Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Трансмембранная разность рН и её роль в фотофосфорилировании

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Трансмембранная разность рН и её роль в фотофосфорилировании"

ч 10 3 1 А. . . .

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛШИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ' ИН. Н. Е. ЛОМОНОСОВА

Физическия Факультет.

На правах рукописи УДК 577. 3 '

РЫЖИКОВ СЕРГЕИ БОРИСОВИЧ

ТРАНСМЕМБРАННАЯ РАЗНОСТЬ рН И ЕЕ РОЛЬ В ФОТОФОСФОРИЛИРОВАНИИ

(специальность ОЗ. 00. 02 - биофизика)

АВТОРЕФЕРАТ-диссерташш на соискание ученой степени кандидата Физико-математических наук.

Москва 1990

Работа выполнена'на каФедре биофизики Физического Факультет; Московского Государственного университета ин. м. В. Ломоносова.

Научнш руководитель : доктор Физико-математических наук

Тихонов А. н.

Официальные оппоненты: доктор Физико-математических наук с. н. с. Бурбаев Л. ш. кандидат Физико-математических наук сорокин Е. и.

Ведущая организация: Институт биохимии АН СССР.

Зашита состоится 599) г_ в /У час-

на заседании специализированного Совета N 3 ОФТТ (К. 053. 05. 77) в МГУ им. И.В.Ломоносова по адресу:

119899 ГСП, Москва, ленинские горы. МГУ.- Физический Факультет, аудитория

с диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического Факультета МГУ.

Автореферат разослан 199^/ г.

Ученый секретарь специализированного Совета Ы 3 ОФТТ (К. 053.05. 77) в МГУ им. М.В.Ломоносова кандидат физико-математических наук

т. м. Козлов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Постановка проблемы, ее актуальность.

ФотоФосФорилирование является важнейшим биоэнергетическим процессом, в результате которого происходит преобразование энергии света в энергию химическоя связи, благодаря чему обеспечиваются энергетические потребности растении. Без понимания Физико-химических механизмов Функционирования энергопреобраэуюших систем' невозможно дать полное описание Фундаментальных процессов жизнедеятельности растений.

Несмотря на значительные успехи в изучении процессов Фотосинтеза, к настоящему времени вопрос о сопряжении энергодонорных (электронный транспорт) и энергоакпепторных (синтез атр) реакции остается одним из самых дискуссионных в биоэнергетике, важное значение при обсуждении предлагаемых концепции имеет вопрос о вешние трансмембраннол разности рн в энергопреобраэуюших мембранах, которая согласно хемиосмотическоя теории является источником энергии для синтеза АТР. в последнее время появились работы, указывающие на • то,'что синтез АТР в изолированных хлоропластах не требует значительной трансменбранной разности рН. Кроме того, 5ыло. показано, что синтез атр в условиях кислотно-щелочных пере-«одов могут производить даже изолированные АТр-синтетазы из хло-?опластов и других объектов. В связи с этим в настоящей работе 1редприняты измерения величины трансмембраннол разности рН в гилакоидах в интактных хлоропластах (листьях) и определение ее ¡клада в синтез АТР как при ФотоФосФорилировании, так и в "мо-1ельных" опытах по синтезу АТР изолированными хлоропластами в •емноте, индуцируемому кислотно-основными переходами.

Цель работы.

В настоящей работе были поставлены следующие задачи:

1) изучение кинетики переноса электронов в интактных хлоропластах (листьях) в связи с выяснением механизмов регуляции электронного

. транспорта и определения трансменбранноя разности РН;

2) определение трансмембраннои разности рн в интактных хлоропластах (листьях) с помощью спиновых меток;

3) сравнительное исследование синтеза АТР хлоропластами и изолированным Фактором сопряжения CFj, индупируеного кислотно-основными переходами, в зависимости от начального и конечного значения рН. буферной емкости внутритилакошшого пространства и разобщителен; ,

4) исследование возможности синтеза АТР. индуцируемого кислотно-основными переходами, изолированным миозином,' который в естественных условиях катализирует только реакцию гидролиза АТР (с целью выяснения универсальности свойства АТР-аз синтезировать АТР в ответ на скачкообразное повышение рН);

5) исследование методом спиновых неток и собственной Флуоресценции белка возможных конФормационных перестроек изолированного CFj и миозина, вызванных скачкообразным повышением рН.

Практическое значение работы.

Полученные результаты о величине трансмембранной разности рН в хлоропластах расширяют наши представления о механизмах Фотосинтеза и имеют важное значение для решения проблем адаптации растении к изменяющимся условиям среды, повышения урожайности растений (которая определяется эффективностью Фотосинтеза)■ выяснения механизма действия гербицидов.

Научная новизна работы.

В настоящей работе впервые на основе кинетических измерении была оценена трансмембранная разность рН в интактных хлоропластах (листьях), которая, как оказалось, не,превышает 1-1.5 единиц рН. В работе впервые были применены спиновые нетки для измерения трансмембранноп разности рН в интактных хлоропластах (листьях) при их Функционировании. Результаты, полученные с помощью спиновых меток, также показали, что в условиях ФотоФосФорилировайия дрН< 1-1.5. В работе впервые были сопоставлены данные по зависимости синтеза АТР в ответ на скачкообразное повышение РН от величины начального и конечного рН для сопрязкенных хлоропластов, разобщенных хлоропластов и-изолированных Ферментов АТР-синт'етаз. которые показали идентичность эффективного значения рк (ркзф=7. 8) для всех исследованных объектов. Впервые был осуществлен синтез АТР,' индуцируемый .скачкообразный повышением рН на препарате изолированного миозина, который в естественных условиях катализирует только реакцию гидролиза АТР.

Апробация.работы, основные результаты работы были изложены на VII Всесоюзной конференции "Магнитнни резонанс в биологии и медицине." (Звенигород 1989).

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в пяти статьях, список которых приведен в конце автореферата.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав с иэлояением литературных данных и собственного экспериментального материала, заключения и выводов, диссертация содержит 123 страницы текста, в тон числе 36 рисунков, список литературы включает 224 ссылки на работы советских и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. В главе дан краткий обзор современных представления о строении и Функционировании злектрон-транспортнои цепи и АТР-синтетаэного комплекса хлоропласто'в. Рассмотрены основные концепции энергетического сопряжения в хлоропластах, при этой особое внимание уделено хениоснотическои и конФормаиношюи концепциям мембранного ФосФорилированин. Б койне главы сформулированы основные задачи диссертационной работы.

ГЛАВА 2. МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА. Данная глава содержит описание объектов и методов исследования. В качестве объектов исследования были использованы листья комнатного растения китайской розы (IUblscus rosa sinensis) и проростков бобов (Vicia faba). Приведены методики выделения изолированных хлоропластов класса Б, сопрягающего Фактора CFj и миозина.

Подробно описаны условия регистрации кинетики окислительно-восстановительны х превращении реакционных центров Фотосистемы 1 путем измерения величины сигнала ЭПР 1 от окисленных центров Р700* (см. рис. 1). описаны методики' определения количества синтезируемого АТР потенциометрическим (по увеличению рН среды) и люциферин-люциферазнын методом. Для определения трансмембранноп разности рН в тилакоидах в работе использовали водорастворимые спиновые метки ТЕМПОамин и ТЕМПОхолин (рис.2, метки No 3,4). В качестве раэобшителея электронного транспорта и ФосФорилирования использовали НН4С1, FCCP (carbonllcyanlde p-trlf luorometiioxy-phenyihrdrazone) и грамицидин D. Для нодиФикации белков использовали спиновые метки, ковалентно связывающиеся с тиоловыми группа-

ни (рис. 2. метки N0 5-8). В работе также производилась регистрация собственной Флуоресценции белков.

глава 3. исследование кинетики окислительно-восстановительных превращении р700* в листьях высших растении. Данная глава посвящена исследованию кинетики Фотоиндупированных окислительно-восстановительных превращений реакционных центров Фотосистемы 1 1фс1) - р700+, выполненных с целью определения рн внутритилакоид-* ного пространства и неханизма регуляции скорости электронного транспорта в интантннх хлоропластах.

На рис. 1, помазана типичная кинетика окислительно-восстановительных превращения Р700*. индуцированных действием света различного спектрального состава, видно, что под действием дальнего красного света, возбуждающего преимущественно ФС1 (хмакс=707нм), происходит рост сигнала ЭПР1, вызванный увеличением ■ количества окисленных центров Р700+. При замене дальнего красного света на белый свет, кинетика приобретает немонотонный характер (кривая А-В-С на рис. 1). В работе были исследованы причины, приводящие к появлению . немонотонной кинетики окислйтельно-восстановительных превращении Р700*.

Количество окисленных центров Р700* определяется соотношением скоростей притока и оттока электронов от ФС1. скорость притока электронов к ФС1 (скорость переноса электрона между Фотосистемами) определяли по времени полувосстановления Р^оо1 после быстрого выключения белого света на стадии В-С (рис. 1). Проведенные измерения показали, что параметр т1/2 не зависит от продолжительности освещения листа белым светом и равен 20 мс. Полученные результаты означают, что в условиях интенсивного освещения

Г

30 с

\ 1

1 I \

«х

707

♦БС

-БС

"х707

-Б

РИС. 1.

Вверху: Сигнал ЭПР суспензии" хлоропластов.

А - свет х707 насыпающей интенсивности. В - в тем» Ниже: Кинетики окислительно-восстановительных превращении р700 в листьях китайской розы. 1-контроль. г-инФильтраиия ю-4 н нетилвиологена Стрелками показаны ноненты включения и выключения света »707 и белого света (БС).

(

1-0 НО

Ыо 1

«¿О

Но 2

N0 3

СН3 сн3

Но А

Но 5

II

О

Но 6

01

Но 7

Но 6*

Ыо 8

'д С1

Рис. 2.

Структурные Формулы используемых в работе спиновых меток.

листьев не происходит изменения скорости переноса электронов на участке между Фотосистемами.

количество восстановленных переносчиков между Фотосистемами определяли по величине параметра \I-Sx 1. где I-интенсивность дальнего красного света <хмах=707нм), а Б-плошаль над кривои. как показано на рис. 1 (Магзьо Т. V.. Кок в. 1970). на основании кинетических измерении в работе было показано, что в холе освещения листа белым светом не происходит существенного изменения количества восстановленных переносчиков электронов между Фотосистемами.

Концентрация окисленной формы Р700* определяется разностью скоростей притока и оттока электронов от Р700+. Так как под действием белого света происходит увеличение концентрации окисленной . формы Р700? (рис.1, стадия В-С). а проведенные в работе эксперименты показывают, что скорость переноса электронов и количество переносчиков электронов между фотосистемами не меняется, то был сделан вывод, что немонотонная кин.етика А-В-С вызвана ускорением оттока электронов от ФС1. Нами было предположено, что это происходит в результате увеличения количества акцепторов ФС1 - НАВР+.

Опыты с инфильтрацией в лист искусственного акцептора электронов ФС1 - метилвиологена подтвердили это предположение. В присутствии метилвиологена происходит лишь незначительное по сравнению с контролем уменьшение сигнала ЭПР1 от Р700* после включения белого света, полученные результаты позволили заключить, что в листьях высших растении регуляция скорости электронного транспорта осуществляется главным образом на акцепторном участке ФС1.

Показано, что скорость оттока электронов от ФС1 под действием белого света не увеличивается при инфильтрации в лист антимицина А - ингибитора циклического транспорта Электронов. Сравнение ки-

нетин окислительно-восстановительных' превращения Р700+ в присутствии метилвиологена. антимипина A. NH4C1 и антимишгаа а вместе с метилвиологеном, позволяет предположить, что необходимое для Функционирования цикла Кальвина соотношение концентрации восстанавливаемого HADPH и синтезируемого АТР (ГАТР)/rNADPH) = 3/2) достигается за счет перераспределения потоков электронов, переносимых' по циклическому и нециклическому пути.

известно (TiKiionov et ai. 1901), что скорость переноса электрона между Фотосистемами определяется скоростью окисления пласто-хиноиа. происходящего на внутренней стороне тилакоиднои мембраны и сопряженного с выделением протонов во внутритилакошшое пространство. а скорость окисления пластохинона определяется внутрити-лакошшым рн. при рН внутритияаксилного пространства выше шести времй переноса электрона между Фотосистемами (параметр ri/2) составляет 20 мс. При уменьшении РН до 4. 5-5. оно возрастает вплоть до 150 мс. Таким, образом, по скорости переноса электрона между Фотосистемами можно определить' РН во внутритилакоидном пространстве. Так как проведенные в настоящей работе измерения показали, что в листе время полувосстановления Р700+ - Tj/з не изменяется по мере освещения листа белым светом 'и равен 20 мс, то можно сделать вывод, что освешение листьев не сопровождается существенным снижением рн внутритилакопдного пространства (рН1п > 6).

ГЛАВА 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗНАЧЕНИЯ РН ВНУТРИТИЛАГСОИДНОГО ПРОСТРАНСТВА В КНТАИТ1СДС ХЛОРОПЛАСТАХ (ЛИСТЬЯХ) С ПОНОИЫО СПИНОВЫХ ИЕТОК. В данной главе описаны результаты исследования Фотоиндупи-рованных изменения сигнала ЭПР водорастворимых спиновых меток ТЕИПОамин н ТЕНПОхолшь выполненных с целью определения значения рН внутритилакоианого пространства в интактных хлоропласта.-: (лис-

тьях). Контрольные эксперименты по измерению окислительно-восстановительных превращении Р700* показали, что введение в лист спиновых меток (исходная концентрация метки в растворе составляла о. 5 мИ) не приводит к действию, характерному для введения в лист разобщителей фосфорилировэния (NH4C1 и др.). Это позволяет заключить, что в наших условиях используемые метки не вызывали разобщения «осФорилирования в листе.

На рис. 3 приведена типичная кинетика Фотоиндупированных изменении сигнала ЭПР от ТЕМРОамина. После введения метки в лист в неосвещенном листе наблюдается сравнительно медленное уменьшение сигнала эпр от спиновой метки, что. по-видимому, вызвано восстановлением метки эндогенными восстановителями. Под действием дальнего красного света х707> возбуждающего преимущественно ФС1. восстановление метки ускоряется лишь незначительно (рис. 3, в центре). При освещении листа белым светом, эффективно возбуждаюшин обе Фотосистемы, кинетика приобретает, сложный характер: вначале (стадия д-ё) наблюдается более быстрое восстановление метки, чем в темноте, затем оно ускоряется еще сильнее (стадия В-С), после чего спад сигнала занедляется и уровень сигнала достигает стационарного значения (стадия D-E). наличие быстрой Фотоиндуцированноя кинетики изменения величины сигнала ЭПР от спиновой метки (стадия А-С) позволяет заключить, что большая часть нетки проникает в хлоропласта, сравнение кинетик Фотоиндупированных изменении сигналов эпр ТЕМПОамина в присутствии и отсутствии NH4O. а также сравнение кинетик Фотоиндупированных изменении сигналов ЭПР двух спиновых меток - ТЕИПОамина. являющейся индикатором рН,. и спиновой нетки ТЕМПОхолина. не чувствительной к образованию ДрН. позволяет заключить, что при Функционировании хлоропластов в натив-

Рис. 3.

Кинетики Фотоиндупированных превращений Р700* (вверху) и инфилътрированого в лист ТЕМПОамина (в центре). Кривая ь вверху соответствует образцу, инфильтрированому ЮОшМ Ш4Сх. Пунктирными линиями (в центре) показан ход кинетики в случае вьшл. белого света

них условиях (листьях) не возникает значительной транснембранной разности рн в тилакоидах (ДрН < 1-1.5). Полученный результат хорошо согласуется с приведенной выше оценкой Д.РН кинетическим методом.

ГЛАВА 5. СИНТЕЗ АТР ХЛОРОПЛАСТАМИ, ИЗОЛИРОВАННЫМИ CFj И МИОЗИНОМ' ПРИ СКАЧКООБРАЗНОМ ПОВЫШЕНИИ РН. ВЛИЯНИЕ НАЧАЛЬНОГО И КОНЕЧНОГО ЗНАЧЕНИИ РН, ПРОНИСАШИХ БУФЕРОВ И РАЗОБЩИТЕЛЕН ФОСФО-РИЛИРОВАНИЯ. Данная, глава в основном посвяшена исследованию синтеза АТР. индуцированного кислотно-основными переходами, изолированными хлоропластани в зависимости от конечного и начального значения рн и концентрации проникающих буферов и разобщителен. Опыты проводили по классической схеме Ягендорфа и Юраиба. Вначале хлоропласта инкубировали в среде с пониженным рН (до 4.5). содержащей проникающий внутрь тилакоилов буфер (сукшшат или MES). неорганический фосфат. HgCi2 и DCHU (ингибитор электронного транспорта). Затеи добавляли ADP и повышали рН вспрыскиванием щелочного буфера. На рис. 4 (вверху) представлена зависимость количества атр. синтезируемого после скачкообразного повышения- РН р расчете на одну молекулу CFj (параметр «) от. конечного рн при постоянном начальной 14.5). Значение рн. при котором 0.5 «тах. в дальнейшем будем называть зФФекпганым PK (рКэф). максимальное значение параметра <* в наших экспериментах составляло «ma^ 6080, рКэф - 7. 8. что согласуется с литературными данными (Jaeen-dorf А.Т.. Unbe Е. 1966. Лобышева и.И,. Микоян В.Д., ГольдФельд и. г. 1987 и др.). На рис. 4 (внизу) представлена зависимость параметра <* от начального значения рн при Фиксированном конечном рН= 8.'3. синтез атр. индуцированный скачкообразным повышением рн. не полностью подавляе-тся при добавлении к хлоропластам разоб-

СогЦго! Сг»ш1с.В ГССР 13 •

• о зотм, —!—ЗасеЬх«и 1втМ X И 15тН

рис. 4.

Зависимость синтеза атр при кислотно-основных переходах от начального и конечного значения рн.

Вверху: начальное рн постоянно (4.5).

изменяется конечное рн. Внизу: конечное рН постоянно (В.3). изменяется; начальное рН.

шителея фотофосфорилирования (ЫН4С1. FCCP. Грамицидин D). Завис) ность « от конечного значения рН при постоянном началь» (рн=4.5) имеет одинаковый характер во всех исследованных случая; сопряженные и разобщенные хлоропласты и изолированный Ферме) CFj! прр этом РКЭф * 7. 8.

На рис. 5'показаны зависимости параметра <» и скорости фотс ФосФорилирования 1Ущ>) от конаентрашш граншшдина D. Синте АТР. индуоируеиыи скачкообразным повышением РН, остается весы значительным .(<*= 10-20) при концентрациях грамицидина D 100-300н> в то время как ФотоФосФорилирование практически полностью подав лено при конаентрашш грамишшша D 1нМ. Проведение эксперинеш показали, что в разобщенных гранишшшом D хлоропластах синте АТР. индуаированныи скачкообразным повышением. рН. возрастает повышением конаентрашш буфера, проникающего внутрь тилакоидов.

на основании .всея совокупности полученных результатов сопоставления их с литературными данными были сделаны следуюши выводы:

1) в хлоропластах существуют по крайней мере два типа компартией . тов. различающихся по своея доступности грамицидину D; возможно

что такини конпартментани являются тилакоиды граны и строны!

2) во всех исследованных случаях: сопряженные хлоропласты хлоропласты в присутствии грамицидина D. и изолированный Факто: сопряжения CFj. в процессах синтеза АТР. инициированного рн ударом, участвуют кислотные группы Фермента CFj с примерно одним) и теми-же значениями рк*7. 8.

В работе была впервые показана возможность синтеза АТР из AS} и Рх изолированным ниозином, индуцированного кислотно-0сновным1 переходами. В качестве контроля.служил денатурированный или обра-

1 lf^ I?" 5* и"1* грамицидин D

рис. 5.

Влияние грамишшина D на синтез ATP при ОотоФосФорилировании (1) и кислотно-основных переходах (2).

ботанныи N-этилмалеимидом Фермент, для контроля были проведен также опыты на активном Ферменте в среде, не подвергавшейся изне нению рн. Количество синтезируемого атр при рН-ударе определял как разность концентрации АТР, измеряемых люциФерин-люпиФеразны способом, при рН-ударе и в контроле, этим исключались из рассмот рения молекулы АТР. которые могли содержаться в исходном препара те ADP (до 1.5И), возможный синтез АТР за счет аденилаткиназно активности Фермента, а также появление в растворе АТР оа счет ос вобождения связанного с миозином АТР. который ног бы переходить раствор после рн-удара и последующей Фиксации образца.

на рис. б представлена зависимость выхода АТР (параметр с конечного значения рн при Фиксированном начальном 5. 8. ма::синал! ныл выход составляет в среднем о. 8 молекул АТР на одну молекул миозина; ркэф в 7.8-8.0. Не исключено, что в ответ на скачкоос разное повышение рн синтезируется большее количестсво АТР. s часть вновь синтезируемого АТР успевает гидролизоваться ииозинс до момента Фиксации пробы. Некоторое уменьшение синтеза АТР ш конечных значениях рн > 8.5. как показали опыты, обУсловле1 увеличением гидролаэнои активности Фермента при высоких рН,

Таким образом, на основании полученных результатов можно еде лать вывод о том, что миозин, подобно АТР-азам другого происхоа дения, способен синтезировать АТР из ADP и Pj при быстрой депрс тонизации кислотных групп Фермента с РКЭф я 7. 8-8. 0.

ГЛАВА 6. ИССЛЕДОВАНИЕ КОНФОРМАШЮННЫХ ПЕРЕСТРОЕК И30ЛИР0ВА1 НОГО ФАКТОРА СОПРЯЖЕНИЯ CF) И МИОЗИНА МЕТОДАМИ СПИНОВЫХ МЕТОК. данной главе описаны результаты исследования конФорнапионных п< рестроек CFj и миозина с поношью спиновых меток, и по регистраш собственной Флуоресценции белков. В работе использовали пять ра:

рн

Рис. 6.

Зависимость синтеза атр миозионом при кислотно-основных переходах от конечного значения рн.

наличных спиновых ме^ок. ковалентно связывающихся с тноловыни гру

памп белка.

Известно, что при связывании большинства спиновых неток белком происходит уменьшение их подвижности. что приводит, к из* нению спектра эпр меток. Лвихение спиновых меток может изменять при конформэпионных перестройках бедка, что. в свое очередь, к хет сказаться на Форме спектров эпр спиновых меток.

в работе было показано, что при присоединении субстра1 ФосФорилирования (аир и атр) к миозину происходит уведиче! параметра 2Тц спектра эпр спиновой метки N03 на I.5 Гс (расс: яние между низкополышн максимумом и высокопольным минлт спектра эпр. характеризующего подвижность метки). Однако, ник ал различии в спектрах эпр миозина и СТ"^ иоднлшировашшх спинов) метками, до и после рн удара в диапазоне рн от 3 до 9 не бьио < нарухено ни для одной из пяти использованных спиновых ме' (рис. 2. мо 5-9). не обнарухно также различия в спектрах соб! венной Флуореспеноии обоих белков до и после скачкообразного ! вышения рн в физиологическом диапазоне рн. Таким образом, указ ними методами не выявляются конФормапионные перестройки иэоли ванного Фактора сопряжения СР] и миозина, которые могли бы им место при Функционировании Ферментов в результате скачкообразн повышения рн. . •.:__ "••''■.

однако, подученные результаты, в принципе, ве исключают шествования конФормалионных перестроек, которые могут происход при Функционировании СР} и миозина. Возможно, что пронехуточ неравновесные конФормапионные состояния белка, возникающие по скачкообразного повышениия РН. являются короткохивушими (мен минуты), а регистрируемые в опыте конечные конФормапионные с

тояния белка близки х начальный, возможно также, что возникающие при этом конФорнапионные перестройки носят локальный характер и потону не регистрируются описанными выше методами. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. '

В работе была изучена роль транснембраннои разности рн в процессах ФотоФосФорилирования. синтеза АТР. индуцируемого кислотно-основными переходами, и регуляции электронного транспорта в хлоропласта*. проведенные исследования позволяют заключить, что. в отличие от изолированных хлоропластов класса Б. содержащих искусственный акцептор электронов - метилвиологен. для которых регуляция скорости электронного транспорта осуществляется на стадии окисления пластохинона и связана с зачислением внутритилакоидного пространства, в листьях имеется второй пункт регуляции - акцепторный участок Фотосистемы 1. ' Регуляция скорости электронного транспорта связана с перераспределением переноса электронов по циклическому и нециклическому пути, что необходимо для достижения оптимального для функционирования цикла Кальвина стехиометричес-кого отношения синтеза АТР и восстановления NADP*.

Эксперименты, проведенные на интактных хлоропластах (листьях). показали, что при функционировании электрон-транспортной цепи в листьях не происходит существенного закисления внутритилакоидного пространства (дрн < 1-1.5). Измерения трансмембранной разности рн .для листьев были проведены двумя независимыми способами; "кинетическим" (т.е. на основаннии данных. полученных при регистрации кинетики окислительно-восстановительных превращения Р700+) и с помощью спинового зонда ТЕМПОамина.

Полученные результаты позволяют заключить, что трансмембранная разность рН является экстенсивным, а не интенсивным Фактором

синтеза at?: разность рН между объемными водными Фазами по об стороны тилакоиднои мембраны не является непосредственным источ кик он энергии для синтеза ATP, высвобождающейся в результате пе гслоса кротона через тилакоидную мембрану по градиенту конпентра пик. наличие замкнутых везикул, обеспечивающих векторный перено протоков через тилакоидную мембрану, необходимо для реализаш цикличности работы АТР-синтетазы путем периодического протониро занпя и лопротонирования Функциональных кислотных групп ATP синтстазы (pK3i,»7.8). Поэтому, для обеспечения фосфорилировани kg столько абсолютное значение величины трансмембранно разности рН. сколько количество переносимых через тилакоиду мгкерану к АТР-синтетазе протонов, восстанавливающих функииональ группы оеркента. При этом необходимо, чтобы по одну сторон меморакы значение рН было выше, а по другую - ниже рК функцио нальяых групп.

указанный вывод был сделан на основе комплексного исследова и;:я на различных уровнях организации Фотосинтетического аппарат высяих растении: интактных хлоропластах (листьях), изолированны хлоропластах класса Б и изолированных Ферментах АТР-синтетаз (водорастворимый оактор сопряжения (CFj).

Вывод со экстенсивной роли трансмембраннои разности рН бы подтвержден в экспериментах на изолированных хлоропластах класс Б. Было показано, что эффективное значение рК кислотных груп атр-синтетазы, депротонирование которых необходимо для синтез атр, не зависит от буферной емкости внутритилакоидного прос транства и одинаково (рКэфз7. 8) для всех исследованных объектов сопряженных и разобщенных хлоропластов, и изолированного сопряга юыего Фактора CF1.

Этот механизм Функционирования АТР-синтетаэы, ло-виликому имеет обшт характер, .что подтверждается результатами экспериментов на изолированном•миозине. Показано, что синтез атр в условиях кислотно-основных переходов возможен не только атр-синтетазами хлоропластов и других энергопреобразуюишх мембран, но и миозином, который в естественных условиях функционирует только как АТР-аза. Полученные результаты и сопоставление их с литературными данными, позволяют сделать вывод об универсальности свойства АТР-аз синтезировать атр при скачкообразном повышении pH.

Полученные результаты находят объяснение в рамках модели •Г;'.'>:шго15!;роваш;я АТР-синтетаэы. ^развитой в работах Блюменеельда с сотрудштами. в основе этой попели легли положение, что "элемен-тарнпп акт" синтеза АТР из ADP и неорганического оосоата не требует наличия замкнутых мембранных везикул и реализуется за счет достаточно быстрой лепротонизатш некоторых кислотных групп Фактора сопряжения CFj. в-результате которой оегмент оказывается в коиФормапиопно неравновесном состоянии (наличие "лишних" отрицательных зарядов в епз 'неизменной белковой глобуле), энергоак-пепторнып акт с;штеза АТР (отделение прочносвязанной молекулы АТР) происходит в золе релаксации этого неравновесного состояния.

ВЫВОДЫ.

1. Показано, что немонотонная кинетика оотоинлупированных окислительно-восстановителытх превращений реакционных центров Фотосистемы 1 - Р700+ в листьях высших растения обусловлена ускорением оттока электронов от Фотосистемы 1 и не связана с тормозениен электронного транспорта между Фотосистемами. На основании полученных кинетических данных можно заключить, что Сушшионирование электрон-транспортной цепи в нативных листьях не

приводит к существенному понижению рН (рН1п>6) внутритилакоидного пространства.

2. Исследование Фотоиндуцированных изменения спектров ЭПР водорастворимых спиновых меток, инфильтрированных в лист, показало, что при функционировании хлоропластов в нативных условия? (листьях) не возникает значительной трансмембранной разности рН е тилакоидах (дрн <1-1.5).

3. Показано, что эффективное значение рк функциональных групг сопрягающего Фактора CFj. ответственных за синтез АТР в темноте при скачкообразном повышении рн, не зависит от буферной емкости внутритилакоидного пространства. На основании полученных результатов и сопоставления их с литературными данными сделан вывод с том, что величина дрН является экстенсивным, а не интенсивны» фактором, определяющим синтез АТР.

4. Установлено, что эффективности разобщающего действия грамицидина D на ФотоФосФорилирование и синтез АТР в тенноте, индуцированный скачкообразным повышением рН, существенно различаются. Полученный результат свидетельствует о существовании внутритила-коилных областей с различной доступностью грамицидина D и согласуется с известными данными о функциональной и морфологически гетерогенности хлоропластов.

5. Показана возможность синтеза АТР миозином из ADP и неорга нического ФосФата при скачкообразном повышении рН.

6. Показано, что процессы протонизаиии и депротонизации Функ циональных групп CFi и миозина, ответственных за синтез АТР npi скачкообразном повышении рН, не сопровождаются такими конФорма ционными преобразованиями белковой глобулы, которые могли бы быт: зарегистрированы использованными в работе спиновыми метками

шалентно связанныни с тиоловыми группами, или вызвать изменение

[уореспенпии основной массы тирозиновых и триптофановых остатков

;лка.

Результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Рыжиков С. Б. . Тихонов А. Н. Регуляция скорости переноса электрона в Фотосинтетических мембранах высших растения. Биофизика 1988. Т. 33. No4. С. 642-647.

2. Рыжиков С. Б. . Хомутов Г. Б., Тихонов А. Н. Регуляция скорости электронного переноса в энергопреобразуюших мембранах хлоро-пластов высших растения. // В сб. "VII всесоюзная конференция "магнитный резонанс в биологии и медицине." Черноголовка. 1989. С. 5-6.

3. Рыхшов С. В. . Тихонов А. Н. • Фотоиндупированные изменения сигналов ЭПР водорастворимых спиновых меток в листьях высших растения. // в сб. . "vil Всесоюзная конференция "Магнитит резонанс в биологии и медицине. " Черноголовка. 1989. с. 155156.

I. рыжиков с. Б.. БлюменФельд л. А.. Петрусевич Ю. м., Тихонов А.П. Синтез АТФ миозином при рН-ударе. // Биофизика 1990. Т. 35. Hol. С. 141-142.

). хомутов Г. Б. , бэргутх С. А. , рыжиков С. Б. . Тихонов А. Н. Взаимолеяствие ионов марганца с тилакоилными мембранами. // Фиэиол. раст. 1989. Т. 36. No4. С. 669-674.