Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моделирование топологии искусственного белка альбебетина: циркулярная пермутация рибосомального белка S6

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Моделирование топологии искусственного белка альбебетина: циркулярная пермутация рибосомального белка S6"

с.

Л На правах рукописи

■V УДК 577.322

Ч

АБДУЛЛАЕВ ЗИЕДУЛЛА ХИКМАТУЛЛАЕВИЧ

МОДЕЛИРОВАНИЕ ТОПОЛОГИИ ИСКУССТВЕННОГО БЕЛКА АЛЬБЕБЕТИНА: ЦИРКУЛЯРНАЯ ПЕРМУТАЦИЯ РИБОСОМАЛЬНОГО БЕЛКА 56

03.00.03- Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1998

Работа выполнена в Цешре "Биоинженерия" РАН и Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научные руководители:

академик РАН, доктор биол. наук М П. Кирпичников доктор биол. наук Д.А. Долгих

Официальные оппоненты:

доктор биол. наук Е.В.Коротков доктор биол. наук А.И.Денесюк

Ведущая организация:

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Защита состоится "£7_" ноября 1998 года в // часов на заседании Диссертационного совета Д 200.30.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 117334, Москва, ул. Вавилова, дом 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан " 2 3" октября 1998 г. Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат фармацевтических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ А1стуальность темы. Современный уровень знаний, накопленный в результате

исследования структурных свойств белков, дает возможность перейти к их активному

практическому применению. Конструирование искусственных белков или белков de

novo позволяет значительно расширить и пополнить имеющиеся знания о

закономерностях структурной организации белковых молекул, связи структуры белка и

функции. Первый белок de novo, полученный в 1988 г. в группе ДеГрадо (Regan &

DeGrado, 1988), отметил собой начало быстрого развития нового направления в

молекулярной биологии - белковой инженерии искусственных белков. В этом

направлении уже достигнуты значительные успехи (обзоры Hecht, 1996; Долгих и др.,

1996), однако сконструированные к настоящему времени искусственные белки, все еще

уступают по стабильности и компактности природным белкам и находятся в состоянии,

называемом состоянием расплавленной глобулы (Ptitsyn, 1995).

Полученный ранее в нашей лаборатории искусственный белок альбебетин (Долгих и др., 1991; Fedorov et.al., 1991) обладает пространственной структурой типа aßßaßß (две а-спирали, лежащие на /?-листе). Топология этого белка уникальна и не наблюдалась в природных белках (рис.1), хотя и не противоречит никаким известным законам формирования белковых структур. Исследования альбебетина с помощью различных физико-химических методов показали, что он обладает компактной и относительно стабильной структурой, похожей на первоначально заданную (Fedorov et.al., 1991; Chemins et.al., 1994), но находится скорее в состоянии расплавленной глобулы, чем в состоянии соответствующем нативному состоянию природных белков. Можно предложить несколько возможных объяснений отсутствия у данного искусственного белка жесткой пространственной структуры:

1) противоречие топологии альбебетина каким-либо еще не известным законам формирования белковых структур, приводящая к тому, что нативный белок с такой топологией невозможно получить вообще;

2) отсутствие заданного пути сворачивания белка или, другими словами, центра сворачивания;

3) неплотная упаковка боковых аминокислотных групп внутри молекулы, возникающая в силу каких-либо неточностей дизайна;

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было анализ топологии, предложенной для альбебетина, и выяснение причин, ведущих к формированию у него состояния расплавленной глобулы. Исходя из целей работы, были сформулированы следующие задачи:

1) Выяснить принципиальную возможность получения сконструированной топологии:

а) найти природный белок с жесткой третичной структурой, имеющий сходное с альбебетином расположение элементов вторичной структуры в пространстве и клонировать его ген;

б) придать ему топологию альбебетина путем мутации;

в) разработать эффективную систему экспрессии и очистки изучаемых белков;

г) изучить и сравнить физико-химических свойства природного и мутантного белков и альбебетина;

2) Исследовать влияние на структуру альбебетина введения фрагмента 131-138 интерферона аг человека на 1Ч-концевую последовательность белка;

Научная новизна и практическая ценность работы. Клонирован ген рибосомального белка Б6 из ТЪегтия ¡ИегторИИиз. Проведен теоретический дизайн и получен циркулярно пермутированный вариант белка Б6. Получены бактериальные штаммы, продуцирующие в больших количествах природные и мутантные белки (до

50 мг/л). Разработана схема очистки рибосомального белка Э6 и пермугантного варианта рибосомального белка Э6. Проведено сравнительное исследование термостабильности, спектров кругового дихроизма и ядерного магнитного резонанса рибосомального белка Б6, пермутантного варианта рибосомального белка Б6, и модифицированного альбебетина и их равновесной денатурации в присутствии мочевины. Установлена возможность реализации новой топологии в пермутанте. Показано, что при гибридном синтезе процесс сворачивания пермутированного Бб осложнен связью с мальтозосвязывающим белком и/или отсутствием метионина в первом положении, что ведет к лабильности третичной структуры у белка.

Полученные результаты открывают возможность создания новых искусственных белков с заданной структурой и свойствами, которые могут быть применены для решения актуальных биотехнологических и медицинских задач.

Апробация работы. Материалы работы докладывались на следующих российских и международных конференциях: Втором съезде биохимического общества российской академии наук (Москва, 1997); II открытой городской научной конференции молодых ученых города Пущино (Пущино, Московская область, 1997); Конференции, посвященной 30-летию журнала "Молекулярная биология" (Москва, 1997); Международном симпозиуме "Структура белков, стабильность, фолдинг. фундаментальные и медицинские аспекты" (Москва, 1998).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано восемь печатных работ, в том числе 4 статьи в отечественных и международных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 103 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, содержит 2 таблицы и 19 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. ВОЗМОЖНА ЛИ ТОПОЛОГИЯ АЛЬБЕБЕТИНА?

1.1 Теоретический дизайн пермутированного белка 56

Результаты, описываемые в этом разделе, были получены совместно с Лабораторией физики белка Института белка РАН, г. Пущино.

Как показать, что топология, предложенная для альбебетина, принципиально возможна для получения и не препятствует образованию жесткой пространственной структуры? Решить этот вопрос можно, если найти природный белок с аналогичной топологией и компактной пространственной структурой. Однако обнаружить такой естественный нативный глобулярный белок не удалось. Поэтому было предложено провести циркулярную пермутацию природного белка, который имеет жесткую третичную структуру и укладку элементов вторичной структуры сходную с альбебетином, но обладает другой топологией. Эксперименты в этой области, освещенные в обзоре литературы, показали, что пермутанты, как правило, обладают жесткой третичной структурой, что дает основание предполагать, что пермутации фактически не разрушают структуру белка.

В качестве природного белка был выбран рибосомальный белок Э6 из Пегтиь /ИегторИНиз (1лгк1аЫ е1.а1., 1994), который имеет аналогичное с альбебетином расположение элементов вторичной структуры в пространстве, но отличается от искусственного белка ходом полипептидной цепи. Белок Б6—это небольшой глобулярный белок, состоящий из 101 аминокислотного остатка. Он был закристаллизован и его пространственная структура получена с высоким разрешением (1лпс1аЫ еГаК, 1994). На рис. 1 показан сравнительный ход полипептидной цепи в альбебетине и в белке Б6. Видно, что для придания белку Бб топологии альбебетина достаточно сшить природные И- и С- концевые последовательности и разрезать петлю

(справа). Обозначены природные Ы- и С-концы. Стрелкой условно указано место разрезания петли для образования новых Ы- и С-концов.

между первой а-спиралью и следующим за ней /2-слоем, т.е. необходимо провести циркулярную пермутацию данного белка.

На первом этапе работы был проведен теоретический дизайн пермутированного белка S6 с помощью пакета программ молекулярной графики "What If' (Vriend, 1990). Определяющим принципом этого дизайна было внесение по возможности наименьших модификаций в пространственную структуру белка. В результате было решено провести следующие изменения:

1) укорачивание белка на четыре С- концевых аминокислотных остатка;

2) удаление первых N-концевых Met и Arg;

3) разрезание исходной цепи белка S6 между Asnl3 и Leu 14;

4) сшивка прежних N- и С-концов петлей: Ala-Ser-Thr-Thr-Pro-Gly

Существенно, что названные изменения затрагивали только N- и С-концевые участки и петлю между первыми /3-слоем и а-спиралью, оставляя неизменным гидрофобное ядро молекулы.

1.2 Клонирование и секвенирование гена 56

Поскольку ген белка 56 не был клонирован и была известна лишь его

аминокислотная последовательность, он был получен с помощью метода полимеразной цепной реакции. При этом использовались вырожденные прямой и обратный праймеры о11_с1 и о11_г, комплементарные концам гена. При выборе последовательности праймеров учитывался тот факт, что у ТЪ. ¡ИегторИНиз в третьем положении кодона в 95% случаев встречается гуанин или цитозин. В состав праймеров были введены необходимые сайты рестрикции и регуляторные элементы для инициации и терминации трансляции. Матрицей служила хромосомная ДНК из ТЪлЪегторЬИиз. Продукт амплификации ожидаемого молекулярного веса был очищен, проклонирован в вектор рТ219Я и отсеквенирован. Секвенирование выделенной и очищенной ДНК и сравнение полученной нуклеотидной последовательности с известной аминокислотной последовательностью белка 86 показало, что проклонированный ген действительно соответствует белку Б6, и он не содержит ошибок. На рис. 2а представлена полученная нуклеотидная последовательность гена Б6 и "соответствующая ей аминокислотная

последовательность.

1 ATO CGC CGG' TAC GAO OTC AAC АТС GTC СТО AAC CCC AAC СТО OAC CAO AGC CAO CTC GCC 60

1MRRYEVNIVLNPNLDQGQLA 20

61 CTO GAG AAO GAG АТС АТС CAО CGG GCT CTG GAG AAC TAC GGC GCC CGC GTG GAG AAG GTG 120

21LEKEIIQRALENYGARVEKV 40

121 GAG GAG CTG GGG CTT CGC CGC CTG GCC TAC CCC АТС GCC AAG GAC CCC CAO GGC TAC TTC 180 (a)

41EELGLRRLAYPIAKDPQGYF 60

lei CTC TGG TAC CAG GTG GAO ATO CCC GAG GAC CGG GTO AAC GAC CTO GCC CGO GAG CTC CGC 240

ölLWYQVEMPEDR'VNDLARELR 80

241 АТС CGG GAC AAC GTO CGC CGG GTC ATG GTG GTG AAG TCC CAG GAG CCC TTC CTC GCC AAC 300

81IRDNVRRVMVVKSQEPFLAN 100 301 GCC TGA 101 A

1 ATO CTO GAC CAG AGC CAO CTC GCC CTO GAG AAO GAG АТС АТС CAO COO GCT CTG GAG AAC 60

IMLDQSQLALEKEIIQRALEN 20

61 TAC GGC GCC CGC ОТО GAG AAG GTG GAO GAG CTG GGG CTT CGC CGC CTG GCC TAC CCC АТС 120

21YGARVEKVEELGLRRLAYPI 40 (®)

121 GCC AAG GAC CCC CAG GGC TAC TTC CTC TGG TAC CAG GTO GAG ATG CCC GAß GAC CGG GTG 180

41AKDPQGYFLWYQVEM-PEDRV 60

181 AAC GAC CTG GCC CGG GAG CTC CGC АТС CGG GAC AAC GTG CGC CGG OTC ATG GTO GTG GCT 240

61NDLARELRIRDNVRRVMVVA 80 241 ТСС ACC ACC CCG GOT CGT TAC OAA GTT AAC АТС GTT CTG AAC CCG AAC TGA

81sttp'gryevnivlnpn*

Piic. 2. Нуклеотндные и соответствующие аминокислотные последовательности гена S6 (а) и пермутированного гена S6p (б).

1.3 Циркулярная пермутацня гена S6

На следующем этапе была проведена циркулярная пермутация гена S6, схема которой изображена на рис. 3. Как видно, пермутация сводится к перебрасыванию N-концевого /^-участка белка S6 на его С-конец. Пермутация проводилась с помощью двух последовательных полимеразных цепных реакций. При этом использовался один прямой праймер - o!2_d и два перекрывающихся обратных праймера - о!2а г и ol2b_r (в принципе, можно было использовать один обратный праймер, однако в этом случае его длина была бы более 80 нуклеотидов). Прямой праймер был комплементарен области первой а-спирали, поэтому синтез с этого праймера приводил к образованию гена, кодирующего белок, начинающийся с а-спирали, а не с уЗ-стренда (рис.3). Два обратных праймера обеспечивали двухступенчатое наращивание N-концевого Д-слоя на С-конец белка, так как содержали в своем составе соответствующую этому стрэнду нуклеотидную последовательность. Все дополнительные изменения, рассчитанные на основании теоретического анализа трехмерной структуры, затрагивали концевые участки и поэтому вносились с помощью тех же праймеров для ПЦР. Праймеры содержали в своей структуре необходимые замены и поэтому обеспечивали одновремен-

Нативный ген S6

Промежуточный продукт ПЦР

Циркулярно-пермупгровштый ген

3' Г"

Последовательность 1 р: 1 ct р 3 ос Р ,

элементов вторичной структуры белка S6 1ST ! 1 1 > 1 ! 0D г С

' 1

(X , р | Др,

I N

I

0=0

Г4

+

+

-I

Рис. 3. Общая схема проведения пермугации гена Б6. Условно изображены ДНК-матрицы и праймеры (/), оЧа г (2) и о12Ь_г (5). I и II -первая и вторая ПЦР соответственно. Под каждой из ДНК-матриц показана соответствующая ей последовательность расположения элементов вторичной структуры в кодируемом белке.

>

5

3

>

ное проведение как пермутации, так и сайт-направленного мутагенеза. В результате двух последовательных реакций был получен фрагмент, содержащий пермутированный ген и необходимые для дальнейшего клонирования сайты рестрикции.

Этот фрагмент был проклонирован в вектор для секвенирования и просеквенирован. Анализ полученной нуклеотидной последовательности показал, что ген имеет все необходимые нам изменения и не содержит ошибок (рис. 26).

1.4 Синтез белков в клетках E.coli

Для наработки пермутантного белка нами были параллельно использованы две системы экспрессии: (1) в виде гибрида с белком-носителем с дальнейшим отщеплением последнего и (2) прямая экспрессия.

Плазмида pMAL-c ("New England Biolabs", США) позволяет экспрессировать

клонированный ген в виде гибрида с мальтозосвязывающим белком. В векторе используется /ас-промотер, индуцируемый ИПТГ и сигнал инициации трансляции гена malE, что обеспечивает высокий уровень экспрессии клонированной последовательности и быструю очистку продукта трансляции с использованием аффинной хроматографии. Для клонирования в плазмиду pMAL-c в последовательность пермутированного гена с помощью ПЦР были введены фланкирующие сайты рестрикции ВатНХ и HindlU. Прямой праймер кодировал в своей структуре последовательность узнавания для специфической протеазы "фактора Ха", который позволяет отщепить мальтозосвязывающий белок. Протеаза расщепляет полипептидную цепь после участка распознавания, так что синтезированный белок не несет дополнительных аминокислот на N-концевой последовательности. В результате ПЦР был получен такой фрагмент и проклоннрован в плазмиду pMAL-c. Экспрессию рекомбинантных генов проводили в штамме E.coli XL 1-Blue. Белок, полученный из такой системы, обозначался S6p-F. В результате биосинтеза выход белка составлял

около 100 мг с 1 литра культуры, однако, после его расщепления фактором Ха и последующей очистки удавалось получить не более 5-7 мг пермутанта Ббр-Р.

Более результативной оказалась прямая экспрессия гена пермутированного белка с плазмиды рСЕМЕХ-1 ("Ргогт^а", США). Ген был проклонирован по сайтам рестрикции Ыйе\ и НтсйИ, что давало возможность использовать для их экспрессии все необходимые регуляторные элементы транскрипции и трансляции гена белка оболочки 10 бактериофага Т7. Поскольку инициация транскрипции осуществлялась с сильного фагового промотора с использованием Т7 РНК-полимеразы, это обеспечило высокий уровень экспрессии клонированной последовательности. Так как сайт инициации трансляции АТв совпадал с сайтом рестрикции ЫЫе\, синтезированный белок также не нес никаких дополнительных аминокислот на М-концевой последовательности. При прямой экспрессии гена пермутантного белка использовался штамм Е.соН ВЬ21(БЕЗ)рЬу58, который является лизогенным по бактериофагу ЦЭЕЗ) и несет участок ДНК с геном ¡асР2 и геном РНК-полимеразы фага Т7 под контролем промотора 1асЦУ5. Полученный из системы прямой экспрессии белок (30 мг белка с I литра культуры) обозначался Эбр-О.

Ген природного белка Бб был проклонирован в вектор рЕТ-Па ("№п^еп", США) по сайтам рестрикции М/е1 и ВатН1, в котором также используется система транскрипции фага Т7. Эта система позволила получить около 30 мг белка с 1 литра культуры клеток штамма Е.соН В1^21фЕЗ)рЬузЗ.

В работе были использованы природный Б6 белок и пермутированные варианты белка Эб, выделенные из системы прямой и гибридной экспрессии.

1.5 Препаративное выделение природного белка Б6 и его пермутантов

Индуцированные ИПТГ клетки растили 16 часов при 37°С при интенсивном

перемешивании. Затем клетки осаждали центрифугированием при 5 000§. Выделение

белка, синтезированного в виде гибрида с мальтозосвязывающим белком, проводили на аффинном сорбенте (амилозная смола) согласно инструкции фирмы-производителя. В случае прямой экспрессии клетки разрушали ультразвуком в 50 мл буфера для выделения (100 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитол, 0,1 мМ фенилметил-сульфонилфторид), водо-нерастворимый дебрис осаждали центрифугированием при 20 000g, нуклеиновые кислоты удаляли добавлением полиэтиленимина (0,04%) и последующим центрифугированием при 20 000g. Далее процедуры выделения для природного и пермутантного белков различались.

Для выделения пермутанта S6p-D супернатант наносили на колонку для анионообменной хроматографии, заполненной Q-сефарозой ("Pharmacia", 16x100 мм), уравновешенную буфером А (25 мМ Трис-HCl, рН 8,0). Элюцию проводили 200 мл градиента NaCl от 0 до 1 М в буфере А. После этого фракции, содержащие пермутантный белок, объединяли, диализовали против 10 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 6,8 и наносили на колонку для адсорбционной хроматографии с керамическим гидроксиапатитом ("BioRad", "Macro-Prep CHT5-I", 10x64 мм). Элюцию проводили 50 мл градиента 10-500 мМ натрий фосфатного буфера.

При выделении природного белка S6 супернатант наносили при тех же условиях на колонку с Q-сефарозой. Фракции, обогащенные целевым белком, находились в "проскоке" с колонки, т.е. не связывались с носителем (эта процедура позволяла избавиться от большого количества клеточных белков). Затем эти фракции диализовали против 10 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5,2 и наносили на колонку, содержащую носитель для катионообменной хроматографии ("Bio-Rad", "Macro-Prep High-S", 12x88 мм). Элюцию проводили 200 мл градиента 10-800 мМ натрий-ацетатного буфера.

Для анализа очистки белковых препаратов провели ВЭЖХ на обращенной фазе, ПААГ-электрофорез и определили по 5 а.о. с N-конца белковой молекулы.

1.6 Изучение структурных свойств пермутантов

Результаты, описываемые далее в этом разделе, были получены совместно с Лабораторией физики белка Института белка РАН г. Пущино.

Для изучения структурных свойств белков, были исследованы спектры кругового дихроизма (КД) в ближней и дальней УФ области. Известно, что спектр КД в ближнем УФ области определяется наличием асимметрии в окружении ароматических остатков белковой молекулы. Выраженный спектр КД в ближней УФ области является свидетельством существования у белковой молекулы жесткой третичной структуры, а спектр КД в дальней УФ области отражает степень симметричности окружения пептидных связей и позволяет характеризовать вторичную структуру белковой молекулы.

Из рис. 4а видно, что белки Э6 и Б6р-Э имеют выраженные и практически совпадающие спектры КД в ближней УФ области при нативных условиях. Это хорошо согласуется с относительно высоким содержанием в них ароматических аминокислотных остатков и свидетельствует о жесткости третичной структуры обеих белковых молекул.

Рис. 4. Спектры КД в ближней (а) и дальней (б) УФ-областях. Кривая 1 - Бб; кривая 2 - Ббр-О: кривая 3 - Эбр-Р: кривая 4 - развернутый 8 М гуанидингидрохлоридом 56. Измерения проводили в 20 мМ натрий-фосфатном буфере рН 7.37 при 20°С. Концентрация белка равна 0.99 мг/мл.

На рис.4б приведены спектры КД в дальней УФ области для пермутантов и природного белка в нативных условиях. Из рисунка видно, что величины эллиптичности при 222 нм и формы спектров двух белков весьма близки. Анализ спектров по традиционной методике (Chang et.al, 1978) показал, что процентное содержание различных элементов вторичной структуры в молекуле S6p-D хорошо согласуется с содержанием вторичной структуры в нативном S6. Так, экспериментально определенное для пермугированного белка S6p-D содержание а-спиралей равно 25%, структуры - 43% и неупорядоченной структуры - 32%, в то время как соответствующие расчетные величины для S6 составляют 26%, 39% и 35%. Таким образом, можно заключить, что вторичная структура белка в результате пермутации заметным образом не изменилась.

Для дополнительного анализа структурных свойств полученные белки были исследованы методом ядерного магнитного резонанса. Выяснилось, что спектр 'Н-ЯМР пермутированного белка S6p-D имеет характерные особенности, присущие спектрам нативных природных белков, при этом дисперсия химических сдвигов амидных и Са-протонов указывает на высокое содержание регулярной вторичной структуры в белковой молекуле. Величина химических сдвигов метальных групп и их дисперсия (рис. 5, кривая S6p-D (ОМ)) характерна для белков, имеющих глобулярную третичную структуру с пространственно сближенными ароматическими кольцами и метильными группами и сходна с характером спектра природного S6 белка. В то же время увеличенная полуширина сигналов от протонов основной полипептидной цепи (например, Са-протонов) является, видимо, следствием подвижности третичной структуры в миллисекундном масштабе времени или образованием белковых комплексов.

I 1 1 1 1 I '-1 1 ] 1-1 ' I 1-1 1 I 1 1 1 ' I 1 1 '—' I 1 1 1 1 i 1 1-1 I 1 1

4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 М.Л.

Рис. 5. Спектр 'Н-ЯМР для белков S6, S6p-D, S6p-F при 30°С в 50 мМ карбонате аммония с pH 7,9, концентрация белка равна 9,0 мг/мл. В скобках указана концентрация мочевины.

Для анализа ассоциации были исследованы спектры 'Н-ЯМР природного белка и пермутанта S6p-D при различных концентрациях мочевины. Добавление не денатурирующих концентраций мочевины (2М) эффективно уменьшает ассоциацию для обоих белков, но существенного изменения подвижности в миллисекундном масштабе не наблюдается (рис. 5). Поскольку сходная подвижность наблюдается и у дикого типа S6 белка (рис. 5), то можно заключить, что пермутант обладает структурными свойствами близкими к свойствам исходного белка.

Для изучения влияния проведенной пермутации на стабильность белка был применен метод сканирующей микрокалориметрии. Известно, что наличие пика

теплопоглощения на калориметрической кривой отражает кооперативное разрушение жесткой третичной структуры белковой молекулы (Рпуа1оу, 1979; Р№уп, 1995). На рис. 6а приведены кривые калориметрического плавления белков Б6 и Ббр-Э (концентрация 2,1 мг/мл). Процесс денатурации во всех случаях был необратим. Температура денатурационного перехода для белка Бб, соответствующая максимуму калориметрического пика, составляла 98°С.

Следует отметить, что ТЪл1\егторЫ1и$ обитает при экстремальных условиях окружающей среды (65°С). Поэтому неудивительно, что дикий тип белка имеет температуру плавления почти 100°С. Проведение пермутации дестабилизирует белок, тем не менее, он значительно стабильнее большинства белков Е.соИ [Фоменко и др., 1998]. Пермутантный белок Ббр-Б кооперативно плавится с

максимумом теплопоглощения при 74°С. Рассчитанное значение Ср при 20°С (293 К) равно 1,33 Дж/град/г, что является характерным для малых глобулярных белков (Рпуа1оу, 1979). Анализ полученных данных также показал, что вант-гоффовская

320 340 360 380 Температура (К)

О 2 4 6 8 10

Концентрация мочевины (М)

Рис. 6. Структурные свойства рнбосомаль-ного белка 86 и его псрмутантов: а - кривые температурной зависимости избыточной теплоемкости, концентрация белка 2.1 мг/мл; б - кривые разворачивания мочевиной, регистрируе-мые по изменению отношения интенсив-носгей триптофановой флуоресценции на длинах волн 330 и 370 нм. Концентрация белка равна 0,01 мг/мл. Кривая 1 - Б6, кривая 2 - Хйр-П. кривая 3 - Й6р-г.

энтальпия плавления больше калориметрической (ДНВг>АНК1.1). Это означает, что кооперативная единица наблюдаемого процесса больше по размерам, чем молекула пермутированного белка, или, иными словами, что процесс тепловой денатурации белка осложнен разрушением ассоциатов. Поэтому калориметрические исследования повторили при более низкой концентрации белка (-0,8 мг/мл). Анализ данных показал, что в этом случае ДНв^ДНкал, т.е. тепловая денатурация пермутированного белка, как и большинства небольших глобулярных белков, является переходом типа "все-или-ничего". Эти результаты коррелируют с приведенными выше данными ЯМР при различных концентрациях мочевины. Таким образом, пермутированный белок имеет жесткую кооперативно плавящуюся третичную структуру.

Для оценки стабильности белка по отношению к денатурирующим агентам было исследовано равновесное разворачивание белков, индуцированное мочевиной. Для индикации процесса перехода был применен метод флуоресцентной спектроскопии. На рис. 66 приведены кривые разворачивания пермутанта Ббр-Э и Э6, отслеживаемые по изменению отношения интенсивностей триптофановой флуоресценции при длинах волн 330 и 370 нм. Из рисунке видно, что в результате пермутации происходит некоторое уменьшение стабильности белка. При этом переход остается кооперативным и протекает в интервале от 3,9 до 6,2 М мочевины. Известно, что величина параметра Ду (мера кооперативное™ перехода; иуегеку, 1996) может быть использована для определения исходного состояния белка, из которого осуществляется денатурационный переход. Так, величина Ду, определенная для перехода белка данного молекулярного веса из нативного состояния в полностью развернутое, равна 8,9±2,0. В то время как, аналогичная величина для перехода белка из состояния расплавленной глобулы в клубок равна 3,4+1,5. В нашем случае значение Ду равно 9,6±0,5, что соответствует

величине, характерной для разворачивания природных нативных белков данного молекулярного веса.

Таким образом, анализ данных кругового дихроизма, ЯМР, калориметрии и равновесного разворачивания мочевиной однозначно свидетельствует о том, что пермутированный Ббр-Р обладает близкой к расчетной регулярной вторичной структурой, а также жесткой и стабильной третичной структурой. Это позволяет нам заключить, что циркулярная пермутация белка Э6 (а также и небольшие дополнительные модификации в области полипептидных концов, проведенные с целью изменения топологии) не препятствует приобретению белком жесткой пространственной структуры. При этом сам характер дизайна пермутированного белка и совокупность полученных данных говорят о том, что он действительно должен обладать уникальной топологией альбебетина (хотя для безусловного подтверждения топологии, очевидно, необходимо проведение прямых экспериментов по ЯМР высокого разрешения или ренгеноструктурному анализу).

Заинтересовавшись различием структурных свойств пермутантов, полученных в разных системах экспрессии мы провели более детальное исследование их физико-химических свойств.

Для анализа конформации молекул были изучены спектры флуоресценции пермутантов и природного белка Э6. Этот метод чувствителен к окружению аминокислотных остатков, содержащих флуоресцирующий хромофор. Например, спектр флуоресценции сольватированного триптофанового остатка имеет максимум при 350 нм, тогда как погружение этого хромофора в неполярное окружение глобулярного белка приводит к характерному сдвигу максимума его флуоресценции в коротковолновую область спектра (так называемый синий или Стоксов сдвиг; Бурштейн, 1977; Регтуакоу, 1993). Из приведенных спектров флуоресценции остатков

триптофана видно (рис. 7), что происходит сдвиг максимума в длинноволновую область у белка Эбр-Р. Это свидетельствует об увеличении доступности

остатков триптофана

растворителю. Также

наблюдается уменьшение

интенсивности спектра в сравнении с диким типом, что вероятно связано с увеличением подвижности окружения триптофанового остатка в белке Ббр-Р. Кроме того, из данных по спектрам КД в дальней УФ области (рис. 46) следует, что вклад неупорядоченной структуры увеличился (это следует из сдвига спектра в коротковолновую область). Это предположение согласуется с результатами анализа спектров 'Н-ЯМР в высокопольной области. Из спектров видно, что белок Ббр-Р утратил часть специфических резонансов, в частности в районе сдвига резонансов метильных групп между -0,7 м.д. и +0,8 м д. (рис. 5, кривая Э6р-Р (ОМ)), которые возникают в результате сдвига резонансов СРЬ-групп гидрофобных аминокислотных остатков под влиянием кольцевых токов соседних ароматических групп (\Vuthrich, 1976). Это возможно при условии, что боковые группы утратили свое специфическое нативное окружение в белковой молекуле и белок лишился жесткости третичной структуры.

Мы предполагаем, что различие физико-химических свойств пермутантов, по-видимому, связано с системами экспрессии. Полученные данные позволяют нам

1,00 --

I

I 2

Длина волны (нм)

Рис. 7. Спектры триптофановой флуоресценции. Кривая 1 - 56; кривая 2 - Ббр-О; кривая 3 -Ббр-И; кривая 4 - развернутый 56. Измерения проводили при 25°С в 20 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7,4, концентрация белка 0,01 мг/мл.

предложить две возможные причины отсутствия жесткой пространственной структуры у пермутанта Ббр-Р:

1) процесс сворачивания белка Ббр-И затруднен ковалентной связью и взаимодействием с мальтозосвязывающим белком, который превышает его по массе в-3,5 раза.

2) вероятно, важная роль в процессе самоорганизации пермутанта принадлежит метионину в первом положении, который отсутствует в белке при синтезе в виде гибрида. Это коррелирует с данными, полученными для а-лактальбумина, который теряет жесткую пространственную структуру в результате процессинга метионина в первом положении (Вепринцев, 1997).

2. ВЛИЯНИЕ МОДИФИКАЦИИ АЛЬБЕБЕТИНА НА ЕГО СТРУКТУРНЫЕ

СВОЙСТВА

Структурные свойства полученного циркулярно пермутированного белка Эбр-Э, позволяют сделать заключение, что топология, предложенная для альбебетина, действительно не противоречит никаким принципам структурной организации белков, и сама по себе не мешает формированию жесткой пространственной структуры белка. Это означает, что путем модификации альбебетина можно, в принципе, добиться получения такой структуры в этом искусственном белке. В качестве таких возможных модификаций можно предложить три подхода, а именно, редизайн структуры альбебетина с целью введения в белок специфических взаимодействий, включение в состав альбебетина дополнительного фрагмента и введение в белок центров нуклеации, которые способствуют правильному сворачиванию белка.

Изменение аминокислотной последовательности альбебетина для получения более тесных внутримолекулярных взаимодействий, требует тщательного дизайна белка и очень мощных вычислительных возможностей. Необходимо определять множество

специфических внутримолекулярных взаимодействий, таких как солевые мостики, ван-дер-ваальсовы и электростатические взаимодействия и другие, которые трудно учесть при моделировании. Имеющееся в настоящее время программное обеспечение и ЭВМ имеют существенные ограничения, не позволяющие целиком охватить такую проблему, тем не менее, некоторые шаги в этом направлении уже предпринимаются.

Другой возможный вариант—это включение в структуру альбебетина центра нуклеации. Возникает закономерный вопрос: почему это предложение стало актуальным именно сейчас? Во-первых, фактические данные о значении центров нуклеации появились в литературе сравнительно недавно (АЬкеукЬ е1.а1, 1994; 5ЬакЬпоУ1сЬ е1.а1, 1996). Во-вторых, во всех сконструированных к настоящему времени искусственных белках не было предусмотрено наличие таких центров. Можно предположить, что именно это является причиной отсутствия у них жесткой пространственной структуры, и введение центров нуклеации позволит существенно облегчить формирование такой структуры. В-третьих, наши предварительные данные, полученные на мутантных вариантах цитохрома с, также позволяют говорить о роли центров нуклеации в процессе самоорганизации белковой молекулы.

Изучение 7 семейств цитохромов с (РМэуп, 1998) позволило выделить консервативные аминокислотные остатки, которые не принимают участие в связывании гема и не несут явной функциональной роли. Было предположено, что они участвуют в образовании центра нуклеации. Эти аминокислоты взаимодействую в начале процесса сворачивания белка, образуя ядро сворачивания, вокруг которого происходит дальнейшее структурирование аминокислотной цепи.

В случае цитохрома с лошади это оказались аминокислотные остатки в положении 10 и 97 (Ршзуп, 1998). Показано, что они участвуют в образовании контактов между 14- и С- концевыми спиралями. Важная роль этих аминокислот была

подтверждена наличием этих контактов в обоих в кинетическом и равновесном интермедиатах. Для проверки этой гипотезы были получены мутантные варианты цитохрома с лошади, содержащие аминокислотные замены в этих положениях и контрольные варианты, содержащие мутации в других положениях. Установлено, что несколько низкий уровень выхода продукта наблюдался в случае белков, содержащих мутации в районе контакта и С-концевых спиралей (Табл. 1). Анализ стабильности четырех мутантных вариантов по разворачиванию в растворах мочевины показал, что из исследованных белков наименее стабилен именно мутант У97А с заменой в районе контакта К- и С-концевых спиралей.

Таблица 1. Уровень экспрессии гена цитохрома с лошади и его мутантных вариантов в Е.соИ. Для четырех белков приведена стабильность при денатурации мочевиной

Вариант (мутация) Уровень экспрессии (мг белка /1л культ.) Точка полуперехода при денатурации (моли мочевины)

Цитохром с 10-12 7,6

H33N 8-10

Fl OA, H33N 2-4

К13М, H33N 6-8

L64A, H33N 8-10 4,8

L68A, H33N 6-8

Y74A, H33N 5-7 6,4

L94A, H33N 12-15

195A, H33N 3-5 5,5

У97A, H33N 4-6 3,8

Таким образом, было показано, что мутации в природном цитохроме с, в районе предполагаемого цента нуклеации, приводят к формированию у белков характерных особенностей, отличающих их от природного цитохрома и мутантов с мутациями вне центра нуклеации. Эти данные указывают на важную роль центров нуклеации и

позволяют предложить их введение в структуру искусственных белков как один из возможных путей получения у них жесткой пространственной структуры.

2.1 Структурные свойства модифицированного альбебетина

Третий предложенный подход предполагает введение в состав белка дополнительных участков, изменяющих укладку его аминокислотной последовательности. Ранее в нашей лаборатории на основе альбебетина был сконструирован биологически активный искусственный белок - альбеферон (Долгих и др., 1993; Оо^кЪ е1.а1., 1996). Он был получен путем включения в Ы-концевую последовательность альбебетина линейного фрагмента аг интерферона человека (Ьеи-Ьуз-Ои-Ьуз-Ьуз-Туг-Бег-Рго), отвечающего за одну из многочисленных активностей последнего. Основной задачей дизайна в этом случае было введение биологической активности в альбебетин, однако полученные нами данные показали, что в результате модификации альбебетин не только приобрел такую активность, но и улучшил свои структурные характеристики. Мы провели сравнение структурных свойства полученного нами альбеферона и альбебетина с помощью ряда физико-химических методов.

Состояние третичной структуры белков анализировали по спектрам КД в ближней ультрафиолетовой области. Следует отметить, что в составе альбебетина отсутствуют ароматические аминокислоты, и это отражается на характере спектра КД (рис. 8а). В то же время в альбефероне имеется остаток тирозина (Туг7), который, по-видимому, и приводит к появлению выраженных специфических сигналов в спектре. Отсюда можно сделать вывод, что в молекуле альбеферона, по крайней мере, в локальном окружении Туг, имеется некоторая относительно жесткая асимметричная структура.

Исследования тепловой денатурации методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии показали, что при плавлении альбеферона наблюдаются небольшие

Длина волны (нм) Температура (К)

Рис. 8. Структурные свойства альбебетина (1) и модифицированного варианта альбебетина (2). а - Спектры КД в ближней УФ области, б - калориметрическое плавление. Измерения проводили в 100 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 8,0, концентрация белка 1,7 мг/мл. Скорость прогрева 0,9 К/мин.

тепловые эффекты (рис. 86). Однако следует отметить, что их амплитуда существенно

меньше (в ~4-5 раз) аналогичных величин, наблюдаемых при плавлении природных

глобулярных белков такой молекулярной- массы. В случае альбебетина

калориметрическая кривая не имеет сколько-нибудь заметного пика теплопоглощения,

что говорит об отсутствии в этом искусственном белке жесткой пространственной

структуры, кооперативно плавящейся при нагревании.

Следовательно, включение в состав альбебетина фрагмента интерферона

приводит к некоторому улучшению его структурных свойств. Так, альбеферон более

компактен (1^=16,0±0,5 А), по сравнению с альбебетином (1^=17,2+0,5 А), обладает

большей устойчивость к разворачиванию мочевиной и тепловой денатурации и

показывает наличие некоторой асимметрии в окружении тирозинового остатка.

Стабилизация структуры искусственного белка происходит, вероятно, в результате

появления новых электростатических взаимодействиях между отрицательно

заряженным альбебетином и положительно заряженным фрагментом интерферона.

22

Таким образом, присоединение коротких пептидных фрагментов на N- или С-конец белка также может быть использовано при дизайне новых или улучшении структуры сконструированных искусственных белков. Эти данные хорошо согласуются с аналогичными результатами, полученными для природных белков. Например, удаление короткого тринадцати членного пептида с С-конца стафилококковой нуклеазы приводит к денатурации белковой молекулы и переходу ее в состояние расплавленной глобулы (Shortle & Meeker, 1989).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Методами кругового дихроизма, сканирующей микрокалориметрии, флуоресценции, ЯМР показано, что пермутированный рибосомальный белок S6, полученный из системы прямой экспрессии обладает близкой к расчетной вторичной структурой и жесткой стабильной третичной структурой, характерной для нативных природных белков. Это позволяет утверждать, что топология аРРаРР (/S-слой, экранированный с одной стороны двумя а-спиралями), предложенная для альбебетина, принципиально возможна и не противоречит принципам структурной организации белков. Кроме того, показано, что введение модификации в альбебетин, приводит к повышению устойчивости альбебетина против денатурации.

Отсутствие жесткой структуры у альбебетина свойственно его аминокислотной последовательности и связано с недостаточно плотной укладкой боковых аминокислотных групп в белковой молекуле или отсутствием в его молекуле центра нуклеации. Отсюда можно сделать вывод о том, что дополнительный дизайн альбебетина в этом направлении может привести к получению искусственного белка с жесткой и стабильной пространственной структурой, не уступающей по этим характеристикам структурам природных белков.

выводы

1. С целью получения природного белка с уникальной топологией, предложенной ранее для искусственного белка альбебетина, проведена циркулярная пермутация рибосомального белка Б6 из ТЪегтив 1ЬегторЫ1и$ путем циркулярной пермугации соответствующего гена.

2. Пермутированный белок получен в препаративных количествах в двух экспрессирующих системах и исследован методами спектроскопии кругового дихроизма, флуоресцентной спектроскопии, ядерного магнитного резонанса, сканирующей микрокалориметрии. Показано, что:

а) пермутированный белок Ббр-Б, полученный из системы прямой экспрессии, обладает близкой к расчетной вторичной структурой, а также жесткой и стабильной третичной структурой, характерной для природных белков.

б) пермутированный белок 5бр-Р, полученный из системы экспрессии в виде гибрида с мальтозосвязывающим белком, обладает выраженной вторичной структурой, но не имеет жесткой третичной структуры, что' может быть связано с трудностью сворачивания белка в виде гибрида или с отсутствием метионина в первой позиции.

3. Показано, что введение модификации в альбебетин путем присоединения октапептида на И-конец альбебетина приводит к улучшению структурных характеристик белка. Молекула альбеферона обладает определенной упорядоченной третичной структурой, а также некоторой кооперативно плавящейся пространственной структурой.

4. Уникальная топология альбебетина не препятствует приобретению белком жесткой и стабильной третичной структуры. Для получения такой структуры в альбебетине целесообразно провести оптимизацию упаковки боковых аминокислотных групп в белковой молекуле и/или ввести в молекулу центр нуклеации.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Z.Kh. Abdullaev, R.F. Latypov, A.Ya. Badertdinov, D.A. Dolgikh, A.V. Finkelstein, V.N. Uversky, M.P. Kirpichnikov (1997): "S6 permutein show that unusual target topology is not responsible for the absence of rigid tertiary structure in de novo protein albebetin" -FEBS Letters, v.414, 2, p.243-246.

2. Р.Ф. Латыпов, З.Х. Абдуллаев, А.Я. Бадретдинов, Э.В. Бочаров, Т.Н. Мельник, И.Ю. Афасижева, A.C. Арсеньев, Д.А. Долгих, В Н. Уверский, A.B. Финкельштейн, М.П. Кирпичников (1998): "Циркулярная пермутация рибосомального белка S6 из Thermus Thermophylus с цель придания ему топологии искусственного белка альбебетина" - Молекулярная биология, т.32, 1, с. 125-133.

3. И.Ю. Афасижева, Д.А. Долгих, З.Х. Абдуллаев, Р.Ф. Латыпов, Е.И. Тиктопуло, В.Н. Уверский, О.Б. Птицын, М.П. Кирпичников (1998): "Исследование влияния биологически активного фрагмента интерферона на структуру искусственного белка-носителя" - Биофизика, т.43, 3, с.384-391.

4. Д.А. Долгих, Р.Ф. Латыпов, З.Х. Абдуллаев, В. Колон, X. Родер, М.П. Кирпичников (1998): "Экспрессия мутантных генов цитохрома с лошади в Escherichia coli" -Биоорганическая химия. 1998, т.24, 10, с.756-759.

5. Z.Kh. Abdullaev, E.V. Bocharov, D.A. Dolgikh, M.P. Kirpichnikov (1998): "Study of circular permutated ribosomal protein S6" - Международный симпозиум "Структура, стабильность и сворачивание белков. Фундаментальные и медицинские аспекты", тезисы докладов, Москва, с. 113.

6. Р.Ф. Латыпов, З.Х. Абдуллаев, А.Я. Бадретдинов, Д.А. Долгих, A.B. Финкельштейн, М.П. Кирпичников (1997). "Циркулярная пермутация рибосомального белка из Thermus Thermophylus" - II открытая городская научная конференция молодых ученых города Пущино, тезисы докладов, Пущино, с.76-77.

7. З.Х. Абдуллаев, Р.Ф. Латыпов, Д.А. Долгих, A.B. Финкельштейн, М.П. Кирпичников (1997): "Использование рибосомального белка S6 для дизайна искусственного белка" - Второй съезд биохимического общества российской академии наук, тезисы докладов, Пущино, с.99-100.

8. З.Х. Абдуллаев, Э.В, Бочаров, Д.А. Долгих, М.П. Кирпичников (1997): "Пермутация рибосомального белка S6 для получения топологии искусственного белка альбебетина" - Конференция, посвященная 30-летию журнала "Молекулярная биология", тезисы докладов. Молекулярная биология, 1998, т.32, 2, с.358-359.