Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование электронного и протонного транспорта в фотосинтетических системах оксигенного типа с помощью спиновых меток

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование электронного и протонного транспорта в фотосинтетических системах оксигенного типа с помощью спиновых меток"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. Ломоносова

Физический факультет

На правах рукописи УДК 577.3

Птушенко Василий Витальевич

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЕКТРОННОГО И ПРОТОННОГО ТРАНСПОРТА В ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ ОКСИГЕННОГО ТИПА С ПОМОЩЬЮ СПИНОВЫХ МЕТОК

03.00.02 - биофизика 03.00.16 - экология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 2006 г.

Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор физико-математических наук,

профессор

Тихонов Александр Николаевич

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

профессор Рууге Энно Куставич

кандидат биологических наук, доцент Тимофеев Кирилл Николаевич

Ведущая организация: Институт Химической Физики РАН

им. Н.Н. Семенова

Защита диссертации состоится «27» апреля 2006 года в 16~0(? часов на заседании диссертационного совета К 501.001.08 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992, ГСП-2, г. Москва, Воробьевы горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, физический факультет, аудитория _.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан

2006 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета К 501.001.08. кандидат физико-математических наук

Г.Б. Хомутов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Открытие электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) Евгением Константиновичем Завойским в 1944 г. (Альтшулер и др., 1944; Завойский, 1944-1945; Zavoisky, 1945-1946), дало науке новый мощный метод исследования, который благодаря пионерским работам Б. Коммонера (Commoner et al., 1954) и JI.A. Блюменфельда (Блюменфельд, 1957; Блюменфельд и Калмансон, 1957) вошел в биологию и в последние полвека является одним из основных биофизических методов исследования. Появившийся в 1960-х гг. благодаря работам А.Б. Неймана, X. Мак-Коннела, A.JI. Бучаченко, А.Н. Кузнецова, Г.И. Лихтенштейна метод спиновых зондов (или спиновых меток), основанный на явлении ЭПР, сделал возможным исследование биологических систем на самых разных уровнях их структурной и функциональной организации.

Одной из наиболее актуальных задач современной биофизики является измерение рН среды в микрообъемах. В биоэнергетике точное измерение рН в микроскопических везикулах митохондрий или внутрихлоропластных образований— тилакоидов— связано с разрешением двух принципиальных вопросов: а) какой механизм сопряжения — локальный или нелокальный — обеспечивает синтез АТР в энергетических органеллах клетки, и б) какова относительная роль двух составляющих трансмембранного протонного потенциала в этом синтезе. Измерение рН с помощью рН-чувствительных спиновых меток уже более 20 лет используется в различных областях химии, биологии и медицины, однако в исследованиях процессов фотосинтеза рН-чувствительные спиновые метки до сих пор не получили должного применения. Измерение рН в микроскопических объемах тилакоидов, содержащих реакционноспособные компоненты электрон-транспортной цепи (ЭТИ), требует разработки специальных методов регистрации и обработки спектров ЭПР спиновых меток и подбора подходящих условий измерений (Trubitsin & Tikhonov, 2003; Tikhonov & Subczynski, 2005). В последние годы было синтезировано большое количество новых рН-чувствительных спиновых меток (Khramtsov et al., 2000; Kirilyuk et al., 2004, 2005; Voinov et al., 2005), обладающих широким спектром физико-химических свойств, что раскрывает широкие возможности для проведения .дада£нщ исследований. В связи с этим актуальной задачей для биофизики исследование свойств

С-Пете. *А

оэ

новых рН-чувствительных спиновых меток и возможностей их применения для измерения внутритилакоидного рН в изолированных хлоропластах растений.

Большинство исследований фотосинтеза осуществляется на изолированных фотосинтетических системах: на отдельных изолированных фотосинтетических комплексах либо на препаратах изолированных тилакоидов (или на хлоропластах класса Б). Однако для изучения регуляции световых стадий фотосинтеза и взаимодействие между разными биохимическими системами фотосинтезирующей клетки необходимо исследование интактных фотосинтетических систем. Одной из наиболее удобных интактных фотосинтетических систем оксигенного типа являются клетки цианобактерий.

Примером другой интактной фотосинтетической системы оксигенного типа являются хлоропласта растений in situ, в живом листе. При этом исследование процессов электронного фотосинтетического транспорта в листьях древесных растений, произрастающих в открытом грунте на территории г. Москвы важно не только с точки зрения биофизики фотосинтеза, но имеет также практическую ценность (для охраны окружающей среды).

Дели и задачи работы

Основной целью данной работы является изучение электронного и протонного транспорта в фотосинтетических системах оксигенного типа, в особенности— интактных, а также исследование возможностей применения ряда имидазолиновых и имидазолидиновых кислород- и рН-чувствительных спиновых меток для изучения световых стадий фотосинтеза.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1) изучить физико-химические и биологические свойства ряда новых имидазолиновых и имидазолидиновых спиновых меток, их взаимодействие с хлоропластами и цианобактериями, и разработать алгоритм измерения АрН и концентрации кислорода по фотоиндуцированным изменениям спектров ЭПР спиновых меток;

2) изучить (с использованием методов ингибиторного анализа, а также фотосинтетических и дыхательных мутантов цианобактерий Synechocystis sp. РСС 6803 и Synechococcus sp. РСС 7942), какие факторы контролируют электронный транспорт (ЭТ) в тилакоидных мембранах цианобактерий и какие фотосинтетические и дыхательные комплексы вносят основной вклад в

суммарный ЭТ на различных участках тилакоидных цепей транспорта электронов;

3) определить, какие показатели фотосинтеза наиболее чувствительны к загрязненности среды произрастания растений продуктами автомобильных выхлопов, изучить характер изменений этих параметров и выяснить, какие изменения в фотосинтетическом аппарате растений происходят под действием этого антропогенного фактора;

4) изучить механизмы влияния природного пигмента амарантина на процессы транспорта электронов в хлоропластах.

Научная новизна работы

Впервые получены сигналы ЭПР ряда имидазолиновых нитроксильных радикалов (ANT-1, ANT-3, ANT-4, ANT-5), локализованных во внутритилакоидном пространстве. Показано, что эти рН-чувствительные спиновые метки могут быть использованы для измерения ДрН в хлоропластах.

Показано, что скорость оттока электронов от ФС1 является существенным фактором регуляции электронного транспорта в клетках цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803, причем в анаэробных условиях отток электронов от ФС 1 является лимитирующим звеном в работе фотосинтетической цепи переноса электронов. Показана корреляция между фотоиндуцированными процессами окисления Р700 в ФС 1 и выделения кислорода в ФС 2. Установлено, что замедление скоростей дыхания (в темноте) и переноса электронов на участке между двумя фотосистемами (в условиях освещения) в клетках цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 обусловлено, в основном, концентрационной составляющей (ДрН) протонного потенциала.

Определены «кинетические» параметры фотосинтетических процессов в листьях растений, измеряемые методом ЭПР и медленной индукции флуоресценции, чувствительные к условиям произрастания растений, включая неблагоприятные антропогенные факторы внешней среды.

Предложен механизм возможного участия беталаинового пигмента амарантина в реакциях транспорта электронов in vitro.

Практическая ценность

Полученные в диссертации данные о физико-химических и биологических свойствах исследованных имидазолиновых и имидазолидиновых спиновых меток могут быть использованы в разнообразных

физиологических, биофизических, физико-химических задачах с применением этих меток. Предложенная в диссертации полуэмпирическая модель, описывающая фотоиндуцированные изменения величины сигнала ЭПР метки, может быть в дальнейшем использована для экспресс-оценки свойств новых спиновых меток (эффективность взаимодействия с цепью переноса электронов хлоропластов, стабильность радикальной формы, эффективность парамагнитного взаимодействия молекул метки с кислородом, как с "релаксационным" и "уширяющим" агентом, и т.п.).

Полученные в диссертации данные об изменении биофизических показателей листьев растений, произрастающих вблизи транспортных магистралей, могут быть использованы при организации защитных зеленых насаждений (лесополос), для оценки их эффективности.

Апробация работы и публикации

Основные результаты диссертации были представлены на Ш Всероссийской научной конференции "Физические проблемы экологии (Физическая экология)" (Москва, 1997), на Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2001", секция "Физика" (Москва, 2001), на IV Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2001), на Международной конференции "Актуальные вопросы экологической физиологии растений в XXI веке" (Сыктывкар, 2001), на XXXV Ежегодном международном съезде "Annual International Meeting: Advanced Techniques and Applications of EPR" (Aberdeen, Scotland, UK, 2002), на Молодежной школе-конференции "Современные проблемы биохимической физики" (Москва, 2002), на V Международном съезде Европейской федерации ЭПР "Meeting of the European Federation of EPR Groups" (Lisbon, Portugal, 2003), на XIII Европейской биоэнергетической конференции ЕВЕС (Pisa, Italy, 2004).

По материалам диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 290 стр., содержит 97 рис. и 3 табл. (в т.ч. 20 стр., Ирис. в приложениях), список литературы содержит 146 библиографических ссылок. Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов, списка литературы и трех приложений.

б

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цели и основные задачи работы.

Глава I диссертации представляет собой обзор литературы, который состоит из двух частей. В первой части приведены современные данные о световых стадиях фотосинтеза и структурно-функциональной организации фотосинтетического аппарата цианобактерий и хлоропластов высших растений. Проведено сравнение электрон-транспортных цепей (ЭТЦ) хлоропластов и цианобактерий. Рассмотрены данные о взаимодействии фотосинтетической и дыхательной ЭТЦ в клетках цианобактерий и высших растений, о компонентном составе хлоропластной и цианобактериальных ЭТЦ, о соотношении активностей и локализации отдельных компонент, о пространственной организации фотосинтетического и дыхательного аппаратов. Особое внимание уделено анализу возможных путей электрона в ходе энергодонорных элетрон-транспортных процессов (нециклический, псевдоциклический, "короткий" и "длинный" циклические пути) и механизмов регуляции электронного и протонного транспорта в цианобактериях и хлоропластах.

Вторая часть Главы I посвящена применениям кислород- и рН-чувствительных спиновых меток в исследованиях фотосинтеза. Проведено сравнение различных методов измерения рН внутри тилакоидов, основанных на применении спиновых меток.

Глава П посвящена описанию материалов и методов, использованных в диссертационной работе. Объектами исследования служили следующие фотосинтетические системы:

• изолированные хлоропласта бобов (Vicia faba L., сорт «Русские черные»), амаранта (Amaranthus tricolor h., сорт «Валентина») и шпината (Spinacia oleráceo L., сорт «Стоик»);

• цианобактерии Synechocystis sp., strain РСС 6803, дикий тип и мутанты PSII-less (без ФС 2), OX-less (без терминальных окисдаз), SDH-less (без SDH), NDH-ABC-less (без NDH-1) и NDb-less (без NDH-2); Synechococcus sp., strain РСС 7942, дикий тип и мутант FTN2 (обладающий длинными клетками);

• листья бобов (Vicia faba L., сорт «Русские черные»), пшеницы (Пшеница мягкая, Triticum aestivumL.) и древесных растений нескольких видов (Клен платановидный, Acer platanoides L., Клен американский, A. negundo L., Рябина обыкновенная, Sorbus aucuparia L., Липа мелколистная, Tilia cordata L.).

7

ANT-1 (KG-2)1

О

N

I

О

ANT-5 (KG-5)1

ANT-2 (KG-1)1

ANT-8

(KG-3)1

N

I

О

ANT-3 (HMI)2

H,N,

i

о

ATI (SH1)5

Y

N

I

О

ANT-4 (KG-4)1

NTI

О

ТА

4 3

о

4_N 3

•Q-

СхТРО

Рис. 1. Кислород- и рН-чувствительные нитроксильные радикалы. Обозначения введены в (Птушенко, 2002). В скобках приведены синонимы, встречающиеся в литературе: — (Tikhonov е.а., 2003), 2 — (Foster е.а., 2003), 3 — (Khramtsov & Volodarsky, 1998).

Кинетику фотосинтетического транспорта электронов во всех исследуемых объектах изучали по фотоиндуцируемым изменениям величины сигнала ЭПРI от окисленных реакционных центров ФС 1 (Ртоо*)- Для анализа работы ФС 2 и комплексов дыхательной ЭТЦ цианобактерий измеряли концентрацию кислорода в среде полярографическим методом и методом ЭПР с помощью кислород-чувствительной спиновой метки СхТРО (см. рис. 1). Для измерения внутритилакоидного рН в хлоропластах использовали рН-

чувствительные спиновые метки, приведенные на рис. 1. Спектры внутритилакоидной фракции молекул метки вычленяли с помощью непроникающего через мембрану парамагнитного уширителя оксалата хрома (СгОх). Измерение скорости фосфорилирования в изолированных хлоропластах проводили рН-метрическим методом (по защелачиванию среды при синтезе АТР). Целостность тилакоидных мембран хлоропластов проверяли по эффекту фотоиндуцированого уширения спиновой метки ТА, поглощаемой тилакоидами в ответ на закисление внутритилакоидного пространства. Целостность хлоропластной мембраны проверяли по фотоиндуцированному восстановлению феррицианида хлоропластами, которая также измерялась рН-метрически (по защелачиванию среды при восстановлении феррицианида).

Изложение результатов диссертационной работы составляет содержание последних трех глав (главы Ш-V) и построено следующим образом. Глава П1 носит "инструментальный" характер: она содержит подробное описание свойств кислород- и рН-чувствительных спиновых меток, анализ возможности их применения в исследованиях фотосинтеза и некоторые полученные с их помощью результаты, относящиеся к наиболее простым модельным фотосинтетическим системам — изолированным хлоропластам класса Б. Глава IV (и дополняющее ее Приложение 3) описывает исследования интактных фотосинтетических систем, в которых находят свое применение некоторые из исследованных в предыдущей главе спиновых меток. Каждому из исследуемых интактных фотосинтетических объектов— цианнобактериям и листьям древесных растений — посвящен отдельный раздел главы. В первом разделе, посвященном цианобактериям, исследуются изменения их биофизических характеристик под действием контролируемого влияния на фотосинтетический аппарат (с использованием ряда мутантов и методов ингибиторного анализа). На полученные при этом результаты отчасти опирается содержание второго раздела, в котором описывается вторая интактная система— листья древесных растений, произрастающих в разных условиях городской среды обитания. Главная задача этого раздела— анализ состояния фотосинтетического аппарата этих растений на основании наблюдаемых изменений (под действием антропогенных влияний) их биофизических характеристик. Последняя Глава V, хотя и посвящена исследованиям, выполненым на изолированной системе (на изолированных хлоропластах класса Б), однако предметом исследований является взаимодействие фотосинтетического аппарата с природным пигментом

9

(амарантином), который, возможно, играет роль в регуляции фотосинтетических процессов in vivo в растениях порядка Centrospermae (Кононков, Гинс, 1997). Опишем теперь подробнее содержание каждой из глав III—V.

Глава III посвящена описанию результатов исследований свойств кислород- и рН-чувствительных спиновых меток и их взаимодействия с хлоропластами; глава содержит 7 разделов.

Раздел Ш.1 содержит описание физико-химических свойств рН-чувствительных спиновых меток, приведенных на рис.1. Приведены спектры меток в буферных водных растворах, зависимости параметров спектров ЭПР от рН и от концентраций меток. Исследовано влияние кислорода и некоторых солей на спектры ЭПР нитроксильных радикалов.

В разделе 1П.2 описано взаимодействие рН-чувствительных спиновых меток с хлоропластами: окислительно-восстановительные превращения спиновых меток при взаимодействии с хлоропластной ЭТЦ, фотоиндуцированное поглощение молекул метки тилакоидами, фотоиндуцированное связывание и диссоциация молекул метки с тилакоидной мембраной. Показана связь между фотоиндуцированным поглощением, интенсивностью редокс-превращений и величиной рКа метки. Показано, что метки ATI, NTT и ANT-3 не оказывают заметного разобщающего действия на тилакоидные мембраны в концентрациях, используемых для измерений внутритилакоидного рН (< 3 мМ).

Основные результаты, касающиеся кислород-зависимых изменений спектров ЭПР рН-чувствительных спиновых меток в хлоропластах, вынесены в отдельный раздел Ш.З. Основные исследования выполнены на метке ANT-3, для которой исследовано влияние разнообразных факторов на кинетику фотоиндуцированных изменений величины ее сигнала ЭПР в хлоропластах: влияние условий газообмена и активных форм кислорода, режима функционирования ЭТЦ, концентрации метки и содержания активно функционирующих ЭТЦ в суспензии. В результате было показано, что в условиях наших экспериментов главную роль в изменении спектра метки играют следующие факторы:

1) редокс-превращения молекул спиновой метки при их взаимодействии с ЭТЦ хлоропластов, приводящие к потере молекулами метки парамагнитных свойств;

2) влияние кислорода как парамагнитного уширителя спектра ЭПР при низких значениях мощности СВЧ (РСвч < Ю мВт);

10

3) влияние кислорода как парамагнитного «релаксатора» при высоких значениях мощности СВЧ (Рсвч> Ю мВт);

4) концентрационно-зависимые изменения спектра метки, обусловленные фотоиндуцированным перераспределением молекул метки между компартментами хлоропластов (поглощение молекул метки тилакоидами).

Л'г (У-е.)

100

50

100

50

АИТ-З

I . I

модель

Рис. 2. Кинетика фото-индуцированных изменений амплитуды (А'1) низкополевой компоненты спектра ЭПР спиновой метки АЫТ-3 в хлоро-пластах: 1 — контроль, Рсвч ' 1 мВт; 2 — контроль, Рсвч= 100 мВт; 3— в присутствии ИН4С1, Рсвч = 1 мВт; 4— в присутствии ЫН4С1, Рсвч ~ 100 мВт; 5 — в присутствии каталазы, Рсвч ~ 1 мВт. Концентрация метки — 1 мМ, концентрация хлоропластов соответствует 1 мкМ Р700. Вертикальными стрелками показаны моменты включения и выключения белого света.

60

240

300

120 180 время, с

Вклад каждого их этих факторов в фотоиндуцированные изменения спектра спиновой метки различен для разных меток и определяется интенсивностью ее взаимодействия с ЭТЦ хлоропластов, степенью уширяющего и "релаксаторного" влияния кислорода при разных его концентрациях, а также трансмембранной разностью рН, скоростью переноса электронов по ЭТЦ и активностью хлоропластной каталазы. Для количественного определения перечисленных характеристик метки и ее взаимодействия с хлоропластами на основании наблюдаемых в эксперименте фотоиндуцированных изменений величины сигнала ЭПР метки, мы

11

разработали простую математическую полуэмпирическую модель, учитывающую влияние всех перечисленных выше факторов на величину сигнала ЭПР спиновой метки. Описанию этой модели и полученных с ее помощью результатов посвящен раздел Ш.4. Показано, что в хлоропластах класса Б, выделяемых по используемой нами методике, при освещении происходит уменьшение концентрации растворенного молекулярного кислорода (за счет неполного разложения перекиси водорода, образующейся в ходе псевдоциклического электронного транспорта) за характерное время ~ 50100 с при концентрации хлоропластов, соответствующей ~ 1 мкМ Р700. В темноте наблюдается "регенерация" кислорода (по-видимому, за счет действия хлоропластной катал азы) с характерным временем -50-100 с. Наилучшее соответствие модельных кривых экспериментальным достигается при величине АрН ~ 3, причем характерное время образования АрН на свету составляет 4-7 с, а время рассеяния АрН в темноте— ~10с. Добавление в суспензию разобщителя (NH4CI) ускоряет восстановление метки в 3-5 раз; примерно во столько же ускоряется и фотоиндуцированное поглощение кислорода. Типичные экспериментальные и модельные кинетические кривые для метки ANT-3 приведены на рис. 2.

В разделе Ш.5 суммируются данные, полученные по физико-химическим свойствам исследованных нами спиновых меток (ANT-1, ANT-2, ANT-3, ANT-4, ANT-5, ANT-8, ATI, NTI) и их взаимодействию с хлоропластами, описанные в предыдущих разделах данной главы, и делаются выводы о возможности их применения для измерения рН внутри тилакоидов (pHin). Так, рН-чувствительные спиновые метки ANT-1, ANT-2, ANT-3, АН, обладающие значениями рК ниже 6,5-7,0 , являются наиболее перспективными для измерений pH¡„ по эффекту рН-зависимого изменения формы спектра метки при ее протонировании/депротонировании. Спектры ЭПР этих меток наименее подвержены искажениям за счет быстрой потери молекулами метки ее парамагнитных свойств и/или эффекта концентрационного уширения при перераспределении метки внутри хлоропласта. Метки ANT-4, ANT-5, ANT-8, NTI, обладающие значениями рК>7, имеют спектры ЭПР, которые могут заметно искажаться в результате концентрационного уширения и потери парамагнетизма. Тем не менее, для этих меток также наблюдаются фотоиндуцированные изменения их спектров в хлоропластах. Поглощение этих меток хлоропластами, когда их концентрация внутри тилакоидов возрастает не более, чем 10 раз, еще не сопровождается заметным искажением формы

12

спектра из-за эффекта концентрационного уширения. Таким образом, используя эти метки, можно измерять значения внутритилакоидного рН по рН-зависимым изменениям спектров ЭПР.

Применению изученных нами спиновых меток к измерениям рН внутри тилакоидов посвящен следующий раздел П1.6. С использованием спиновых меток АИТ-З, АКГ-4 и АКГ-5, в присутствии парамагнитного уширителя СгОх в среде в концентрациях 8-16 мМ, показано, что при освещении изолированных хлоропластов класса Б происходит закисление внутритилакоидного пространства; образующаяся при этом величина ДрН> 2-2,5. Спектры ЭПР внутритилакоидной фракции метки приведены на рис. 3.

Я (Э) Я (Э) Я (Э)

Рис.3. Спектры ЭПР спиновых меток ANT-3, ANT-4 и ANT-5: вверху — внутренний сигнал в хлоропластах, в темноте и при освещении ( >15 с), в присутствии каталазы и метилвиологена; внизу — в буферных растворах при разных значениях рН. Концентрации меток— 1 мМ, концентрация хлоропластов соответствует ~5 мкМ Р70п . Мощность СВЧ-излучения — 10 мВт.

Последний раздел Ш.7 данной главы посвящен кислород-чувствительной спиновой метке СхТРО. Спектр ЭПР данной метки обладает суперсверхтонкой структурой (суперСТС), хорошо разрешенной в анаэробных условиях (см. рис. 4). Изучена зависимость формы спектра от концентрации кислорода и концентрации самой метки, выбраны параметры спектра, чувствительные к концентрации кислорода и построены калибровочные зависимости. Показано, что в изолированных хлоропластах > 90% кислорода, растворенного в среде, поглощается за время т= 15 с (при 1мкМР700). В темноте происходит "регенерация" молекулярного кислорода за время т < 70150 с, что согласуется с данными, полученными при построении математической модели кинетики изменения величины сигнала ЭПР спиновых меток, описанной в разд. Ш.4.

Рис. 4. Спектры ЭПР спиновой метки СхТРО: а — в буфере, в атмосфере аргона и в равновесии с воздухом; б— в суспензии цианобактерий БупесИосух^ йр. 6803, помещенной в газонепроницаемую кварцевую кювету, в темноте и на свету. Концентрация метки 0,1 мМ, амплитуда ВЧ-модуляции магнитного поля Нт = 0,025 Гс.

3234 3235 3236 3237 Я (Э)

Глава IV посвящена исследованиям фотосинтетического электронного транспорта в интактных фотосинтетических системах: в листьях древесных растений и в цианобактериях.

В разделе 1У.1 описаны результаты исследований процессов фотосинтетического и дыхательного электронного и протонного транспорта, протекающих в тилакоидных мембранах цианобактерий. Наше внимание было сосредоточено, главным образом, на решении следующих вопросов:

1) какие факторы, в первую очередь, контролируют электронный транспорт (ЭТ) в тилакоидных мембранах цианобактерий?

2) Достигается ли при нормальной работе электрон-транспортных цепей (ЭТЦ) тилакоидной мембраны цианобактерий состояние дыхательного и/или фотосинтетического контроля? Если да, то какова величина коэффициента дыхательного (фотосинтетического) контроля?

3) Какой вклад в вносят в трансмембранный протонный потенциал электрическая и концентрационная составляющие?

4) Какие комплексы вносят основной вклад в суммарный ЭТ на различных участках тилакоидных ЭТЦ (дегидрогеназы, ФС 2, оксидазы, ФС 1)?

Рис. 5. Фотоиндуцированные изменения величины сигнала ЭПРI (Р) и параметра а (см. определение на рис. 4) спектра ЭПР спиновой метки СхТРО, инкубируемой в суспензии цианобактерий Synechocystis sp. 6803 (дикий тип): вверху— клетки, подвергавшиеся заморозке, с добавлением глицерина; внизу — клетки, не подвергавшиеся заморозке. Темновая адаптация— 10 мин. Момент включения света показан вертикальной стрелкой.

Основные исследования были выполнены на клетках цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 дикого типа, а также мутантных штаммов SDH", NDH-ABCT, NDb", OX-, PS2", не имеющих одного или нескольких компонентов дыхательной или фотосинтетической ЭТЦ (сукцинатдегидрогеназы, NADH-

дегидрогеназ 1 или 2, терминальных оксидаз или фотосистемы 2, соответственно). Было показано, что:

1) фотосинтетический электронный транспорт контролируется протонным потенциалом и скоростью оттока электронов на акцепторной стороне ФС 1; роль последнего фактора становится решающей в анаэробных условиях. При этом наблюдается корреляция между фотоиндуцированными процессами окисления Р700 в ФС 1 и выделения кислорода в ФС 2 (рис. 5).

2) Коэффициенты дыхательного и фотосинтетического контроля (замедление электронного транспорта из-за образования трансмембранного протонного потенциала, измеренное в темноте и на свету, соответственно) составляют ~ 2,0 и ~ 2,8, соответственно (раздел IV.! .5) (см. рис. 6)

Рис. 6. Изменение параметров а и АН/ (определения а и АН) см. на рис. 4) спектра ЭПР спиновой метки СхТРО, инкубируемой в суспензии цианобактерий БупесИосузНз зр. 6803, дикого типа (слева) и ОХ~ мутанта (справа), не подвергавшихся заморозке, в кварцевой кювете. Освещение белым светом — в течение б мин (моменты включения и выключения света показаны вертикальными стрелками). Концентрация СССР — 80 мкМ.

3) Основной вклад в протонный потенциал, влияющий на скорость дыхания, вносит его концентрационная составляющая АрН (раздел IV.1.5).

4) Основной вклад (до 80%) в приток электронов в цепь переноса между двумя фотосистемами со стороны дыхательной цепи в темноте вносит SDH. В условиях освещения относительный вклад циклического транспорта электронов в суммарный поток электронов к Р700+ составляет ~30-60% от полного потока электронов, включающего поток электронов от ФС 2. (раздел IV.1.3).

5) Основной вклад в электронный транспорт на участке ЭТЦ после PQ вносит ФС 1, вклад терминальных оксидаз тилакоидной мембраны в условиях освещения практически незаметен (> 10%) (раздел IV.1.4).

6) Поглощение кислорода клеткой подавляется цианидом (20 мМ) на ~85%. Неспецифическое поглощение кислорода, сохраняющееся в отсутствие терминальных оксидаз, составляет менее 5% (раздел IV.1.2).

Раздел IV.2 посвящен исследованиям фотосинтетических характеристик древесных растений, произрастающих в естественных условиях в черте города. Поскольку, как известно, одной из главных экологических проблем города Москвы является обилие автотранспорта, нами для исследований были выбраны условия, в которых именно этот антропогенный фактор проявляется наиболее заметно: был исследован участок парка МГУ им. М.В.Ломоносова, примыкающий к двум оживленным транспортным магистралям. В нашем исследовании мы попытались ответить на три вопроса:

1) какие показатели фотосинтеза наиболее чувствительны к загрязненности среды произрастания растений продуктами автомобильных выхлопов;

2) какие изменения в фотосинтетическом аппарате растений происходят под действием этого антропогенного фактора;

3) на каких характерных расстояниях от источника загрязнения (дороги) проявляется его влияние в естественных (городских) условиях. Очевидно, последний вопрос имеет также большое практическое значение.

Работа включала измерения фотосинтетических характеристик листьев с применением трех разных биофизических методов: электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), медленной индукции флуоресценции (МИФ; совместно с В.А. Караваевым) и термолюминесценции (TJI; совместно с М.К. Солнцевым); регистрировали также спектры флуоресценции и содержание разных форм хлорофилла в исследуемых образцах. Измерения проводились на растениях нескольких видов (клен платановидный, Acer platanoides L., клен

17

американский, A. negundo L., рябина обыкновенная, Sorbus aucuparia L., липа мелколистная, Tilia cordata L.); бо'лыпая часть результатов была получена на листьях Рябины обыкновенной. В результате этой работы было показано, что:

1) "кинетические" характеристики фотосинтетических процессов в листьях растений (времена фотоиндуцированного окисления Р700, тушения МИФ и т.п.) более чувствительны к условиям произрастания растений, чем "стационарные" показатели.

2) Для древесных растений, произрастающих в составе относительно густых посадок ("лес") вдоль автомобильной дороги, основные показатели фотосинтетической активности перестают заметно меняться при удалении от нее, начиная с 50-70 м (см. рис. 7). Это позволяет предположить, что характерная "глубина проникновения" автомобильных выхлопов в лесопосадки составляет около 50-70 м, и растения, произрастающие на бо'льших расстояниях от дороги, относительно слабо испытывают ее антропогенное воздействие.

0.0 0.5 1.0 1.5 время, с

20 40 60 80 растояние от дороги, м

Рис. 7. Зависимость индукционного времени тш фотоиндуцированного окисления Р7оо листьев рябины от расстояния места произрастания растения от дороги.

Исследования, описанные в Главе V, выполнены на изолированной системе (хлоропластах класса Б). Предметом этих исследований является взаимодействие фотосинтетического аппарата с природным пигментом амарантином, который, возможно, играет роль в регуляции фотосинтетических процессов in vivo в растениях порядка Centrospermae, и, в частности, рода Amaranthus. Методом ЭПР были исследованы фотоиндуцированные окислительно-восстановительные превращения Р700 в хлоропластах растений нескольких видов (бобов (Vicia faba L.), амаранта (Amaranthus tricolor L.) и шпината (Spinacia oleráceo L.)) и участие в них амарантина, а также реакций

18

протонного транспорта в присутствие амарантина. В итоге было показано, что амарантин может взаимодействовать с ЭТЦ хлоропластов, восстанавливаясь за счет взаимодействия с ФС 2. Кроме того, в хлоропластах амаранта амарантин приводит к частичному восстановлению реакционных центров ФС 1. При этом амарантин практически не оказывает влияние на светозависимое образование трансмембранной разности рН.

Диссертация также содержит три приложения.

Приложение 1 содержит расчет распределения молекул спиновой метки в хлоропластах, возникающее при закислении внутритилакоидного пространства за счет работы фотосинтетической ЭТЦ. Результаты этого расчета используются для построения полуэмпирической модели фотоиндуцируемых изменений величины спектра ЭПР спиновой метки в хлоропластах, описанной в разделе Ш.4.

Приложение 2 представляет собой дополнение к разделу 1П.З и содержит не включенные в него экспериментальные данные по фотоиндуцированным изменениям величины сигнала ЭПР всех исследованных в данной работе имидазолиновых и имидазолидиновых спиновых меток в хлоропластах.

Приложение 3 содержит экспериментальные данные, полученные при исследовании цианобактерий, не связанные непосредственно с вопросами, поставленными нами в разделе IV. 1. В данном приложении описаны исследования фотосинтетического электронного и протонного транспорта в клетках "длинноклеточного" мутанта Р1п2 цианобактерии БупесИососсш ер. РСС 7942. Приведены результаты измерений фотосинтетического трансмембранного градиента рН и кинетики электронного транспорта в клетках цианобактерий. По полученным результатам высказано предположение, что отток электронов от ФС I у Е1п2 не контролируется непосредственно кислородом (как это имеет место у ЗупескосуйШ 6803), а каким-либо другим акцептором (или регулятором), истощающимся в анаэробных условиях.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что в тилакоидных мембранах интактных цианобактерий ЭупесНосузШ ер. РСС 6803, выращенных в автотрофных условиях, дыхание и фотосинтетический транспорт электронов контролируется протонным потенциалом. Замедление скоростей дыхания (в темноте) и переноса электронов на участке между двумя фотосистемами (в условиях освещения) обусловлено, в основном, концентрационной составляющей (АрН)

19

протонного потенциала. Коэффициенты дыхательного (fcR) и фотосинтетического (к?) контроля равны kR = 2,0 и кР = 2,8.

2. Показано, что скорость оттока электронов от ФС1 является существенным фактором регуляции электронного транспорта в клетках цианобактерий. В анаэробных условиях отток электронов от ФС1 является лимитирующим звеном в работе фотосинтетической цепи переноса электронов.

3. Измерены вклады дыхательной и фотосинтетической цепей переноса электронов в процессы электронного транспорта в тилакоидной мембране Synechocystis sp. РСС 6803.

• Поток электронов на кислород через терминальные оксидазы (темновое дыхание) не превосходит 10% от общей потока электронов к Р7оо+ в условиях освещения. Неспецифическое (цианид-резистентное) поглощение кислорода составляет не более 15% от общей скорости дыхания в темноте. Сукцинат-дегидрогеназа является основным донором электронов (до 80%), поступающих в пластохиноновый пул со стороны дыхательной цепи.

• В условиях освещения непрерывным светом клеток дикого вида вклад циклического транспорта электронов в поток электронов к Р7<ю+ достигает ~30-60% от полного потока электронов, включающего приток электронов к

Р7оо+отФС2.

4. Установлена взаимосвязь между физико-химическими свойствами ряда рН-чувствительных нитроксильных радикалов (спиновых меток) имидазолинового и имидазолидинового ряда и характером их взаимодействия с хлоропластами. Показано, что спиновые метки ANT-1, ANT-3, ANT-4, ANT-5 и ATI могут быть использованы в качестве зондов для количественных измерений внутритилакоидного рН в хлоропластах.

5. Определены «кинетические» параметры фотосинтетических процессов в листьях растений, измеряемые методом ЭПР и медленной индукции флуоресценции, чувствительные к условиям произрастания растений, включая неблагоприятные антропогенные факторы внешней среды.

6. Показано, что беталаиновый пигмент амарантин взаимодействует с хлоропластами, восстанавливаясь за счет взаимодействия с ФС 2. В хлоропластах амаранта амарантин является донором электрона для ФС 1. При этом амарантин практически не влияет на светозависимое образование трансмембранной разности рН.

Благодарности

В заключение я хотел бы выразить глубокую благодарность своему научному руководителю, Александру Николаевичу Тихонову, за удивительную деликатность, терпение, постоянную заботу и внимание, за радость совместной работы с ним все эти одиннадцать лет. Я признателен всем, с кем мне довелось сотрудничать, всем, кто в той или иной форме оказывал мне помощь и поддержку, за обсуждения, советы, идеи, разнообразные хлопоты и просто за человеческое участие. Я благодарен за все своим верным друзьям и маме, без которых и этот труд сегодня был бы немыслим.

Основные результаты диссертации представлены в следующих публикациях.

1. Караваев В.А., Солнцев М.К., Полякова И.Б., Птушенко В.В., Трубицин Б.В., ЮринаТ.П., Юрина Е.В., Тихонов А.Н. (2001) «Изменения медленной индукции флуоресценции листьев клена вблизи транспортных магистралей». //Биофизика, т. 46, стр.381-382.

2. Птушенко В.В., Гинс М.С., Гинс В.К., Тихонов А.Н. (2002) «Взаимодействие амарантина с электронтранспортной цепью хлоропластов». // Физиология растений, т.49, стр.656-662.

3. Trubitsin B.V., Ptushenko V.V., Koksharova O.A., Mamedov M.D., Vitukhnovskaya L.A., Grigor'ev I.A., Semenov A.Yu., Tikhonov A.N. (2005) «EPR study of electron transport in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Oxygen-dependent interrelations between photosynthetic and respiratory electron transport chains». // Biochim. Biophys. Acta, v. 1708, pp.238-249.

4. Солнцев M.K., Караваев B.A., Кузнецов A.M., Птушенко В.В., Трубицин Б.В., Францев В.В., Тихонов А.Н. (2001) «Изменения биофизических показателей листьев в зависимости от удаленности растений от транспортных магистралей». // Тезисы докладов "3-й Всероссийской научной конференции "Физические проблемы экологии (Физическая экология)", Москва, 22-24 мая 2001 г., с.180.

5. Птушенко В.В. (2001) «Взаимодействие амарантина с электронтранспортной цепью хлоропластов». // Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2001". Секция "Физика". Сборник тезисов. Москва, физический ф-т МГУ.

6. Птушенко В.В., Гинс М.С., Тихонов А.Н. (2001) «Участие амарантина в окислительно-восстановительных реакциях в изолированных хлоропластах». // Труды IV Международного симпозиума "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования", Из-во РУДН, Москва-Пущино, 20-24 июня 2001 г., стр.96-98.

7. Solntsev М.К., Karavaev V.A., Kuznetsov A.M., Ptushenko V.V., Trubitsin B.V., Frantsev V.V., Tikhonov A.N. (2001) «Biophysical characteristics of tree leaves near the urban highways». // Abstracts, International conference "Ecological physiology of plants: problems and possible solutions in the XXI century". October 1-6, 2001, pp.113-114. (Солнцев M.K., Караваев В.A., Кузнецов A.M., Птушенко В.В., Трубицин Б.В., Францев В.В., Тихонов А.Н. «Биофизические показатели листьев древесных пород вблизи транспортных магистралей». - Материалы Международной конференции "Актуальные вопросы экологической физиологии растений в XXI веке" (Сыктывкар) - 1-6 октября 2001 г., стр. 113-114.)

8. Tikhonov A.N., Trubitsin B.V., Ptushenko V.V., Grigoriev I.A. (2002) «Proton transport in chloroplasts as studied with pH-sensitive spin labels». // Abstracts of 35th Annual International Meeting: Advanced Techniques and Applications of EPR, Aberdeen, Scotland, UK, p.Ll 1.

9. Птушенко В.В. (2002) «Применение рН-чувствительных спиновых меток для исследования протонного транспорта в хлоропластах». // Материалы молодежной школы-конференции "Современные проблемы биохимической физики", Москва, 2-9 декабря 2002 г., стр. 24.

10. Tikhonov A.N., Agafonov R.V., Grigor'ev I.A., Ikryannikova L.N., Kirilyuk I.A., Ptushenko V.V., Trubitsin B.V. (2003) «Imidazoline- and Imidazilidine Nitroxide Radicas as Probes for the Study of Bioenergetic Processes in Chloroplasts» // Abstracts of 5A Meeting of the European Federation of EPR Groups, Lisbon, Portugal, p.028.

11. Tikhonov A.N., Trubitsin B.V., Agafonov R.V., Grigor'ev I.A., Kirilyuk I.A., Koksharova O.A., Ptushenko V.V., Mamedov M.D. (2004) «EPR study of Bioenergetic Processes in Oxygenic Photosynthetic Systems». // Abstracts of 13th European Bioenergetic Conference (EBEC), Pisa (Italy), v.13, p. 262.

Подписано к печати ¿Ь ОЪ Об Тираж 12О Заказ Ъд

Отпечатано в отделе оперативной печати физического факультета МГУ

eL£2éAL 6 A -Sé

■6216

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Птушенко, Василий Витальевич

Список сокращений.

Введение.

Глава I. Обзор литературы.

Глава II. Материалы и методы.

Глава III. Свойства кислород- и рН-чувствительных спиновых меток и их взаимодействие с хлоропластами.

Глава IV. Исследование интактных фотосинтетических систем.

Глава V. Исследование влияния беталаинового пигмента амарантина на ход светозависимых реакций фотосинтеза в хлоропластах.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование электронного и протонного транспорта в фотосинтетических системах оксигенного типа с помощью спиновых меток"

Глава I. Обзор литературы.13

1.1. Структурно-функциональная организация фотосинтетического аппарата цианобактерий и высших растений.13

1.1.1. Методы изучения фотосинтетической цепи электронного транспорта. .15

1.1.1.1. Фотосистема 2. Методы термолюминесценции и медленной индукции флуоресценции.16

1.1.1.2. Перенос электронов между фотосистемами. Трансмембранный перенос протонов.18

1.1.1.3. Фотосистема 1. Сигнал ЭПРI и метод электронного парамагнитного резонанса.19

1.1.2. Дыхательная цепь электронного транспорта.19

1.1.3. Пространственная организация (локализация в клетке) фотосинтетического и дыхательного аппаратов. Свойства отдельных компонентов ЭТЦ.21

1.1.3.1. Строение цианобактериальной клетки и внутриклеточная локализация молек. дыхательных и фотосинтетических комплексов.21

1.1.3.2. Соотношение активностей (количества) разных компонентов ЭТЦ в цианобактериальной клетке.23

1.1.3.3. Строение хлоропласта.25

1.1.3.4. Роль и свойства отдельных комплексов.27

1.1.3.5. Гипотезы о причинах неравномерного пространственного распределения фотосистем.29

1.1.4. Альтернативные режимы функционирования электрон-транспортной цепи.30

1.1.4.1. Циклический электронный транспорт.30

1.1.4.2. Псевдоциклический ЭТ.33

1.1.4.3. Физиологическая роль циклического и псевдоциклического ЭТ.34

1.1.4.4. Циклический транспорт с участием NDH-1.37

1.1.4.5. Транспорт электронов в тилакоидной мембране хлоропластов с участием "нестандартных" конечных доноров и/или акцепторов электрона.38

1.1.4.6. "Гибридные" пути электронного транспорта в тилакоидной мембране цианобактерий.39

1.1.5. Трансмембранная разность рН и фотофосфорилирование в хлоропластах.40

1.1.5.1. Стехиометрия электронного и протонного транспорта.41

1.1.5.2. Стехиометрия синтеза АТР и переноса протонов через АТР-синтазу.41

1.1.5.3. «Локальный» и «делокализованный» механизмы энергетического сопряжения.43

1.1.6. Особенности регуляции электронного и протонного транспорта в цианобактериях и хлоропластах.45

1.1.6.1. Явление фотосинтетического контроля.45

1.1.6.2. Регуляция активности фотосинтетических ферментов.48

1.1.6.3. Редокс-регуляция фотосинтетических ферментов.49

1.1.6.4. Регуляция, связанная с взаимным влиянием фотосинтетической и дыхательной цепей в цианобактериях.50

1.1.6.5. Регуляция, связанная с взаимным влиянием фотосинтетической и дыхательной цепей в растительной клетке.55

1.1.6.6. Терморегуляция фотосинтеза.58

1.1.6.7. Роль фитохрома в регуляция фотосинтеза.60

1.2. Применение спиновых меток в исследованиях фотосинтеза.69

1.2.1. Измерение трансмембранного протонного потенциала в хлоропластах. .69

1.2.1.1. Измерение рН, основанное на перераспределении молекул зонда между объемом тилакоидов и внешней средой.69

1.2.1.2. Измерение рН, основанное на изменении спектральных свойств рН-чувствительных зондов.70

1.2.1.3. Недостатки применения индикаторов для измерения рН.71

1.2.1.4. Имидазолиновые и имидазолидиновые рН-чувствительные радикалы.73

I.2.2. Оксиметрия.74

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Птушенко, Василий Витальевич

Выводы

1. Показано, что в тнлакоидных мембранах интактных цианобактерий Synechocystis sp. РСС 6803, выращенных в автотрофных условиях, дыхание и фотосинтетический транспорт электронов контролируется протонным потенциалом. Замедление скоростей дыхания (в темноте) и переноса электронов на участке между двумя фотосистемами (в условиях освещения) обусловлено, в основном, концентрационной составляющей (АрН) протонного потенциала. Коэффициенты дыхательного и фотосинтетического (кР) контроля равны kR = 2,0 и кР = 2,8.

2. Показано, что скорость оттока электронов от ФС 1 является существенным фактором регуляции электронного транспорта в клетках цианобактерий. В анаэробных условиях отток электронов от ФС 1 является лимитирующим звеном в работе фотосинтетической цепи переноса электронов.

3. Измерены вклады дыхательной и фотосинтетической цепей переноса электронов в процессы электронного транспорта в тилакоидной мембране Synechocystis sp. РСС 6803.

• Поток электронов на кислород через терминальные оксидазы (темновое дыхание) не превосходит 10% от общего потока электронов к Р700+ в условиях освещения. Неспецифическое (цианид-резистентное) поглощение кислорода составляет не более 15% от общей скорости дыхания в темноте. Сукцинат-дегидрогеназа является основным донором электронов (до 80%), поступающих в пластохиноновый пул со стороны дыхательной цепи.

• В условиях освещения непрерывным светом клеток дикого вида вклад циклического транспорта электронов в поток электронов к Р7оо+ достигает ~30-60% от полного потока электронов, включающего приток электронов к Р7оо+ от ФС 2.

4. Установлена взаимосвязь между физико-химическими свойствами ряда рН-чувствительных нитроксильных радикалов (спиновых меток) имидазолинового и имидазолидинового ряда и характером их взаимодействия с хлоропластами. Показано, что спиновые метки ANT-1, ANT-3, ANT-4,

ANT-5 и ATI могут быть использованы в качестве зондов для количественных измерений внутритилакоидного рН в хлоропластах.

5. Определены «кинетические» параметры фотосинтетических процессов в листьях растений, измеряемые методом ЭПР и медленной индукции флуоресценции, чувствительные к условиям произрастания растений, включая неблагоприятные антропогенные факторы внешней среды.

6. Показано, что беталаиновый пигмент амарантин взаимодействует с хлоропластами, восстанавливаясь за счет взаимодействия с ФС 2. В хлоропластах амаранта амарантин является донором электрона для ФС 1. При этом амарантин практически не влияет на светозависимое образование трансмембранной разности рН.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Птушенко, Василий Витальевич, Москва

1. Альтшулер С., Завойский Е., Козырев Б. (1944) Новый метод исследования парамагнитной абсорбции // ЖЭТФ, т. 14, № 10/11, с. 407-409.

2. Асланиди К.Б., Шалапенок А.А., Карнаухов В.Н., Берестовская Н.Г., Шавкин В.И. (1988) Метод определения фунционального состояния растения по спектрам флуоресценции хлорофилла. // Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР. 44с.

3. Блюменфельд JJ.A. (1957) Спектры парамагнитного резонанса биологических объектов и миграция энергии. // Изв. АН СССР, сер. биол., с.285.

4. Блюменфельд JJ.A., Калмансон А.Э. (1957) Спектры электронного парамагнитного резонанса нативных и денатурированных белков. // ДАН СССР, 117, с.72.

5. Бучаченко А.Л., Вассерман A.M. (1973) Стабильные радикалы: Электронное строение, реакционная способность и применение. // М., Химия.

6. Ванин А.Ф. (2005) NO необходим для жизнедеятельности растений. // Нетрадиционные сельскохозяйственные, лекарственные и декоративные растения. №1 (2), с.37.

7. Вершубский А.В., Приклонский В.И., Тихонов А.Н. (2001) Электронный и протонный транспорт в хлолоропластах с учетом латеральной гетерогенности тилакоидов. Математическая модель. // Биофизика, т.46, вып.З, с.471-481.

8. Вёртц Дж., Болтон Дж. (1975) Теория и практические приложения метода ЭПР. // М.: Мир. 552c.(John Е. Wertz, James R. Bolton. Electron spin resonance: Elementary theory and practical applications. New York: McGraw-Hill Book Company, 1972)

9. Владимиров Ю.А., Добрецов Т.Е. (1980) Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. // М., Наука., 320с.

10. Говинджи. (1987) Фотосинтез, //тт.1,2, М.: Мир.

11. Гудвин Т., Мерсер Э. (1986) Введение в биохимию растений. М.: Мир. В 2т. Т 1. 392с. (Goodwin T.W., Mercer E.I. Introduction in Plant Biochemistry. Oxford, New-York, Toronto, Sydney, Paris, Frankfurt: Pergamon press, 1983.)

12. Гудвин Т., Мерсер Э. (1986) Введение в биохимию растений. М.: Мир. В 2т. Т2.312с.

13. Гусев М.В., Минеева JI.A. (1985) Микробиология. // Учебник. 2-е изд. М.: Изд-во Моск. ун-та. 376с.

14. Завойский Е.К. (1944) Парамагнитная абсорбция в перпендикулярных и параллельных полях для солей, растворов и металлов: Докт. дис. // М.: ФИАН.

15. Иванов Б.Н., Головина Е.В., Кузнецова Л.Г., Новичкова Н.С., Романова А.К (1988) Содержание нитратов в питательном растворе и индукция флуоресценции хлорофилла листьев клевера // Физиология растений, т. 35, с. 294-302.

16. Караваев В.А., Довыдъков С.А. (1999) Влияние хлорида кадмия на медленную индукцию флуоресценции и фотосинтез листьев бобов // Биофизика, т. 44, с. 145-146.

17. Карапетян Н.В., Бухое Н.Г. (1986) Переменная флуоресценция хлорофилла как показатель физиологического состояния растений // Физиология растений, т. 33, с. 1013-1026.

18. Козо-Полянский Б.М. (1924) Новый принцип биологии. Очерк теории симбиогенеза. //Jl.-М., "Пучина". 147с.

19. Кондратьева Е.Н. (1996) Автотрофные прокариоты. // М.: Изд-во МГУ, 312 с.

20. Кузнецов А.Н. (1976) Метод спинового зонда. // М., Наука.

21. Кукушкин А.К, Караваев В.А. (1995) Физико-химические механизмы регуляции фотосинтеза: гипотезы, достижения, перспективы // Физ. мысль России, с. 17-30.

22. Кукушкин А.К, Тихонов А.Н. (1988) Лекции по биофизике фотосинтеза растений. // М.: Изд-во Моск. Университета. 320 с.

23. Лихтенштейн Г.И. (1972) Применение спиновых меток в биологии. // М., Наука.

24. Магницкий С.Г. (1995) Исследование трансмембранного градиента рН в хлоропластах методом спиновых меток. Дисс. канд. физ.-мат. наук. // Москва, МГУ.

25. Магницкий С.Г., Тихонов А.Н. Влияние осмотичности и солевого состава среды инкубации на генерацию АрН в хлоропластах // Биофизика. 1995. Т.40. Вып.2. С.347-353.

26. Мережковский КС. (1909) Теория двух плазм, как основа симбиогенезиса, нового учения о происхождении организмов. // Казань, типо-лит. Имп. ун-та. 102 е., с илл. (Отг. из Ученых записок Имп. Казанск. ун-та, 1909, т.76).

27. Парибок Т.А. (1983) Загрязнение растений металлами и его эколого-физиологические последствия // Растения в экстремальных условиях минерального питания / Под ред. Школьника М.Я. и Алексеевой-Поповой Н.В. Л.: Наука, с. 82-99.

28. Скулачев В.П. (1972) Трансформация энергии в биомембранах. // М. Наука.

29. Скулачев В.П. (1989) Энергетика биологических мембран. // М., Наука, 564с.

30. Солнцев М.К. (1989) О природе полосы термолюминесценции фотосинтетических объектов при 40-80°С // Журнал физ. химии, т. 63, с. 1959-1960.

31. Солнцев М.К. (1995) Влияние спектрального состава действующего света на термолюминесценцию листьев бобов при 40-70°С // Биофизика, т. 40, с. 417421.

32. Твердислов В.А., Тихонов А.Н., Яковенко JI.B. (1987) Физические механизмы функционирования биологических мембран. // М.: Изд-во МГУ.

33. АО. Тимофеев К.Н., Гольдфельд М.Г. (1986) Путь электрона в фотосинтезе: реакции в фотомембранах // Журнал Всесоюзного химического общества им. Д.И. Менделеева, т. 31, №6, с. 495-502.

34. Тихонов А.Н. (1985) Механизмы регуляции электронного и протонного транспорта в энергопреобразующих мембранах хлоропластов. Дисс. докт. физ.-мат. наук. // Москва, МГУ.

35. Тихонов А.Н., Блюменфельд JI.A. (1985) Концентрация водородных ионов в субклеточных частицах: физический смысл и методы определения. // Биофизика, т. 30, вып. 3, с. 527-537.

36. A3.Тихонов А.Н., Рууге Э.К., Субчинский К.В., Блюменфельд JI.A. (1975). // Физиология растений, т.22, с.5-15.

37. Тихонов А.Н., Тимошин А.А. (1985а) Электронный транспорт, перенос протонов и их связь с фотофосфорилированием в хлоропластах. Влияние интенсивности действующего света. // Биологические мембраны, т.2, с.349-362.

38. Фаминцын А.С. (1912) О роли симбиоза в эволюции организмов. // Доложено в заседании Физ.-матем. отд-ния 9 ноября 1911 г. Сиб. тип. Акад. наук, 68 с. (Отт. из: "Известия Акад. наук 1912 г.")

39. Ченцов Ю.С. (1984) Общая цитология. // 2-е изд. М. Изд-во МГУ, 352с.

40. Arnon D.I., Allen M.B., Whatley F.R. (1954) Photosynthesis by isolated chloroplasts. I I Nature v. 174, pp.394-396.

41. Arnon D.I., Whatley F.R., Allen M.B. (1957) Triphosphopyridine nucleotide as a catalyst of photosynthetic phosphorylation. // Nature v. 180 (4578), pp.182-185.

42. Azarkina N, Siletsky S, Borisov V, von Wachenfeldt C, Hederstedt L, Konstantinov AA (1999) A cytochrome bb'-type quinol oxidase in Bacillus subtilis strain 168. // J Biol Chem. v.274(46), pp.32810-7.

43. Bailar J.C. Jr., Jones E.M. (1939) // Inorganic Synthesis v.l: pp.35-38

44. Barber J. (1982) Influence of surface charges on thylakoid structure and function. //Ann. Rev. Plant. Physiol, v.33, pp.261-95.

45. BendallD.S., Manasse R.S. (1995) Cyclic phosphorilation and electron transport. // Biochim Biophys Acta, v. 1229 pp.23-38.

46. Bennett J. (1983) Regulation of photosynthesis by reversible phosphorylation of the light-harvesting chlorophyll a/b protein. // Biochem. J., v.212, pp. 1-13.

47. Berg SP, NesbittDM. (1979) Chromium oxalate: a new spin label broadening agent for use with thylakoids. // Biochim Biophys Acta; v.548(3), pp.608-15.

48. BogoradL. (1981) Chloroplasts. // J. Cell Biol., v.91, pp.256-270.

49. Chance В., Sies H., Boveris A. (1979) Hydroperoxide metabolism in mammalian organs. // Physiological Reviews, v. 59, No. 3, pp. 527-605.

50. Commoner В., Townsend J., Pake G.E. (1954) Free radicals in biological materials. //Nature v. 174, p.689.

51. Cooley J.W., Howitt C.A., Vermaas W.F.J. (2000) Succinate:Quinol Oxidoreductases in the Cyanobacterium Synechocystis sp. Strain PCC 6803: Presence and Function in Metabolism and Electron Transport. // Journal Of Bacteriology, v.182, No.3, pp.714-722.

52. Dilley R.A. (1971) Coupling of ion and electron transport in chloroplasts. // Curr. Top. Bioenerg. v.4, pp.237-71

53. Dilley R.A., Theg S.M., Beard W.A. (1987) Membrane-proton interactions in chloroplasts bioenergetics: Localized proton domains. // Ann. Rev. Plant Physiol v.38, pp.347-368.

54. Frenkel A. (1954) Light induced phosphorylation by cell-free preparations of photosynthetic bacteria. // J. Am. Chem. Soc. v.76, pp.5568-5569.

55. Gardestrom P. (1996) Interaction between mitohondria and chloroplasts. // Biochim Biophys Acta, v.1275, pp.38-40.

56. Gardestrom P., Wigge B. (1988) Influence of Photorespiration on ATP/ADP Ratios in the Chloroplasts, Mitochondria, and Cytosol, Studied by Rapid Fractionation of Barley (Hordeum vulgare) Protoplasts // Plant Physiol, v.88, pp.69-76.

57. Hill R., Bendall F. (1960) Function of the two cytochrome components in chloroplasts a working hypothesis. // Nature v.186, pp. 136-137.

58. Howitt C.A., UdallP.K., Vermaas W.F.J. (1999) Type 2 NADH Dehydrogenases in the Cyanobacterium Synechocystis sp. Strain PCC 6803 Are Involved in Regulation Rather Than Respiration // Journal Of Bacteriology, v.181, No. 13, pp.3994-4003.

59. InoueY (1996) Photosynthetic thermoluminescence as a simple probe of Photosystem II electron transport. // In: Amesz J and Hoff AJ (eds) Biophysical Techniques in Photosynthesis, pp 93-107. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands.

60. Jagendorf A.T., Uribe E. (1966). ATP formation caused by acid-base transition of spinach chloroplasts. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA v.55, pp. 170-177.

61. Khramtsov V.V., Weiner L.M., Grigor'ev I.A., Volodarsky L.B. (1982) Proton exchange in stable nitroxyl radicals. EPR study of the pH of aqueous solutions. // Chem. Phys. Lett., v.91, p.69.

62. Khramtsov V.V., Weiner L.M., Eremenko S.I., Belchenko O.I., Schastnev P.V., Grigor'ev I. A., Reznikov V.A. (1985) Proton exchange in stable nitroxyl radicals of imidazoline and imidazolidine series. // J.Magn.Res., v.61, pp.397.

63. Kirilyuk IA, Bobko AA, Grigor'ev IA, Khramtsov VV. (2004) Synthesis of the tetraethyl substituted pH-sensitive nitroxides of imidazole series with enhanced stability towards reduction. // Org Biomol Chem. v.2(7), pp. 1025-30.

64. Kirilyuk IA, Bobko AA, Khramtsov VV, Grigor'ev IA. (2005) Nitroxides with two pK values—useful spin probes for pH monitoring within a broad range. // Org Biomol Chem. v.3(7), pp. 1269-74.

65. Kocherginski N., Swartz H.M. (1995) Nitroxide spin lables: reactions in biology and chemistry. // CRC Press, Boca Raton.

66. Kobharova O.A., Wolk C.P. (2002a). Genetic tools for cyanobacteria. // Appl Microbiol Biotechnol. v.58(2), pp.123-37.

67. Kobharova O.A., Wolk C.P. (20026). A novel gene that bears a DNAJ motif influences cyanobacterial cell division. // Journal of bacteriology, v.184, No.19, p.5524-5528.

68. Kramer D.M., Sacksteder C.A., Cruz J.A. (1999) How acidic is the lumen? //Photosynth. Res. v.60, pp.151-163.

69. Krause G.H., Weis E. (1991) Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: the basics // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol, v.42, pp.313-349.

70. Lazar D. (1999) Chlorophyll a fluorescence induction // Biochim. Biophys. Acta, v.1412, pp.1-28.

71. Ligeza A, Tikhonov AN, Hyde JS, Subczynski WK. (1998) Oxygen permeability of thylakoid membranes: electron paramagnetic resonance spin labeling study. // Biochim Biophys Acta, v.1365 (3), pp.453-63.

72. Ligeza A., Tikhonov A.N., Subczynski W.K. (1997). In situ measurements of oxigen production using paramagnetic fiisinate particles injected into a bean leaf. // Biochim. Biophys. Acta, v. 1319, pp. 133-137.

73. Lolkema J.S., Hellingwert K.J., Konigs W.N. (1982) The effect of "probe binding" on the quantitative determination of the proton-motive force in bacteria. // Biochim. Biophys. Acta, v.681, pp.85-94.

74. Malkin S, Canaani O, Havaux M. (1986) Analysis of Emerson enhancement under conditions where photosystem II is inhibited — are the two photosystems indeed separated? // Photosynth Res v. 10, pp.291-296.

75. Mitchell P. (1961) Coupling of Phosphorylation to Electron and Hydrogen Transfer by a Chemi-Osmotic type of Mechanism. // Nature, v.191, No.4202, pp.144-148.

76. Motohashi K., Kondoh A., Stumpp M.T., Hisabori T. (2001) Comprehensive survey of proteins targeted by chloroplast thioredoxin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.98, No.2, pp.11224-11229.

77. Ohkawa H., Pakrasi H.B., Ogawa T. (2000) Two Types of Functionally Distinct NAD(P)H Dehydrogenases in Synechocystis sp. Strain PCC6803. // The Journal Of Biological Chemistry, v.275, No.41, pp.31630-31634.

78. Portis A.R. (1992) Regulation of Ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase activity. // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol, v.43, pp.415—437.

79. Roberts AG, Bowman MK, Kramer DM. (2004) The inhibitor DBMIB provides insight into the functional architecture of the Qo site in the cytochrome b6f complex. // Biochemistry, v.43(24), pp.7707-16.

80. Roberts AG, Kramer DM. (2001) Inhibitor "double occupancy" in the Q(o) pocket of the chloroplast cytochrome b6f complex. // Biochemistry, v.40(45), pp. 13407-12.

81. Samuilov VD, Barsky EL. (1993) Interaction of carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone with the photosystem II acceptor side. // FEBS Lett. v.320(2), pp.118-20.

82. Sazanov L.A., Burrows P.A., Nixon P.J. (1998) The chloroplast Ndh complex mediates the dark reduction of the plastoquinone pool in response to heat stress in tobacco leaves. // FEBS Letters v.429, pp.115-118.

83. Seelert H., Poetsch A., Dencher N.A., Engel A., Sthilberg H., Muller D.J. (2000) Structural biology. Proton-powered turbine of a plant motor. // Nature v.405, pp.418-419.

84. Sherman D.M., Troyan T.A., Sherman L.A. (1994) Localization of Membrane Proteins in the Cyanobacterium Synechococcus sp. PCC7942. Radial Asymmetry in the Photosynthetic Complexes. // Plant Physiol, v. 106, pp.251-262.

85. Skulachev V.P. (1988) Membrane bioenergetics. // Springer-Verlag.

86. Solntsev M.K., Ekobena H.P.F., Karavaev V.A., Yurina T.P. (1998) Dynamics of the action of various physical and chemical factors on the thermoluminescence of photosynthetic systems. // Journal of Luminescence, V.76&77, pp.349-353.

87. Stanier R.Y., Cohen-Bazire G. (1977) Phototrophic procaryotes: the cyanobacteria. // Ann. Rev. Microbiol, v.31, pp.225-274.

88. Stock D., Leslie A.G.W., Walker J.E. (1999) Molecular Architecture of the Rotary Motor in ATP Synthase. // Science v.286, pp.1700-1705.

89. Subczynski W.K., Cieslikowska D., Tikhonov A.N. (1990) Light-Induced Oxigen Uptake in Chloroplasts: ESR Spin-Label Oximetry. // Photosynthetica v.24 (1), pp.75-84.

90. Tikhonov A.N., Khomutov G.B., Ruuge E.K., Blumenfeld L.A. (1981) Electron transport control in chloroplasts. Effects of photosynthetic control monitored by the intrathylakoid pH. // Biochim. Biophys. Acta, v.637, pp.321-333.

91. Theg S.M., Chiang G., Dilley R.A. (1988) Protons in the Thylakoid Membrane-sequestered Domains Can Directly Pass Through the Coupling Factor during ATP Synthesis in Flashing Light. // The Journal of Biological Chemistry, v.263, No.2, pp.673-681.

92. Trissl H.-W., Wilhelm C. (1993) Why do thylakoid membranes from higher plants form grana stacks? // Trends Biochem Sci v. 18, pp.415-419.

93. Trubitsin B.V., Tikhonov A.N. (2003) Determination of a transmembrane pH difference in chloroplasts with a spin label Tempamine. // Journal of Magnetic Resonance, v. 163, pp.257-269.

94. Tyerman S.D., Bohnert H.J., Maurel С., Steudle Е„ Smith, J.A.C. (1999) Plant acuaporins: their molecular biology, biophysics and significance for plant water relations. // J.Exp.Bot. v.50, pp. 1055-1071.

95. Vredenberg WJ, Tonk WJ. (1975) On the steady-state electrical potential difference across the thylakoid membranes of chloroplasts in illuminated plant cells. Biochim Biophys Acta, v.387(3), pp.580-7.

96. Wast I J, Bendall DS, Howe CJ. (2002) Higher plants contain a modified cytochrome сб. // Trends Plant Sci. v.7, pp.244-245.

97. Weaver E.C. (1968) EPR studies of free radicals in photosynthetic systems // Ann. Rev. Plant Physiol, v.19, p.283-294.

98. Westerhoff H.V., Melaudri B.A., Venturoli G., Azzone G.F., Kell D.B. (1984) Mosaic protonic coupling hypothesis for free energy transduction. // FEBS Lett, v.165, pp.1-5.

99. Williams R.J.P. (1961) Possible functions of chains of catalysts. // J. Theor. Biol, v.l, p.1-13.

100. Williams R.J.P. (1978) The multifarious coupling of energy transduction. // Biochim. Biophys. Acta, v.505, pp. 1-44.

101. Wolosiuk R.A., Ballicora M.A., Hagelin K. (1993) The reductive pentose phosphate cycle for photosynthetic C02 assimilation: enzyme modulation. // The FASEB Journal, v.7, pp.622-637.

102. Zavoisky E.K. (1945) Spinmagnetic resonance in paramagnetics. // Journal of Physics USSR, v. 9, p. 245. ("Магнитоспиновый резонанс в парамагнетиках")

103. Zavoisky E.K. (1946) Spin magnetic resonance in the decimetrewave region. // Journal of Physics USSR, v. 10, p. 197-198. ("Магнитоспиновый резонанс в области дециметровых волн").

104. Zhang N., Portis A.R. (1999) Mechanism of light regulation of Rubisco: a specific role for the larger Rubisco activase isoform involving reductive activation by thioredoxin-f. // Proc Natl Acad Sci USA, v.96(16), pp.943 8-43.

105. Zhang H, Whitelegge JP, Cramer WA (2001) Ferredoxin:NADP oxidoreductase is a subunit of the chloroplast cytochrome b6f complex. // J. Biol. Chem. v.216, pp.38159-38165.