. W.J. Lucas. Mechanism of acquisition of exogenous bicarbonate by internodal cells of Chara corallina. Planta, 156, 181-192, 1982.

83. W.J. Lucas, R. Nucitelli. HCOJ and OH" transport across the plasmalemma of Chara: spatial resolution obtained using extracellular vibrating probe. Planta, 150, 120-131, 1980.

84. W.J. Lucas, F.A. Smith. The formation of alkaline and acid regions at the surface of Chara corallina cells. J. Exp. Bot, 24(1), 1-14, 1973.

85. V.S. Lunevsky, O.M. Zherelova, I.Y. Vostrikov, G.N. Beiestovsky. Excitation of Characeae cell membranes as a result of activation of calcium and chloride channels. J. Membr. Biol., 72, 43-58, 1983.

86. S. Mackenzie, L. Mcintosh. Higher plant mitochondria. Plant Cell, 11, 571-585, 1999.

87. T.A. McConnaughey, R.H. Falk. Calcium-proton exchange during algal calcification. Biol. Bull., 180, 185-195, 1991.

88. J.P. Metraux, P.A. Richmond, L. Taiz. Control of cell elongation in Nitella by endogenous cell wall pH gradients. Plant Physiol., 65, 204-210, 1980.

89. A.J. Miller, D. Sanders. Depletion of cytosolic free calcium induced by photosynthesis. Nature, 326, 397-400, 1987.

90. P. Miiller, X.-P. Li, K.K. Niyogi. Non-photochemical quenching. A response to excess light energy. Plant Physiol., 125, 1558-1566, 2001.

91. S. Muto, S. Izawa, S. Miyachi. Light-induced Ca2+ uptake by intact chloroplasts. FEBS Lett., 139, 250-254, 1982.

92. Nedbal, V. Brezina. Complex metabolic oscillations in plants forced by harmonic irradiance. Biophys. J., 83, 2180-2189, 2002.

93. H.E. Neuhaus, M. Sitt. Pertrubation of photosynthesis in spinach leaf discs by low concentrations of methyl viologen. Planta, 91, 205-211, 1989.

94. E.A. Nothnagel, L.S. Barak, J.W. Sanger, W.W. Webb. Fluorescence studies on modes of cytoclilasin B and phallotoxin action on cytoplasmic streaming in Chara. J. Cell Biol, 88, 364-372, 1981.

95. K. Oda, P.J. Linstead. Changes in Cell Length During Action Potentials in Chara. J. Exp. Bot., 26, 228-239, 1975.

96. Packer. Effect of nigericin upon light-dependent monovalent cation transport in chloroplasts. Biochem. Biophys. Res. Commun., 28, 1022-1027, 1967.

97. K. Padmasree, L. Padmavathi, A.S. Raghavendra. Essentiality of mitochondrial oxidative metabolism for photosynthesis: optimization of carbon assimilation and protection against photoinhibition. Grit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 37(2), 71-119, 2002.

98. C. Pastenes, P. Pimentel, J. Lillo. Leaf movements and photoinhibition in relation to water stress in field-grown beans. J. Exp. Bot, 56(411), 425-422, 2005.

99. H. Peña-Cortés, J. Fisahn, L. Willmitzer. Signals involved in wound-induced proteinase inhibitor II gene expression in tomato and potato plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 4106-4113, 1995.

100. R.B. Peterson, M.N. Sivak, D.A. Walker. Carbon dioxide-induced oscillations in fluorescence and photosynthesis. Plant Physiol., 88, 1125-1130, 1988.

101. C. Plieth, B. Sattelmacher, U.-P. Hansen. Cytoplasmic Ca2+-H+-exchange buffers in green algae. Protoplasma, 198, 107-124, 1997.

102. C. Plieth, B. Sattelmacher, U.-P. Hansen. Light-induced cytosolic calcium transients in green plant cells. II. The effect on a I<+ channel as studied by a kinetic analysis in Chara corallina. Planta, 207, 52-59, 1998a.

103. C. Plieth, B. Sattelmacher, U.-P. Hansen, G. Thiel. The action potential in Chara: Ca2+ release from internal stores visualized by Mn2+-induced quenching of fura-dextran. Plant J., 13(2), 167-175, 1998b.

104. G.D. Price, M.R. Badger, M.E. Basset, M.I. Whitecross. Involvement of plasmalemmasomes and carbonic anhydrase in photosynthetic utilization of bicarbonate in Chara corallina. Aust. J. Plant Physiol., 12, 241-256, 1985.

105. S.S. Pyatygin, V.A. Opritov, V.A. Khudyakov. Subthreshold changes in excitable membranes of Cucurbita pepo L. stem cells during cooling-induced action potential generation. Planta, 186, 161-165, 1992.

106. D. Remis, A.A. Bulychev, G.A. Kurella. Photo-induced pH changes in the vicinity of isolated Peperomia metallica chloroplast. J. Exp. Bot, 39(202), 633-640, 1988.

107. A.V. Ruban, P. Horton. An investigation of the sustained component of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in isolated chloroplasts and leaves of spinach. Plant Physiol, 108, 721-726, 1995.

108. F. Rutschmann, U. Stalder, M. Piotrowski, C. Oecking, A. Schaller. LeCPKl, a calcium-dependent protein kinase from tomato. Plasma membrane targeting and biochemical characterization. Plant Physiol., 129, 156-168, 2002.

109. J. Sai, C.H. Johnson. Dark-stimulated calcium ion fluxes in the chloroplast stroma and cytosol. Plant Cell, 14, 1279-1291, 2002.

110. M.E. Salvucci, A.R.J. Portis, U. Heber, W.L. Ogren. Stimulation of tliylakoid energization and ribulose-bisphosphate/oxygenase in Arabidopsis leaves by methyl viologen. FEBS Lett, 221, 215-220, 1987.

111. D. Sanders, J. Pelloux, C. Brownlee, J.F. Harper. Calcium at the crossroad of signaling. Plant Cell, 14, S401-S417, 2002.

112. G. Schansker, A. Srivastava, Govindjee, R.J. Strasser. Characterization of the 820-nm transmission signal paralleling the chlorophyll a fluorescence rise (OJIP) in pea leaves. Funct. Plant Biol., 30, 785-796, 2003.

113. G. Schansker, S.Z. Toth, R.J. Strasser. Methylviologen and dibromothymoquinone treatments of pea leaves reveal the role of photosystem I in the Chi a fluorescence rise OJIP. Biochim. Biophys. Acta, 1706, 250-261, 2005.

114. G. Schonknecht, C.S. Bauer, W. Simonis. Light-dependent signal transduction and transient changes in cytosolic Ca2+ in a unicellular green alga. J. Exp. Bot., 49(318), 1-11, 1998.

115. U. Schreiber, W. Bilger, C. Neubauer. Chlorophyll fluorescence as a nonintrusive indicator for rapid assessment of'in vivo photosynthesis. E.-D. Schulze & M.M. Caldwell (eds.), Ecophysiology of Photosynthesis, 49-70, 1995.

116. U. Schreiber, H. Walz, J. Kolbowski. Propagation of spatial variations of chlorophyll fluorescence parameters in dandelion leaves induced by laser spot heating. http://pam-news.de/ar/03-01/PAMNews03-01.html, 2003.

117. K.A. Serikawa, D.M. Porterfield, P.J.S. Smith, D.F. Mandoli. Calcification and measurement of net proton and oxygen flux reveal subcellular domains in Acetabularia acetabulum. Planta, 211, 474-483, 2000.

118. E.E. Serrano, E. Zeiger, S. Hagiwara. Red light stimulates an electrogenic proton pump in Vicia guard cell protoplasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 436-440, 1988.

119. V.A. Shepherd, M.J. Beilby, T. Shimmen. Mechanosensory ion channels in charophyte cells: the response to touch and salinity stress. Eur. Biophys. J., 31, 341-355, 2002.

120. T. Shimmen, A. Yamamoto. Intracellular chloride and potassium ions in relation to excitability of Chara membrane. J. Membr. Biol., 55, 223-232, 1980.

121. T. Shimmen, A. Yamamoto. Induction of a new alkaline band at a target position in internodal cells of Chara corallina. Plant Cell Physiol., 43, 980-983, 2002.

122. T. Shimmen, S. Yonemura, M. Negoro, W.J. Lucas. Studies on alkaline band formation in Chara corallina-. ameliorating effect of Ca2+ on inhibition induced by osmotic shock. Plant Cell Physiol., 44(9), 957-960, 2003.

123. K. Siebke, E. Weis. Assimilation images of leaves of Glechoma hederacea: Analysis of non-synchronous stomata related oscillations. Planta, 196, 155-165, 1995a.

124. K. Siebke, E. Weis. Imaging of chlorophyll-a-fluorescence in leaves: Topography of photosynthetic oscillations in leaves of Glechoma hederacea. Photosynth. Res., 45, 225-237, 1995b.

125. J.R. Smith. Effect of spatially inhomogeneous membrane upon the measured electrical properties of Chara. J. Membr. Biol., 73, 185-192, 1983.

126. J.R. Smith, M.J. Beilby. Inhibition of electrogenic transport associated with the action potential in Chara. J. Membr. Biol., 71, 131-140, 1983.

127. J.R. Smith, N.A. Walker. Membrane conductance of Chara measured in the acid and basic zones. J. Membr. Biol., 73, 1983.

128. P.J.S. Smith, N.A. Walker. Effects of pH and light on the membrane conductance measured in the acid and basic zones of Chara. J. Membr. Biol., 83, 193-205, 1985.

129. J.F.H. Snel, H.H.A. Dassen. Measurement of light and pH dependence of single-cell photosynthesis by fluorescence microscopy. J. Fluor., 10, 269-273, 2000.

130. E.P. Spalding. Ion channels and the transduction of light signals. Plant Cell Environ., 23, 665-674, 2000.

131. D.G. Spear, J.K. Barr, C.E. Barr. Localization of hydrogen ion and chloride ion fluxes in Nitella. J. Gen. Physiol., 54(3), 397-414, 1969.

132. H. Sugi, S. Chaen. Force-velocity relationships in actin-myosin interactions causing cytoplasmic streaming in algal cells. J. Exp. Biol., 206, 1971-1976, 2003.

133. M. Tazawa. Cell physiological aspects of the plasma membrane electrogenic H+ pump. J. Plant Res., 116, 419-442, 2003.

134. M. Tazawa, S. Fujii, M. Kikuyama. Demonstration of light-induced potential change in Chara cells lacking tonoplast. Plant Cell Physiol., 20, 271-280, 1979.

135. K. Toko, H. Chosa, K. Yamafuji. Dissipative structure in the Characeae: Spatial pattern of proton flux as a dissipative structure in characean cells. J. Theor. Biol., 114, 125-175, 1985.

136. M. Tominaga, T. Kinoshita, K. Shimazaki. Guard-cell chloroplasts provide ATP required for H+ pumping in the plasma membrane and stomatal openind. Plant Cell Physiol., 42(8), 795-802, 2001.

137. K. Trebacz, R. Tarnecki, T. Zawadzki. The effects of ionic channel inhibitors and factors modifying metabolism on the excitability of the liverwort Conocephalum conicum. Physiol. Plant., 75, 24-30, 1989.

138. K. Trebacz, T. Zawadzki. Characteristics of the light-induced generator potentials in the liverwort Conocephalum conicum. Physiol. Plant., 75, 20-26, 1989.

139. O. Van Kooten, J.F.H Snel. The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology. Photosynth. Res., 25, 147-150, 1990.

140. K.H. Vanselow, U.-P. Hansen. Rapid effect of light on the K+ channel in the plasmalemina of Nitella. J. Membr. Biol., 110, 175-187, 1989.

141. A. Vian, C. Henry-Vian, E. Davies. Rapid and systemic accumulation of chloroplast mRNA-binding protein transcript after flame stimulus in tomato. Plant Physiol., 121, 517-524, 1999.

142. W. Vredenberg, W.J.M. Tonk. Photosynthetic energy control of an electrogenic ion pump at the plasmalemma of Nitella translucens. Biochim. Biophys. Acta, 298, 354, 1973.

143. M. Wacke, G. Thiel. Electrically triggered all-or-noiie Ca2+-liberation during action potential in the giant alga Chara. J. Gen. Physiol., 118, 11-21, 2001.

144. M. Wacke, G. Thiel, M.T. Hütt. Ca2+ dynamics during membrane excitation of green alga Chara: model simulations and experimental data. J. Membr. Biol., 191, 179-192, 2003.

145. M. Wada, F. Grolig, W. Haupt. Light-oriented chloioplast positioning. Contribution to progress in photobiology. J. Photochem. Photobiol., 17, 3-25, 1993.

146. D.A. Walker, M.N. Sivak, R.T. Prinsley, J.K. Cheesbrough. Simultaneous measurement of oscillations in oxygen evolution and chlorophyll a fluorescence in leaf pieces. Plant Physiol., 73, 542-549, 1983.

147. N.A. Walker, F.A. Smith. Circulating electric current between acid and alkaline zones associated with HCO^T assimilation in Chara. J. Exp. Bot., 28, 1190-1206, 1977.

148. N.A. Walker, F.A. Smith, I.R. Cathers. Bicarbonate assimilation by fresh-water charophytes and higher plants: I. Membrane transport of bicarbonate ions is not proven. J. Membr. Biol., 57, 51-58, 1980.

149. D.C. Wildon, J.F. Thain, P.E.H. Minchin, I.R. Gubb, A.J. Reilly, Y.D. Skipper, H.M. Doherty, P.J. O'Donnell, D.J. Bowles. Electrical signalling and systemic proteinase inhibitor induction in the wounded plant. Nature, 360, 62-65, 1992.

150. R.A. Wolosiuk, C.M. Hertig, A.N. Nishizawa, B.B. Buchanan. Enzyme regulation in C4 photosynthesis. Role of Ca2+ in thioredoxin-linked activation of sedoheptulose bisphosphatase from corn leaves. FEBS Lett., 140(1), 31-35, 1982.

151. X. Yao, M.A. Bisson. Passive proton conductance is the major reason for membrane depolarization and conductance increase in Chara buckellii in high-salt conditions. Plant Physiol., 103, 197-203, 1993.

152. E. Zeiger. Sensory transduction of blue light in guard cells. Trends Plant Sei., 5, 183-185, 2000.

153. S. Zimmermann, T. Ehrhardt, G. Plesch, B. Müller-Röber. Ion channels in plant signaling. Cell. Mol. Life Sei., 55, 183-203, 1999.1. Благодарности

Информация о работе

Крупенина, Наталия Анатольевна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.02

Диссертация

Пространственная организация фотосинтетической активности и транспорта протонов в возбудимой растительной клетке - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы