Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование протонного транспорта в хлоропластах методом спиновых меток

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование протонного транспорта в хлоропластах методом спиновых меток"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА.

« 1

ФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ.

На правах рукописи УДК 621.315:547.814+577.150.87

Магницкий Сергей Геннадиевич

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТОННОГО ТРАНСПОРТА В ХЛОРОПЛАСТАХ МЕТОДОМ СПИНОВЫХ МЕТОК.

03.00.02. - биофизика.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук.

Москва —1996 год.

Работа выполнена на кафедре биофизики физического

факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.

Научный руководитель: доктор физико-математических

наук, профессор А.Н.Тихонов.

Официальные оппоненты: доктор физико-математических

наук Ю.М.Петрусевич; кандидат биологических наук Е.А.Головина.

Ведущая организация: Институт химической физики

им.Н.Н. Семенова РАН.

Защита диссертации состоится "6" июня 1996 г. в часов на заседании диссертационного совета № 3 ОФТТ /К.053.05.77/ в МГУ им.М.В.Ломоносова по адресу: 119899, ГСП, Москва, Воробьевы горы, МГУ, физический факультет, аудитория •

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан '50 сЬу^оаЯ,_1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета № 3 ОФТТ /К.053.05.77/ в МГУ им.М.В. Ломоносова кандидат физико-математических наук

О.А.Котельникова.

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность темы. Одной из важнейших задач современной био-1ки является выяснение механизмов преобразования энергии в расти-ной клетке. В ряду наиболее актуальных проблем биоэнергетики, ение которых имеет первостепенное значение для понимания молеку-шх механизмов преобразования энергии в биологических мембра-является выяснение механизмов регуляции процессов сопряжения тронного и протонного транспорта в хлоропластах — энергопреоб-тощих органеллах растительной клетки. Решение этой задачи имеет )средственное отношение к выяснению фундаментальных принципов кономерностей преобразования энергии. Преобразование энергии в ительной клетке неразрывно связано с процессами электронного и тонного транспорта, происходящих в мембранах тилакоидов. Изуче-путей протонного переноса, сопряженного с реакциями синтеза АТР лакоидах, позволит глубже понять природу энергетического сопря-ля и выяснить механизмы регуляции фотофосфорилирования в хло-тастах.

Цель работы. Настоящая работа имела целью исследование протон) транспорта в хлоропластах класса Б для того, чтобы попытаться тить на вопрос о существовании альтернативных путей миграции гонов, выделяющихся на световых стадиях фотосинтеза, к ТРсинтазному комплексу. Для этого, прежде всего, необходимо бы->азработать и обосновать адекватный метод измерения трансмем-шой разности рН (АрН) в тилакоидах с помощью спиновой метки ШОамин.

Научная новизна работы:

— В работе впервые измерена концентрационная зависимость п метров спектра ЭПР молекул спиновой метки ТЕМПОамин (ТА), л лизованных во внутритилакоидном пространстве хлоропласта. Опр лено значение критической концентрации спиновой метки, находящ! во внутреннем объеме тилакоида, начиная с которой наблюдается фект концентрационного уширения спектра ЭПР молекул ТА.

— Построена полуэмпирическая математическая модель, описываю концентрационную зависимость фотоиндуцированного уширения а тра ЭПР спиновой метки ТА в суспензии хлоропластов, анализ кото позволил найти оптимальные условия для адекватного измерения Ар хлоропластах с помощью ТА.

— Показано, что фотоиндуцированное поглощение ТА хлор о пласта N соотношение между значениями АрН, измеряемыми с помощью Т, условиях фосфорилирования (состояние 3) и в состоянии фотосинтет! ского контроля (состоянии 4), зависят от осмотичности и ионной С] среды инкубации. Полученные результаты свидетельствуют о возм ности гетерогенного распределения АрН в тилакоидной системе хлс пластов.

— Выявлено влияние некоторых физиологических факторов (возрас затенение растений при выращивании) на функционирование электр транспортной цепи нативных хлоропластов в листьях высших растени Практическая ценность. Дано обоснование нового метода измере] трансмембранной разности рН в хлоропластах, применение которого

>ует знания внутритилакоидного объема. Найдены границы и опти-эные условия применения этого метода.

обацня работы: Основные результаты диссертационной работы доены на конференциях: "Структурно-функциональная организация ^синтетических мембран и их моделей", Пущино, 8-11 июня 1993 г.; тЬгапе Вюепе^еисз", Москва, 15-20 декабря, 1995 г.; Ломоносовские ия, физический факультет МГУ им.М.В.Ломоносова, Москва, 1996 г. япкацпп. По материалам диссертационной работы опубликовано 3 тные работы, список которых приведен в конце автореферата. /ктура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзо-итературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуж-й, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 146 стра-IX, включающих 40 рисунков и 8 таблиц. Список литературы состоит 1 наименований.

II. СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ. Во введении показана актуальность темы и кратко изложены основ-направления исследований.

Обзор литературы (Глава 1). состоящий из шести разделов, содер-основные результаты исследований структурной и функциональной низации фотосинтетического аппарата высших растений, а также ание наиболее распространенных методов определения ДрН в хло-астах. Изложены современные представления о строении и локали-и в тилакоидной мембране полиферментных комплексов (ФС1, ФС2, эмплекса, Н+АТРсинтазы), обеспечивающих преобразование энер-:вета. Описаны свойства светособирающей антенны, приведены дан-

ные о первичных процессах фотосинтеза, рассмотрен процесс раздех зарядов в реакционном центре, описаны реакции электронного и тонного транспорта. Приведены данные о характерных временах < ления и восстановления реакционных центров фотосистемы 1, фо_ стемы 2 и элементов электронтранспортной цепи хлоропластов. смотрен состав и строение факторов сопряжения Fo и Fi и механ] синтеза АТР в активном центре Н+АТРсинтазного комплекса. При ны данные об измерении протонного потенциала и гипотезы об ал нативных путях миграции протонов к активному центру Н+АТ1 тазного комплекса. Проанализированы известные методы опредех ДрН в хлоропластах. В заключительном разделе главы 1 сформули] на задача работы.

Вторая глава содержит описание материалов и методов иссле; ния, включая метод выделения хлоропластов класс Б из листьев б< Описана кинетика окислительно-восстановительных превращений ; ционного центра фотосистемы 1 в изолированных хлоропластах, иа зовавшаяся для их тестирований на способность синтезировать Описана кинетика окислительно-восстановительных превращение ционного центра ФС1 в листьях, необходимая для исследования влк физиологических факторов на световые стадии фотосинтеза.

Третья глава посвящена обоснованию метода определения Д помощью спиновой метки ТЕМПОамин. Основу метода составляе ление фотоиндуцированного перераспределения молекул ТА м внешним и внутренним объемами тилакоида в соответствии с велич трансмембранной разности рН. Накопление ТА внутри тилакоида м

вводить к эффекту концентрационного ушир@ния спектра ЭПР. Од-:м из главных достоинств ТА как рН-индикатора является то. что спивая метка, в отличие от других рН-индикаторов, практически не свивается с тилакоидноймембраной.

Спектр ЭПР молекул ТА в водном растворе представляет собой иплет с константой изотропного расщепления а ко = 16,7 Э, характер-[й для нитроксильных радикалов, вращающихся в водной среде со еменем вращательной корреляции тс = 5 -КМ1 с (рис.1, спектр 1). :ектр ТА во внутритилакоидном пространстве мы получали, вычитая гктры ЭПР ТА, растворенного в суспензии хлоропластов, содержащей рамагнитный уширитель хром оксалат (СгОх), из уширенного хром салатом спектра ЭПР ТА, растворенного в среде инкубации хлоро-астов. Разностный сигнал ЭПР (рис.1, спектр 2) представляет собой ш^етричный триплет, характерный для нитроксильных радикалов, ижущихся в полярном окружении. Из рис. 1 (спектр 2), видно, что все нии разностного спектра имеют большую ширину по сравнению с со-зетствующими линиями спектра ЭПР молекул ТА, находящихся во гшней среде. Кроме этого, все три линии разностного сигнала заметно "шчаются друг от друга по амплитуде и ширине. Это может быть обус:-влено замедлением вращения молекул ТА, вследствие повышенной ¡кости "структурированной" воды во внутритилакоидном объеме.

Нельзя, однако, исключить того, что при достаточно высоких кон-зтрациях СгОх форма разностного сигнала ЭПР может частично искаться за счет парамагнитного "уширителя" (например, вследствие, эникновения некоторого количества оксалата хрома во внутритила-

о

Рис.1 Спектры спиновой метки ТЕМПОамин (1мМ). 1 - среда

Рис.2 Зависимость кажущегося времени вращательной корреляции Тс, определенное по форме разностного спектра ЭПР, от концентрации СгОх в суспензии хлоропластов.

ный объем). Действительно, из рис.2 видно, что значение времени 1ательной корреляции тс, формально вычисляемого для разностного гра ЭПР, увеличивается с ростом концентрации СгОх в среде инку-и. Следует отметить, что дополнительное уширение разностного фа, наблюдаемое при возрастании концентрации СгОх в среде ин-ции, обусловлено влиянием "уширителя" на спектр ЭПР молекул ТА ри тилакоидов, но никак не связано с наложением на этот спектр lo уширенного сигнала от ТА во внешней среде (рис.3). Экстраполя-зависимости ширины низкополевой компоненты разностного спек-АНрр, полученного при разных концентрациях СгОх в среде инкуба-

при [СгОх]—> 0 (рис.3) дает величину, не превышающую (ДЯ^ш = 2,0 Э, что лишь незначительно больше ширины низкополевой компо-л спектра ЭПР молекул ТА во внешней среде (ДЯ^ош = 1,8 Э.

Исследование зависимости параметров спектра ЭПР от концентраТА в водном растворе показало, что заметный эффект уширения ра, обусловленный усилением обменного взаимодействия между

лис

оксильными радикалами, накапливающиеся внутри тилакоидов, ен проявляться только тогда, когда концентрация метки внутри эсходит пороговое значение [ТА]Э. Для молекул ТА, находящихся в ; инкубации тилакоидов, ранее была получена величина ([ТА] g)out = iM. Однако^ критическая концентрация для молекул ТА, движу-я внутри тилакоидов ([TA]s)m, может иметь другое значение, чем для о внешней среде (например, вследствие заторможенного вращения

1 . [СгОх], мМ

О -|—I—|—I—I—I—|—I—|—I—|—I—|

О 20 40 60 80 100 120

Рис.3 Зависимость ширины низкополевой компоненты спектра ЭПР ТА от концентрации СгОх. 1 - для ТА в среде инкубации 2 - для разностного сигнала ЭПР.

Рис.4 Зависимость ширины низкополевой компоненты спектра ЭПР ТА от концентрации спиновой метки. 1 - ТА в среде инкубации хлоропластов; 2, 3 - для разностных спектров ЭПР ТА в суспензии хлоропластов, содержащей 20 и 50 мМ СгОх.

1екул метки или другой полярности окружения). Проведенное нами ледование концентрационной зависимости параметров спектра ЭПР I молекул ТА, локализованных внутри тилакоида, показало, что \]э)т=2.5-4,0мМ.

Для количественного определения ДрН по кривой зависимости фо-¡ндуцированного изменения величины сигнала ЭПР от концентрации в среде необходимо было получить ответы на вопросы: какова форма ктральных линий, принадлежащих ТА во внешней среде, и меняется гип спектральных линий при переносе ТА во внутритилакоидное про-анство? Для этого мы провели анализ формы низкополевой компоты СТС спектра ТА, аппроксимируя соответствующие линии функ-ми Лоренца и Гаусса, используя метод линейных анаморфоз. На .5 изображены линейные анаморфозы спектров ТА внутри и снаружи акоида при концентрации метки 1 мМ. Видно, что основной вклад в >му линии спектра, как во внутритилакоидном пространстве, так и в вд инкубации хлоропластов дает гауссова составляющая.

Приведенная на рис.4 — концентрационная зависимость получена в сутствии 20 и 50 мМ СгОх. Как видно из рис.3, при этих концентрах СгОх достаточно сильно уширяет сигнал ЭПР молекул ТА, нахо-щхся снаружи^.и не оказывает сильного побочного влияния на спектр Р молекул ТА внутри тилакоидов ([СгОх] < 20 мМ). Это позволяет ректно вычислить разность спектров ЭПР суспензии, содержащей ропласты, ТА и СгОх, и спектра ЭПР раствора ТА и СгОх. Из рис.4 но, что для молекул ТА, находящихся внутри тилакоидов, заметное фение сигнала ЭПР наблюдается лишь при концентрациях ТА выше

2,5 - 4,0 мМ, что лишь незначительно превышает величину

мМ, полученную ТА в среде инкубации хлоропластов.

Изучение спектров ЭПР ТА в разных условиях позволяет свя

феномен уширения спектра с двумя причинами: 1) уширение, вызваь

•V

спин-спиновым в з аи м о дей ств иум о л екул ТА (концентрационное уш ние), и 2) уширение, связанное с изменением подвижности молекул (неконцентрационное уширение). При достаточно высоких концентр; ях ТА "концентрационное уширение" существенно превосхс "неконцентрационное". Именно это обстоятельство позволяет нам пользовать эффект концентрационного уширения спектра ЭПР определения величины АрН, вычисляемой по формуле:

где [TA]in - концентрация ТА во внутритилакоидном пространс [ТА]0- концентрация ТА во внетилакоидной среде.

Определить концентрацию ТА внутри тилакоидов [TA]in можно, рьируя содержание ТА в суспензии [ТА]о. Для любого значения А можно найти такую концентрацию метки [ТА]0*, при которой конц рация метки внутри тилакоидов равна критической ([ТА]8)Ш. При у' вии [ТА]0 > [ТА]0* концентрация ТА внутри будет превышать порога уровень ([ТА]э)т, в этом случае поглощение ТА тилакоидами будет провождаться заметным уширением сигнала, вследствие эффекта i центрационного уширения спектра.

Величину футоиндуцированного изменения сигнала ЭПР (АА), гистрируемого при фиксированном магнитном поле, настроенном

ггремум неуширенного сигнала ЭПР молекул ТА во внешней среде, |Жно вычислить по формуле:

1 +

ДА = А,

(2)

1 +

е А0 - амплитуда спектра ЭПР ТА до освещения, \> - внутренний объем лакоидов, V - объем внетилакоидной среды, Р(х0) - функция, учиты-ющая изменение амплитуды сигнала ЭПР, вследствие уширения слек-а ЭПР ТА внутри тилакоидов при концентрациях ниже пороговой, у) - функция, учитывающая изменение амплитуды сигнала ЭПР, педствие уширения спектра ЭПР ТА внутри тилакоидов при концент-циях выше пороговой.

Показанный на рис.6 график функции вычисленный из

V

авнения (2) при значениях параметров = —=0,0001 и фЯ= 3, аналоги-

н экспериментальным зависимостям (рис.7). На нем различимы два ин-рвала: интервал медленного роста величины ЛА, соответствующего не-«центрационному уширению, и интервал быстрого роста, соответ-вующего концентрационному уширению. Анализ зависимостей

1-44), полученный для разных значений параметров у = АрН^

»зволил найти условиях эксперимента, при которых определяемый диа-13он АрН^ максимально узок. При значении у = 0,000описанный ме-|Д позволяет достаточно точно определять АрН (АрН =±0,3!* в ШИР°" >м диапазоне его физиологических значений (от 1,5 до 3,5 ед. рН) ис.8).

".Ло. ЧЛи

Рис.5 Линейные анаморфозы низкополевой компоненты спектра ЭПР ТА ([ТА] = 1 мМ). Пустые символы - среда инкубации хлоропластов, темные символы - дифференциальный спектр.

ния спектра ЭПР ТА (ДА) от концентрации спиновой метки вычисленное из уравнения (2). Пунктирные линии соответ-стуют двум способам аппроксимации.

тертая глава посвящена измерению величины АрН в хлоропластах щящихся в различных метаболических и физиологических состояни-помощью метода концентрационного уширения спектра ЭПР спино-метки ТЕМПОамин. Показано, что в состоянии интенсивного фос-илирования (состоянии 3) эффект фотоиндуцированного уширения тра (параметр ЛА) выражен слабее, чем в состоянии фотосинтетиче-о контроля (состоянии 4). Это, очевидно, обусловлено тем, что в 'Виях фосфорилирования хлоропласты поглощают меньшее количе-спиновой метки, чем в состоянии фотосинтетического контроля, внения кинетических кривых, полученных для хлоропластов суспен-)ванных в средах с различным содержанием KCl показало; что^ри-гвие KCl в среде инкубации способствует поглощению большего ко-:ства спиновой метки.

Зависимость величины АрН от концентрации сахарозы в среде ин-;ции хлоропластов^не содержащей KCl, функционирующих в состоя; 3 и 4 растет, достигая АрН = 2,8 - 2,9 при 400 мМ сахарозы в среде /бации. При низкой осмотичности среды инкубации (10 мМ сахаро-значение АрН в метаболических состояниях 3 и 4, составляют АрН = 1,8. Обнаружено, что при высокой осмотичности среды инкубации чина АрН практически одинакова в обоих метаболических состоя;. Этот факт свидетельствует о том, что в хлоропластах имеются ти-1иды, в которых АрН одинаково в состояниях 3 и 4. На рис.9 приведена зависимость величины АрН от концентрации роз(^ среде инкубации хлоропластов в присутствии 100 мМ KCl. видно из рис.9, при высоком осмотическом давлении (400 мМ саха—

0,014 г

0,007 -

0,000

0 20 40 60 80

Рис.7 Экспериментальная зависимость параметра фотоинду-цированного уширения спектра ЭПР ТА (ДА) от концентрации спиновой метки в суспензии хлоропластов.

4,00

3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00

3,50 3,25 3,00 2,75 2,50 2,25 2,00 1,75 1,50

Рис.8 Значения величины ДрН определяемое из графиков функции (2) при двух условиях аппроксимации (у = 0,0001). Первый — параметр модели; второй, третий — два способа апроксимации.

) различий в величинах АрН между 3 и 4 метаболическими состоя-¡и зарегистрировать так<<же не удалось. Напротив, при низком осмо-:ком давлении среды инкубации (10 мМ сахарозы) величины АрН в 3 метаболических состояниях несколько отличались и составили: ^4) = 1,8 ± 0,1 АрН(З) = 1,5 ± 0,1. Полученные результаты можно объ-гь тем, что присутствие 100 мМ КС1 в среде инкубации хлороплас-при низком осмотическом давлении способствует равномерному ределению протонов по всей тилакоидной системе хлоропласта. Для любого состава среды инкубации в условиях фосфорилирова-величина ЛА всегда меньше, чем в состоянии фотосинтетического роля. Величина параметра Л А определяется не только значением но и количеством поглощенных молекул ТА. Тот факт, что в со-ти 3 величина ЛА ниже, чем в состоянии 4, означает, что в условиях юрилирования хлоропласты поглощают меньшее число молекул ТА, з состоянии фотосинтетического контроля. Это, очевидно, обуслов-тем, что в состоянии 3 сильное закисление внутритилакоидного гранства, регистрируемое по эффекту концентрационного уширения гра, происходит для меньшего числа тилакоидов, чем в состоянии 4. )да следует, что в условиях фосфорилирования по крайней мере для деленной части тилакоидов значения АрН в состояниях 3 и 4 могут лчаться. Для гетерогенной системы используемый нами метод дает гния АрН в компартментах с максимальным значением АрН. Два гриментальных факта — совпадение измеренных величин АрН в ме-ггических состояниях 3 и 4, и различия в количестве поглощаемых

3,5 -1 3,0 -2,5 -2,0 -1,5 ~ 1,0

АрН

Концентрация сахарозы, мМ

—1-1-1-1—

0 100 200

—I-1-1-1

300 400

Рис.9 Зависимость величины АрН от концентрации сахарозь в среде инкубации хлоропластов в присутствии 100 мМ КС1 Темные символы - 10"2 мМ М§2+АТР, пустые символы - 4 М£2+АОР.

ДрН(З) * ДрН(4)

ДА

ДрН(З) = АрН (4)

Рис. 10 Схема., илюстрирующая распределение протоншКвтила] дах гарн и межгранных тилакоидах.

1екул ТА, поглощаемых в состояниях 3 и 4, — могут свидетельство-ь о гетерогенности ДрН в хлоропластах. Действительно, в условиях :форилирования утечка протонов наружу из межгранных тилакоидов, орые содержат большую часть Н+АТРсинтазных комплексов, проис-[ит интенсивнее, чем из тилакоидов гран, обедненных содержанием \ТРсинтаз. В том случае, если протонный обмен между гранальными ежгранными тилакоидами ограничен стерическими или кинетически-причинами, латеральная гетерогенность тилакоидов может быть при-юй того, что в условиях интенсивного фосфорилирования значения Л в межгранных тилакоидах будут ниже, чем в тилакоидах гран.

Для объяснения различий в величине трансмембранного градиента в хлоропластах, инкубированных в различных средах, можно вос-1ьзоваться качественной моделью (рис.10). В состоянии 4 концентра-I протонов гранальных и межгранных тилакоидах одинакова. Связа-это с тем, что в 4 состоянии отсутствует быстрая утечка Н+ наружу, этому их концентрация в тилакоидах гран и стромы успевает вырав-гься. В состоянии 3 распределение протонов между тилакоидами гран илакоидами стромы может быть другим. Протоны, поступившие в ти-соиды гран, сравнительно медленно покидают их, в то время как про-1Ы, выделившиеся в тилакоиды стромы, где находится большинство АТРсинтаз, гораздо быстрее покидают внутритилакоидное простран-;о через Н+АТРсинтазу. Поскольку Н+АТРсинтаза расходует протоны шнительно быстро (характерное время срабатывания фермента 2.5 I, ДрН в тилакоидах стромы может быть меньше, чем в тилакоидах

1н.

Угол наклона зависимости ЛА - ЛА([ТА]0) пропорционален ко: честву поглощенной метки, при этом отрезок, отсекаемый от абсциа характеризует значение АрН. Рис.10 схематически демонстрирует р пределение протонов в состояниях 3 и 4 для хлоропластов, инкубиров; ных в среде, содержащей 100 мМ KCl (рис. 1 Оа)^ и в отсутствии 1< (рис. 106), /Цля схемы приведенной на рис. 10а, АрН(З) н ДрН(4). В сост нии 4 количество поглощенного ТА велико (угол q>4 велик). При эт основной вклад в значение АрН вносится протонами, сосредоточенны в многочисленных тилакоидах гран. В состоянии 3 количество пог. щенного ТА меньше (ф 3 < <Р 4 ). Это обусловлено утечкой протонов тилакоидов стромы через Н+АТРсинтазу. При этом более низкое зна ние АрН в тилакоидах стромы маскируется высоким значением АрН счет протонов, аккумулированных в тилакоидах гран, что проявляете виде равенства АрН(З) = ДрН(4).

Рис. 106 соответствует хлоропластам, инкубированным в среде кубции, содержащей KCl. Графики функций А А - AA(fTAJ) пересека абсциссу в разных точках, это означает, что ДрН(3)*АрН(4). В состояв 4 количество поглощенного ТА велико (угол ^ велик). Основной вкла значение АрН(4) вносится протонами, сосредоточенными в многоч ленных тилакоидах гран. В состоянии 3 количество поглощенного

меньше (%<(Ра)- При этом получается, что измеряемое в состоянш значение АрН ниже, чем в состоянии 4. ДрН(З) < ДрН(4). Более низ значение ДрН(З) связано с утечкой протонов через Н+АТРсинтазу, ло лизованную в тилакоидах стромы. Регистрируемое низкое значе]

(3) свидетельствует о падении концентрации протонов во всей тила-;ной системе хлоропласта. Вероятно, в условиях среды, содержащей становится возможным сообщение между тилакоидами вообще и коидами гран и тилакоидами стромы. в частности. Таким образом, в :ах предложенной модели объясняется влияние КС1 как фактора, эбствующего "объединению" внутритилакоидных пространств гран юмы.

Пятая глава работы посвящена изучению особенностей кинетики питкльно-восстановительных превращений реакционного центра системы 1 у двух гибридов огурца. Сортовые различия имеют осо-о большое значение для селекционной работы применительно к ви-выращенныД^в закрытом грунте, где освещенность является лими-ющим фактором. Такими видами являются в первую очередь огурец тт.

Изучено влияние затенения растений при выращивании на кинетику индуцированных превращений Р700 в листьях двух гибридов огур-различающихся по теневыносливости. Показано, что затенение >ев (2—10 дней) вызывает изменение кинетики фотоиндуцированных штельно-восстановительных превращений Р700, которое свидетель-т о наличии адаптационных процессов, затрагивающих функцио-вание электрон-транспортной цепи хлоропластов.

ВЫВОДЫ.

;ледование концентрационной зависимости параметров спектра Р спиновой метки ТЕМПОамин (ТА) показало, что критическая

концентрация метки, начиная с которой наблюдается уширение с тра, составляет величину [гл]'п =2,5-4,0 мМ для молекул ТА, локал ванных во внутритилакоидном пространстве, и величину [7^]" =2,5 для ТА во среде инкубации хлоропластов.

2. Установлено, что форма линии низкополевой компоненты спе} ЭПР спиновой метки ТА, локализованной как в среде инкубации, т; во внутритилакоидном пространстве, является гауссовой в интер! концентрации ТА от 0 до 15 мМ.

3. Построена полуэмпирическая математическая модель, описываю концентрационную зависимость фотоиндуцированного ушире спектра ЭПР спиновой метки ТА в суспензии хлоропластов, по: ляющая оптимизировать условия эксперимента для адекватного и: рения АрН с помощью ТА.

4. Показано, что фотоиндуцированное поглощение ТА хлоропласта*/ соотношение между значениями АрН, измеряемыми с помощью Т условиях фосфорилирования (состояние 3) и в состоянии фотосинт ческого контроля (состояний 4), зависят от осмотичности и ионной лы среды инкубации. Полученные результаты свидетельствуют о ] можности гетерогенного распределения АрН в тилакоидной сист хлоропластов.

5. Показано, что затенение листьев (2-10 дней) вызывает изменение К1 тики фотоиндуцированных окислительно-восстановительных пре! щений Р700, которое свидетельствует о наличии адаптационных про; сов, затрагивающих функционирование электрон-транспортной и хлоропластов.

шительное исследование ДрН у хлоропластов, выделенных из гний разного возраста, показало, что влияние условий инкубации таболического состояния хлоропластов на величину ДрН стано-я четко выраженным у хлоропластов из "зрелых" растений (возраст ше 10 12 дней с момента прорастания).

ПУБЛИКАЦИИ

Павлова, С.Г. Магницкий, А.В. Борисов, Л.А. Паничкин, А.Н. ihob "Кинетика фотоиндуцированных окислительно-восстанови-шх превращений реакционного центра р700 в листьях светолюби-и теневыносливых гибридов огурца. Известия Тимирязевской :кохозяйственной академии, выпуск 3, стр. 136-143, 1994. Магницкий, А.Н.Тихонов "Влияние осмотичности и солевого со-t среды инкубации на генерацию ДрН в хлоропластах. Биофизика, Ю, вып.2.

Tikhonov, S.Magnitsky, M.Masarova and L.A.Blumenfeld "A New oach to Measuring a Transmembrane pH Difference in with the EPR Probes Technique", В сборнике трудов XVI Международной кон-нции "Магнитный резонанс в биологических системах", 1994, цховен, Нидерланды.

gnitsky, М. Massarova, A. Tikhonov "Determination of transmem-; pH difference in chloroplasts using the effect of consentrationa! lening of Tempoamine EPR spectrum", Current Topics in Biophysics, ати.

ООП Физ.ф-та МГУ Зак.70-60-96