Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Промежуточные состояния белковых молекул и получение искусственных белков

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Промежуточные состояния белковых молекул и получение искусственных белков"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БЕЛКА ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В .Л. Э11ГЕЛЬГАРДТА

-Ш—в*-

1 1 ЦП а На правах рукописи

1 1 НОЯ 1УЬ0 УДК 577.21

577.322

ДОЛГИХ ДМИТРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ СОСТОЯНИЯ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ И ПОЛУЧЕНИЕ ИСКУССТВЕННЫХ БЕЛКОВ

Специальность 03.00.03 "Молекулярная биология"

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1996 г.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор А.П.Рысков

член-корреспондент РАН, доктор физико-математических наук, профессор А.Р.Хохлоб

доктор химических наук, профессор В.М.Степанов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Московский государственный университет им. М.ВЛомоносова

Защита состоится " / " л^/^Л,_ 1996 года в // часов

на заседании Диссертационного совей. Д.200.30.01

при Инсгшуге биологии гена РАН

по адресу: 117334, г. Москва, ул. Вавилова 34/5.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117984, г. Москва, ул. Вавилова д.32.

Диссертация в виде научного доклада разослана " // " б-^ГЛ-Х^/, л— 1996 г.

у

Ученый секретарь Диссертацонного совета кандидат фармацевтических наук Л.С.Грабовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Современный уровень знаний о белках, закономерностях, формирования их структуры и функции позволил исследователям перейти от пассивного изучения этих важнейших биологических макромолекул к активному, направленному на практическое применение полученных знаний. Появилась белковая инженерия - отрасль молекулярной биологии, задачей которой является усовершенствование природных белков для нужд человека и создание новых, не существующих в природе белков. Настоящая работа состоит из двух частей, отвечающих пассивному и активному этапу исследования белка. Первая часть посвящена изучению равновесных и кинетических промежуточных структурных состояний белка, позволившему нам выявить новое состояние белковой молекулы - состояние расплавленной глобулы, участвующее во многих биологически важных процессах. Вторая часть, включающая в себя практическое использование полученных знаний, связана с созданием новых белков с заданной структурой и свойствами.

Известно, что структура белка формируется под действием целого ряда взаимодействий, имеющих разную физическую природу и отвечающих различным уровням организации белковых молекул. Водородные связи формируют вторичную структуру белка, гидрофобные силы способствуют компактизации белковой глобулы, электростатические, ван-дер-ваальсовы и другие специфические взаимодействия определяют укладку боковых групп и гонкие детали пространственной структуры. Эти силы по-разному зависят от условий, в которых находится молекула белка, поэтому в определенных условиях возможно существование особых состояний белковой молекулы, соответствующих ослаблению одних взаимодействий, в то время как другие остаются неизменными или даже усиливаются. Такие состояния реализуются в равновесии под действием умеренных денатурирующих воздействий, а также в кинетике сворачивания белка из полностью развернутой цепи, когда на разных этапах сворачивания "включаются", и "выключаются" различные физические взаимодействия, определяющие структуру белка. Поиск и исследование подобных состояний важны для выяснения основных законов структурной организации и фуцкцио1шрования белка, понимания процесса его самоорганизации и, в конечном счете, для применения полученных знаний в белковой инженерии. В то же время к моменту начала нашего . исследования в литературе преобладала точка зрения, что белковые молекулы могуг находиться только в двух стабильных состояниях - нативном, пространственно структур ировги и гом состоянии, отвечающем функционально активному белку, и развернутом, близком к состоянию статистического клубка, без существеных элементов пространствегаюй структуры.

Конструирование новых белков с заданными свойствами является логическим продолжением исследования закономерностей формирования структуры и функции белка. Это не только лучший путь проверки уровня наших знаний о белке, но и практическое их использование с целью создания новых белковых конструкций с полезными свойствами. Первый

искусственный белок (или белок de novo) был создан 8 лет назад и с тех лор исследователи сконструировали несколько десятков искусственных белков. Структура большинства из них повторяла структуры природных белков. Наша работа посвящена получению искусственного белка с новой, не наблюдавшейся в природе структурой, а также введению в него функциональной активности и, таким образом, получению первого биологически активного искусственного белка.

Цель и задачи иследования Целью настоящей работы было: 1) поиск и исследование равновесных и кинетических промежуточных состояний белковых молекул, отличных по своим свойствам как от нативных, так и от полностью развернутых белков; 2) выяснение их роли в процессах, связанных с самоорганизацей и функционированием белков; 3) моделирование промежуточных состояний и получение искусственных белков, которые по своим свойствам соответствуют подобным состояниям; 4) получение и исследование искусственного белка, сконструированного под заданную вторичную и пространственную структуру; 5) получение биологически активного искусственного белка.

На защиту выносятся следующие основные положения и результаты

1. Обнаружено и исследовано новое состояние белковых молекул -состояние расплавленной глобулы, промежуточное по своим свойствам между нативным и полностью развернутым состояниями белка.

2. Выявлены основные свойства состояния расплавлешюй глобулы и предложена его модель, согласно которой это состояние соответствует уменьшению ван-дер-ваалъсовых и других специфических взаимодействий, определяющих уникальную третичную структуру белка и размораживанию мелкомасштабных флуктуаций структуры, в то время как водородные связи главной цепи и гидрофобные взаимодействия в молекуле белка в значительной степени сохранены.

3. Показано, что состояние расплавленной глобулы накапливается в процессе ренатурадш белков, то есть является кинетическим промежуточным состоянием на пути сворачивания белка.

4. Получен искусствешшй белок альбебетин, сконструированный под заданную пространственную структуру, не наблюдавшуюся до сих пор в природных белках.

5. Показано, что альбебетин находится в состоянии, соответствующем состоянию расплавленной глобулы; он обладает близкой к заданной вторичной структурой и компактной и относительно стабильной пространственной структурой, не противоречащей заданной.

6. Разработана эффективная система экспрессии искусственных белков в К со И с использованием техники слитых белков, позволившая получить препаративные количества альбебетина и его модифицироватпых вариантов.

7. На основе альбебетина получен первый искусственный белок, обладающий заданной биологической функцией, который сохраняет основные структурные свойства альбебетина, имеет высокое сродство к рецепторам на поверхности тимоцитов мыши и активирует реакцию бласт-трансформации гимоцитов при концентрациях порядка 1СИ1 М. -

Научная: новизна Все перечисленные выше результаты получены впервые. Обнаружено и исследовано состояние расплавленной глобулы -новое состояние белковых молекул, промежуточное по своим свойствам между нативными и развернутыми белками. Это состояние впервые детально охарактеризовано с помощью целого ряда физических методов, несущих информацию о различных уровнях организации белковых структур. Впервые показана роль состояния расплавленной глобулы в процессе самоорганизации белка. Впервые получены и исследованы искусственные белки с новой, не наблюдаемой в природе архитектурой, также впервые предложено использовать их в качестве носителей отдельных биологических функций природных белков, на основании чего сконструирован и получен первый искусственный белок, обладающий биологической активностью.

Практическая ценность работы Полученные в работе результаты изменяют существующие представления о структуре белка, позволяют значительно приблизиться к пониманию процесса его самоорганизации, вплотную подойти к конструированию новых белков с полезными свойствами. Состояние расплавленной глобулы, впервые описанное нами на примере нескольких белков, в настоящее время обнаружено у многих белков и исследуется в целом ряде лабораторий. Широко обсуждается его роль в таких биологически важных процессах, как взаимодействие вновь синтезируемых белков с шаперонами, транспорт белхов через мембрану, их взаимодействие с лигандами и др., поэтому понимание свойств состояния расплавленной глобулы важно для исследования названных процессов. Полученные автором результаты по конструированию и получению искусственных белков открывают возможность создания искусственных белков с заданной структурой и свойствами, которые могут быть использованы в качестве носителей различных биологических активностей, существенных для решения многих биотехнологических и медицинских задач.

Апробация работы Материалы работы докладывались и обсуждались на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), XVI конференции FEBS (Москва, 1984), симпозиуме "Protein Folding, Structure and Function" (Keystone, USA, 1991), Международном симпозиуме "Biomolecular engineering and bioelectronics" (Москва, 1991), Международной школе-семинаре "Modern problems of physical chemistry of macromolecules" (Пушило, 1991), I международном симпозиуме CAPE "Prediction and experiment. Three-dimensional structure of gomologous proteins" (Braunschweig, Germany, 1991), V конференции Российской Федерации "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1992), симпозиуме "Advances in gene technology: protein engineering and beyond" (Miami, USA, 1993), конференции Международного союза по белковой инженерии "INPEC-93" (Osaka, Japan, 1993), Международной конференции "Molecular genetics in modern biotechnology" (Mallorca, Spain, 1993), Международной конференции памяти академика АА.Баева (Москва, 1996) и других отечесгвешшх и международных конференцих.

Публикации Основные результаты работы отражены в 42 публикациях, в том тесле 20 статьях в отечественных и международных журналах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

СОСТОЯНИЕ РАСПЛАВЛЕННОЙ ГЛОБУЛЫ - НОВОЕ СОСТОЯНИЕ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ

РАВНОВЕСНОЕ ПРОМЕЖУТОЧНОЕ СОСТОЯНИЕ БЕЛКА

Промежуточное состояние белка, названное впоследствии А.Вадой "состоянием расплавленной глобулы" (Ohgushi and Wada, 1983) со ссылкой на нашу оригинальную работу (Dolgikh et al., 1981), было впервые детально исследовало и описано нами на примере трех белков: a-лакгальбуминов человека и коровы и карбоаншдразы В коровы. Так как к моменту начала нашего исследования в литературе преобладала точка зрения, что белковые молекулы могут находиться только в двух стабильных состояниях -нативном, пространственно структурированном, и развернутом, близком к состоянию статистического клубка, отдельные разрозненные дашше по необычным состояниям белка, не укладывающимся в эту схему, оставались без внимания. Поэтому для изменения существовавшей парадигмы необходимы были комплексные исследования новых состояний с помощью целого ряда физических методов, взимно подтверждающих и дополняющих друг друга. В совокупности нами было использовано более 10 различных физических методов, позволивших детально описать состояние расплавленной глобулы и заложить основу для нового представления о свойствах белковых молекул. Так как наиболее детально был исследован первый из белков, в котором было обнаружено состояние расплавленной глобулы, то есть а-лакгальбумин коровы, далее в этом разделе работы в качестве примеров мы будем приводить экспериментальные данные в основном для этого белка (хотя друтие белки также изучались большинством из использованных методов).

В результате исследования трех названных белков мы установили, что под действием относительно слабых денатурирующих агентов (кислые значения рН среды, умеренные концентрации денатурангов, температурные воздействия) эти белки могут переходить в особые формы, обладающие сходными физическими характеристиками, промежуточными между характеристиками нативных и полностью развернутых белков. В общей сложности мы изучили 7 таких промежуточных форм, а именно, кислые формы двух а-лактальбуминов (рН2) и карбоаншдразы В (рНЗ,6), промежуточные по гуашщинхлориду формы а-лактальбумина человека и карбоапгидразы, а также температурно-денатурированные формы а-лактальбуминов. Мы объединили зги промежуточные формы в единое состояние, назвав его флуктуирующим состоянием без уникальной пространственной структуры (Dolgikh et al., 1981). Устоявшийся сейчас термин Вады "расплавленная глобула" более наглядно отражает свойства этого состояния, проявляющиеся экперименталыю, хотя в литературе есть данные, что для некоторых белков подобные состояния могут в той или иной степени обладать и кооперативным температурным плавлением, т.е., строго говоря, не являются полностью "расплавленными".

Одним из самых существенных моментов в описании состояния расплавленной глобулы было установление размеров молекул белка в этом состоянии. Первые данные были получены методом вискозиметрии, позволяющем определить характеристическую вязкость (отражающую эффективный гидродшгамическтг объем молекулы) по времени течения раствора белка через капилляр. Превышение этой величины для трех исследуемых белков в состоянии расплавленной глобулы над соответствующими значениями для натшзных белков составляло не более 30%. Если учесть, что характеристическая вязкость белков при полном разворачивании мочевиной или гуанидингидрохлоридом возрастает обычно в несколько раз или даже на порядок, становится очевидно, что по этому параметру молекула белка в состоянии расплавленной глобулы гораздо ближе к нативньш, чем к развернутым белкам и действительно может быть названа глобулярной.

%Р/С, см3/г

КОНЦЕНТРАЦИЯ, мг/мл

Рис.1. Зависимость удельной вязкости г)5Р/с от концентрации белка для коровьего а-лактальбумина в нативной (— —), развернутой 6М гуанидингидрохлоридом (- - -), "кислой" (рН 2,0; —) и температурно-денатурированной (50 °С, 10 мМ ЭДТА; —) формах.

На рис.1 в качестве примера показаны данные вискозиметрии для коровьего а-лакгальбумина. Необходимо учесть, что молекула этого белка содержит 4 дисульфидные связи, поэтому при его разворачивании

1уанидшггидрохлоридом характеристическая вязкость возрастает всего на 80%, в то время как для карбоангидразы, не имеющей З-Б-связей, она увеличивается в 8 раз. Другой метод, использованный нами для оценки молекулярных размеров белка в состоянии расплавленной глобулы, -диффузное рассеяние рентгеновских лучей. Радиус инерции коровьего а-лакт альбумина в кислой форме, определенный этим методом по кривой рассеяния в области малых углов, составил 1,57 ни, что лишь незначительно превышает соответствующее значение для нативного белка (1,55 нм). Кривые диффузного рентгеновского рассеяния в широкой области углов рассеяния для этих двух форм белка приведены на рис.2а.

log I

р(г), отн. единицы

|Д, нм

8 0 1 2 3 4

Межатомные расстояния, нм

Рис.2, (а) Зависимость логарифма интенсивности рассеяния log I от вектора рассеяния ц и (Ь) функция раслределениямежатомных расстояний р(г) для а-лактальбумина коровы в нативной (-) я кислой (—) формах.

Из рисунка видно, что, хотя эти кривые и не совпадают в деталях, они близки друг к другу и, имеют общую форму, типичную для природных глобулярных белков. Функция радиального распределения межатомных расстояний р(г) в молекуле а-лактальбумина, полученная нами путем Фурье-преобразования кривой рассеяния для белка в кислой форме, оказалась сдвинута в сторону больших расстояний приблизительно на 0,2 нм по сравнению с функцией для нативной формы, что также говорит о высокой компактности состояния расплавленной глобулы (рис.2Ъ).

Для определения молекулярных размеров исследуемых белков мы использовали также седиментацию и поляризовшшую люминесценцию

трштгофановывх остатков; кроме того, в других работах размеры нескольких промежуточных форм оценивались по значению коэффициентов диффузии (Gast et al., 1986; Бычкова и др., 1990) и с помощью гель-хроматографии (Uversky, 1993). Все названные методы подтвердили компактность белковых молекул в состояшш расплавленной глобулы. В целом наши результаты в сочетании с полученными позднее данными других авторов для многих белков позволяют сделать однозначный вывод о том, что белковые молекулы в состоянии расплавленной глобулы весьма компактны, при этом для разных белков увеличение объема по сравнению с нативными формами может варьироваться в пределах от 10-20 до 30-40 процентов.

Для исследования вторичной структуры белков в состоянии расплавленной глобулы мы использовали метод кругового дихроизма, особенно эффективный при определении содержания а-спиральной структуры. Кроме того, кислая форма коровьего а-лактальбумина и карбоангидразы В были исследовала методом инфракрасной спектроскопии. Все промежуточные формы исследуемых белков обнаружили высокое содержание регулярной вторичной структуры, сравшшое с ее содержанием в нативных формах белков. На рис.3 показаны спектры кругового дихроизма в дальней ультрафиолетовой области для кислой и температурно-денатурированной промежуточных форм коровьего а-лактальбумина в

Длина волны (им) Волновое число (см-1)

Рис.3, (а) Спектры кругового дихроизма в дальней ультрафиолетовой области для кислой (— -) и гемпературно-денатурировашгой ( - • —) промежуточных форм коровьего а-лактальбумина в сравнении с нативной

(-) и развер1гутой 6 М гуанидшггидрохлоридом (--) формами; (Ь)

инфракрасные спектры кислой (---) и нативной (-) форм белка.

сравнении с нативной и развернутой 6 М гусиншшгидрохл оридом формами, а также инфракрасные спектры кислой и нативной форм белка. Из рисунка видно, что промежуточные формы обладают значительной регулярной вторичной структурой, причем для кислых форм обоих а-лакгальбуминов и карбоашидразьг разложение спектров на реперные дает содержание а- и р-структуры, особенно близкое к их содержанию в нативных белках. Так, по данным кругового дихроизма, содержание а-сггиралей и р-струкгуры в молекуле коровьего а-лактальбумина составило 31% и 18% в кислой форме против соответственно 33% и 22% в нативной форме. Различия в инфракрасных спектрах этих форм белка (рис.ЗЬ) также соответствуют изменению регулярной вторичной структуры не более чем на несколько процентов. Сходный результат был получен из анализа инфракрасных спектров карбоангадразы, являющейся р-струкгурпым белком: 39% р-структуры в нативной форме и 37% - в кислой. Другие белки, описанные к настоящему времени в литературе, могут показывать в состоянии расплавленной глобулы заметно меньшее содержание регулярной структуры по сравнению с их нативными формами, тем не менее по этому параметру все они в состоянии расплавленной глобулы более похожи на нативные, чем на полностью развернутые белки.

По ряду других физических параметров состояние расплавленной глобулы весьма близко к полностью развернутому состоянию. Это обстоятельство препятствовало исследователям распознать его как особое отдельное состояние белковых молекул. Так, спектры кругового дихроизма в ближней ультрафиолетовой области, отражающие степень асимметрии среднего окружения ароматических боковых групп, для белков в состоянии расплавленной глобулы намного менее выражены, чем в нативном С0СТ0Я1ШИ. На рис.4 в качестве примера приведены спектры кислой и температурно-денатурированной форм коровьего а-лактальбумина в сравнении со спектрами нативной и полностью развернутой форм. Именно близость спектров кислой и развернутой форм коровьего а-лактальбумина была одним из аргументов, которые привели Куваджиму (Кхго^щш, 1977) к выводу, что молекула этого белка в кислой форме также развернута (или, по крайней мере, сильно увеличена).

Отсутствие выражешшх спектров в ближней ультрафиолетовой области действительно может быть интерпретировано как отсутствие внуфимолекулярных контактов вблизи ароматических групп в развернутой молекуле белка. Однако оно может быть интерпретировано и по-другому, а именно, как результат усреднения по времени или ансамблю молекул окружения ароматических групп при наличии таких внутримолекулярных контактов. Для выяснения этого вопроса мы использовали метод поляризованной люминесции триптофановых остатков, позволяющий оценить времена релаксации движений остатков триптофана (которые вносят основной вклад в спектр кругового дихроизма в ближней ультрафиолетовой области). В результате были получены средние времена релаксации для нативной и кислой форм белка, которые составили соответственно 19 и 16 не. В то же время среднее время релаксации для развернутой 8 М мочевиной формы белка составило 8 не. Сравнение этих

величин показывает, что движение остатков триптофана в кислой форме белка весьма ограничено по сравнению с их движением в полностью развернутом белке. Такой же результат был получен и для промежуточных форм человеческого а-лактальбумина. Это означает, что слабый спектр кругового дихроизма в ближней ультрафиолетовой области в данном случае объясняется не отсутствием внутримолекулярных контактов, а усреднением окружешы ароматических групп.

[0] (град х см2/дмоль)

Длина волны (им)

Рис.4. Спектры кругового дихроизма в ближней ультрафиолетовой области для кислой (- - -) и темперагурно-денатурированной (— • —) промежуточных форм коровьего а-лактальбумина в сравнении с нагивной (-) и развернутой 6 М гуанидингидрохлоридом (--) формами.

Другой характеристикой, по которой состояние расплавленной глобулы весьма близко к полностью развернутому состоянию, является спектр ядерного магнитного резонанса. На рис.5 приведены спектры кислой и темперагурно-денатурированной промежуточных форм коровьего а-лакгальбумина в сравнении со спектром нативной формы белка. Из рисунка видно, что спектры обеих промежуточных форм утратили часть специфических резонансов, в частности, все резонансы в районе между -0,7 м.д. II +0,8 м.д., которые происходят в результате сдвига резонансов алифатических боковых групп под влиянием кольцевых токов соседних ароматических групп. Также утрачены резонансы в районе 5,0 м.д. - 6,5 м.д., которые соответствуют обычно протонам ароматических колец и части Са-протонов. Это означает, что многие боковые группы утратили свое специфическое нативное окружение в кислой и температурно-

денатурированной формах. Тем не менее спектры ЯМР сохраняют некоторые особенности, отличающие их от спектров полностью развернутых белков (более широкие линии спектра, наличие нескольких отдельных резонансов в районе 8,5 м.д. в спектре кислой формы и др.).

Рис.5. Спектр ядерного магнитного резонанса коровьего а-лактальбумина в кислой (А) и температурно-денатурированной (Т) формах. Для сравнении приведен спектр нативной (14) формы белка.

Кислые формы коровьего а-лактальбумина и карбоангидразы В были исследованы с помощью метода водородно-дейтериевого обмена, который позволяет оценить динамическую доступность для растворителя пептидных групп белка. На рис.6 показаны кинетические кривые дейтерообмена для коровьего а-лактальбумина, полученные с помощью метода инфракрасной спектроскопии по соотношению интенсивности полос поглощения Амид I и Амид II. Для сравнения на рисунке приведена соответствующая кривая для окисленной рибонуклеазы, которая характеризуется высокой скоростью дейтерообмена и используется в качестве модели обмена в полностью доступных растворителю пептидных группах. Из рисунка видно, что на начальной стадии реакции скорость обмена в нативном а-лакгальбумине заметно превышает скорость обмена в кислой форме белка. Это соответствует обмену в экспонированных растворителю пептидных группах, который зависит от значения рН среды и приоисходит гораздо быстрее при нативных значениях рН, чем при кислых. Однако при больших временах реакции, соответствующих обмену в неполностью доступных растворителю группах, скорость обмена в кислой форме белка выше, чем в нативной и, как видно из рис.6, за 7 часов успевает обменяться более 80% протонов ИН-

и

групп в кислой форме, в то время как для нативного белка половина таких кротонов остается необменявшейся. Это означает, что в молекуле кислой формы а-лакгальбумина динамическая доступность неполностью экспонированных 1ЧН-групп, а следовательно, подвижность локальных участков молекулы, значительно выше, чем в нативной форме, хотя все же заметно ниже, чем в окисленной рибонуклеазе. Подобный результат был получен и для кислой формы карбоангидразы В. Имеющиеся сейчас в литературе более детальные исследовашш доступности различных МП-групп белков, полученные с помощью двухмерного ЯМР в сочетании с дейтерообменом, показывают, что относительно медленно обменивающиеся в состоянии расплавленной глобулы N11-группы сильно защищены от обмена и в нативиом состоянии. Такие данные получены для а-лакгальбумина (С1гуап е1 а1., 1993), щггохрома с (\Уи ег а1., 1993), апомиоглобина (Ни§11Хоп й а!., 1990). Это позволяет предположить, что в расплавленной глобуле сохраняются элементы пространственной организации нативных белков.

Время (мин)

Рис.6. Зависимость доли необменявшихся в процессе дейтерообмена ИН-групп Х1 от времени для коровьего а-лз. кг альбумина в кислой (МД) и нативной (+++) формах. Для сравнении приведена также кривая для окислетпгой рибопуклеазы А (ххх).

Как уже говорилось, термин "расплавленная глобула" был предложен А.Вадой в качестве названия описашгого нами нового состояния белковых молекул. Из самого термина следует, что молекулы белка в этом состоянии расплавлены, то есть, в отличие от нативного состояния, не обладают кооперативным температурным плавлением. Если для нативных белков зависимость парциальной удельной теплоемкости от температуры имеет характерные пики плавления, то для белков в состоянии расплавленной глобулы, напротив, получаются пологие гладкие кривые. На рис.7 приведены кривые плавления коровьего а-лактальбумина в кислой форме в сравнении с кривыми плавления этого белка в нативной и бескальциевой формах. Из рисунка видно, что нативная форма а-лакгальбумина имеет пик плавления при 65 °С, причем калориметрическая теплота плавления, определяемая по площади под пиком, равна Вант-Гоффовской, определяемой по ширине перехода.

СР (ДжхНхК-!)

20 40 60 80

Температура ( °С )

Рис.7. Зависимость парциальной удельной теплоемкости Ср от

температуры для коровьего а-лакгальбумина в наишпой (—), кислой (--)

и бескальциевой (в присутствии 10 мМ ЕДТА; - - •) формах .

Это говорит о том, что коровий а-лактальбумин в нативной форме, подобно другим небольшим белкам, плавится по принципу "все или ничего" (Рпуа1оу, 1979). В то же время кривая для кислой формы не имеет никаких признаков кооперативного температурного плавления. Такой же результат был получен для всех промежуточных форм человеческого а-лакгальбумина

и для основной части молекулы карбоангидразы в кислой форме.

Отсутствие кооперативного температурного плавления кислых форм исследуемых белков позволило нам предположить, что они уже "расплавлены", то есть термодинамически эквивалентны температурно-денатурировашшм формам. Это побудило нас к изучению также и других свойств последних с целью выяснить, насколько они близки к другим промежуточным формам с точки зрешга их структуры. При этом мы воспользовались тем фактом, что а-лактальбумины являются Са-связывакшпши белками и удаление Са приводит к значительному снижению температуры плавления, как показано на рис.7. Это позволило нам измерить характеристическую вязкость температурно-денатурированой формы коровьего а-лактальбумина в присутствии 10 мМ ЭДТА при 50 °С (см. рис.7), а не при 80 °С, что трудно технически. Значение вязкости соствило 3,0 + 0,5 см3/г, то есть практически совпало с соответствующими величинами для кислой и нативной форм белка (см. рис.1). В то же время характеристическая вязкость развернутого 6 М гуанидинхлоридом белка при 50 °С равна 7+1 см3/г. Это означает, что молекулы белка в температурно-денатурированной форме практически так же компактны, как в кислой и нативной формах и гораздо более компактны, чем в развернутой форме. Мы исследовали также спектры кругового дихроизма и ядерного магнитного резонанса температурно-денатурированной формы (см. рис.3-5) и выяснили, что и по этим параметрам она сходна с другими промежуточными формами белка. Иными словами, по основным характеристикам температурно-денатурованная форма принадлежит к тому же типу промежуточного состояния белка, что и остальные промежуточные формы.

Таким образом, в результате исследования рада промежуточных форм трех белков мы пришли к выводу, что все эти формы имеют выраженные сходные собенности, позволяющие отнести их к одному типу состояния белковых молекул, то есть к состоянию расплавленной глобулы. Анализ этого состояния с помощью многих физических методов, взаимно дополняющих друг друга, еыявил его основные свойства, которые вкратце суммированы ниже. Часть этих свойств характерна для нативных белков, по другим свойствам состояние расплавленной глобулы похоже на полностью развернутые белки. Молекула белка в этом состоянии весьма компактна, порой почти так же, как и в нативном состоянии и имеет выраженную вторичную структуру, также часто похожую на нативную. В то же время она не плавится кооперативно при нагревании и обладает спектрами кругового дихроизма в ближней ультрафиолетовой области, спектрами ЯМР и кинетикой дейтерообмена, близкими с соответствующим характеристикам развернутых белков.

Для понимания природы состояния расплавленной глобулы важно, что оно может быть получено из нативного путем кооперативного температурного плавления - фазового перехода первого рода. Это озачает, что оно обладает значительно большей энтальпией и энтропией, чем нативное состояние, то есть резким ослаблением внутримолекулярных взаимодействий и и резким увеличением внутримолекулярной подвижности. Так как большинство внутренних степеней свободы в белке связано с

мелкомасштабными флуктуациями структуры, прежде всего с движениями боковых групп, именно раскрепощение таких флукгуаций может делать состояние расплавленной глобулы термодинамически выгодным в соответствующих условиях. При этом молекула белка теряет значительную часть специфических внутримолекулярных взаимодействий, таких как Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия, солевые мостики и др. Эти взаимодействия сильно зависят от расстояния и даже небольшого увеличения размеров молекулы может быль достаточно для их значительного ослабления.

На основании этого рассмотрения была предложена модель состояния расплавленной глобулы, согласно которой оно отличается от нативного некоторым .увеличением размеров молекулы, приводящему к резкому ослаблению короткодействующих сил внутримолекулярного притяжения и существенному увеличению флукгуаций структуры белка. Увеличение флуктуации затрагивает прежде всего мелкомасштабные колебания боковых ipymi и главной цепи, но может включать и более крупномасштабные движения, например небольшие смещения блоков регулярной вторичной структуры или перестройки неупорядоченных участков. При этом неспецифияеские гидрофобные взаимодействия внутри молекулы белка в значительной степени сохранены, хотя белок и обладает увеличенной гидрофобной поверхностью как было показано с помощью специфических гидрофобных проб (Semisotnov et al., 1991). Эта модель была предложена в наших первых работах (Dolgikh et al., 1981, 1985) и в настоящее время она получила подтверждение в работах многих исследователей. Сейчас состояние расплавленной глобулы описано для десятков белков и их число продолжает быстро расти (Ptitsyn, 1995). И если в начале нашего исследования оно представлялось скорее исключением, чем правилом, то теперь есть все основания предполагать, что подбором соответствующих экспериментальных условий это состояние может быть найдено в большинстве, если не во всех белках.

В настоящее время в литературе нет однозначных дашгых, сохраняет ли молекула белка в состоянии расплавленной глобулы близкую к нативной топологию, то есть взаимное расположение элементов регулярной структуры. Прямая информация об этом может быть прямо получена только методом ЯМР (так как кристаллизация белка в состоянии расплавленной глобулы для рентгеноструктурного анлиза вряд ли возможна в силу значительной внутримолекулярной подвижности). Мы уже упоминали данные по анализу неполностью доступных дейтерообмену NH-групп с использованием двухмерного ЯМР для миоглобина и цитохрома с; кроме того, есть результаты ЯМР-исследования модифицированного инсулина, который сохраняет в состоянии расплавленной глобулы нативное расположение а-спиралей и ^-структуры (Hua et al., 1992, 1993). Помимо этого, имеются результаты по окислению в состоянии расплавленной глобулы восстановленных SH-групп (Peng and Kim, 1994), показывающие, что "нативные" S-S-связи завязываются намного эффективнее "ненативных". Однако необходимо отметить, что тем же методом получались и противоположные результаты (Ewbaak and Creighton, 1991), поэтому в целом этот вопрос, видимо, еще остается открытым.

В заключение этого раздела отметим, что недавно были получены доказательства, что состояние расплавленной глобулы отделено не только ог нативного, но и от полностью развернутого состояния белка переходом по принципу "все или ничего" (Ptitsyn and Uversky, 1994). Это означает, что оно является, наряду с нативным и полностью развернутым состояниями, третьим термодинамическим состоянием молекулы белка (а не "поджатым клубком", как предполагалось в некоторых работах), то есть использование термина "состояние" оправдано не только со структурной, но и с термодинамической точки зрения.

РОЛЬ СОСТОЯНИЯ РАСПЛАВЛЕННОЙ ГЛОБУЛЫ В

САМООРГАНИЗАЦИИ БЕЛКА И ДРУГИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ

СОСТОЯНИЕ РАСПЛАВЛЕННОЙ ГЛОБУЛЫ КАК КИНЕТИЧЕСКОЕ ПРОМЕЖУТОЧНОЕ СОСТОЯНИЕ НА ПУТИ СВОРАЧИВАНИЯ БЕЛКА

Существенная общность состояния расплавлешюй глобулы, предполагаемая в наших первых работах и практически доказанная в настоящее время, подразумевает роль этого состояния в различных физических и биологических процессах. Прежде всего рассмотрим его значение в механизме самоорганизации белка. В 1973 г. О.Б.Птицыным был предложен стадийный механизм сворачивашгя белка (Птицьгн, 1973). Согласно этому механизму в процессе сворачивания из развернутого состоятпш в нативнуго фупкционалыгую структуру молекула белка проходит через, по крайней мере, два отдельных промежуточных состояния: первое, обладающее элементами вторичной структуры, флуктуирующими около их "нативпых" положений; и второе, с более стабильной вторичной структурой и близкой к нативной пространственной укладкой. Нетрудно видеть, что состояние расплавленной глобулы похоже на второе из этих кинетических промежуточных состояний. Чтобы выяснить, наблюдается ли состояние расплавленной глобулы в кинетике сворачивания белка, мы исследовали процесс ренатурации карбоангидразы В из 5,45 М гуашшиггидрохлорида. В этих условиях молекула карбоангидразы является полностью развернутой. Из литературы было известно, что этот белок обладает медленной кинетикой ренатурации и поэтому может быть удобной моделью для исследования процесса сворачивания белков.

На рис.8 показаны кинетические кривые ренатурации карбоангидразы В, полученные по изменению эллиптичности при 222 нм и 270 нм, приведенной вязкости и эстеразной активности. Из рисунка видно, что "нативные" значения приведенной вязкости и эллиптичности при 222 нм восстанавливаются в процессе ренатурации значительно быстрее, чем два других параметра. Это говорит о существовании по крайней мере одного кинетического промежуточного состояния, которое накапливается во время сворачивания и отличается как от начального полностью развернутого состояния, так и ог конечного нативного. Это промежуточное состояние обладает компактностью и вторичной структурой, близкими к таковым для

нативного белка, однако не имеет эстеразной активности и уникального нативного окружения ароматических боковых групп. Таким образом, по своим структурным характеристикам оно соответствует равновесному состоянию расплавленной глобулы.

Мы исследовали также кинетику перехода карбоангидразы В из состояния расплавленной глобулы (наблюдаемого при 1,97 М гуанидингадрохлорида) в нативное состояние (0,97 М гуанидштидрохдорвда). Так как значения приведенной вязкости и эллиптичности при 222 нм близки для этих двух состояний, кинетика перехода изучалась только по эллиптичности при 270 нм и эстеразной активности. Выяснилось, что эти кинетические кривые практически совпадают с соответствующими кривыми для перехода из развернутого состояния в нативное (рис.8), что говорит о близости соответствующих акшвациошшх барьеров.

Время (мин)

Рис.8. Кинетика восстановления "степени нативносги" в процессе ренатурации карбоангидразы В из полностью развернутого состояния (5,45 М 1уапидинпвдрохдорида) в нативное (0,97 М гуашгдшггидрохдоряда) по различным параметрам: приведышой вязкости (+++), энзиматической активности (ооо), эллиптичности при 222 нм (-) и 270 нм (-).

В тоже время переход из развернутого состояния в состояние расплавленной глобулы, исследованный нами по эллиптичности при 222 нм, происходит за мертвое время эксперимента. Сопоставление данных по кинетике переходов между тремя состояниями (развернутым, расплавленной глобулой и нативным) позволило нам сделать вывод, что состояние расплавленной глобулы является кинетическим промежуточным состоянием

ira пути сворачивания белка. Позднее этот вывод был подтвержден для ряда белков с помощью различных физических методов, прежде всего, дейгерообмена в сочетании с ЯМР. В настоящее время имеются убедительные данные о том, что кинетическое промежуточное состояние апомиоглобина имеет те же защищенные от обмена NH-группы, что и равновесное состояние расплавленной глобулы в этом белке (Jennings and Wright, 1993), сходные результаты получены для цитохрома с, барназы, стафилококковой нуклеазы и других белков (Baldwin, 1993; Roder and Eloeve, 1994).

Интересно отметить, что за последнее время в связи с ростом экспериментальных возможностей исследования быстрых процессов в кинетике сворачивания белков было обнаружено и другое промежуточное состоятге, предсказанное в работе (Птицын, 1973). Это первое промежуточное состояние на пути сворачивания, более развернутое, чем расплаалештя глобула и содержащее флуктуирующие зародыши элементов вторичной структуры. А недавно близкое состояние - "частично свернутое состоят«; белковой молекулы" - было обнаружено и в равновесных исследованиях (Uvcrsky and Ptitsyn, 1994).

РОЛЬ СОСТОЯНИЯ РАСПЛАВЛЕННОЙ ГЛОБУЛЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ.

Состояние расплавленной глобулы впервые было описано нами для 7 промежуточных форм трех белков. Это позволило нам предположить, что оно может иметь общее значение в различных биологически важных процессах и, в частности, показать роль этого состояния в самоорганизации белка. В настоящее время, когда оно описано для десятков белков и является уже не исключением, а скорее правилом, есть много свидетельств, подтверждающих важное значите состояния расплавленной глобулы в биологических процессах. Так, непосредственно связаными с состоянием расплавлешюй глобулы оказались многие вопросы белковой инженерии, в частности, конструирование белков с заданной структурой и свойствами, которому посвящена основная часть этой диссертации. В этом разделе мы остановимся на тех моментах, которые предполагались нами в самом начале нашего исследования, а также вкратце осветим современное состояние этой проблемы.

Существенно, что состояние расплавленной глобулы может быть получено при весьма умеренных денатурирующих воздействиях, в некоторых случаях достаточно близких к физиологическим. Так, в человеческом ос-лактальбумине оно достщается при комнатных температурах при удалении иона кальция. Это позволило нам предположить участие состояния расплавленной глобулы в различных процессах, связанных с взаимодействием белков с лигандами, когда необходимо высокоспецифическое, но не очень сильное связывание а также повышенная гибкость для подстройки к лиганду. Недавно было показано (Bychkova et al., 1992), что регинол-связывающий белок освобождается от ретинола при низких значениях рН среды и при этом переходит в состояние

расплавленной глобулы. И хотя величина рН этого перехода довольно низка (полупереход при 4,5), локальное значение рН около мембраны, где функционирует ретинол-связывающсий белок, может достигать такой величины. Это позволило авторам обоснованно предположить, что именно такой механизм его функционирования реализуется in vivo. Взаимодействие белков с мембранами и трансмембранный транспорт также, по-видимому, включает их функционирование в состоянии расплавленной глобулы. Это было экспериментально показано для домена колицина A (Van der Goot et al. 1991), предшественника дегидрофолатредукгазы, некоторых токсинов и другах белков. Обзор этих результатов дан в работе (Bychkova and Ptitsyn, 1993). Там же можно найти много аргументов в пользу роли состояния расплавленной глобулы и в других физиологических процессах, таких как деградация белков, сборка рибосом, нуклеосом и других сложных клеточных структур и т.д. Мы не будем останавливаться на этих работах, упомянем только такие важные моменты, как сборка белков in vivo и взаимодействие с шаперонами, а также значение состояния расплавленной глобулы в некоторых заболеваниях, связанных с мутациями белков.

Экспериментальные исследования самоорганизации белка долгое время были связаны только с изучением процесса его ренатурации in vitro, тогда как сворачивание белка in vivo оставалось неисследованным. В то же время простое сопоставление времени биосинтеза белков (~10 с) с временем формирования нативной функциональной структуры (~103 с) и расплавленной глобулы (доли секунды) позволяло предположить, что после биосинтеза in vivo белок находится в клетке именно в состоянии расплавленной глобулы. При этом он, очевидно, должен быть защищен от клеточных протеаз, расщепляющих белки в этом состоянии гораздо более эффективно, чем в нативном (Merril et al., 1990). Открытие белков-шаперонов и исследование их связывания с вновь синтезированными белками пролило свег на эту проблему. Было показано, что белш распознаются шаперонами в состоянии, похожем на состояние расплавленнной глобулы (Martin et al., 1991), и связывание с шаперонами защищает их от неправильного сворачивания, агрегации и деградации. В последнее время этот вывод подтвержден в целом ряде работ, посвященных исследованию взаимодействия шаперонов с белками, анализ которых можно найти, например, в недавнем обзоре (Ptitsyn, 1995).

Все перечисленные выше данные показывают, что состояние расплавленной глобулы действительно функционально и его исследование имеет практическое значение. Особенно наглядно это следует из того, что с ним связаны, по-видимому, некоторые генетические заболевания, например, муковисцидоз, когда точечная мугация переводит белок (трансмембранный регулятор проводимости) в состояние расплавлешюй глобулы и это приводит к его деградации (Yang et al., 1993). Подобный механизм заболевания предполагается и для эмфиземы, гиперхолестеролемии и некоторых других болезней (Bychkova and Ptitsyn, 1995). Понимание свойств состояния расплавленной глобулы, очевидно, может бьггь весьма важно для борьбы с этими болезнями.

МОДЕЛИРОВАНИЕ СОСТОЯНИЯ РАСПЛАВЛЕННОЙ ГЛОБУЛЫ И ПОЛУЧЕНИЕ ИСКУССТВЕННЫХ БЕЛКОВ

ИСКУССТВЕННЫЕ БЕЛКИ КАК МОДЕЛЬ СОСТОЯНИЯ РАСПЛАВЛЕННОЙ ГЛОБУЛЫ

Исследование свойств белковых молекул и, в частности, промежуточных состояний белка необходимо не только для понимания механизма его функционирования. Оно является теоретической базой для целого научного направления - белковой инженерии, задача которой заключается в практическом использовании наших знаний о белках. Переход от пассивной формы исследования к активной, включающей в себя моделирование и изменение природных и создание новых, не имеющихся в природе о&ьекгов, является закономерностью развития многих отраслей науки. И хотя мы не можем пока сказать, что изучены все законы формирования белковых структур, необходимые для белковой инженерии, существующий уровень знаний позволяет этому направлешпо успешно развиваться уже сейчас. Стало реальностью улучшение свойств природных белков для нужд биотехнологии, например, увеличение термостабилыюсти или изменение эффективности работы и специфичности ферментов. Но пожалуй, наиболее ярко возможности белковой инженерии проявляются в конструировании искусственных белков, приводящем к получению абсолютно новых белковых конструкций с заданными свойствами. Это направление, которому посвящена основная часть настоящей диссертации, пока еще делает первые шаги .и порой можно услышать, что изучайте природных белков позволяет получит?» те же или даже большие результаты с меньшими затратами. Например, новые или лучше функционирующие белки могут быть получены эволюционно, с помощью направленного селекционного давления или путем модификации природных белков, принципы сворачивания белков можно лучше понять, исследуя белки с хорошо известными пространственными структурами, а мутации природных белков позволяют получать детальную информацию о структурно-функциональных отношениях в белках. По-видимому, эти возражения отчасти справедливы. Чем же объясняется интерес исследователей к получению искусственных белков? Приведем мнение одного из пионеров белковой инженерии Криса Зандера: "Основной ответ исходит из человеческого желания понять принципы природных процессов не только пассивным, но и активным путем... Чем лучше мы спланируем новые эксперименты и предскажем их результаты, тем более обширны будут наши знания. Кроме того, возможность создания новых белков, исходя только из основных принципов, может открыть широкую область возможных технологий и применений, лежащих за пределами природной эволюции" (Sander, 1994). Мы можем добавить лишь, что стремление к активному пути исследования заложено, видимо, в самой природе человеческого познания: не только изучать и модифицировать уже созданное, но и создавать заново, проверяя и применяя на практике полученные знания.

Достигнутое в настоящее время понимание принципов структурной организации белков позволяет довольно успешно предсказывать вторичную

структуру белка на основании его известной первичной структуры. Предсказание третичной структуры белка пока еще представляет достаточно трудную задачу. Максимум достигнутый сейчас исследователями -определение нескольких наиболее вероятных пространствешшх структур, среди которых, как правило, находится и истинная. При этом под пространственной структурой мы понимаем не детальную тонкую структуру белка (аналог, скажем, данных рентгеноструктурного анализа высокого разрешения), а скорее, общую топологию белковой молекулы. Детальная же структура белка определяется множеством специфических внутримолекулярных взаимодействий, таких как солевые мостики, ван-дер-ваальсовы взаимодействия и др., которые очень трудно учесть при предсказании. Нетрудно видеть, что предсказание общей структуры белка, включающей вторичную структуру и общую топологию без учета тонких специфических взаимодействий является не чем иным, как предсказанием структуры в состоянии расплавленной глобулы, в которой "выключены" именно тонкие взаимодействия. А так как задача конструирования белков с заданной структурой эквивалентна, по сути, обратной задаче предсказания пространственной структуры белка по его первичной структуре, конструирование искусственных белков фактически является Аюделированием состояния расплавленной глобулы. Неудивительно поэтому, что практически все полученные до настоящего времени искусственные белки находятся в состоянии расплавленной глобулы. Это может восприниматься как проблема, которую надо преодолевать, пытаясь рассчитать специфические ваимодействия в процессе моделирования или вводя такие взаимодействия (например, S-S связи) в структуру эмпирическим путем методом проб и ошибок. Однако, если учесть, что состояние расплавленной глобулы имеет немало биологических проявлений, в некоторых случаях эта проблема может из недостатка превратиться в преимущество, как будет показано ниже.

АЯЬБЕБЕТИН - ИСКУССТВЕННЫЙ БЕЛОК С ЗАДАННОЙ СТРУКТУРОЙ.

К настоящему времени методами белковой инженерии сконструировано несколько десятков структур белков de novo, причем гены части из них были синтезированы химически и их удалось экспрессировать. Дизайн этих белков основывался на повторении структурных мотивов природных белков и зачастую на прямом использовании элементов их аминокислотных последовательностей. В то же время современная теория белковых структур позволяет конструировать белки и с новой, то есть не обнаруженной до сих пор в природе архитектурой. Одна из таких белковых структур, показанная на рис.9, была выбрана для дизайна первого искусственного белка с новой архитектурой. Эта структура отвечает всем известным принципам формирования структуры глобулярных белков, в то же время в природных белках она пока не встречалась. Мы назвали этот белок альбебетином, так как он состоит из двух повторяющихся элементов сфр.

Рис.9. Предполагаемая пространственная структура искусственного бежа альбебетина.

В принципе пространственная структура глобулярного искусственного белка, состоящего из двух а-спиралей и четырех fi-участков, может быть реализована очень большим числом способов, т.е. обладай, множеством топологий. Нетрудно подсчитать, что если каждая а-стгираль может занимать одну из двух позиций, а p-стренд - одну из четырех, то с учетом двух возможных ориентации каждого элемента регулярной вторичной структуры это число составляет 2! х 4! х 26/2 = 1536 топологий (множитель 1/2 учитывает симметрию второго порядка). При этом мы считаем, что элементы регулярной вторичной структуры обладают действительно высокой стабильностью, гак что шобые изменения вторичной структуры исключены или, по крайней мере, сильно невыгодны энергетически. Таким образом, задача белкового дизайна состоит в том, чтобы создать такую первичную структуру, которая будет формировать заданную вторичную структуру и оптимальным образом отвечать желаемой топологии, в то время как остальные структуры будут намного менее выгодны. При этом число реальных стабильных топологий, которые необходимо рассматривать при дизайне, значительно меньше теоретически возможного. Так, известно, что параллельное расположение соседних по последовательности элементов вторичной структуры менее выгодно, чем ангипараллельное (Finkelstein and Ptitsyn, 1987), А если еще и длины перетяжек между элементами регулярной вторичной структуры будут невелики, то каждый элемент сможет занять только антипараллельное положение по отношению к предыдущему. В этом случае остаются только 4! х 2! = 48 топологий, причем большинство из гак также маловероятны, так как они противоречат общим правилам формирования белковых структур (Finkelstein and Ptitsyn, 1987), а имешю, включают в себя скрещешгые перетяжки между элементами вторичной структуры или левозакрученные рар-сегмспги. Таким образом, остаются только 12 топологий (рис.10), в числе которых находится и заданная топология альбебетина.

Чтобы сделать ее более стабильной, чем остальные 11, можно воспользоваться тем, что только эта топология включает в себя полностью

антипараллельный р-слой, причем стренды Р] и Рз лежат на краях слоя, а Р2 и (34 - в середине. Поэтому если перетяжки между арендами будут очень короткими (длина, достаточная для образования лишь р-изгиба между соседними стрегщами), а стренды и Рз будут более гидрофильны, чем [Ь и Р4, наша топология будет стабильнее остальных.

N NN N N

^^ ^^ Ш^]

С С С С

NN NN N N

Рис.10. Схематическое представление 12 наиболее вероятых топологий белка, состоящего из двух а-спиралей и четырех р-стрендов, с ангипараллельным расположением соседних по последовательности элементов вторичной структуры. Топология альбебетина показана слева в верхнем ряду.

Исходя из вышеизложенного был проведен дизайн первичной структуры альбебетина, включавший в себя следующие основные моменты. Во-первых, для получения достаточно стабильных а- и р- участков они были сконструированы из из а- и р-образующих остатков, прежде всего, лейцинов для а-спиралей и валиков для р-участков. При этом остатки лейцина были включеныв спирали в положения ¡, Ц-З, 1+4, 1+7, а остатки валина - в положения 1, ¡+2, ¡+4 в р-участки для формирования гидрофобных поверхностей контакта между а-спиралями и р-листом. Во-вторых, на концы а-спиралей были введены разноименные заряды, а именно остатки глутаминовой и аспарагиновой кислот на N-конец и аргинина на С-конец, что, как известно, способствует дополнительной стабилизации а-спиралей из-за притяжения этих остатков к парциальным зарядам спиралей. В-третьих, для правильного взаимного расположения р-участков, то есть для расположения стрендов 01 и рз на краях слоя, а 02 и Р4 - в середине, в крайние участки были включены гидрофильные заряженные аминокислотные остатки глутаминовой кислоты, а в средние - практически не заряженные при нейтральных значениях рН остатки гастидина. И, наконец, длины перетяжек между а- и р-участками были сокращены до минимума для предотвращения образования пространственных структур, отличных от изображенной на рис.9. Перетяжки между элементами регулярной вторичной структуры были насыщены остатками пролина и

глицина, разрушающими а- и р-структуру, длина самих а- и р-участков составила приблизительно 1,8 им.

Окончательный вариант первичной структуры альбебетина, приведешгый па рис.11, был получен после проверки предполагаемой пространственной структуры на оптимальную плотность упаковки с помощью молекулярных моделей СРК и введения несколькоих замен, улучшающих упаковку белка. Впоследствие структру альбебетина тестировали также с помощью компьютерных методов анализа с использованием программ кш^ II (Вюхут) и НурегОют. Результаты тестирования показали, что заданная пространственная структура искусственного белка имеет достаточный запас прочности, почта не уступая природным белкам по плотности упаковки внутри белковой глобулы или по количеству "слабых мест" в молекуле (участков с неоптимальными торсионными углами или межатомными растоягшями).

Есот ВатН1 Руи11

САТфТЙтЦ АТ|3,с!1 СЙв вве вАС ССА ЭАА ТвС СТС ОАО СТС

"""" 10 Ме1 Азр Рго Аэр Рго й1и Суэ Lвu С1и С1п 1_ец_1еи

Крп!

СОТ СЭС СТО СвС СвТ ТСС вТА вАА вТТ вАА СТС АСТ ЭйТ ЙЗТ'АСС ЭТА Аго Аго 1_еи в1у &у вег Уа120 С1и Уа1 С1и Уа1 ТЬг С1у ТИг Уа1

ВзрМИ

САС вТТ вАА ЭТв ТСГССЩ|ЛА САТ ССй бЭС ОАО ССА вАА ТСС СТС вАв Жэ30 Уа1 в1и Уа1 Эег Рго Фи Аэр Рго Аэр40'

РуиН

САС стё СТС СвТ ССС СТС вое вэт ТСС ЭТА вАА вТТ вАА вТС АСТ вСТ С51п 1.еи 1_е» Агд Агу50 1_еи &у в1у вег Уа1 аи Уа1 в1и Уа1 ТИг60 С1у

Крп1 ВзрМН НШШ

8ШГ® бТА САС ЭТТ вАА втс ТСРОШЩА вАТ СвТ ТАв ТАА Ш|Ш Оу ТИг Уа1 № Уа1 С1и Уа1 Бег Рго70 Б1и Аэр Агд Б^р

Рис.11. Аминокислотная последовательность искусственного белка и нуклеотидная последовательность соответствующего гена. Показаны участки, отвечающие а-спиралям ( —=■ ) и р-структуре ( — ) и сайты рестрикции.

Полученная таким образом первичная структура искусственного белка была "переведена" в ген альбебетина с учетом частоты встречаемости кодонов в Е.соИ, при этом в ген были введены несколько сайтов рестрикции дая удобства клонирования и возможности последующих модификаций. Структура альбебетина состоит из двух повторяющихся частей (аРР),

поэтому мы синтезировали химически только половину его гена, клонировали ее и затем удвоили в составе плазмиды. Схема получения гена альбебетина показана на рис.12.

Вначале были синтезированы 8 олигонуклеотидов длиной от 31 до 37 оснований, соответствующие прямой и обратной цепи половины гена, затем их фосфорилировали (кроме 5'-концевых в прямой и обратной цепи), смешивали и отжигали, получая 4 двухцепочечных фрагмента с перекрывающимися липкими концами. При этом первый фрагмент (рис.12) начинался с выступающего 5'-конца GATC, комплиментарного липкому концу сайта рестрикции Bglll, а последний фрагмент заканчивался липким концом сайта Hindlll. Эти фрагменты клонировали по названным сайгам рестрикции в вектор - плазмиду pSTH, несущую ген гормона роста человека, на место С-концевой части гена гормона роста. Из иол ученной таким образом плазмиды pSTH/ABBl вырезали по сайтам BamHI и Hindlll половину гена альбебетина и клонировали ее в ту же плазмиду pSTH/ABBl по сайтам Bglll (который имеет такой же липкий конец, что и BamHI) и Hindlll. В результате была получена плазмида pSTH/ABB2, несущая полный ген искусственного белка. После этого ген альбебетина был субклоцирован по сайтам рестрикции EcoRI и Hindlll в плазмиду pSPT19 под контроль промотора для РНК-полимеразы фага SP6 для его экспрессии в бесклеточной системе трансляции. Затем была проведена модификация гена: С-концевой остаток Leu был замшей на Arg для придания белку большей гидрофильносги и предотвращения его возможной агрегации. Для этого в полученную плазмиду по сайтам Bglll и Hindlll был вставлен короткий двухцепочечный фрагмент из двух специально синтезированных 15-членных олигонуклеощцов с соответствующими липкими концами и требуемой заменой. В результате была получена плазмида pSPT/АВВЗ, использованная для экспрессии в бесклеточной системе. Ген альбебетина в этой плазмиде имеет остаток Arg на С-конце, не несет сайта Bglll и именно этот конечный вариант приведен на рис.11.

Одна из постоянных проблем с которой сталкиваются исследователи при конструировании искусственных белков (а также модифицировашшх природных белков) - это их экспрессия, выделение и очистка. Зачастую белки оказываются в тельцах включения, кроме того, они могут подвергаться расщеплению клеточными прогеазами. Для того, чтобы обойти эту проблему, мы решили применить биосинтез в бесклеточной системе трансляции, причем использовать его не только для тестирования экспресии белка и определения его молекулярного веса, как это обычно делается, но и для первичного исследования структуры белка.

Для наработки альбебетина в бесклеточной системе была использована плазмида pSPT/АВВЗ, содержащая ген искусственного белка под промотором для РНК-полимеразы фага SP6. Эта полимераза способна эффективно синтезировать РНК со своего промотора, при этом неспецифического синтеза практически не наблюдается. О силе и специфичности этого промотора говорит такой факт. Мы пробовали клонировать фрагмент Hindlll-HindlH ДНК фага SP6, содержащий ген РНК-полимеразы, в E.coli и обнаружили, что наличие в этом фрагменте

Рис.12. Схема клонироваиия гена альбебетина. Пояснения в тексте.

двух промоторов дня РНК-полимеразы делает клонирование фрагмента в иолноразмерном виде невозможным, так как полимераза начинает немедленно синтезировать большое количество РНК с этих промоторов, забирая на себя все ресурсы клетки и делая ее нежизнеспособной. Высокая эффективность РНК-полимеразы фага SP6 позволила нам успешно использовать ее для синтеза в бесклеточной, системе.

Для первичного структурного тестирования альбебетина мы применили методику, позволившую провести анализ альбебетина без очистки белка, используя всего несколько десятков напограмм радиоактивно меченного белка. Эта методика включает в себя синтез радиоактивно меченного белка в бесклеточной системе трансляции и его анализ такими общими структурными методами, как гель-фильтрация, электрофорез в градиенте мочевины, ограниченный протеолиз и др., примешшыми к радиоактивно меченным белкам, с последующей радиоавтографией. Существенно, что эта методика не требует предварительной очистки белка, полученного в бесклеточной системе трансляции, т.к. использование в системе большого количества мРНК, наработанного с помощью высокоспецифичной РНК-полимеразы фага SP6 приводит к синтезу в системе практически только одного меченого белка. Поэтому такая методика может быть применима для структурного анализа не только искусственных, но и модифицированных природных белков, когда требуется быстро протестировать их структуру без экспрессии препаративных количеств белка. Она включает в себя следующие этапы.

1. Клонирование исследуемого белка в плазмиду под контроль промотора для РНК-полимеразы фага SP6 (или Т7), что позволяет эффективно нарабатывать in vitro соответствующую мРНК.

2. Получение мРНК с помощью фаговой РНК-полимеразы.

3. Наработка белка в бесклеточной системе трансляции с использованием одной или нескольких радиоактивно меченных (3Н или 35S) аминокислот.

4. Исследование полученного белка без предварительного выделения и очистки такими методами, как электрофорез в градиенте мочевины, гель-фильтрация. ограниченный протеолиз с последующей радиоавто1рафией, которые несут информацию об общих структурных характеристиках белка, его компактности и стабильности.

Если полученные таким образом данные свидетельствуют об отсутствии у исследуемого белка компактной стабильной структуры (что вполне вероятно при конструировании белков de novo и мутантных белков), то в первичную структуру белка могут быть введены замены и весь процесс тестирования повторен еще раз. В том же случае, когда получен положительный результат, т.е. структура компактна и достаточно стабильна, можно с реальной надеждой на успех пытаться экспрессировать белок в E.coli или другой системе in vivo. Для проведения тестирования достаточно синтезировать в бесклеточной системе трансляции несколько нанограмм меченного белка, однако система позволяет в принципе получать и значительно большие количества - до миллиграмм (Spiiin et al., 1988). При этом существенно отметить, что в бесклеточной системе трансляции можно проводить синтез практически любых белков, в том числе и токсичных для клетки. Не является препятствием и низкая стабильность белка, так как для

бесклеточных систем характерно практическое отсутствие протеазной активности (Erickson and Blobel, 1983).

Для синтеза альбебетина в бссклеточной системе транслядии бьша наработана мРНК in vitro с штазмиды pSPT/ЛВВЗ с помощью РНК-полимеразы фага SP6. После этого проводили трансляцию в бесклеточной системе из зародышей пшеницы (Erickson and Blobel, 1983), используя в качестве радиоактивной метки [3Н]-лейцин. При этом в 50 мкл реакционной смеси в стандартном эксперименте в наших условиях синтезировалось до 10 пикомолей образца с активностью 106-107 имп/мин. Этого количества было вполне достаточно для проведения эксперимента по электрофорезу в градиенте мочевины, гель-фильтрации или протеолизу.

На рис.13 показан радиоавтограф электрофореза продуктов трансляции в присутствии додецилсульфата натрия. Из рисунка видно, что в системе синтезируется только один радиоактивно меченный полипептид с молекулярной массой около 8000 Да, что близко к расчетной молекулярной массе альбебетина 7756 Да.

Молекулярная масса, кДа

43 —

29 -18 — 14,3 —

6,2 — 3 —

12 3 4

Рис. 13. Радиоавтограф электрофореза продуктов трансляции в бесклеточной системе в присутствии додецилсульфата натрия. Показано положение реперных белков указанной молекулярной массы ( в тыс. Дальтон). Слоты 1-4 соответствуют различному количеству мРНК в трансляцииотшой смеси: 1, 2, 3 и 4 мкг.

На рис.14 приведены результаты хроматографии продуктов трансляции на градуированной с помощью природных глобулярных белков колонке с Superóse 12 п "нативиых" условиях (рН7,6, 200 мМ К-ацетатный буфер) и в присутствии 9М мочевины (в том же буфере). Как видно из рисунка, альбебетин сходит с колонки одним пиком как в "нативных" условиях, так и в присутствии мочевины, что свидетельствует об отсутствии ассоциации молекул белка. Объем элюция альбебетина в отсутствие мочевшш соответствует объему элюции нативного природного белка с молекулярной массой 8,5 кДа, что свидетельствует о компактности искусственного белка. Развернутые белки имеют в подобных экспериментах кажущуюся молекулярную массу, вдвое и более превышающую истинную. По объему

элю1щи были вычислены значения радиуса Стокса альбебетина согласно (Ackers, 1967), которые составили 1,7 нм для нативного и 2,4 нм для развернутого мочевиной белка. Эти величины близки к соответствующим значениям для природных белков такой молекулярной массы (Uversky, 1993).

Для анализа стабильности альбебетина мы использовали электрофорез в градиенте мочевины по Крейтопу (Creighton, 1979) и ограниченный прогеолиз согласно (Lang and Schmid, 1986) с последующей радиоавтографией. На рис.15 показан радиоавтограф электрофореза продуктов трансляции в градиенте мочевины.

РАДИОАКТИВНОСТЬ,

НОМЕР ФРАКЦИИ

Рис.14. FPLC-хроматография продуктов трансляции альбебетина в бесклеточной системе на колонке Superóse 12 в нативных условиях (о-о) и в присутствии 9 М мочевины (х-х). По оси ординат отложена радиоактивность фракций, определенная после осаждения трихлоруксусной кислотой.

Из рисунка следует, что электрофоретическая подвижность альбебетина претерпевает кооперативный S-образный переход с точкой полуперехода около 5,5 М мочевины, свидетельствующий о кооперативном изменении структуры белка под действием денатуранта. Такой характер перехода наблюдается у глобулярных белков со стабильной компактной структурой (Creighton, 1979) и это предполагает наличие у альбебетина подобной структуры при концентрацшг мочевины 0-3 М, т.е. до начала перехода. Анализ да!шых по денатурации природных глобулярных белков мочевиной показывает, что глобулярные белки близкой молекулярной массы обладают сходной степенью кооперативности перехода. Интересно отметить, что по этим параметрам альбебетин заметно стабильнее белка de novo "felix" (Hecht et al., 1990), и несколько менее стабилен, чем первый четырехспиральный искусственный белок, подученный в работе Regan and DeGrado, 1988 (оба белка близки по молекулярной массе к альбебетину).

Катод

ОМ 8 М

КОНЦЕНТРАЦИЯ МОЧЕВИНЫ

Рис.15. Радиоавтограф электрофореза продуктов трансляции в бесклеточной системе в градиенте мочевины по Крейтону (О^1&оп, 1979). Стрелками показано направление градиента и миграции белка при электрофорезе.

О наличии у альбебетина определенной структуры свидетельствуют и данные по его ограниченному протеолизу. В структуре белка имеются два сайта для щепления трипсином, а именно аргининовые "тандемы" 14-15 и 49-50 (см. рис.11). На рис.16 приведен радиоавтограф электрофореза продуктов трипсинолиза белка в "нативных" условиях и в присутствии 4 М мочевины. Из рисунка видно, что альбебетин расщепляется трипсином в присутствии мочевины существенно быстрее, нежели без нее. Очевидно, что, если бы полипептидная цепь искусственного белка была бы развернута,

он бы расщеплялся трипсином эффективнее в отсутствие мочевины, так как в 4 М мочевине активность трипсина снижена вдвое. При более полном расщеплении белка de novo трипсином в "натявных" условиях (рис.17) появляются фрагменты альбебетина, обладающие неодинаковой кинетикой дальнейшего расщепления.

Без мочевины 4 М мочевины

0 0,25 1 3 10 20 40 0 0,25 1 3 10 20 40

Время трипсинолиза (мин)

Рис.16. Радиоавтограф электрофореза с додецилсульфагом натрия продуктов трансляции в бесклеточной системе после их ограниченного трипсинолиза в нативных условиях (слоты 1-7) и в 4М мочевине (слота 814). Внизу указана длительность трипсинолиза в минутах. Препарат в слотах 1 и 8 трипсином не обрабатывали.

Анализ расположения остатков аргинина в первичной структуре альбебетина позволил нам идентифицировать зги фрагменты, как показано на рис.17. При этом мы не делаем различия между расщеплением в соседних аминокислотах аргшшнового тандема, т.к. ограниченные возможности электрофореза не позволяют нам разделить, скажем, фрагменты 15-73 и 1673, поэтому они фигурируют здесь как один фрагмент 16-73. Из рис. 17 видно, что большие фрагменты белка, а именно 1-48 и 16-73, появляющиеся уже через 1 минуту после начала процесса, имеют различную кинетику трипсинолиза. Так как окружение остатков аргинина по первичной структуре в больших фрагментах идентично, это свидетельствует о наличии в этих фрагментах определешшх дальних взаимодействий, а следовательно,

и их определенной пространственной структурированности (это относится, по крайней мере, к фрагменту 1-48, имеющему более медленную кинетику расщепления). Существенно, что более медленная кинетика расщепления фрагмента 1-48 согласуется с нашей моделью пространствешюй структуры интактного белка, так как по этой модели сайт для атаки трипсина в этом фрагменте частично заэкранирован другой а-спиралью, тогда как в во фрагменте 16-73 он полностью экспонирован (рис.18).

Фрагмент

1 2 10 20 40 Время (мни)

Рис.17. Радиоавтограф градиентного электрофореза высокого разрешения (20%-30% ПЛАТ) с додепилсульфатом натрия продуктов трансляции в бесклеточной системе после их обработки трипсином в нативных условиях. Внизу указана длительность трипсинолиза в минутах.

Рис.18. Предполагаемые пространственные структуры фрагментов трипсинолиза 16-73 (слева) и 1-48. Стрелкам указаны оставшиеся после первого расщепления сайты для атаки трипсина.

Таким образом, исследование сконструировашюго нами искусственного белка с помощью методики быстрого тестирования структуры показало наличие у альбебетина компактной и относительно стабильной структуры, не противоречащей заданной. Это позволило нам перейти к его экспрессии в препаративных количествах в E.coli с целью дальнейшего более детального исследования. Мы получили несколько генноинженерных конструкций дяя прямой экспрессии альбебетина, используя конструкцию с регуляторной частью плазмиды pSTH, в которой первоначально клонировался альбебстин, а также плазмиды рЕТ8с и pET23d (Studier, 1990), однако уровень прямой экспрессии во всех случаях был очень низок и нестабилен. Поэтому мы предпочли экспрессировать искусственный белок в виде так называемого "фыожн" или слитного белка, то есть в виде единой полипептидной цепи с N-концом другого белка -белка-носителя, который затем отщепляется химическими или энзиматическими методами. Мы получили две таких конструкции, экспрессирующие альебебтин в виде слитных белков: с ß-галактозидазой и с мальтозосвязывающим белком (МСБ).

С помощью метода полимеразной цепной реакции в ген альбебетина были введены участки, содержащие необходимые сайты рестрикции для клонирования в соответствующие плазмиды после генов белков-носителей. При этом в конструкции с р-галактозидазой альбебетин следовал сразу за ß-галактозидазой и его предполагалось отщеплять химически по первому остатку метиошша с помощью BrCN (так как альбебетин не содержит других остатков метиошша). В системе с МСБ альебебетин соединялся с белком-носителем специальным участком из четырех аминокислот, который распознается высокоспецифичной прогеазой "фактор Ха", для последующего энзиматического расщепления с помощью этой протеазы. Обе системы экспрессии оказались эффективны: слитные белки составляли до 40-50% тотального клеточного белка, однако в системе с ß-галактозидазой слитный белок образовывал тельца включения:, в го время как в системе с МСБ он находился в растворимом виде. Поэтому для препаративной наработки альбебетина мы выбрали систему экспрессии с МСБ. Она имеет несколько преимуществ по сравнению с другими системами, в которых используются слитные белки. Прежде всего, МСБ (и, соответственно, слитный бедок) экспрессируегся с высокой эффективностью и может составлять до половины тотального клеточного белка. Он обладает высокой растворимостью, поэтому получаемые на его основе слитные белки также обычно находятся в растворимой фракции, а не в тельцах включения. Преимуществом также является и возможность простой и эффективной аффинной хроматографии на амидозной смоле для очистки слитного белка. И, наконец, использование фактора Ха, который расщепляет полипептидную цепь после участка распознавания, позволяет отщепить как белок-носитель, так и участок распознавания, поэтому экспрессируемый искусственный белок не несет дополнительных аминокислот на N-конце. Протеазы, используемые в других системах экспрессии, могут оставлять участки распознавания или их фрагменты на экспрессируемом белке после расщепления. Это зачастую не имеет значения при экспрессии природных белков (например, если эти "хвосты" не влияют на активность белка),

однако для искусственных белков с заданной пространственной структурой такой вариант неприемлем, так как дополнительные аминокислоты могут исказить эту заданную структуру.

При экспрессии альбебетина мы использовали плазмиду pMALc (New England BioLabs), содержащую tac-промотор, индуцируемый изопротглтиогалактозидом. Для экспрессии был отобран модифицировашшй штамм E.coli HKF2, полученный в лаборатории Х.Блёкера (H.Bloecker, GBF, Braunschweig). Индуцированные клетки осаждали, разрушали с помощью установки высокого давления (French press), затем обрабатывали ультразвуком и осаждали еще раз при 15000 g. Супернатант наносили на колонку с Q-сефарозой "fast flow" для предварительной очистки слитного белка. После этого фракции,. обогащенные слитным белком, наносили на колонку с амилозной смолой, на которую садился только слитный белок. Его смывали с колонки 10 мМ мальтозой, еще раз проводили хроматографию на Q-сефарозе для отмывки от мальтозы, после чего расщепляли фактором Ха и опять наносили на колонку с амилозной смолой. Мальтозосвязывающий белок оставался на колонке, а в проскоке находился практически чистый альбебетин. Для дополнительной очистки белка использовали гель-хроматографию на колонке с супердексом 75. В общей сложности было получено приблизительно 50 мг альбебетина с чистотой не менее 95%, который и использовался в дальнейших экспериментах.

На рис.19 приведен спектр кругового дихроизма (КД) альбебетина. Видно, что искусственный белок обладает выраженным спектром КД, характерным для белков с значительным содержанием регулярной вторичной структуры. Анализ спектра по модифицированной методике Провенчера и Глёкнера (Provencher and Gloeckner, 1981) показал, что содержание а- и ß-структуры в молекуле альбебетина составляет 28% и 40%, соответственно. Эти величины весьма близки к значениям 30% и 36%, ожидаемым для заданной структуры искусствегагого белка (рис.11), что подтверждает корректность дизайна вторичной структуры альбебетина. Кроме того, это свидетельствует также и в пользу задашюй пространствегаюй структуры белка, так как короткие перетяжки между элементами регулярной вторичной структуры препятствуют образованию подавляющего большинства других пространственных структур без заметного искажения вторичной структуры (см. раздел о дизайне альебебетина).

Для выяснения, обладает ли альбебетин уникальной пространственной структурой с плотной внутримолекулярной укладкой или, подобно другим искусственным белкам, находится в состоянии расплавленной глобулы, мы провели его микрокалориметрическое исследование, а также протестировали плавление белка с помощью кругового дихроизма, то есть изучили зависимость эллиптичности при длине волны 220 нм от температуры. Оба метода дали одинаковый результат, а

ЭЛЛИПТИЧНОСТЬ, мград 4

180 190 200 210 220 230 240 250

ДЛИНА ВОЛНЫ, км

Рис.19. Спектр кругового дихроизма альбебетина. Концентрация белка составляет 0.43 мг/мл, толщина кюветы 0,05 мм.

ТЕПЛОЕМКОСТЬ, кДжК^моль"1

ЭЛЛИПТИЧНОСТЬ при 220 им, мград

40 60

ТЕМПЕРАТУРА, °С

Рис.20. Зависимость теплоемкости (-) и эллиптичности при длине

волны 220 нм (--) искусственного белка от температуры.

именно, гладкие кривые без сколько-нибудь заметных признаков кооперативного температурного плавления (рис.20). Эти дашгае показывают, что альбебепш, очевидно, находится в состоянии расплавленной глобулы. Недавно они были подтверждены также методом ядерного магнитного резонанса в лаборатории К.Добсона (C.Dobson) в Оксфордском университете, где было показано, что альбебетин обладает спектром ЯМР, характерным для природных белков в состоянии расплавлешюй глобулы.

Таким образом, в результате этой работы нами получен и исследован белок (le novo альбебетин, сконструированный под заданную пространственную структуру. Для его первичного анализа была применена новая методика быстрого тестирования структуры, позволяющая проводить оценку структурных свойств белков de novo и мутантных белков с использованием всего нанограммовых количеств белка без его предварительной очистки. Исследование альбебетина с помощью этой методики а также другими методами показало, что он обладает заданной вторичной структурой и компактной относительно стабильной пространственной структурой, соответствующей, или, по крайней мере, не противоречащей первоначально заданной. Разумеется, детальное соответствие может быть показано только такими методами, как ренггеноструктурный анализ или ЯМР, однако уже полученные дагагые позволили нам планировать проведение модификаций искусственного белка, напрвленных прежде всего на введение в альбебетин функциональной активности.

АЛЬБЕБЕТИН С ФРАГМЕНТОМ ИНТЕРФЕРОНА - ПЕРВЫЙ ИСКУССТВЕННЫЙ БЕЛОК С ЗАДАННОЙ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ

КОНСТРУИРОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ИСКУССТВЕННОГО БЕЛКА

Как уже говорилось, к настоящему времени сконструировано несколько десятков искусственных белков, часть которых была получена экспериментально. Структура большинства из них соответствует структуре нативных белков в состоянии расплавлешюй глобулы. В литературе сообщалось о получении искусственных белков, обладающих коооперативным температурным плавлештем при микрокалориметрическом исследовании (Tanaka et al., 1994; см. также ссылки из этой работы), однако значения энтальпии и энтропии перехода в этих случаях намного меньше величин, которые можно было бы ожидать при плавлении природных белков соответствующей молекулярной массы. Это свидетельствует о том, что и в этих случаях белковые молекулы (или, по крайней мере, их основные части) находятся в состоянии расплавленной глобулы. С точки зрения белкового дизайна ого может рассматриваться как недостаток, неумение дизайнеров полностью смоделировать природные белки, включая специфические взаимодействия, обеспечивающие уникальную

пространственную структуру белка. Тем не менее исследователи уже сейчас пытаются использовать полученные искусственные белки в качестве носителей какой-либо функции. При этом чаще всего рассматривается функция связывания металлов, так как она достаточно проста и позволяет, помимо получения функции per se, также косвенно проверить полученную пространственную структуру. В аминокислотную последовательность искусственного белка вводятся нескольких остатков гистидина в положения, позволяющие им образовать сайты связывания металла, в соответствии с заданной пространственной структурой. Этот подход не лишен недостатков, прежде всего потому, что остатки гистидина могут связывать металлы и неспецифически, без образования кластеров - сайтов связывания. А так как получить действительно высокие константы связывания, как правило, не удается, трудно делать однозначные выводы о соответствии (или несоответствии) реальной пространственной структуры белка заданной.

На наш взляд, больший интерес представляет получение искусственных белков, обладающих биологической активностью. В этом случае состояние расплавленной глобулы, в котором находятся искусственные белки, может не только не быть недостатком, но и стать реальным преимуществом. Мы уже упоминали о том, что в последнее время появляется все больше и больше доказательств функциональной роли состояния расплавленной глобулы, например, при прохождении белков через мембраны (Bychkova and Ptitsyn, 1993). Использование именно таких свойств этого состояния было бы важно при конструировании биологически активных искусственных белков.

Недавно были получены новые интересные данные об усваивании лекарственных препаратов белковой природы в состоянии расплавленной глобулы. Ученые фармацевтической компании "Emisphere Technologies" и Висконсинского университета исследовали влияние ряда низкомолекулярных (200-300 Дальтон) химических соединений, связывающихся с белками, на усваивание - а-интерферона, инсулина и гормона роста крысами и обезьянами при пероральном введешш (Milstein et al., 1996). Было показано, что эти соединения способствуют переходу названных белков в промежуточное состояние с характеристиками расплавленной глобулы и их добавление к белкам приводит к значительному улучшению усваивания, т.е. увеличению концентрации белков в сыворотке крови. Авторы сделали вывод о том, что именно это промежуточное состояние ответственно за прохождение белков через слизистую кишечника и попаданию их в кровь.

Известно, что природные белки часто обладают не одной, а несколькими активностями, причем для таких белков как интерферон или гормон роста количество активностей может составлять многие десятки (Balkwill and Burke, 1989). Для некоторых из этих активностей показано, что они опосредуются отдельными, порой сравнительно небольшими, участками белков. Результаты работы Milstein et al. (1996) позволяют предположить, что введение таких активных фрагментов в состав искусственных белков, находящихся в состоянии расплавленной глобулы, могло бы способствовать более эффективному проникновению этих фрагментов через мембраны и, в конечном счете, к усилению биологического эффекта. Принимая во

внимание вышеизложенное, мы приступили к конструированию на базе альбебетшга первого биологически активного искусственного белка.

В принципе для придания искусственному белку биологической активности возможно использование различых подходов. Прежде всего в его состав могут бьггь включены участки или участок, соответствующие активному центру какого-либо природного белка. (Мы не рассматриваем здесь возможность конструирования новой, не наблюдаемой в природных белках активности). В случае пространственно организованного активного центра, состоящего из нескольких разделенных по первичной структуре фрагментов, как, например, каталитические центры ферментов, проведение подобного дизайна требует знания точной пространственной структуры белка-реципиента. Поскольку для искусственных белков, полученных до сих пор, такие данные отсутствуют, "привитие" на эти белки пространственно организованного активного центра в настоящее время практически невозможно. В то же время линейные активные центры, представляющие собой небольшие непрерывные участки аминокислотной последовательности белка и сохраняющие биологическую активность в виде пептидов, могут бьггь включены в состав белка de novo без знания точной пространстветгой структуры последнего. При этом необходимо, чтобы вводимый участок обладал достаточной свободой и мог принять конформацию, необходимую для проявления его функциональной активности и в то же время не нарушал существенно пространственную структуру искусственого белка. Возможны два варианта включения линейного активного участка в состав искусственного белка: 1) замена близкого по первичной структуре фрагмента белка и 2) вставка в экспонированные участки белковой молекулы. В первом случае необходимо иметь участок первичной структуры, достаточно гомологичный (или хотя бы похожий по расположению гидрофобных и гидрофильных аминокислот) активному фрагменту, который будет вводиться в состав белка. Очевидно, что чем более гомологичный участок будет найден, тем больше, в принципе, вероятность успешного дизайна. Известно, однако, что даже идентичные по первичной структуре пептиды могут принимать различную конформацию в разных белках (Argos, 1987). Во втором случае активная последовательность не заменяет собой какой-либо фрагмент белка, а вставляется в экспонированные - петлевые или концевые - участки белковой молекулы; при этом предполагается, что локальные изменения в таких участках не должны существенно влиять на общую структуру белка и вводимый функциональный фрагмент в силу своей экспонироватпюсти может принимать конформацию, необходимую для проявления биологической активности.

При выборе активного участка для включения его в состав альбебетина мы исходили из следующих соображений. Во-первых, получаемая биологическая активность должна быть легко тестируема, что должно облегчить ее обнаружение даже без наработки значительных количеств белка, используя только синтез в бесклеточной системе. Во-вторых, вводимый фрагмент должен быть относительно коротким, чтобы не нарушать общую структуру альбебетина. И, в-третьих, поскольку альбебетин является кислым белком, при выборе мы отдавали предпочтение щелочным

активным фрагментам. Мы сравнили аминокислотную последовательность альбебетина с более чем 150 последовательностями функционально важных линейных фрагментов белков, описанных в литературе, однако сколько-нибудь значительной гомологии обнаружить не удалось. Поэтому мы решили включить активный участок в экспонировашгую часть молекулы альбебетина и выбрали для этого октаиептид LKEKKYSP, соответствующий фрагменту 131-138 интерферона человека, который, как было показано (Zav'yalov et al., 1991), отвечает за одну из многочисленных биологических активностей интерферона. Он имеет высокую константу связывания с рецепторами тимоцигов мыши и активирует реакцию бласг-трансформации тимоцитов при концентрациях порядка 10~u М. Этот октапептид отвечает всем необходимым условиям для включения в состав альбебетина: его высокая аффинность к рецепторам позволяет легко тестировать связывание; он имеет щелочной характер, относительно короток и гидрофилен, что позволяет предполагать сохранение общей пространственной структуры альбебетина при его вставке. Было показано, что связывание этого пептида с рецепторами заметно ухудшается при добавлении остатка Cys на его С-консц и практически исчезает при введении нескольких дополнительных аминокислот на его N-конец. В молекуле интерферона фрагмент 131-138 находится в петлевом участке и также имеет значительно меньшую константу связывания с рецегггорами, чем отдельный октапептид (Zav'yalov et al., 1991). Поэтому мы пришли к выводу, что этот активный фрагмент следует вставить в N-конец молекулы альбебетина сразу после первого остатка метионина.

ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ АЛЬБЕБЕТИНА С ФРАГМЕНТОМ ИНТЕРФЕРОНА - ПЕРВОГО БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ИСКУССТВЕННОГО БЕЛКА.

Для получения гена альбебетина с фрагментом интерферона были синтезированы два олигонуклеотида, комплементарные друт другу за исключением концов, соответствовавших липким концам сайтов рестрикции EcoRI и BarnHI. Олигонуклеотида имели следующие последовательности:

5' ААТТС ATG СТС AAG GAA AAG AAG TAC ТСТ ССА 3' 3' G TAC GAG TTC CTT TTC TTC ATG AGA GGT CTAG 5'

Их отжигали и клонировали по сайтам рестрикции EcoRI и Bam HI (см. рис.11) в плазмиду, несущую ген альбебетина под контролем промотора РНК-полимеразы фага SP6. На рис.21 показала предполагаемая пространственная структура альбебетина с пришитым фрагментом интерферона.

Для тестировния структурных характеристик полученного белка мы использовали вначале экспрессию в бесклеточной системе трансляции и метод быстрого тестирования структуры, который был использован при изучении альбебетина. Для синтеза альбебетина с фрагментом интерферона

в бесклеточной: системе трансляции с полученной плазмиды с геном in vitro былр наработана мРНК с помощью РНК-полимсразы фага SP6. Трансляцию проводили в бесклеточной системе из зародышей пшеницы, используя в качестве радиоактивной метки [3Н]-лейцин, количество образца в реакциогагой смеси оценивали но его радиоактивности и известной удельной активности используемой метки. Электрофорез продуктов трансляции в присутствии додецилсульфата натрия с последующей радиоавтографией показал, что в системе синтезируется только один радиоактивно меченный полипептид с молекулярной массой около 9000 Да, что близко к расчетной молекулярной массе альбебетина с фрагментом интерферона 8729 Да.

Рис.21. Предполагаемая пространственная структура альбебетина с фрагментом интерферона. Показаны К- и С-конец белка а также аминокислотная последовательность фрагмента интерферона после первого остатка метионина.

Чтобы проверить, является ли молекула синтезируемого белка мономером, а также для оценки его компактности мы провели хроматографию продуктов трансляции на отградуировашюй колонке Superóse 12. На рис.22 приведены результаты хроматографии продуктов трансляции в нативных условиях (рН7,6) и в присутствии 9 М мочевины. Как видно из рисунка, в обоих случаях альбебетин с фрагментом интерферона сходит с колонки одним пиком, что говорит об отсутствии ассоциации молекул белка. Значение радиуса Стокса для белка в нативных условиях, вычисленное по объему элюции согласно (Ackers, 1967), составило 1,7 нм, что вполне соответствует этой величине для глобулярных белков такой молекулярной массы и свидетельствует о компактности молекулы альбебетина с фрагментом интерферона. Интересно отмстить, что величина радиуса Стокса для самого альбебетина, полученная таким же образом, составляет, как уже говорилось, также 1,7 нм, т.е. добавление фрагмента интерферона не приводит к увеличению молекулы альбебетина. Значение же радиуса Стокса для альбебетина с фрагментом интерферона, развернутого 9 М мочевиной, как и следовало ожидать, больше этой

величины для альбебетина (2,4 нм) и составляет 2,5 нм. Исследование денатурационного перехода альбебетина с фрагментом интерферона с помощью гель-хроматографии и электрофореза в градиенте мочевины по (СгещМоп, 1979) выявило кооперативное изменении структуры белка под действием денатуранта при концентрации мочевины от 4 до 7 М. При этом параметры перехода, а именно, степень кооперативности и точка полуперехода соответствуют подобным величинам для природных глобулярных белков близкой молекулярной массы (Шейку, 1993) Подобный характер перехода наблюдается у глобулярных белков со стабильной компактной структурой, что подтверждает наличие у альбебетина с фрагментом интерферона такой структуры при концентрации мочевины 0-4 М, т.е. до начала перехода.

РАДИОАКТИВНОСТЬ,

тыс. имп/мин

60

40

20

0

Рис.22. FPLC-хроматография продуктов трансляции альбебетина с фрагментом интерферона на колонке Superóse 12 в нативных условиях (о-о) и в присутствии 9 М мочевины (х-х). По оси ординат отложена радиоактивность фракций, определенная после осаждения трихлоруксусной кислотой.

10 20 30 40

НОМЕР ФРАКЦИИ

Для более детального анализа структурных характеристик альбебетшга с фрагментом интерферона мы наработали искусственный белок в Е.соИ с помощью той же системы экспресии с мальтозосвязывающим белком, которая использовалась для получения альбебелша. Это позволило выяснеть, соответствует ли его структура состоянию расплавленной глобулы, а также исследовать альбебетин с фрагментом интерферона методом кругового дихроизма. На рис.23 показан спектр кругового дихроизма альбебетина с фрагментом интерферона в сравнении со спектром альбебетина.

ЭЛЛИПТИЧНОСТЬ, мград 4

2

О

■2

-4

-6

180 190 200 210 220 230 240 250 ДЛИНА ВОЛНЫ, ии

Рис.23. Спектр кругового дихроизма альбебетина с фрагментом

интерферона (-). Для сравнения приведен спектр альбебетина (--).

Экспериментальные условия те же, что и в подписи к рис.19.

Из рисунка видно, что спектры обоих белков весьма близки. Их анализ показывает, что альбебетин с фрагментом интерферона содержит примерно на 10% меньше регулярной вторичной структуры, чем альбебетин. Это согласуется с естественным предположением, что фрагмент интерферона, находящийся в петлевом участке в молекуле интерферона, не образует регулярную вторичную структуру также и в составе альбебетшга. Для выяснения, находится ли альбебетин с фрагментом интерферона в состоянии расплавленной глобулы, мы также использовали метод КД и исследовали зависимость эллиптичности при длине волны 220 нм от температуры. Как и в случае альбебетина, была получена гладкая кривая без признаков кооперативного температурного плавления в интервале

температур от 15 до 95 °С, что показывает, что при введении фрагмента интерферона искуествсшшй белок сохранил свойства состояния расплавленной глобулы. Недавно это было подтверждено также с помощью метода ядерного магнитного резонанса в лаборатории К.Добсона в Оксфордском университете.

Таким образом, приведенные выше данные свидетельствуют о том, что структурные характеристики молекулы альбебетина с фрагментом интерферона весьма близки к характеристикам самого альбебетина и это позволяет считать, что введенный фрагмент не нарушил существенным образом общую структуру искусственного белка. Для тестирования биологической активности альбебетина с фрагментом интерферона мы исследовали влияние белка на реакцию бласт-трансформации тимоцитов мыши и его ингибиторный эффект на связывание с рецепторами тимоцитов радиоактивно меченного фрагмента интерферона в виде окгапегшща ЬКЕККУЗР. Данные по ингибированию связывания показаны на рис.24.

ИНГИБИРОВАНИЕ, %

КОНЦЕНТРАЦИЯ, М

Рис.24. Конкурентное ингибироватте альбебетином с фрагментом интерферона специфического связывания меченного 1351 октапенгида ЬКЕККУБР (4,4 х 10"иМ) с тимоцигами мыши. По оси ординат отложена величина ингибирования связывания в процентах, по оси абсцисс -молярная концентрация ингибитора. Стрелкой показано графическое определение величины 1С50.

Из рисунка видно, что полученный нами белок эффективно конкурирует с октапептидом за рецепторы тимоцитов. Из графика мы определили величину IC50, соответствующую 50% ингибироваппя, и вычислили константу ингибирования по (Cheng & Prusoff, 1973) как показано в таблице 1. Из таблицы следует, что альбебетин с фрагментом интерферона имеет высокое сродство к рецепторам тимоцитов мыши и свзываст их заметно более эффективно, нежели сам интерферон. Данные по активации реакции бласт-трансформации показаны на рис.25. Из рисунка видно, что альбебетин с фрагментом интерферона является сильным активатором этой реакции и активирует бласт-трансформацшо тимоцитов даже несколько эффективнее, т.е. при более низких концентрациях, чем интерферон.

Полипепгид Kd(M) IC50 (М) Ki(M)

Альбебетин с фрагментом интерферона - 1,6 х 10-1° 1,4 х 10-П

Интерферон ct2 человека 2,5 х 10-1° 9,9 х 10"9 8,6 х 10-Ю

Фрагмент интерферона в виде октапептида LKEKKYSP 4,2 х 10-12 - -

Таблица 1. Параметры связывания альбебетина с фрагментом интерферона и человеческого интерферона с рецепторами тимоцитов мыши. Для сравнения приведена величина К^ для фрагмента интерферона в виде октапептида согласно ^ау'уа1о\' е1 а1., 1991). Величина К^ интерферона а2 человека определена для меченного 135Г белка.

Таким образом, подученный нами белок - альбебетин с фрагментом интерферона - обладает компактностью и относительной стабильностью и имеет общую пространственную структуру близкую, или, по крайней мере, не противоречащую первоначельно заданной структуре альбебетина. Он высокоэффективно связывает рецепторы тимоцитов мыши и обладает высокой бласт-трансформирующей активностью при концентрациях порядка 10"11 М. Это позволяет нам сделать вывод, что мы действительно получили первый биологически активный искусственный белок.

РАДИОАКТИВНОСТЬ, тыс. ими/мин

100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0

Рис.25. Активация бласт-грансформации тимоцигов мыши альбебетином с фрагментом интерерона (а). По оси ординат показано включение радиоактивного [3Н] в тимоциты при бласг-трансформации, по оси абсцисс - молярная концентрации белка. Контроль соответствует бласт-трансформации тимоцигов без добавления альбебетина с фрагментом интерферона. Для сравнения показаны данные (Ь) для человеческого интерферона, взятые из работы 2ау'уа1оу ег а!. (1991).

Причиной высокой активности полученного белка является, по-видимому, значительная гибкость фрагмента интерферона (находящегося в ?\Г-конце молекулы), позволяющая ему "подстроиться" под конформацшо рецептора. Для моделирования ситуации, когда фрагмент интерферона будет

Ю-18 10-8

КОНЦЕНТРАЦИЯ, М

менее гибким, мы получили также модифицированный вариант альбебетина с фрагментом шггерферона, отличающийся первой аминокислотой, а именно, содержащей остаток изолейцина вместо метионина (при использовании системы экспрессии в виде слитных белков в первой позиции может быть любой аминокислотный остаток, а не только метиониновый). Мы полагали, что гидрофобный остаток изолейцина может "залипнуть" на гидрофобное ядро молекулы, так что гидрофильный фрагмент шггерферона окажется в виде петли. Исследование такой белковой конструкции показало, что она практически не обладает биологической активностью и связыванием с рецепторами. Это позволяет предположить, что для проявления активности фрагменту шггерферона действительно необходима специфическая конформация или высокая гибкость (хотя мы не можем исключить, что остаток изолейцина стерически осложняет связывание с рецептором).

В нашей работе бласт-трансформирующая активность интерферона была перенесена на альбебетин с помощью короткого пептидного фрагмента - линейного участка последовательности интерферона, самого обладающего такой активностью. Получение функциональной активности, опосредуемой пространственно организоватгым активным центром в данном случае не представлялось возможным ввиду отсутствия точной информации о структуре молекулы альбебетина, которая может быть получена методом реитгеноструктурного анализа или ЯМР. Однако в настоящее время появились данные, что даже те биологические активности (связашше прежде всего с белок-белковым взаимодействием), которые соответствуют пространственно организованным активным центрам, могут моделироваться пептидными фрагментами. Была разработана методика фагового дисплея, позволяющая искать такие фрагменты путем включения случайных последовательностей в белки оболочки нитевидных фагов и отбора фаговых колоний, обладающих сродством к заданному рецептору. Применение этих методов позволяет существенно расширить круг биологических активностей, которые могут быть перенесены с одного белка на другой и включены в состав искусственных белков.

Искусственные белки представляют собой удобную модель для иследования отдельных биологических активностей сложных природных белков. "Привитие" какой либо одной активности на искусствешшй белок позволяет изолировать и детально исследовать эту активность, исключая перекрестное влияние других активностей. Альбебетин был сконструирован исходя из основных принципов формирования белковых структур, это небольшой белок, его первичная структура достаточно проста и не имеет гомологии с природными белками, поэтому можно предполагать, что он не будет обладать сильной иммуногенностью. Это также может представлять интерес для дизайна биологически активных белковых конструкций с полезными медицинскими и биотехнологическими свойствами.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено новое состояние белковых молекул, промежуточное по своим свойствам между пативным и полностью развернутым состояниями белка, получившее название состояния расплавленной глобулы. Это состояние характерно для многих белков при умеренных концентрациях денатуратов, изменении рН среды, нагреве и других дестабилизирующих воздействиях. В результате его детального изучения с помощью многих физических методов, несущих информацию о различных уровнях организации белковых структур, выявлены основные свойства состояния расплавлешюй глобулы и предложена его модель. Согласно этой модели состояние расплавлешюй глобулы соответствует уменьшению ван-дер-ваальсовых и других специфических взаимодействий, определяющих уникальную третичную структуру белка и размораживанию мелкомасштабных флуктуаций структуры, в то время как водородные связи главной цепи и гидрофобные взаимодействия в молекуле белка в значительной степени сохранены.

2. Показано, что состояние расплавленной глобулы накапливается в процессе ренатурации белков, то есть является кинетическим промежуточным состоянием на пути сворачивания белка in vitro. Сделано предположение об участии состояния расплавленной глобулы в процессе самоорганизации белка in vivo а также других процессах, связанных со структурой и функцией белков. В настоящее время это предположение получило подтверждение во мношх исследованиях, посвященных роли состояния расплавленной глобулы в процессах взаимодействия вновь синтезированных белков с шаперонами, транспорта белков через клеточную мембрану, связывания с лигандами, в получении мутантных и искусственных белков и т.д.

3. С помощью методов генной инженерии получен искусственный белок альбебегин, сконструированный под заданную пространственную структуру, образованную двумя a-спиралями лежащими на ангипараллельном ()-листе, которая не наблюдалась до сих пор в природных белках. Для его первичного исследования применена новая методика быстрого тестирования структуры мутантных и искусственных белков, позволяющая оценивать их общие структурные свойства, используя минимальные количества радиоактивно меченного образца, полученного в бесклеточной системе трансляции, без его предварительной очистки.

4. Получена эффективная система экспрессии искусственных белков в E.coli в виде слитных белков с мальтозо-связывающим белком с их последующим расщеплением высокоспецифичной протеазой фактор Ха. Эта система экспрессии позволила наработать альбебетин и его биологически активный вариант в препаративных количествах с использованием аффинной хроматографии на амилозной смоле.

5. Поведено детальное исследование структуры искусственного белка альбебетина с помощью ряда физико-химических методов и установлено, что альбебетин находится в состоянии, соответствующем состоянию расплавленной глобулы. Показано, что он обладает близкой к заданной

вторичной структурой и компактной и относительно стабильной пространственной структурой, не противоречащей заданной. 6. На базе альбебетина получен первый искусственный белок, обладающий заданной функцией: биологически активный фрагмент 131-138 интерферона «2 человека, активирующий бласт-трансформацию тимоцитов мыши, включен в состав искусственного белка. Проведено исследование общих структурных характеристик и биологических свойств альбебетина с фрагментом интерферона и показано, что он сохраняет компактность и относительную стабильность альбебетина, обладает высокой аффинностью к рецепторам на поверхности тимоцитов мыши и активирует реакцию бласт-трансформации тимоцитов при концетрациях порядка Ю-11 М. Таким образом, показана возможность использования искусственнных белков в качестве носителей отдельных биологических функций природных белков, что позволяет выделять исследуемые функции "в чистом виде", отделяя юс от других активностей исходных природных белков для детального изучения, получения модельных белковых конструкций, не обладающих побочными активностями, и других целей.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Статьи в отечественных журналах:

1. Гильманшин Р.И., Долгих Д.А., Птицын О.Б., Финкелынтейн A.B., Шахнович Е.И. Белковые глобулы без уникальной пространственной структуры: экспериментальные данные для а-лактальбумшюв и общая модель. // Биофизика. 1982. Т.27. No.6. С. 1005-1016.

2. Птицын О.Б., Долгих Д.А., Гильманшин Р.И., Шахнович Е.И., Финкельштейн A.B. Флуктуирующее состояние белковой глобулы. // Молекулярная биология. 1983. Т.17. No.3. С.569-576.

3. Долгих Д.А., Абатуров Л.В., Бражников Е.В., Лебедев Ю.О., Чиргадзе Ю.Н., Птицын О.Б. Кислая форма карбоангидразы: "расплавленная глобула" с вторичной структурой. // Доклады АН СССР. 1983. Т.272. No.6. С. 14811484.

4. Савченко P.C., Железная Л.А., Долгих Д.А., Матвиенко Н.И. Два новых промотора для РНК-иолимеразы фага SP6 локализованы за геном РНК-полимеразы. // Доклады АН СССР. 1988. Т.300. No.3. С.736-739.

5. Долгих Д.А., Федоров А.Н., Чемерис В.В., Чернов Б.К., Финкельштейн A.B., Шульга A.A., Алахов Ю.Б., Кирпичников М.П., Птицын О.Б. Получение и исследование альбебетина, искусственного белка с заданной пространственной структурой. // Доклады АН СССР. 1991.Том 320. No.5. Стр.1266-1270.

6. Долгих Д.А., Федоров А.Н., Чсмерис В.В., Финкельштейн A.B., Шульга A.A., Габриэлян А.Э., Птицын О.Б., Кирпичников М.П. Искусственный

белок с заданной пространственной структурой : дизайн, получение и исследование. //Биотехнология. 1992. No.5. С.18-21.

7. Долгих Д.А., Кирпичников М.П., Птицын О.Б., Федоров А.Н., Фипкельштейн А.В., Чемерис В.В. Белок da novo с заданной пространственной структурой: новые подходы к конструированию и анализу. // Молекулярная биология. 1992. Том 26. No.6. С.758-767.

8. Долгих Д.А., Габриэлян А.Э., Наволоцкая Е.В., Чемерис В.В., Кирпичников М.П. Искусственный белок с заданной пространственной структурой и биологической активностью. // Биофизика. 1993. Том 38. No.l. С.67-74.

9. Долгих Д.А., Кирпичников М.П., Птицын О.Б., Чемерис В.В. Белковая инженерия искусственных белков. // Молекулярная биология. 1996. Т.ЗО. No.2. С.261-272.

10. Aphasizheva I.Yu., Dolgikh D.A., Navolotskaya E.V., Zav'yalov V.P., Kirpichiiikov M.P. Biological activity of de novo proteins incorporating an interferon fragment. // Russian J. Immunol. 1996. In press.

Статьи в международных журналах:

11. Dolgikh D.A., Gilmanshin R.I., Brazhnikov E.V., Bychkova V.E., Semisotnov G.V., Venyaminov S.Yu., Ptitsyn O.B. a-Lactalbumin: compact state with fluctuating tertiary structure? // FEBS Letters. 1981. Vol.136. No.l. P.311-315.

12. Dolgikh D.A., Kolomiets A.P., Bolotina LA., Ptitsyn O.B. "Molten globule " state accumulates in carbonic anhydrase folding. // FEBS Letters. 1984. Vol.165. No.l. P.88-92.

13. Brazhnikov E.V., Chiigadze Yu.N., Dolgikh D.A., Ptitsyn O.B. Non-cooperative temperature melting of a globular protein without specific tertiary structure: acid form of bovine carbonic anhydrase B. // Biopolymers. 1985. Vol.24. No. 10. 1899-1907.

14. Dolgikh D.A., Abaturov L.V., Bolotina I.A., Brazhnikov E.V., Bychkova V.E., Gilmanshin R.I., Lebedev Yu.O., Semisotnov G.V., Tiktopulo E.I., Ptitsyn O.B. Compact state of a protein molecule with pronounced small-scale mobility: bovine a-lactalbumin. // European Biophysical Journal. 1985. Vol.13. No.l. P.109-121.

15. Timchenko A.A., Dolgikh D.A., Damashun H., Damashun G. Comparison of native and "acidic" forms of bovine a-lactalbumin by diffuse X-ray scattering. // Studia biophysica. 1986. Vol.112. No.2-3. P.201-206.

16. Fedorov A.N., Dolgikh D.A., Chemeris V.V., Chernov B.K., Finkelstein A.V., Schulga A.A., Alakhov Yu.B., Kiipichnikov M.P., Ptitsyn O.B. De novo design, synthesis and study of albebetin, a polypeptide with a predetermined three-dimensional structure. Probing the structure at nanogram level. // Journ. Mol. Biol. 1992. Vol.225. P.927-931.

17. Chemeris V.V., Dolgikh D.A., Fedorov A.N., Finkelstein A.V., Kirpichiiikov M.P., Uversky V.N., Ptitsyn O.B. A new approach to artificial and modified proteins: theory-based design, synthesis in a cell-free system and fast testing of structural properties by radiolabels. // Protein Engineering. 1994. Vol.7. P.1041-1052.

18. Dolgikh D.A., Fedorov A.N., Finkelstein A.V., Ptitsyii O.B., Skryabin K.G., Kirpiehnikov M.P. Protein engineering of albebetin, a de novo protein with a predesigned three-dimensional structure. // In: Molecular Manufacturing. ELB.A. Forum Series, ed. by C.Nicolini, Vol.2. Plenum Press, New York, 1996. P.101-114.

19. Dolgikh D.A., Uversky V.N., Gabrielian, A.E., Chemeris V.V., Fedorov A.N., Navolotskaya, E.V., Zav'yalov, V.P., Kirpichnikov M.P. The de novo protein with attached biological function: transferring of interferon blast-transforming activity to albebetin. // Protein Engineering. 1996. Vol.9. No.2. P.195-201.

20. Dolgikh D.A., Gabrielian A.E., Uversky V.N., Kiipiclmikov M.P. Protein engineering of de novo protein with predesigned structure and activity. // Applied biochemistry and biotechnology. 1996. In press.

Тезисы отечественных конференций:

21. Веньяминов С.Ю., Долгих Д.Л. Какова структура глобулярных белков в денатурированном теплом состоянии? // Тезисы докладов IV Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров. Харьков. 1981. С.34-35.

22. Долгих Д.А., Гильмапшин Р.И. Частично-денатурированное состояние белковых молекул. // Тезисы докладов I Всесоюзного биофизического съезда. Москва. 1982. С.13.

23. Долгих Д. А., Коломиец А.П., Абатуров Л.В., Бражников Е.В., Болотина И.А., Лебедев Ю.О., Цалкова Т.Н., Птицын О.Б. Равновесные и кинетические ггромежуточные состояния карбоангадразы. Тезисы I Всесоюзного биофизического съезда. Москва. 1982. С.20.

24. Бражников Е.В., Долгих Д.А. Совпадение вторичной структуры карбоангадразы В в температурно-денатурированном состоянии и в кислой форме. // Тезисы докладов V Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров. Харьков. 1984. С.29.

25. Бражников Е.В., Чиргадзе Ю.Н., Долгих Д.А., Птицьш О.Б. Некооперативное температурное разрушение вторичной структуры глобулярного белка без уникальной третичной структуры: кислая форма карбоангадразы В. // Тезисы докладов V Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров. Харьков. 1984. С.29-30.

26. Семисотнов Г.В., Гильманншн Р.И., Долгих Д.А., Коломиец А.П., Кугашснко В.П., Родионова H.A. Стадийность разворачивания и сворачивашгя карбоангадразы В. // Материалы VI Всесоюзного ашпозиума по конформационным изменениям биополимеров в растворах. Тбилиси. 1985. С.11.

27. Долгих Д.А., Федоров А.Н., Чемерис В.В., Финкельштейн A.B., Шульга A.A., Кирпичников М.П., Птицын О.Б. Искусственный белок с заданной пространственной структурой : дизайн, получение и исследование. // V конференция Российской Федерации "Новые направления биотехнологии", тсзиси докладов. 1992. Пущино. С.77.

Тезисы международных конференций:

28. Ptitsyn О.В., Dolgikh D.A., Gilmanshin R.I., Fiakelstein A.V., Shakhnovich E.I. A novel physical state of a protein molecule - fluctuating ("molten") globule. // XVI FEBS conference, abstracts. Moscow. 1984. P.333.

29. Dolgikh D.A., Fedorov A.N., Chemeris V.V., Chernov B.K., Finkelstein A.V., Schulga A. A., Alakhov Yu.B., Ptitsyn O.B., Skiyabin K.G., Kirpichnikov M.P. Design, synthesis and investigation of the de novo protein with predetermined three-dimensional structure // Biomolecular engineering and bioelectronics. Abstracts of the international symposium. Moscow, USSR. 1991. P.8.

30. Ptitsyn O.B., Bychkova V.E., Dolgikh D.A., Semisotnov G.V., Uversky V.N. Molten globule and protein folding // Modern problems of physical chemistry of macromolecules. International school-seminar. Pushchino, USSR. 1991. Abstracts. P.57-58.

31. Fedorov A.N., Dolgikh D.A., Chemeris V.V., Chernov B.K., Finkelstein A.V., Schulga A.A., Alakhov Yu.B., Kirpichaikov M.P., Ptitsyn O.B. Construction, synthesis and investigation of the de novo polypeptide with predicted three-dimensional structure // Modern problems of physical chemistry of macromolecules. International school-seminar. Pushchino, USSR. 1991. Abstracts. P.94.

32. Fedorov A.N., Dolgikh D.A., Chemeris V.V., Chernov B.K., Finkelstein A.V., Schulga A.A., Alakhov Yu.B., Kirpichnikov M.P., Ptitsyn O.B. Construction, synthesis and investigation of the de novo polypeptide with predicted three-dimensional structure // Jorn. Cell. Biochem. Suppl. 15G. 1991. P.207.

33. Fedorov A.N., Dolgikh D.A, Chemeris Y.V., Chernov B.K., Finkelstein A.V., Schulga A.A., Alakhov Yu.B., Kirpichnikov M.P., Ptitsyn O.B. A de novo design, synthesis and investigation of albebetin, a polypeptide with predetermined three-dimensional structure // Protein biosynthesis. International conference. Pushchino, USSR. 1991. Abstracts. P.41.

34. Dolgikh D.A., Fedorov A.N., Chemeris V.V., Chernov B.K., Finkelstein A.V., Schulga A.A., Alakhov Yu.B., Kirpichnikov M.P., Ptitsyn O.B., Engineering and investigation of the de novo protein with predesigned structure // Prediction and experiment. Three-dimensional structure of gomologous proteins. First international CAPE symposium. Braunschweig, Germany. 1991. Abstracts. P.45.

35. Gabrielian A.E., Dolgikh D.A., Ivanova N.B., Kirpichnikov M.P. Database of continuous protein-protein interaction sites: analysis of functionally important elements of primary structures and design of proteins with predetermined function. // II Russian-Israel Symposium on Peptides & Proteins. 1992, Moscow. Abstracts. P. 37.

36. Ptitsyn O.B., Fedorov A.N., Dolgikh D.A., Chemeris V.V., Finkelstein A.V., Kirpichnikov M.P. Design, synthesis and investigation of artificial protein with pre-determined structure. // II Russian-Israel Symposium on Peptides & Proteins. 1992, Moscow. Abstracts. P.33.

37. D.A.Dolgikli, G.Niakatura, T.Domke, S.Emery, H.Bloecker, M.P.Kirpichnikov, D.Shomburg. Expression in a fusion expression system of de novo proteins and their investigation. // "Molecular Genetics in Modern Biotechnology." International Conference. Mallorca, Spain. 1993. Abstracts. P.63.

38. A.E.Gabrielian, D.A.Dolgikh, A.A.Shulga, M.P.Kirpichnikov. The de novo protein with pre-determined three-dimensional structure and attached biological activity. // "INPEC'93". International conference. Osaka, Japan. 1993. Abstracts. P.ll-12.

39. Ptitsyn O.B., Chemeris V.V., Dolgikh D.A., Fedorov A.N., Finkelstein A.V., Kirpichnikov M.P., Uversky V.N. A new approach to artificial proteins: theory-based design, synthesis in the cell-free system and structural probing at the nanogram level. // Protein Engineering. 1993. Vol.6. Suppl. P.122.

40. V.V. Chemeris, D.A.Dolgikh, A.N.Fedorov, A.V.Finkelstein, M.P.Kirpichnikov, V.N.Uversky, O.B.Ptitsyn. A new approach to artificial and modified proteins. V International summer school on biophysics. Rovinj, Croatia. 1994. Abstracts. P.76.

41. D.A.Dolgikh, M.P.Kirpichnikov. The de novo protein possessing biological activity. // 23 FEBS Meeting. Basel, Switzerland. 1995. Abstracts. P.294

42. Афасижева И.Ю., Абдуллаев 3.X., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Получение и исследование различных систем экспрессии генов искусственных белков в E.coli. // Международная конференция, посвящяшая памяти акад. А.А.Баева. Москва, 1996. Тезисы. С.76.

ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА;

(цитируемые в тексте работы с участием автора приведены в списке публикаций по теме диссертации)

Бычхова В.Е., Бартошевич С.Ф., Кленин С.И. Срав1штельное исследование коэффициентов диффузии а-лактальбуминов и лизоцима с помощью поляризационного интерферометра. // Биофизика. 1990. Т.35. С.242-248.

О.Б.Птицьш. Стадийный механизм самоорганизации белковых молекул. // Доклады АН СССР. 1973. Т.210. С. 1213-1215.

Argos P. Analysis of sequence-similar pentapeptides in unrelated protein tertiary structures. Strategies for protein folding and a guide for site-directed mutagenesis. // J. Mol. Biol. 1987. Vol. 197. P. 331-348.

Baldwin R.L. Pulsed H/D exchange studies of folding intermediates. // Cuir. Biol. 1993. Vol.3. P.84-91.

Balkwill F.R., Burke F. The cytokine network. // Immunol. Today. 1989. Vol.10. P.299-304. Bychkova V.E., Berni R., Rossi G.-L., Kutyshenko V.P., Ptitsyn O.B. Retinol-binding protein is in the molten globule state at low pH. // Biochemistry. 1992. Vol.31. P.7566-7571. Bychkova V.E., Ptitsyn O.B. The molten globule in vitro and in vivo. // Chemtracts-Biocliemistry and Molecular Biology. 1993. Vol.4. P.133-163.

Bychkova V.E., Ptitsin O.B. Folding intermediates are involved in genctic disease? // FEBS Lett. 1995. Vol.359. P.6-8.

Chyan C.-L., Wormald C., Dobson C.M., Evans P.A., Baum J. Structure and stability if the molten globule state of guinea-pig a-lactalbumin: a hydrogen exchange study. // Biochemistry. 1993. Vol.32. P.5681-5691.

Cheng Y.C., Prusoff W.H. Relationship between the inhibition constant (Kj) and the concentration of inhibitor which caused 50 per cent inhibition (I50) of an cnzymatic reaction. // Biochem. Pharmacol. 1973. Vol. 22. P. 3099-3108.

Cieigtaon Т.Е. Electrophoretic analysis of the unfolding of proteins by urea. // J. Mol. Biol. 1979. Vol. 129. P. 235-264.

Erickson AH., Blobel, G. Cell-free translation of messenger RNA in a heat germ system. // Meth. Enzymol. 1983. Vol.96. P.38-49.

Ewbank J.J., Creighton Т.Е. The molten globule protein conformation probed by disulphide bonds. // Nature. 1991. Vol.350. P.518-520.

Finkelstein A.V., Ptitsyn O.B. Why do globular proteins fit the limited set of folding patterns? // Progr. Biophys. and Mol.Biol. 1987. Vol. 50. P. 171-190.

Gast K., Zirver D., Welfle H., Bychkova V.E., Ptitsyn O.B. Quasielectric light scattering from human a-lactalbumin: comparison of molecular dimensions in native and "molten globule" states. // Int. J. Biol. Macromol. 1986. Vol.8. P.231-236.

Hecht M.H., Richardson J.S., Richardson D.C., Ogden R.C. De novo design, expression and characterization of fclix: a four-helix bundle protein of native-like sequence. // Science. 1990. Vol.249. P.884-891.

Hua Q.-X., Kochoyan M., Weiss M.A. Structure and dynamics of des-pentapeptide-insulin in solution: the molten-globule hypothesis. // PNAS. 1992. Vol.89. P.2379-2383. Hua Q.-X., Ladbury J.E., Weiss M.A. Dynamics of a monomelic insulin anologue: testing the molten-globule hypothesis. // Biochemistry. 1993. Vol.32. P.1433-1442.

Hughson F.M., Barric D., Baldwin R.L. Structural characterization of a partly folded apomyoglobm intermediate. // Science. 1990. Vol.249. P.1544-1548.

Jennings P.A., Wright P.E. Formation of a molten globule intermediate early in the kinetic folding pathway of apomyoglobin. // Science. 1993. Vol.262. P. 892-896.

Kuwajima K. A folding model of a-lactalbumin deduced from the three-state denaturation mechanism. //J. Mol. Biol. 1977. Vol. 114. P. 241-258.

Lang K., Schmid F.X. Use of trypsin-pulse method to study the refolding pathway of ribonuclease. // Eur. J. Biochem. 1986. Vol.159. P.275-281.

Martin J., Langer Т., Botcva R., Schamel A., Horwich A.L., Haiti F.-U. Chaperonin-mediated protein folding at the surface of GroEL through a "molten globule"-like intermediate. Nature. 1991. Vol.352. P.36-42.

Merril A.R., Cohen F.S., Cramer W.A. On tlie nature of the structural change of the colicin El channel peptide necessary for its translocation-competent state. // Biochemistry. 1990. Vol.29. P.5829-5836.

Milstein S.J., Leipold H., Sarubbi D., Leone-Bay A., Mlynek G.M., Robinson J.R. Oral bioavailability of partially folded proteins. 1996. In press.

Ohgushi M., Wada A. "Molten-globule state": A compact form of globular proteins with mobile side-chains. //FEBS Lett. 1983. Vol.164. P.21-24.

Peng Z., Kim P.S. A protein dissection study of a molten globule. // Biochemistry. 1994. Vol.33. P.2136-2141.

Privalov P.L. Stability of proteins. Small globular proteins. // Adv. Protein Chcm. 1979. Vol.33. P.167-241.

Provencher S.W., Gloeckner, J. Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism. Biochemistry. 1981. Vol.20. P.33-37.

Ptitsyn O.B. Molten globule and protein folding. // Adv. Protein Chem. 1995. Vol.47. P.83-229. Ptitsyn O.B., Uversky V.N. The molten globule is a third thermodinamical state of protein molecules. // FEBS Lett. 1994. Vol.341. P.15-18.

Roder H. Eloeve G. Early stages of protein folding. // In: Frontier in Molecular Biology, ed. by Pain R.H. Oxford University Press. Oxford. 1994. P.26-59.

Sander C. Design of protein structures: helix bandle and beyond. // Trends in Biotechnology. 1994. Vol.12. P. 163-167.

Semisotnov G.V., Rodionova N.A., Razgulyacv O.I., Uversky V.N., Gripas' A.F., Gilmanshin R.I. Study of the molten globule intermediate state by a hydrophobic fluorescent piobe. // Biopolymers. 1991. Vol.31. P.119-128.

Spinn A.S., Baianov V.l., Ryabova L.A., Ovodov S.Yu., Alakhov Yu.B. A continuous cell-free translocation system capable of producing polypeptides in high yield. // Science. 1988. Vol.242. P. 1162-1164.

Studier F.W., Rosenberg A.H., Dunn J.J., Dubcndorff, S.W. Use of T7 RNA polymerase to direct the expression of cloned genes. // Mcth. Enzymol. 1990. Vol.185. P.60-89.

Tanaka T., Kuroda Y., Kimura II., Kidokoro S., Nakamura H. Cooperative deformation of a de novo designed protein. 11 Protein Engineering. 1994. Vol.7. P.969-976.

Uveisky V.N. Use of fast protein size-exclusion liquid chromatography to study the unfolding of proteins which denature through the molten globule. // Biochemistry. 1993. Vol.32. P.13288-13298.

Uversky V.N., Ptitsyn O.B. "Partly folded" state, a new equilibrium state of protein molecules: four-state guanidinium chloride-induced unfolding of ß-lactamase at low temperature. // Biochemistry. 1994. Vol.33. P.2782-2791.

Van der Goot F.G., Gonzales-Manes J.M., Lakey J.H., Pattus F. Molten globule membrane-insertion intermediate of the pore-forming domain of colicine-A. // Nature, 1991. Vol. 354. P.408-410.

Wu L.C., Laub P.B., Eloeve G.A., Carey J., Roder H. A noncovalent peptide complex as a model for an early folding intermediates of cytochrome c. // Biochemistry. 1993. Vol.32. P.10271-10276. Yang Y., Janich S., Cohn J.A., Wilson I.M. The common variant of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator is recognized by hsp70 and degraded in a pre-Golgi nonlysosomal compartment. // PNAS. 1993. Vol.90. P.9480-9484.

Zav'yalov V.P., Navolotskaya E.V., Abramov V.M., Galaktionov V.G., Isaev I.S., Kaurov O.A., Kozliich A.T., Mayorov V.A., Prusakov A.N., Vasilenko R.N., Volodina E.Yu. Tlie octapeptide corresponding to the region of the highest homology between a-interferon and thymosin aj effectively competes with both cjtokines for common liigh-aflimty receptors on murine thymocytes. // FEBS Lett. 1991. Vol. 278. P. 187-189.