Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование протонного транспорта в хлоропластах с помощью рН-чувствительных спиновых меток

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Трубицин, Борис Вячеславович

Содержание.

Список используемых сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Структурно-функциональная организация хлоропласта.

1.1.1. Цепь электронного транспорта хлоропластов.

Фотосистема 2.

Цитохромный b</f комплекс.

Фотосистема 1.

1.1.2. Протонный транспорт и фотофосфорилирование в хлоропластах.

1.1.2.1. Перенос протонов к АТР-синтазе.

1.1.2.2. Структура АТР-синтазного комплекса.

Строение фактора сопряжения CFq.

Строение фактора сопряжения CF].

1.1.2.3. Функционирование АТР-синтазы.

1.1.2.4. «Локальный» и «делокалгорванньдр механизмы энергетического сопряжения.:.:!.!.

1.1.3. Особенности регуляции электронного и протонного транспорта в хлоропластах.

1.1.3.1. Явление фотосинтетического контроля.

1.1.3.2. Регуляция активности фотосинтетических ферментов.

Регуляция распределения энергии поглощаемого света между фотосистемами.

1.1.3.3. Редокс-регуляция фотосинтетических ферментов.

1.1.3.4. Терморегуляция фотосинтеза.

1.1.3.5. Роль фитохрома в регуляция фотосинтеза.

1.2. Методы измерения величины АрН.

1.2.1. Флуоресцентные красители.:.

1.2.2. ЯМР-спектроскопия.

1.2.3. «Кинетический» метод измерения АрН.

1.2.4 Спиновые метки.

1.2.4.1. Использование в качестве зонда спиновой метки ТЕМПАМИН.

1.2.4.2. Использование имидазолиновых рН-чувствительных радикалов.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Выделение хлоропластов.

2.2. Оценка функциональной активности хлоропластов.

2.3. Регистрация и обработка спектров ЭПР.

2.3.1. Программное обеспечение.

2.3.2. Получение разностных спектров ЭПР спиновых меток внутри тилакоидов.

Глава 3.

Результаты и их обсуждение.

3.1. Определение внутритилакоидного рН с помощью спиновой метки

ТЕМПАМИН.

3.1.1. Локализация ТА внутри тилакоида.

3.1.2. Методы измерения рН;„ с помощью спиновой метки ТЕМПАМИН.

3.1.2.1. Регистрация метки внутри тилакоидов по увеличению «внутреннего» сигнала ЭПР.

3.1.2.2. Определение АрН по эффекту концентрационного уширения спектра ЭПР.

3.1.2.3. Сравнение концентрационных зависимостей параметров спектров различных спиновых меток.

3.1.3. Количественное определение АрН по эффекту концентрационного уширения спектра ЭПР спиновой метки ТЕМПАМИН.

3.1.3.1. Моделирование концентрационной зависимости параметров спектра

ЭПР спиновой метки ТЕМПАМИН.

Экспериментальные условия, влияющие на форму спектральной линии.

Моделирование суперСТС спектральной линии.

Зависимость ширины спектральной линии от концентрации спиновой метки.

3.1.3.2. Моделирование фотоиндуцированного поглощения ТА тилакоидами.

Определение вида функции FfQ.

3.1.3.3. Измерения АрН в различных условиях функционирования хлоропластов.

3.2. Определение ДрН в хлоропластах с помощью рН-чувствительных спиновых меток (имидазолиновые радикалы).

3.2.1. Построение калибровочных кривых для измерения рН с помощью имидазолиновых радикалов.

3.2.2. Измерения внутритилакоидного рН с помощью метки ATI.

3.2.2.1. Получение разностных спектров ЭПР при освещении образца.

3.2.2.2. Локализация метки в образце.

3.2.3. Измерение величины АрН в различных метаболических состояниях хлоропластов.

3.2.4. Зависимость трансмембранной разности рН от рН внешней среды.

3.3. Изучение электронного транспорта в листьях методом ЭПР.

3.3.1. Влияние неорганического фосфата на работу фотосинтетического аппарата растений.

3.3.2. Влияние экологических факторов на работу фотосинтетического аппарата растений.

3.3.3. Кинетика фотоиндуцированных окислительно-восстановительных превращений реакционного центра Р700+ в листьях С3- и С4-растений.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование протонного транспорта в хлоропластах с помощью рН-чувствительных спиновых меток"

Фотосинтез является одним из важнейших биологических процессов. В настоящее время достигнуты значительные успехи в изучении структурно-функциональной организации фотосинтетического аппарата хлоропластов -энергопреобразующих органелл растительной клетки. Выяснена последовательность фотохимических и темновых биохимических процессов, обеспечивающих всю совокупность фотосинтетических процессов (поглощение света, миграция энергии, разделение зарядов в реакционных центрах, электронный и протонный перенос, синтез АТР, фиксация углекислоты в цикле Кальвина и т.д.). Расшифровано молекулярное строение большинства электрон-транспортных и светособирающих белковых комплексов (Jordan et al., 2001; Zouni et al., 2001), входящих в тилакоидные мембраны хлоропластов, детально изучено строение и функционирование АТФ-синтазного комплекса (Abrahams et al., 1994; Stock et al., 1999). Однако остаётся открытым ряд вопросов, касающихся регуляции световых стадий фотосинтеза и механизмов сопряжения протонного транспорта с реакциями синтеза АТФ в хлоропластах. К числу наиболее актуальных задач биоэнергетики относятся исследование путей переноса протонов к АТФ-синтазе («локальный» и «нелокальный» механизмы), (Dilley et al, 1985-1999) и выяснение вклада двух составляющих протонного потенциала (трансмембранная разность рН, АрН = pHin - pHoub и трансмембранная разность электрических потенциалов, Дф) в обеспечении синтеза АТФ в хлоропластах (Kramer et al., 1999-2001). Решение этих задач непосредственно связано с измерениями АрН в хлоропластах. Определение АрН затруднено тем, что прямое измерение рН внутри тилакоидов (pHin) электродами практически невозможно ввиду малости внутритилакоидного объёма. Поэтому для измерения pHin обычно используют специальные красители, спектры поглощения или флуоресценции которых чувствительны к рН окружающей среды (Владимиров, Добрецов, 1980). Однако использование таких соединений в качестве индикаторов pHin в хлоропластах ограничено тем, что большинство индикаторов, как правило, связывается с тилакоидной мембраной, что может приводить к существенному завышению измеряемой величины АрН (Lolkema et al., 1982). Поэтому разработка новых методов измерения АрН в хлоропластах с помощью рН-чувствительных спиновых меток является одной из наиболее актуальных задач биофизики фотосинтеза. Для этого в данной работе решались следующие практические задачи.

1) Обоснование и разработка алгоритма измерения АрН по фотоиндуцированным изменениям спектра ЭПР спиновой метки TEMP AMINE.

2) Разработка метода измерения АрН в хлоропластах с помощью имидазолиновых меток.

В ходе выполнения поставленных в данной работе задач возникла необходимость в создании программного обеспечения, позволяющего получать корректные разностные спектры ЭПР молекул спиновых меток, локализованных внутри тилакоидов, и проводить необходимую обработку получаемых спектров.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Трубицин, Борис Вячеславович

Выводы.

1. Показано, что основная часть молекул спиновой метки TEMP AMINE, используемой для измерения рН внутри тилакоидов, локализуется в объёмной водной фазе внутритилакоидного пространства.

2. Разработан алгоритм, позволяющий определять трансмембранную разность рН в хлоропластах по эффекту фотоиндуцированного изменения величины сигнала ЭПР спиновой метки TEMP AMINE в зависимости от концентрации метки в суспензии хлоропластов.

3. Получен сигнал ЭПР рН-чувствительного имидазолинового нитроксильного радикала ATI (4-амино-2,2,5,5-тетраметил-3-имидазолин-1-оксил, рК = 6,2), локализованного во внутритилакоидном объёме хлоропластов и изучена его зависимость от рН. Зарегистрированы фотоиндуцированные изменения этого сигнала, свидетельствующие о том, что спиновая метка ATI может быть использована в качестве индикатора фотоиндуцированных изменений внутритилакоидного рН.

4. Определены спектральные параметры сигнала ЭПР метки ATI (положение экстремумов высокополевой компоненты спектра и ширина линии), которые могут быть использованы для количественных измерений внутритилакоидного рН.

5. Значения АрН в хлоропластах, измеренные с помощью двух спиновых меток (ATI и TEMPAMINE), согласуются друг с другом. В состоянии фотосинтетического контроля АрН составляет 2,2 - 2,5;в состоянии активного синтеза АТР АрН равно 1,5 - 2,2 (в зависимости от условий эксперимента) при внешнем рН 7,5 - 8,0.

6. Показано, что основной вклад в появление индукционного периода, предшествующего значительному росту сигнала ЭПР1 в листьях различных видов растений, вносят процессы темновой дезактивации ферментов цикла Кальвина.

7. Создано оригинальное расширяемое программное обеспечение, позволяющее регистрировать в цифровой форме спектры ЭПР и с помощью встроенных процедур обработки и модификации корректно получать разностные спектры и анализировать их параметры. Предусмотрена возможность прямого экспортирования зарегистрированных спектров ЭПР в ведущие математические программные пакеты для дальнейшей обработки и представления результатов.

Заключение.

В результате исследований, выполненных в данной диссертационной работе, были обоснованы и разработаны соответствующие алгоритмы измерения трансмембранной разности рН (АрН) в хлоропластах с помощью двух спиновых меток двух разных типов (ТА и ATI). Измерения АрН помощью ТА основаны на эффекте концентрационного уширения спектра ЭПР молекул спиновой метки, накапливающихся внутри тилакоидов. Измерения АрН помощью молекул ATI основаны на том, что протонирование молекул ATI приводит к изменению формы спектра ЭПР. Доказано, что большая часть молекул ТА и ATI, находящиеся внутри тилакоидов, находится в осмотическом объеме тилакоидов, то есть молекулы спиновых меток ТА и ATI локализуются в объемной водной фазе внутритилакоидного пространства. Измерения АрН с помощью спиновых меток двух разных типов (ТА и ATI) дали хорошо согласующиеся между собой результаты. Таким образом, проведенные в работе исследования создают основу для решения одной из наиболее актуальных проблем биоэнергетики - выяснение вклада концентрационной составляющей протонного потенциала (АрН) в величину трансмембранной разности электрохимических потенциалов ионов водорода, генерируемой в хлоропластах в зависимости от условий функционирования хлоропластов.

Проведенные в диссертационной работе измерения величины АрН показали, что в хлоропластах создается трансмембранная разность рН, значение которой может варьировать в зависимости от условий эксперимента (метаболическое состояние, осмотичность среды инкубации, совместное или раздельное функционирование фотосистем). Характерно, что в условиях, отвечающих оптимальному синтезу АТР (pH0Ut= 7,5-8,0), создается трансмембранная разность рН, не превышающая величину АрН = 2,0-2,2. Полученные результаты согласуются с новейшими данными о структурной организации АТР-синтазного комплекса хлоропластов, указывающими на высокое стехиометрическое соотношение п = Н+/АТР (п > 4), а также могут быть объяснены в рамках представлений о существовании неоднородного распределения ДрН между тилакоидами гран и межгранными тилакоидами.

Исследования протонного потенциала в нативных системах (хлоропласты in situ, то есть хлоропласты в листьях) с помощью спиновых меток или других индикаторов затруднены ввиду неопределенности локализации молекул индикаторов в исследуемой системе. Альтернативой использованию молекулярных индикаторов АрН может служить «кинетический» метод измерения внутритилакоидного pHitl, основанный на измерении скорости переноса электронов между двумя фотосистемами, которая зависит от величины pHin. Сопоставление результатов измерения АрН в изолированных хлоропластах с помощью спиновых меток и с данными по измерению АрН в аналогичных условиях «кинетическим» методом показало хорошее согласие между этими методами. Наиболее адекватным способом измерения скорости переноса электронов между фотосистемами в листьях (хлоропласты in situ) является исследование кинетики окислительно-восстановительных превращений реакционного цента Р7оо методом ЭПР. В этой связи представлялось интересным изучить влияние различных факторов, влияющих на кинетику фотоиндуцированных редокс-превращений Р700 в листьях. Проведенное в диссертационной работе сравнительное исследование листьев различных видов растений показало, что сложная кинетика редокс-превращений Р700, определяется не только процессами активации ферментов на акцепторном участке ФС 1, но зависит также от условий произрастания растений. Эти факторы следует учитывать при анализе данных по измерению АрН «кинетическим» методом.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Трубицин, Борис Вячеславович, Москва

1. Abrahams J.P., Leslie A.G.W, Lutter R., Walker J.E. (1994) Structure at 2,8 A resolution of Fi-ATPase from bovine heart mitochondria. Nature 370,621-628.

2. Allen J.F. (1984) Photosynthesis and phosphorylation of light-harvesting chlorophyll a/b protein in intact chloroplasts. Effects of uncouplers. FEBS Lett., 166, 237-244.

3. Allen J.F., Horton P. (1981) Chloroplast protein phosphorylation and chlorophyll fluorescence quenching. Activation by tetramethyl-p-hydroquinone, an electron donor to plastoquinone. Biochim Biophys. Acta, 638, 290-295.

4. Anderson J.M. (1981) Consequences of spatial separation of photosystem 1 and 2 in thylakoid membranes of higher plant chloroplasts. FEBS Lett. 237:519-31

5. Anderson J.M. (1982) Mol. and Cell.Biochem V.46, p. 161-172.

6. Anderson J.M. Photoregulation of the composition, function and struture of thylakoid membranes. Ann. Rev. Physiol, v. 37. p. 93 136.

7. Anderson J.M., Akerlund H. -E., Jergil В., Larsson C.(1982) FEBS lett. V.149, p.181-185.

8. Andreeva A., Tikhonov A. (1983) Comparative study on the kinetics of electron transport and the slow chlorophyll fluorescence changes in bean leaves. Photobiochem. Photobiophys., 6, 261-266

9. Arnon D.I. & Chain R.K. (1975) FEBS lett. V. 82, p.297-302.

10. Avron M. (1977) Ann. Rev. Biochem. V.46, p. 143-155.

11. Babcock G.T., Blankenship R.E., Sauer K. (1976) Reaction kinetics for positive charge accumulation on the water side of chloroplast photosystem II. FEBS Lett. 61:286-89

12. Bailar J.C. Jr., Jones E.M. (1939) Inorganic Synthesis v. 1: 35-38

13. Вakker-Grunwald J., Van Dam K. (1973). Biochim. Biophys. Acta. V.292, p.808-814.

14. Bales B.L. (1989) Inhomogeneously Broadened Spin-Label Spectra. Biological Magnetic Resonance, 8, 77-130

15. Barber J. (1982) Influence of surface charges on thylakoid structure and function.

16. Ann. Rev. Plant. Physiol. 33:261-95

17. Barber J., Chow W.S. (1979) A mechanism for controlling the stacking and unstacking of chloroplast thylakoid membranes. FEBS Lett. 105:5-10.

18. Beard W.A., Chiang G.G., Dilley R.A. (1988) J. Bioenerg. Biomembr. V.20, p.107 128.

19. Beard W.A., Dilley R.A. (1986) A shift in chloroplast energy coupling by KC1 from localized to bulk phase delocalized proton gradients. FEBS Lett. 201:57-62.

20. Beard W.A., Dilley R.A. (1986) Further evidence that KCl-thylakoid isolation induces a localized proton gradient energy coupling to become bulk phase delocalized. 7th Int. Congr. Photosynth.

21. Beard W.A., Dilley R.A. (1988) J. Bionerg. Biomembr. p.129-154.

22. Bellin J.S., Mekander R. & Mahoney R.D. (1973) Photochem. Photobiol V.17, pp.17

23. Bendall D.S., Manasse R.S. (1995) Biochem. Biophys. Acta, 1229, 23.

24. Bennett J. (1983) Biochem. J., V.212, p.1-13.

25. Berg S.P., Lusczakoski D.M., Morse II P.D. (1979) Spin label motion in the internal aqueous compartment of spinach thylakoids. Archives of Biochemistry and Biophysics vol. 194, No. 1, 138-148

26. Berg SP, Nesbitt DM. (1979) Chromium oxalate: a new spin label broadening agent for use with thylakoids. Biochim Biophys Acta. Dec 6;548(3):608-15.

27. Berry S., Rumberg B.(1999) Biochim Biophys. Acta, 1410, 248-261

28. Bjokman O., Holgren P. (1966) Photosynthetic adaptation to light intensity in plants native to shaded and exposed habitats. Phisiol. Plantarum. v. 19. fasc. 4. p. 854 859.

29. Blumenfeld L.A., Tikhonov A.N. (1994) Biophysical thermodinamics of intracellurar processes. Molecular machines of the livbing cells. Springer-Verlag.

30. Boardman N.K. Comparative photosynthesis of sun and shade plants.// Ann. Rev. Plant Physiol. 1977. v. 28. p. 335 377.

31. Boyer P.D. (1974) Conformational coupling in biological energy transduction. In: Dynamics of Energy-Transducing Membranes. Elsevier, Amsterdam, 289-301.

32. Buchanan B.B (1981) Role of light in the regulation of chloroplast enzymes. Ann. Rev. Plant Physiol., 31, 341-374.

33. Dilley R.A. (1971) Coupling og ion and electron transport in chloroplasts. Curr. Top. Bioenerg. 4:237-71

34. Dilley R.A., Screiber U. (1984). J. Bioenerg. Biomembr. p. 173-193.

35. Dilley R.A., Theg S.M., Beard W.A. (1987) Membrane-proton interactions in chloroplasts bioenergetics: Localized proton domains. Ann. Rev. Plant Physiol V.38, p.347-368.

36. Dilley R.A., Vernon L.P. (1965) Ion and water transport processes related to the light-dependent shrinkage of chloroplasts. Arch. Biochem. Biophys. 11:365-75

37. Dmitriev O.Y., Jones P.C., Fillingame R.H. (1999) Structure of the subunit с oligomer in the FiF0 ATP synthase: Model derived from solution structure of the monomer and cross-linking in the native enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 7785-7790.

38. Edwards G., Walker D.A. C3,C4: Mechanisms, and Cellular and Environmental Regulation of Photosynthesis. Blackwell, Oxford.

39. Englander J.J., Downer N.W., Englander S.W. (1982) Reexamination of rhodopsin structure by hydrogen exchange. J. Biol. Chem. 257:7982-86

40. Forster V., Hong Y.-Q., Junge W. (1981) Electron transfer and proton pumping under excitation of dark-adapted chloroplasts with flashes of light. Biochim. Biophys. Acta 638:141-52

41. Fowler C.F., Kok B.(1976) Biochim. Biophys. Acta, 423, 510-523.

42. Goldfeld M.G., Khangulov S.V., Blumenfeld L.A. (1978) Photosynthetica, V. 12, p. 21-34.

43. Graan Т., Ort D.R.(1983) J.Biol. Chem., 258, 2831-2836.

44. Haraux F., de Kouchkovsky Y. (1998) Energy coupling and ATP synthase. Photosynthetic Research 57, 231 -251.

45. He X., Miginiac-Maslow M., Sigalat C., Keryers E., Haraux F. (2000) Mechanism of activation of the chloroplasts ATP synthase., J.Biol. Chem. 275, 13250-13258.

46. Hind G., Nakatani H.Y., Izawa S. (1974) Light-dependent redistribution of ions in suspensions of chloroplast thylakoid membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA71:1484-88

47. Hong Y.Q., Jung W. (1983). // Biochim. Biophys. Acta. V.722.

48. Jagendorf A.T (1977) Photophosphorylation. In: Encyclopedia of Plant Physiology (Trebst A., Avron M., Eds.) Springer-Verlag, Berlin, pp. 307-337.

49. Jagendorf A.T. (1975) Mechanism photophosphorylation. In Bioenergetics of Photosynthesis (Govindjee, Ed.) Acad. Press. N.V. pp. 142-152

50. Junge W. (1977) Physical aspects of light harvesting, electron and electrochhemical generation in photosynthesis of green plants. In:Trebst A. and Avron M. (eds) Encyclopedia of Plant Physiology, 5, 59-93, Springer-Verlag.

51. Keana J.F.W., Acarregui M.J., Boyle S.L.M. (1982) 2,2-disubstituted-4,4-dimethylimidozolidinyl-3-oxy nitroxides indicators of aqueous acidity through variation of aN with pH. J.Am.Chem.Soc., 104, 827-830.

52. Khramtsov V.V., Volodarsky L.B. (1998) Use of imidazoline nitroxides in studies of chemical reactions: ESR measurement of concentration and reactivity of protons, thiols, and nitric oxide. Biol. Mag. Res. 14: 109-180

53. Khramtsov V.V., Weiner L.M. (1988) Proton Transfer Reactions in Free Radicals.Spin pH Probes, in: Russian Chemicals Reviews, 57(9), 824-839, Springer-verlag.

54. Khramtsov V.V., Weiner L.M., Eremenko S.I., Belchenko O.I., Schastnev P.V., Grigor'ev I.A., Reznikov V.A. (1985) Proton exchange in stable nitroxyl radicals of imidazoline and imidazolidine series. J.Magn.Res., 61,397.

55. Khramtsov V.V., Weiner L.M., Grigor'ev I.A., Volodarsky L.B. (1982) Proton exchange in stable nitroxyl radicals. EPR study of the pH of aqueous solutions. Chem. Phys. Lett., 91,69.

56. Kinoshita K., Jr., Yasuda R., Noji H., Ishiwata S„ Yoshida M.( 1998) Fl-ATPase: a rotary motor made of a single molecule. Cell, v.93, pp.21-24.

57. Kobayashi Y., Inoue Y., Shibata K., Heber U. 1979 // Planta, V. 146, p. 481-486.

58. Кок В., Forbush В., McGloin M. (1970) Cooperation of charges in photosynthetic 02 evolution -1. A linear four step mechanism. Photochem. Photobiol. 11:457-75

59. Kramer D.M., Sacksteder C.A. (1998) A diffused-optics flash kinetic spectrometer (DOFS) for measurements of absorbance changes in intact plants in the steady-state. Photosynth. Res. 56, 103-112.

60. Kramer D.M., Sacksteder C.A., Cruz J.A. (1999) How acidic is the lumen? Photosynth. Res., 60, 151-163

61. Laikov D.N. (1997) Chem.Phys.Lett., 281, 151-156

62. Leong T-Y., Anderson J.M. (1984) Adaptation of the thylakoid membranes of pea chloroplasts to light intensities. 1. Study on the distribution of chlorophyll-protein complexes. Photosynthesis Res., v. 5. N 1. p. 105 115.

63. Lichtenthaler H.K. et all (1986). Photosynthetic activity, chloroplast ultrastrukture and leaf charakteristic of higt-light and low-light plants and of sun and shade leavs. Photosynthesis Res. v. 2. N 1. p. 115 -141.

64. Lolkema J.S., Hellingwert K.J, Konigs W.N. (1982) The effect of "probe binding" on the quantitative determination of the proton-motive force in bacteria. Biochim. Biophys. Acta 681:85-94

65. Magnitsky S.G., Masarova M, Tikhonov A.N (1996) Determination of transmembrane pH difference in chloroplasts using the effect of concentrational broadening of tempoamine EPR spectrum. Cur. Topics in Biophys., 20: 25-31

66. McCarty R.E., Evron Y., Johnson E.A. (2000) The chloroplast ATP synthase: a rotary enzyme? Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 51, 83-109.

67. Melis A. (1984) Light regulation of photosynthetic membrane structure, organisation and function. J. Cell Biochem. 24. N 2. p. 271 285.

68. Melis A., Brown J.S. (1980) The stoichiometry of system 1 and 11 reaction centres in differnt photosynthetic membranes. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. v. 77. N 8. p. 4712-4716.

69. Mitchell (1961) Nature. V.191,N 4202 p.144-148.

70. Nesbitt D.M., Berg S.P. (1980) Proton involvement with the light-induced hindrance of spin label motion in the lumen of spinach thylakoids. Biochim. Biophys. Acta 593:353-61

71. Nesbitt D.M., Berg S.P. (1982) The influence of spinach thylakoid lumen volume and membrane proximity on the rotational motion of spin label tempamine.

72. Biochim. Biophys. Acta 679:169-74

73. Nicolay K., Lolkema J., Helingwerf K.J., Kaptein R., Konings W.N. (1981) Quantitative agreement between the values for the light-induced ДрН in Rhodopseudomonas sphaeroides measured with automated flow-dialysis and 31P NMR. FEBS Lett., 123, 319-323.

74. Ogawa S., Shen C., Castillo C.L.A. (1980) NMR study of the cross-membrane pH gradient induced by ATP hydrolysis in mitochondria. Biochim. Biophys. Acta ,590, 159-169

75. Ort D.R., Dilley R.A., Good N.E. (1976) Photophosphorylation as function of illumination time. II. Effects of permeant buffers. Biochim. Biophys. Acta 449:108-24

76. Pedersen P.L. et al. (2000) J. Bioenerg. Biomemb. 32, 325-332.

77. Polia G.M. & Jagendorf A.T. (1969) Light-induced change in the buffer capacity of shpinat chloroplast suspension. Biochem. Biophys. Res. Commun., v36, pp. 696-703.

78. Quintanilha A.T., Mehlhorn R.J. (1978) pH gradient across thylakoid membranes measured with a spin-labeled amine. FEBS. V.91, 104-108

79. Ramanujam P., Bose S. (1983) Correlation between thylakoid stacking and cation-induced decrease in photosystem I electron transport at saturating light intensity. Arch. Biochem. Biophys., 221, 238-242.

80. Roberts J.K.M., Wade-Jardetzky N., Jardetzky O. (1981) Intracellular pH measurements by 31P nuclear magnetic resonance. Influence of factors other than pH on 31P chemical shift. 20, 5389-5394.

81. Robinson B.H., Mailer C., Reese A.W. (1999) Linewidth Analysis of Spin Labels in Liquids. J. of Magnetic Res., 138, 199-219.

82. Rumberg В., Schubert K., Strelow F., Tran-Ahn T. (1990) The H+/ATP coupling ratio at the H+-ATP synthase of spinach chloroplast is four. In: Baltscheffsky M. (ed) Current Research in Photosynthesis. Vol III, 125-128.

83. Rumberg В., Siggel U. (1969) pH changes in the inner phase of the thylakoids during photosynthesis. Naturwissenschaften 56, 130-132.

84. Sacksteder С. A., Kanazawa A., Jacoby M. E., Kramer D. M. (2000) The proton to electron stoichiometry of steady-state photosynthesis in living plants: A proton-pumping Q cycle is continuosly engaged. PNAS, v. 97, no. 26, 14283-14288

85. Seelert H., Poetsch A., Dencher N.A., Engel A., Sthilberg H., Muller D.J. (2000) Proton-powered turbine of a plant motor. Nature 405, 418-419.

86. Skulachev V.P. (1988) Membrane bioenergetics. Springer-Verlag.

87. Stiehl H.H., Witt H.L (1969) Qauntative treatment of the function of plastoquinone in photosynthesis. ZNaturforsh 24b, 1588-1598.

88. Stock D., Leslie A.G.W., Walker J.E. (1999) Science 286, 1700-1705.

89. Theg S.M., Chiang G., Dilley R.A. (1988) Protons in the Thylakoid Membrane-sequestered Domains Can Directly Pass Through the Coupling Factor during ATP Synthesis in Flashing Light. The Journal of Biological Chemistry, v.263, no.2,673-681

90. Tiemann R., Witt H.T. (1982) Salt dependence of the electrical potential at the photosynthetic membrane in steady-state light and its structural consequence. Biochim. Biophys. Acta 681:202-11

91. Tikhonov A.N., Khomutov G.B., Ruuge E.K. (1984) Photobiochem. Photobiophys. V.8, p.261-269.

92. Tikhonov A.N., Khomutov G.B., Ruuge E.K., Blumenfeld L.A. (1981) Biochim. Biophys. Acta. V.637, p.321-333.

93. Walz D., Goldstein L., Avron M. (1974) Determination and analysis of the buffer capacity of isolated chloroplasts in the light and in the dark. Europ. J. Biochem.,, v.47, pp. 403-407.

94. Westerhoff H.V., Melaudri B.A., Venturoli G., Azzone G.F., Kell D.B. (1984) Mosaic protonic coupling hypothesis for free energy transduction. FEBS Lett, 165, 1-5.

95. Williams R.J.P. (1978) The multifarious coupling of energy transduction. Biochim. Biophys. Acta, 505, 1-44.

96. Wille B. (1988) Thylakoid volume, proton translocation and buffering capacity as measured with spin-label techniques. Biochim. Biophys. Acta 936:513-30

97. Zouni A., Witt H.-T., Kern J., Fromme P., Kraufi N., Saenger W., Orth P.(2001) Crystal structure of photosystem II from Synechococcus elongatus at 3.8 A resolution. Nature 409, 739-743.

98. Александров В.Я. (1975) Клетки, макромолекулы и температура. Изд. Наука.

99. Бекина P.M., Карновский А.А. (1968) Хранение изолированных хлоропластов без изменения активности фотофосфорилирования. Биохимия Т.ЗЗ, №1, 178-81

100. Блюменфельд JI.A. (1974) Проблемы биологической физики. М.,Наука.

101. Блюменфельд JI.A., Тихонов А.Н. (1987) Биофизика, , Т. XXXII, вып. 5, С 800-813.

102. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. (1980) Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М., Наука., 320 с.

103. Говинджи. (1987) Фотосинтез. Т. 1,2, М.: Мир,

104. Замараев К.И., Молин Ю.И., Салихов К.М. (1977) Спиновый обмен, изд. «Наука», Новосибирск.

105. Инграм Д. (1961) Электронный парамагнитный резонанс в свободных радикалах. Изд. ин. лит., Москва.

106. Кузнецов А.Н. (1976) Метод спинового зонда. Москва, Наука.

107. Кукушкин А.К., Тихонов А.Н. (1988) Лекции по биофизике фотосинтеза высших растений. Москва, изд. МГУ.

108. Магницкий С.Г. (1993) Исследование трансмембранного градиента рН в хлоропластах методом спиновых меток. Дисс. канд. физ.-мат. наук. Москва, МГУ.

109. Магницкий С.Г., Тихонов А.Н (1998) Определение внутритилакоидного рН в хлоропластах по эффекту обменного уширения спектра ЭПР спиновой метки ТЕМПОамин. Биоф. 43 вып. 1, 69-76

110. Малый практикум по физиологии растений по ред. Гусева М.В., МГУ, Москва, 1982.

111. Масарова М. (1988) Энергетическое сопряжение в хлоропластах при совместном и раздельном функционировании двух фотосистем. Диссертация канд. физ.- мат. наук. Москва.

112. Берлинер J1. ред. (1979) Метод спиновых меток. Теория и применение. Москва, Мир.

113. Рыжиков С.Б., Тихонов А.Н. (1988) Биофизика 33, 642.

114. Скулачев В.П. (1972) Трансформация энергии в биомембранах. М. Наука.

115. Твердислов В.А., Тихонов А.Н., Яковенко J1.B. (1987) «Физические механизмы функционирования биологических мембран», изд-во МГУ.

116. Тимошин А.А. (1984) Механизм регуляции энергетического сопряжения в хлоропластах. Диссертация канд. физ.- мат. наук. Москва.

117. Тихонов А.Н. (1985) Механизмы регуляции электронного и протонного транспорта в энергопреобразующих мембранах хлоропластов. Дисс. докт. физ.-мат. наук. Москва, МГУ.

118. Тихонов А.Н., Блюменфельд JI.A. (1985) Концентрация водородных ионов в субклеточных частицах: физический смысл и методы определения. Биофизика 30, вып. 3, 527-537

119. Тихонов А.Н., Павлова И.Е. (1975) Кинетика фотоиндуцированных окислительно восстановительных превращений в листьях древесных растений, выращенных при различной освещенности.// Физиол. растений, т. 25. вып. 3. с. 477-482.

120. Тихонов А.Н., Рууге Э.К. (1975) Исследование электронного транспорта в фотосинтетических системах методом ЭПР. I Влияние предыстории освещения на кинетику окислительно-восстановительных превращений Р700-Биофизика, XX, вып.6, 1049-1053.

121. Тихонов А.Н., Рууге Э.К., Субчинский В.К., Блюменфельд JI.A. (1975) Исследование кинетики электронного транспорта и хроматических переходов в изолированных хлоропластах методом ЭПР. // Физиология раст., 22, 5-15.

122. Тихонов А.Н., Тимошин А.А. (1985) Электронный транспорт. Перенос протонов и их связь с фотофосфорилированием в хлоропластах. Влияние интенсивности действующего света. Биол. мембраны, Т.2, N 4 С.349-362.

123. Тихонов А.Н., Тимошин А.А., Рууге Э.К., Блюменфельд JI.A. (1982) Поверхностный потенциал тилакоидной мембраны, фотоиндуцированное поглащение протонов и фотофосфорилирование в хлоропластах. Доклад академии наук СССР. Биофизика, Т. 226, N 3.

124. Чугунова Н.Г., Кособрюхов А.А., Карпилова И.Ф., Чермных JT.A. (1983) Газообмен и ростовые процессы у тепличных огурцов при адаптации к световым условиям. С-х. биология. N 6. с. 62 66.

125. Автор выражает глубокую и искреннюю благодарность своему научному руководителю Александру Николаевичу Тихонову за постоянное внимание, терпение, плодотворное обсуждение результатов и неоценимую помощь в работе.

126. Автор благодарит Лейлу Юрьевну Устынюк за проведение квантово-химических расчетов молекулы ТА и Дмитрия Николаевича Лайкова за возможность использования созданной им программы расчетов методом DFT.

127. Автор благодарит А.А. Байкова и В.В. Птушенко за помощь в работе.

128. Автор благодарит Игоря Алексеевича Григорьева за любезно предоставленные спиновые метки.