Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологически активные искусственные белки на основе альбебетина и функциональных фрагментов α-интерферона, фактора дифференцировки HLDF и инсулина

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Черткова, Рита Валерьевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ДИЗАЙНА БЕЛКОВ DE NOVO С ЗАДАННОЙ СТРУКТУРОЙ.ю

1.1 а-Спиральные белки.

1.2 Белки со смешанной (а-Р) структурой.

1.3 Р-Структурные белки.

Глава 2. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ДИЗАЙНА ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ БЕЛКОВ.

2.1 Дизайн каталитической активности.^.

2.2 Конструирование мембранных белков и ионных каналов.

2.3 Дизайн лиганд-связывающего участка белковой молекулы.

2.4 Альбеферон - биологически активный искусственный белок.

Глава 3. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ФРАГМЕНТЫ ИНТЕРФЕРОНА-а, ФАКТОРА ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ HLDF И ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА.

3.1 Интерфероны-а и их функциональные пептиды.

3.2 Фактор дифференцировки HLDF и его биологически активные фрагменты.

3.3 Инсулин и инсулин-подобные полипептиды.

ЧАСТЬ II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4.1 Материалы.

4.1.1. Реактивы и ферментные препараты.

4.1.2. Штаммы.

4.1.3. Плазмидные вектора.

4.1.4. Питательные среды для роста бактерий.

4.1.5. Синтетические олигонуклеотиды.

4.2 Методы.

4.2.1. Трансформация клеток Е.соИ плазмидной ДНК.

4.2.1.1. Приготовление компетентных клеток.

4.2.1.2. Трансформация плазмидной ДНК.

4.2.2. Выделение плазмидной ДНК.

4.2.3. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле.

4.2.4. Количественные определения препаратов ДНК и примесей РЖ.

4.2.5. Выделение ДНК из агарозного геля.

4.2.6. Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК.

4.2.7. Олигонуклеотид-направленный мутагенез.

4.2.8. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

4.2.9. Экспрессия генов рекомбинантных белков.

4.2.10. Анализ локализации гибридных белков в клеткахсоИ.

4.2.11. Выделение и очистка гибридных белков.

4.2.12. Выделение и очистка целевых искусственных белков.

4.2.13. Аналитические методы.

4.2.13.1. Электрофоретический анализ белков в 8В8-ПААГ.

4.2.13.2. Количественный анализ белковых препаратов.

4.2.13.3. Определение Л'-концевой последовательности полипептидов.

4.2.14. Методы структурных исследований.

4.2.14.1. Спектры КД.

4.2.14.2. Спектры 'Н-ЯМР.

4.2.15. Методы биологических исследований.

4.2.15.1. Культивирование клеточных линий.

4.2.15.2. Определение антипролиферативной активности.

4.2.15.3. Определение дифференцирующей активности.

4.2.15.4. Определение противовирусной активности.

4.2.15.5. Определение цитотоксической активности.

4.2.15.6. Определение инсулин-подобной активности.

4.2.16. Построение молекулярных моделей.

4.2.17. Исследование иммуногенности искусственных белков.

Глава 5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

5.1 Дизайн биологически активных вариантов альбебетина.

5.2 Конструирование генов биологически активных вариантов альбебетина.

5.3 Экспрессирующие вектора и биосинтез в прокариотической системе (Е.соИ).

5.4 Выделение и очистка искусственных белков.

5.4.1. Выделение и очистка гибридных белков.

5.4.2. Выделение и очистка целевых искусственных белков.

5.5 Структурные свойства биологически активных вариантов альбебетина.

5.5.1. КД-спектроскопия искусственных белков.

5.5.2. ЯМР-спектроскопия искусственных белков.

5.6 Биологические свойства искусственных белков.

5.6.1. Противовирусные и цитотоксические свойства двух вариантов альбеферона, содержащих пептидный фрагмент ЬКЕИШОБ (30-36) из консенсусной последовательности ИФН-а2.

5.6.2. Влияние белка АВВ-Гс1 на дифференцировку и рост промиелоцитарной лейкемической линии клеток человека НЬ-60.

5.6.3. Влияние вариантов альбебетина, содержащих инсулин-подобный пептидный фрагмент на способность клеточной линии Ь-929 поглощать глюкозу.

5.7 Исследование ммуногенности альбебетина и его биологически активных вариантов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биологически активные искусственные белки на основе альбебетина и функциональных фрагментов α-интерферона, фактора дифференцировки HLDF и инсулина"

Актуальность темы. Практическое применение белковых и пептидных препаратов, обладающих важными фармакологическими свойствами, во многих случаях сопровождается нежелательными побочными эффектами в случае полифункциональных белков, малой эффективностью действия вследствие быстрой деградации в организме в случае пептидных препаратов, а также стимуляцией аутоиммунных заболеваний. Вследствие этого, перед современной биоинженерией стоит проблема создания белковых препаратов-аналогов, сочетающих отсутствие нежелательных активностей со стабильностью in vivo и низкой иммуногенностью. Одним из перспективных подходов к решению этой проблемы является использование активных пептидов или функциональных фрагментов, отделенных от вызывающих нежелательные эффекты частей белковой молекулы, в составе искусственной конструкции. Такая конструкция должна состоять из биологически инертного носителя, ковалентно связанного с функциональным фрагментом. В качестве носителя может выступать молекула искусственного белка (или белка de novo), не обладающего собственной функциональной активностью.

Создание первого белка de novo [1] явилось началом быстрого развития белковой инженерии искусственных белков - нового направления в молекулярной биологии, в котором за последние годы достигнуты значительные успехи [обзоры 2, 3]. Ранее был впервые получен искусственный белок альбебетин [4, 5], обладающий заданной пространственной структурой (две a-спирали, лежащие на Р-листе,) и уникальной, не наблюдающейся в природных белках топологией. На примере альбебетина была показана принципиальная возможность использования белков de novo в качестве эффективных носителей биологических активных пептидных последовательностей. Так, модельный искусственный белок альбеферон [6], представляющий собой альбебетин с введенным в его последовательность активным фрагментом (130-137) интерферона-аг (ИФН-0С2) человека, сохранял заданную структуру исходного альбебетина [7], обладал высокой биологической активностью, сравнимой с активностью ИФН-а.2 человека [8] и, по данным предварительного исследования, низкой иммуногенностью [9].

Помимо потенциальной возможности использования в качестве фармакологических средств, подобные конструкции могут служить инструментом для исследования функциональной роли тех или иных непрерывных фрагментов белковых молекул, тем самым способствуя более глубокому пониманию механизмов их действия. Все вышеизложенное определяет актуальность задачи получения и подробного исследования белковых конструкций на основе альбебетина, содержащих заданные биологические активности и представляющих прикладной биомедицинский или биотехнологический интерес.

Цель исследования. Целью настоящей диссертационной работы являлось конструирование, получение и исследование свойств ряда биологически активных вариантов альбебетина, содержащих в своем составе функциональные пептидные фрагменты человеческих ИФН-а2, фактора дифференцировки HLDF и инсулина.

Основные задачи исследования.

1. Осуществить теоретический дизайн белковых конструкций, имитирующих функциональный эпитоп ИФН-осг (противовирусный центр связывания а-интерферонов); воспроизводящих дифференцирующую и инсулин-подобную активности фактора дифференцировки HLDF и инсулина, соответственно.

2. Получить гены этих белковых конструкций и вектора для экспрессии в прокариотической системе (Escherichia coli).

3. Разработать эффективную схему биосинтеза, выделения и очистки искусственных белков. Получить альбебетин и его варианты в необходимых для исследований количествах.

4. Исследовать и сопоставить физико-химические свойства полученных белков со свойствами альбебетина.

5. Определить биологическую активность полученных белков.

Научная новизна и практическая значимость работы. Все результаты, изложенные в настоящей диссертационной работе, получены впервые.

1. Проведен теоретический дизайн вариантов искусственного белка альбебетина, содержащих функциональные пептидные фрагменты природных белков ИФН-аг, фактора дифференцировки НЫЭР и инсулина человека.

2. Получены экспрессирующие конструкции, содержащие гены пяти новых искусственных белков. На основе этих конструкций разработана эффективная схема биосинтеза, выделения и очистки, позволяющая нарабатывать искусственные белки в количествах, необходимых для биологических и физико-химических исследований.

3. Проведено сравнительное исследование спектров кругового дихроизма и ядерного магнитного резонанса полученных искусственных белков. Показано, что присоединение пептидных фрагментов к молекуле альбебетина не приводит к значительным изменениям вторичной и третичной структуры белка, хотя вызывает небольшое увеличение содержания неупорядоченной структуры и лабильности третичной структуры.

4. Исследованы биологические свойства искусственных белков. Показано, что оба варианта альбебетина, содержащие пептидные фрагменты ИФН-аг, обладают противовирусной активностью, причем один из них практически воспроизводит активность рекомбинантного ИФН-аг; альбебетин, содержащий фрагмент из фактора дифференцировки Н1ЛЭР, обладает дифференцирующей и антипролиферативной активностью, сопоставимой с активностью исходного пептида; альбебетин, содержащий инсулин-подобный пептид, воспроизводит активность последнего приблизительно на 70 %.

Наличие биологической активности полученных искусственных белков является основой для их дальнейшего изучения в качестве возможных лекарственных препаратов нового поколения. Преимуществом таких конструкций, содержащих отдельный активный

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Черткова, Рита Валерьевна

выводы

1. Впервые сконструированы пять новых искусственных белков на основе искусственного белка альбебетина и функциональных пептидных фрагментов природных белков ИФН-СХ2, фактора дифференцировки Н1ЛЗР и инсулина человека. Получены гены этих искусственных белков и экспрессируклцие конструкции, содержащие эти гены.

2. Разработана эффективная схема биосинтеза, выделения и очистки искусственных белков. Альбебетин и его варианты получены в препаративных количествах, позволяющих провести исследования физико-химических и биологических свойств.

3. Структурные свойства искусственных белков исследованы методами спектроскопии кругового дихроизма и ядерного магнитного резонанса. Показано, что присоединение пептидных фрагментов к молекуле альбебетина не приводит к значительным изменениям вторичной и третичной структуры белка, хотя вызывает небольшое увеличение содержания неупорядоченной структуры и лабильности третичной структуры.

4. В ходе исследования биологических свойств полученных белков было показано, что: а) оба варианта альбебетина, содержащие два пептидных фрагмента ИФН-аг, обладают противовирусной активностью, причем один из них практически воспроизводит активность рекомбинантного ИФН-аг; б) альбебетин, содержащий фрагмент из фактора дифференцировки НЫЛ7, обладает дифференцирующей и антипролиферативной активностями, сопоставимыми с активностями исходного пептида; в) альбебетин, содержащий инсулин-подобный пептид воспроизводит активность последнего приблизительно на 70 %.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в диссертационной работе результаты демонстрируют возможность конструирования искусственных белков с заданными функциональными свойствами. Воспроизведение искусственными белками ABBI-I и ABBI-II противовирусных свойств интерферонов-а позволяет использовать их как инструменты в дальнейших детальных исследованиях механизмов индукции внутриклеточных сигналов, ведущих к проявлению вышеназванных свойств. Кроме этого, высокая биологическая активность этих искусственных белков является основой для их изучения в качестве новых лекарственных препаратов противовирусного действия. Преимуществом этих белков является отсутствие потенциальной возможности провоцировать выработку аутоантител к участкам интерферонов-а, не имеющих отношения к противовирусной активности. Наличие дифференцирующей и антипролиферативной активностей пептида TGENHR из фактора дифференцировки HLDF в составе белка ABB-fd подтверждает возможность получения аналогов нативных индукторов клеточной дифференцировки, которые в могут использоваться в качестве терапевтических средств для лечения некоторых форм лейкозов. Преимуществами таких препаратов по сравнению с химеотерапевтическими средствами являются отсутствие побочных воздействий и токсичности, хорошая растворимость и физиологический диапазон активных концентраций. Наличие потенциальной инсулин-подобной активности альбебетина, содержащего пептид GERGFFYCN свидетельствует о возможности получения белковых аналогов инсулина, обеспечивающих более эффективное и пролонгированное действие по сравнению с рекомбинантным гормоном. В целом, полученные результаты служат основанием для дальнейших исследований (как in vitro, так и in vivo) биологических свойств нового белка, а также для последующих клинических испытаний в качестве возможных терапевтических средств.

91

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Черткова, Рита Валерьевна, Москва

1. Regan L., DeGrado W.F. Characterization of a helical protein designed from first principles. //

2. Science, 1988, V. 241, N. 4868, P.976-978.

3. DeGrado W.F., Summa C.M., Pavone V., Nastri F., Lombardi A. De novo design and structuralcharacterization of proteins and metalloproteins. // Annu. Rev. Biochem., 1999, N.68, P. 779819.

4. Moffet D.A., Hecht M.H. De novo proteins from combinatorial libraries. // Chem. Rev., 2001,1. V.101, N.10, P. 3191-203.

5. Долгих Д.А., Федоров H.A., Чемерис В.В., Чернов Б.К., Финкелыптейн A.B., Шульга

6. A.A., Алахов Ю.Б., М.П. Кирпичников, О.Б. Птицын. Получение и исследование альбебетина, искусственного белка с заданной пространственной структурой. // Доклады АН СССР, 1991, Т.320, N.5, С.1266-1269.

7. Fedorov A., Dolgikh D., Chemeris V., Chernov В., Finkelstain A., Schulga A., Alakhov Y.,

8. Kirpichnikov M., Ptitsyn O. De novo design, synthesis and study of albebetin, a polypeptide with a predetermined three-dimensional structure. Probing the structure at the nanogram level. // J. Mol. Biol., 1992, V. 225, P. 927-931.

9. Dolgikh D.A., Gabrielyan A.E., Navolotskaya Ye.V., Chemeris V.V., Kirpichnikov M.P.

10. Artificial protein with a set spatial strukture and biological activity. // Biophisics, 1993, V.38, N.l, P.59-65.

11. Aphasizheva I.Yu., Dolgikh D.A., Abdullaev Z.K., Uversky V.N., Kirpichnikov M.P., Ptitsyn

12. O.B. Can grafting of an octapeptide improve the structure of de novo protein? // FEBS, 1998, V.425, P. 101-104.

13. Dolgikh D.A., Uversky V.N., Gabrielyan A.E., Chemeris V.V., Fedorov A.N., Navolotskaya

14. Ye.V., Zav'yalov V.P., Kirpichnikov M.P. The de novo protein with grafted biological function: transferring of interferon blast-transforming activity to albebetin. // Protein Engeneering, 1996, V.9, N.2, P.195-201.

15. Афасижева И.Ю., Долгих Д.А., М.П. Кирпичников. Исследование иммуногенныхсвойств альбеферона биологически активного искусственного белка. // Молекулярная биология, 1999, Т. 33, N. 4, С.679-683.

16. Tuchscherer G., Scheibler L., Dumy P., Mutter M. Protein design: on the threshold of functional properties. // Biopolymers, 1998, V. 47, N. 1, P. 63-73.

17. Vita C., Vizzavona J., Drakopoulou E., Zinn-Justin S., Gilquin В., Menez A. Novel miniproteins engineered by the transfer of active sites to small natural scaffolds. // Biopolymers, 1998, V. 47, N. 1, P. 93-100.

18. Betz S.F., Leibman P. A., DeGrado W.F. De novo design of native proteins: characterization of proteins intended to fold into antiparallel, Rop-like, four-helix bundles. // Biochemistry, 1997, V. 36, P.2450-2458.

19. Betz S.F., Raleigh D.P., DeGrado W.F., Lovejoy В., Anderson D., Ogihara N., Eisenberg D. Crystallization of a designed peptide from a molten globule ensemble. // Folding and Design, 1996, V.l, N.l, P.57-64.

20. Betz S.F., DeGrado W.F. Controlling topology and native-like behavior of de novo-designed peptides: design and characterization of antiparallel four-stranded coiled coils. // Biochemistry, 1996, V. 35, P. 6955-6962.

21. Klemba M., Regan L. Characterization of metal binding by a designed protein: single ligand substitutions at a tetrahedral Cys2His2 site. // Biochemistry, 1995, V.34, P. 10094-10100.

22. Morii H., Honda S., Ohashi S., Uedaira H. a-Helical assembly of biologically active peptades and designed helix bundle protein. //Biopolymers, 1994, V.34, P. 481-488.

23. Boice J.A., Dieckmann G.R., DeGrado W.F., Fairmann R. Thermodinamic analysis of adesigned three-stranded coiled coil. // Biochemistry, 1996, V. 35, P. 14480-14485.94

24. Lombardi A., Bryson J.W., DeGrado W.F. De novo design of heterotrimeric coiled coils. // Biopolimers, 1994, V. 40, N.5, P. 495-504.

25. Zhou N.E., Kay C.M., Hodges R.S. Disulfide bond contribution to protein stability: positional effects of substitution in the hydrofobic core of the two-stranded a-helical coiled-coil. // Biochemistry, 1993, V.32, P.3178-3187.

26. Myszka D.G., Chaiken I.M. Design and charakterization of a intramolecular antiparallel coiled coil peptide. // Biochemistry, 1994, V.33, P.2363-3272.

27. Monera O.D., Kay C.M., Hodges R.S. Electrostatic interactios control the parallel and antiparallel orientation of a-helical chains in two-stranded a-helical coiled-coil. // Biochemistry, 1994, V.33, P.3862-3871.

28. Tanaka T., Kuroda Y., Kimura H., Kidokoro S., Nakamura H. Cooperative deformation of a de novo designed protein. // Protein Engineering, 1994, V.7, N.8, P. 969-976.

29. Tanaka T., Hayashi M., Kimura H., Nakamura H. De novo design and creation of a stable artificial protein. // Biophys. Chem., 1994, V.50, N.5, P.47-61.

30. Tanaka T., Kimura H., Hayashi M., Fujiyoshi Y., Fukuhara K., Nakamura H. Characteristics of a de novo designed protein. // Protein Science, 1994, V.3, P. 419-427.

31. Goraj K., Renard A., Martial A.J. Synthesis, purification and initial structural characterization of oktarellin, a de novo polypeptide modelled on the a/p-barrel proteins. // Protein Engineering, 1990, V.3, N.4, P.259-266.

32. Butcher D., Bruch M.D., Moe G.R. Design and characterization of a model a/p peptide. // Biopolymers, 1995, V.35, P.109-120.

33. Yan Y., Erickson B.W. Engineering of betabellin 14D: disulfide-indused folding of a ß-sheet protein. // Protein Science, 1994, V.3, P. 1069-1073.

34. Quinn T.P., Tweedy N.B., Williams R.W., Richardson J.S., Richardson D.C. Betadoublet: de novo design, synthesis, and characterization of a ß-sandwich protein. // Proc. Natl. Acad. Sei., 1994, V.91, P.8747-8751.

35. Smith C.K., Withka J.M., Regan L. A thermodynamic scale for the ß-sheet forming tendencies of the amino acids. // Biochemistry, 1994, V.33, P.5510-5517.

36. Mayo K.H., Ilyina E., Park H. A recipe for designing water-soluble, beta-sheet-forming peptides. //Protein Science, 1995, V.5, P. 1301-1315.

37. Ramirez-Alvarado M., Blanco F.J., Serrano L. De novo design and structural analysis of a model ß-hairpin peptide system. // Nat. Struct. Biol., 1996, Y.3, N.7, P. 604-611.

38. Guo Z., Thirumalai D. Kinetics and termodynamics of folding a de novo designed four-helix bundle protein. // J. Mol. Biol., 1996, V. 263, P.323-343.

39. O'Neil K., DeGrado W.F. A termodynamic scale for the helix-forming tendencies of the commonly occurring amino acids. // Science, 1990, V. 250, P. 646-651.

40. West M.W., Hecht M.H. Binary patterning of polar and nonpolar amino acids in the sequences and structures of native proteins. // Protein Science, 1995, V. 4, P. 2032-2039.

41. Baumann G., Frommel C., Sander C. Polarity as a criterion in protein design. // Protein engineering, 1989, V.2, N.5, P.329-334.

42. Kamtekar S., Schiffer J.M., Xiong H., Babik J.M., Hecht M.H. Protein design by binary patterning of polar and nonpolar amino acid. // Science, 1993, V. 262, P. 1680-1685.

43. Lazar G.A., Desjarlais J.R., Handel T.M. De novo design of the hidrophobic core ubiqitin. // Protein Science, 1997, V. 6, N. 6, P. 1167-1178.

44. Munson M., Brien R., Sturtevant J.M., Regan L. Redesigning the hydrophobic core of a four-helix-bundle protein. // Protein Science, 1994, V. 3, P. 2015-2022.

45. Doig A.J., Baldwin R.L. N- and C-capping preferences for all 20 amino asids in a-helical peptides. // Protein Science, 1995, V. 4, P. 1325-1336.

46. Chakrabartty A., Kortemme T., Baldwin R.L. Helix propensities of amino acids measured in alanine-based peptides without helix-stabilizing side-chain interactions. // Protein Science, 1994, V. 3, P. 843-852.

47. Chakrabartty A., Doig A. J., Baldwin R.L. Helix capping propensities in peptides parallel those in proteins. // Proc. Natl. Acad. Sci., 1993, V. 90, P. 11332-11336.

48. DeGrado W.F., Sosnick T.R. Protein minimization: downsizing through mutation. // Proc. Natl. Acad. Sci., 1996, V. 93, P. 5680-5681.

49. Zhou N.E., Kay C.M., Hodges R.S. The role of interhelical ionic interactions in controlling protein folding and stability. // J. Mol. Biol., 1994, V. 237, P. 500-512.

50. Wendt H., Berger C., Baici A., Thomas R.M., Bosshard H.R. Kinetics of folding of leucine zipper domains. // Biochemistry, 1995, V. 34, P. 4097-4107.

51. Engel M., Williams R.W., Erickson B.W. Designed coiled-coil proteins: synthesis and spectroscopy of two 78-residue a-helical dimers. // Biochemistry, 1991, V. 30, P. 3161-3169.

52. Gurezka R, Langosch D. In vitro selection of membrane-spanning leucine zipper proteinprotein interaction motifs using POSSYCCAT. // J. Boil. Chem., 2001, V. 276, N 49, P. 45580-45587.

53. Choma C.T., Lear J.D., Nelson M.J., Dutton P.L., Robertson D.E., DeGrado W.F. Design of heme-binding four-helix bundle. // J. Am. Chem. Soc., 1994, V. 116, P. 856-865.

54. Robertson D.E., Farid R.R., Moser C.C., Urbauer J.L., Mulholland S.E., Pidikiti R., Wand A.J., DeGrado W.F., Dutton P.L. Design and synthesis of multi-haem proteins. // Nature, 1994, V. 368, P. 425-432.

55. Dolgikh D.A., Gilmanshin R.I., Brazhnikov E.V., Bychkova V.E., Semisotnov G.V., Venyaminov S.Yu., Ptitsyn O.B. a-Lactalbumin: compact state with Fluctuating tertiary structure? //FEBS Letters, 1981, V. 136, N. 1, P. 311-315.

56. Muller H.N., Skerra A. Grafting of a high-affinity Zn(II) site on the ßbarrel of retinol-binding protein results in enhanced folding stability and enable simplified purification.// Biochemistry, 1994, V. 33, P. 14126-14135.

57. Berg J.M., Kim C.A. Thermodynamic ß-sheet propensities measured using a zink-finger host peptide. // Nature, 1993, V. 362, P. 267-270.

58. Pessi A., Bianchi E., Crameri A., Venturini S., Tramontano A., Sollazo M. A designed metal-binding protein with a novel fold. // Nature,1993, V. 362, P. 367-369.

59. Smith C.K., Regan L. Guedelines for protein design: the energetics of ß-sheet side chain interaction. // Science, 1995, V. 270, P. 980-982.

60. Minor D.L., Kim P.S. Context is a major determinant of ß-sheet propensity. // Nature, 1994, V. 371, P. 264-267.

61. Moser R., Frey R., Munger K., Hehlgans T., Klauser S., Langen H., Winnacker E.-L., Mertz R., Gutte B. Expression of the synthetic gene of an artificial DDT-binding polypeptide in Escherichia coli. // Protein Engeneering, 1990, V. 1, N. 4, P. 339-343.

62. Ryota K., Weaver L.H., Matthews B.W. Stracture-based design of a lysozyme with altered catalitic activity. // Nature Stractural Biology, 1995, V. 2, P. 1007-1011.

63. Scrutton N.S., Berry A., Perham R.N. Redesign of the coenzyme specificity of a dehydrogenase by protein engineering. //Nature, 1990, V. 343, P. 38-43.

64. Hedstrom L., Szilagyi I., Rutter W.J. Converting trypsin to chymotrypsin: the role of surface loops // Science, 1992, V. 255, P. 1249-1253.

65. Hahn K.W., Klis W.A., Stewart J.M. Design and synthesis of a peptide having chymotrypsin-like esterase activity. // Science, 1990, V. 248, P. 1544-1547.

66. Tommos C., Skalicky J.J., Pilloud D.L., Wand A.J., Dutton P.L. De novo proteins as models of radical enzymes. // Biochemistry, 1999, V. 38, P. 9495-9507.

67. Baltzer L., Broo K.S. De novo designed polypeptide catalysts with adopted folded structures// Biopolymers, 1998, V. 47, P. 31-40.

68. Futaki S. Peptide ion channels: design and creation of function. // Biopolymers, 1998, V. 47, P. 75-81.

69. Liu L., Deber C.M. Guidelines for membrane protein engineering derived from de novo designed model peptides. // Biopolymers, 1998, V. 47, P. 41-62.

70. Nastri F., Lombardi A., D'Andrea L., Sanseverino M., Maglio O., Pavone V. Miniaturized hemoproteins. // Biopolymers, 1998, V. 47, P. 5-22.

71. Aphasizheva I.Yu., Dolgikh D.A., Navolotskaya Ye.V., Abramov V.M., Zav'yalov V.P., Kirpichnikov M.P. Biological activity of de novo proteins with incorporated interferon fragment. // Russian Journal of Immunology, 1997, V. 2, N. 1, P. 59-61.

72. Kienker P.K., DeGrado W.F., Lear J.D. A helical-dipole model describes the single-channel current rectification of an uncharged peptide ion channel. // Proc. Natl. Acad. Sci., 1994, V. 91, P. 4859-4863.

73. Russell C.J., King D.S., Thorgeirsson T.E., Shin Y.K. De novo design of a peptide which partitions between water and phospholipid bilayers as a monomelic alpha-helix. // Protein Engeneering, 1998, V. 11, N. 7, P. 539-547.

74. Schafmeister C.E., Miercke L.J.W., Stround R.M. Structure at 2.5 A of a designed peptide that maintains solubility of membrane proteins. // Science, 1993, V. 262, P. 734-738.

75. Regan L. Protein design: novel metal-binding sites. // TIBS, 1995, V. 20, N. 7, P. 280-285.99

76. Bryson J.W., Betz S.F., Lu H.S., Suich D.J., Zhou H.X., Otoeil K.T., DeGrado W.F. Protein design: a hierarchic approach. // Science, 1995, V. 270, N. 10, P. 935-941.

77. Handel T.M., Williams S.A., DeGrado W.F. Metal ion-dependent modulation of the dynamics of a designed protein. // Science, 1993, V. 261, P. 879-885.

78. Yamashita M.M., Wesson L., Eisenman G., Eisenberg D. Where metal ions bind in proteins. // Proc. Natl. Acad. Sci., 1990, V. 87, P. 5648-5652.

79. Gregory D.S., Martin C.R., Cheetham J.C., Rees A.R. The prediction and characterization of metal binding sites in proteins. // Protein Engeneering, 1993, V. 6, N. 1, P. 29-35.

80. Desjarlais J.R., Berg J.M. Use of a zinc-finger consensus sequence framework and specificity rules to design specific DNA binding proteins. // Proc. Natl. Acad. Sci., 1993, V. 90, P. 22562260.

81. Choo Y., Sanchez-Garcia I., Klug A. In vivo repression by a site-specific DNA-binding protein designed against an oncogenic sequence. // Nature, 1994, V. 372, P. 642-645.

82. Bychkova V.E., Ptitsyn O.B. The molten globule in vitro and in vivo. II Chemtracts-Biochem. Mol. Biol., 1993, V. 4, P. 133-163.

83. Taniguchi T., Mantei N., Schwarztein M., Nagata S., Murmatsu M., Weissmann C. Human leukocyte and fibroblast interferons are structurally related. // Nature, 1980, V. 285, P. 547549.

84. Pestka S., Langer J., Zoon K., Samuel C. Interferons and their actions. // Annual Review Biochem., 1987, V. 56, P. 727-777.

85. Pestka S. The human interferon a species and receptors. // Biopolymers, 2000, V. 55, P. 254287.

86. Kontsek P. Human type I interferons: structure and function. // Acta Virologica, 1994, V. 38, P. 345-360.

87. Uze G., Lutfalla G., Mogensen K. Genetic transfer of a functional human interferon alpha receptor into mouse cells: cloning and expression of its cDNA. // Cell, 1990, V. 60, P. 225234.

88. Novick D., Cohen B., Rubinstein M. The human interferon alpha/beta receptor: characterization and molecular cloning. // Cell, 1994, V. 77, P. 391-400.

89. Cohen B., Novick D., Barak S., Rubinstein M. Ligand-induced association of the type I interferon receptor components. // Mol. Cell. Biol., 1995, V. 15, P. 4208-4214.

90. Zav'yalov V., Denesyuk A., Zav'yalova G. Interferons alpha/beta and their receptors: place in the hierarchy of cytokines. // Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scandin., 1997, V. 105, N.3, P. 161-186.

91. Radhakrishnan R., Walter L., Hruza A., Reichert P., Trotta P., Nagabhushan T., Walter M. Zinc mediated dimer of human interferon-alpha 2b revealed by X-ray crystallography. // Structure, 1996, V. 4, N. 12, P. 1453-1463.

92. Klaus W., Gsell B., Labhardt A., Wipf B., Senn H. The three-dimensional high resolution structure of human interferon alpha-2a determined by heteronuclear NMR spectroscopy in solution. // J. Mol. Biol., 1997, V. 274, N. 12, P. 661-675.

93. Zav'yalov V., Denesyuk A. Possible conformation of interferons: a prediction based on amino acid composition and sequence. // Immunol. Lett., 1982, V. 4, N. 1, P. 7-14.

94. Zav'yalov V., Denesyuk, A., Zav'yalova G. Theoretical analysis of conformation and active sites of interferons. // Immunol. Lett., 1989, V. 22, P. 173-182.

95. Zav'yalov V., Denesyuk A., Zav'yalova G. Theoretical conformational analysis of a family of alpha-helical immunocytokines. //Biochim. Biophys. Acta., 1990, V. 1041, P. 178-185.

96. Sprang S., Bazan J. Tumor necrosis factor receptor superfamily. // Curr. Opin. Struct. Biol., 1993, V.3, P. 815-827

97. Kontsek P., Boresky L., Kontsekova E., Macicova I., Kolsunova A., Novak M., Krchnak V. Mapping of two immunodominant structures on human interferon alpha 2c and their role in binding to cells. // Mol. Immunol., 1991, V. 28, N. 11, P. 1289-1297.

98. Kontsek P., Boresky L., Kontsekova E., Kolsunova A., Novak M., Zav'yalov V., Maiorov, V. Immunodominant structures in the aminoterminal portion of human interferon alpha 1. // Mol. Immunol., 1992, V. 29, N. 7-8, P. 863-870.

99. Kontsek P., Boresky L., Zav'yalov V., Maiorov V. Peptide-mapping of three neutralizing epitopes into predicted biologically active sites of human interferon-alpha 2. // Immunol. Lett., 1993, V. 35, N. 3, P. 281-284.

100. Danilkovich A., Freze K., Shevalier A., Samukov V., Kirkin A., Gusev M. Synthetic peptide with antiproliferative activity: a short C-terminal fragment of the human interferon alpha-2 molecule. // Immunol. Lett., 1992, V. 31, N. 1, P. 15-20.

101. Danilkovich A., Freze K., Romashkova J., Valujskikh A., Makarov E., Targoni O.,

102. Zav'yalov V., Vasilenko R., Dolgikh D., Kirpichnikov M., Navolotskaya E., Korpela T. // International Patent Application PCT/FI98/00418,2000; Finnish Patent W09852594,2001.

103. Fish E.N. Definition of receptor binding domains in interferon-alpha. // J. Interferon Res., 1992, V. 12, N. 4, P. 257-266.

104. Senda T., Saitoh S., Mitsui, Y. Refined crystal structure of recombinant murine interferonbeta at 2.15 A resolution. // J. Mol. Biol., 1995, V. 253, N. 13 (1), P. 187-207.

105. Piehler J., Schreiber G. Mutational and structural analysis of the binding interface between type I interferons and their receptor Ifnar2. // J. Mol. Biol., 1999, V. 294 (1), N. 19, P. 223237.

106. Uze G., Di Marco S., Mouchel-Vielh E., Monneron D., Bandu M.-T., Horisberger M.A., Dorques A., Lutfalla G., Mogensen K.E. Domains of interaction between alpha interferon and its receptor components. // J. Mol. Biol., 1994, V. 243, P. 245-257.

107. Mitsui Y., Senda T., Shimazu T., Matsuda S., Utsumi J. Structural, functional and evolutionary implications of the three-dimensional crystal structure of murine interferon-beta. // Pharmac. Ther., 1993, V. 58, N. 1, P. 93-132.

108. Uze G., Lutfalla G., Mogensen K. Alpha and beta interferons and their receptor and their friends and relations. // J. Interferon Cytokine Res., 1995, V. 15, N. 1, P. 3-26.

109. Bogdan C. The function of type I interferons in antimicrobial immunity. // Curr. Opin. Immunol., 2000, V. 12, N. 4, P. 419-424.

110. Akbar A., Lord J., Salmon M. IFN-alpha and IFN-beta: a link between immune memory and chronic inflammation. // Immunol. Today, 2000, V. 21, N. 7, P. 337-342.

111. Sinigaglia F., D'Ambrosio D., Panina-Bordignon P., Rogge L. Regulation of the IL-12/IL-12R axis: a critical step in T-helper cell differentiation and effector function. // Immunol. Rev., 1999, V. 170, N. 8, P. 65-72.

112. Ruuth K., Carlsson L., Hallberg B., Lundgren E. Interferon-alpha promotes survival of human primary B-lymphocytes via phosphatidylinositol 3-kinase. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2001, V. 284 (3), N. 15, P. 583-586.

113. Ronnblom L., Aim G., Oberg K. Autoimmunity after alpha-interferon therapy for malignant carcinoid tumors. // Ann. Intern. Med., 1991, V. 115 (3), N. 1, P. 178-183.

114. Ioannou Y., Isenberg D. Current evidence for the induction of autoimmune rheumatic manifestations by cytokine therapy. // Arthritis Rheum., 2000, V. 43, N. 7 P. 1431-1442.

115. Ronnblom L., Aim G. A pivotal role for the natural interferon alpha-producing cells (plasmacytoid dendritic cells) in the pathogenesis of lupus // J. Exp. Med., 2001, V. 194, N. 12, P. F59-F63.

116. Brietman T.R., Selonic S.E., Collins S.J. Induction of differentiation of the human promyelocytic leukemia cell line (HL-60) by retinoic acid. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, V. 77, N. 5, P. 2936-2940.

117. Костанян И.А., Нуриева Р.И., Наволоцкая Е.В., Астапова М.В., Драницына С.М., Завьялов В.П., Липкин В.М. Изучение механизма дифференцирующего действия L -глутаминовой кислоты на клетки HL-60. // Молекулярная биология, 1998, Т. 32, N. 1, С. 148-153.

118. Aggarwal В.В., Moffat В., Harkins R.N. Human lymphotoxin. Production by a lymphoblastoid cell line, purification, and initial characterization. // J. Biol. Chem., 1984, V. 259, P. 686-690.

119. Resnitzki D., Yarden A., Zipori D., Kimchi A. Autocrine beta-related interferon controls c-myc suppression and growth arrest during hematopoietic cell differentiation. // Cell, 1986, V. 46, P. 31-40.

120. Kohase M., Henriksen-DeStefano D., May L.T., Vilsek J., Sehgal P.B. Induction of beta 2-interferon by tumor necrosis factor: a homeostatic mechanism in the control of cell proliferation // Cell, V. 45, P. 659-666.

121. Kostanyan I.A., Astapova M.V., Starovoytova E.V., Dranitsina S.M., Lipkin V.M. A new human leukemia cell 8.2 kDa differention factor: isolation and primary structure. FEBS Lett., 1994, N. 356, P. 327-329.

122. Костанян И.А., Астапова M.B., Старовойтова E.B., Драницына С.М., Липкин В.М.

123. Новый фактор дифференцировки из культуральной среды клеток линии HL-60,105обработанных ретнноевой кислотой. Выделение и определение первичной структуры. //Биоорганическаяхимия, 1995, T.21.N4, С.243-248.

124. Смирнова Е.В., Ракитина Т.В., Евтодиенко А.Ю., Костанян И.А., Липкин В.М. Клонирование и характеристика гена человеческого рибосомального белка S21. // Биоорганическая химия, 2000, Т. 26, N. 5, С. 392-396.

125. Humbel R.E. Insulin-like growth factors I and II. // Eur. J. Biochem., 1990, V. 190, P. 445462.

126. Adham I. M., Burkhardt E., Benahmed M., Engel W. Cloning of a cDNA for novel insulinlike peptide of the testicular Leydig cells. // J. Biol. Chem., 1993, V. 268, P. 26668-26672.

127. Chassin D., Laurent A., Janneus J.-L., Berger R., Bellet D. Cloning of a new member of the insulin gene superfamily (INSL4) expressed in human placenta. // Genomics, 1995, V. 29, P. 465-470.

128. Lagueux M., Lwoff L., Meister M., Goltzene F., Hoffmann J. A. cDNA from neurosecretory cells of brains of Locusta migratoria (Insecta, Orthoptera) encoding a novel member of the superfamily of insulins. // Eur. J. Biochem., 1990, V. 187, P. 249-254.

129. Smit A.B., Geraerts W.P.M., Meester I., van Heerikhuizen H., Joosse J. Characterization of a cDNA clone encoding molluscan insulin-related peptide II of Lymnaea stagnalis. II Eur. J. Biochem., 1991, V. 199, P. 699-703.

130. Duret L., Guex N., Peitsch M.C., Bairoch A. New insulin-like proteins with atypical disulfide bond pattern characterized in Caenorhabditis elegans by comparative sequence analysis and homology modeling. // Genome Res., 1998, V. 8, P. 348-353.

131. Bell G.I., Swain W.F., Pictet R.L., Cordell B., Tischer E., Goodman H.M. Nucleotide sequence of a cDNA clone encoding human preproinsulin. // Nature, 1979, V. 282, P. 525527.

132. Bell G.I., Pictet R.L., Rutter W.J., Cordell B., Tischer E., Goodman H.M. Sequence of the human insulin gene. //Nature, 1980, V. 284, P. 26-32.

133. Liu Z.Z., Kumar A., Ota K., Wakkner E., Kannwar U.S. Developmental regulation and the role of insulin and inslin receptor in metanephrogenesis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, V. 94, P. 6758-6763.

134. Carver R.S., Sliwkowski M.X., Sitaric S., Russel W.E. Insulin regulates heregulin binding and ErbB3 expression in rat hepatocytes. // J. Biol. Chem., 1996, V. 271, N 23, P. 1349113496.

135. Su T.-Z.,Wang M., Syu L.-J., Saltiel A.R., Oxender D.L. Regulation of system a amino acid transport in 3T3L1 adipocytes by insulin. // J. Biol. Chem., 1998, V. 273, N 6, P. 3173-3179.

136. Khan F.A., Goforth P.B., Zhang M., Satin L.S. Insulin activates ATP-sensitive K+ channels in pancreatic P-cells trough a phosphatidylinositol-3 kinase-depended pathway. // Diabetes, 2001, V. 50, P. 2192-2198.

137. Gorden P., Arakaki R., Collier E., Carpentier J.-L. Biosynthesis and regulation of the insulin receptor. // Yale J. Biol. Med., 1989, V. 62, P. 521-531.

138. Tsuda S., Kaihara M., Zhou X., Britos D., Arakaki R. The in vitro synthesized and processed human insulin receptor precursor binds insulin. // FEBS lett., 1999, V. 457, P. 13-17.

139. Dalle S., Ricketts W., Imamura T., Vollenweider P., Olefsky J.M. Insulin and insulin-like growth factor I receptor utilize different G-protein signaling components. // J. Biol. Chem., 2001, V. 276, N. 191, P. 15688-15695.

140. Drejer K. The bioactivity of insulin analogues from in vitro receptor binding to in vivo glucose uptake. // Diabetes, 1992, Metab. Rev., N.8, P. 259-285.

141. Weitzel G, Eisele K, Guglielmi H, Stock W, Renner R. // Structure and activity of insulin. XI. Biologically active synthetic peptides of the insulin sequence B22-25. Hoppe Seylers. Z. Physiol. Chem., 1971, V.352, N 12, P.1735-1738.

142. Kristensen C., Kjeldsen T., Wiberg F.C., Schaffer L., Hach M., Havelund S., Bass J., Steiner D.F., Andersen A.S. Alanine scanning mutagenesis of insulin. // J. Biol. Chem., 1997, V. 272, P.12978-12983.

143. Gammeltofit S. Insulin receptors: binding kinetics and structure-function rela-tionship ofinsulin. // Physiol. Rev., 1984, V. 64, P. 1321-1378.108

144. Kaarsholm N.C., Ludvigsen S. The high resolution solution structure of the insulin monomer determined by NMR. // Receptor, 1995, V. 5, P. 1-8

145. D'Ercore D.J., Calikoglu A.S., Gutierres-Ospina G. The role of the insulin-like growth factor in central nervous system. // Mol. Neurobiol., 1996, V. 13, N 3, P. 227-255.

146. Vella V., Sciacca L., Pandini G., Mineo R., Squatrito S., Vigneri R., Belfiore A. The IGF system in thyroid cancer: new concepts. // J. Clin. Pathol., 2001, V. 54, P. 121-125.

147. Маслов Д.Л., Прозоровский B.H. Исследование способности липосом, модифицированных синтетическими фрагментами инсулина, специфически взаимодействовать с клетками PC 12. // Вопросы медицинской химии, 2000, Т. 46, N. 4, С. 377-383.

148. Yanisch-Perron С., Vieira J., Messing J. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. // Gene, 1985, V.33, P.103-113.

149. Bullock W.O., Fernande J.M., Sort J.M. XLl-Blue: a high efficiency plasmid transforming recA Escherichia coli strain with beta-galactosidase selection. // Biotechniques, 1987, V. 5, P. 376-378.

150. Studier F.W., Moffatt B.A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. // J. Mol. Biol., 1986, V.189, N. 1, P.113-130.

151. Маниатис Т., Фрич Э., Сембрук Д. Молекулярное клонирование. // Москва, "Мир", 1984.

152. Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. // J. Mol. Biol., 1983, V.166, N. 4, P.687-714.

153. Birnboim H., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmidDNA. //Nucl. Acids. Res., 1979, V.7,N. 6, P.1513-1522.

154. Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit. // United States Biochemical, 1992.

155. QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit. // Instruction manual. Stratagene, 1997.

156. A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins. // Qiagen, 1997.

157. Protein Fusion and Purification System. Direction for expression and purification of proteins from cloned genes. // New England Biolabs, 1991.

158. Laemmli U.C. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature, 1970, V.227, P.680-685.

159. Schagger H., Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. // Analytical biochemistry, 1987, V.166, P.368-379.

160. Practical Protein Chemistry. A Handbook / Ed. by Darbre A. Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore, John Wiley & Sons Ltd, 1986.

161. Edman P., Henschen A. / In: Protein Sequence Determination. / Needleman S.B. (Ed.), 2nd edn., Springer, Berlin, Heidelberg, New York, 1975, P. 232-279.

162. Provencher S.W., Glocker J. Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism. // Biochemistry, 1981, V. 20, P.33-37.

163. Тесенков В. // Реакция бласт-трансформации лимфоцитов селезенки под влиянием антигена in vitro. Иммунологические методы / Ред. Х.Фримеля. М.; Мир, 1979.

164. Baehner R.L., Nathan D.G. Quantitative nitroblue tetrazolium test in chronic granulomatous disease. // J.Med., 1968, V.278, P.971-976.

165. Ершов Ф. // Система интерферона в норме и при патологии. М.: "Медицина", 1996.

166. Чижов Н., Ершов Ф., Индулен М. // Основы экспериментальной химиотерапии вирусных инфекций. Рига: "Зинатне", 1988.

167. Worthington J., Morgan К. Epitope mapping using syntheticpeptides. Peptide Antigenes. A Practical Approach. // Ed. by Wisdom G.B., Oxford New-York - Tokio, Oxford University Press, 1994, P. 181-217.

168. Day C., Schwartz В., Li В., Pestka S. Engineered disulfide bond greatly increases specific activity of recombinant murine interferon-beta. // J. Interferon Res., 1992, V. 12, N.2, P. 139143

169. Hu R., Bekisz J., Hayes M., Audet S., Beeler J., Petricoin E., Zoon K. Divergence of binding, signaling, and biological responses to recombinant human hybrid IFN // J. Immunol., 1999, V. 163(2), N. 15, P. 854-860.

170. Kolesanova E.F., Kozin S.A., Rumyantsev A.B., Jung C., Hui Bon Hoa G., Archkov A.I. Epitope mapping of cytochrome P450cam (CYP 101). // Arch. Bichem. Biophys., 1997, V. 341, P.229-237.1. БЛАГОДАРНОСТИ

171. Приношу свою глубокую благодарность заведующему Лабораторией спектрального анализа ИБХ РАН A.C. Арсеньеву, а также всем сотрудникам за царящую в лаборатории дружескую атмосферу, которая благотворно влияла на выполнение диссертационной работы.

172. Отдельную благодарность хочу выразить сотрудникам нашей группы, доброжелательность и высокий профессионализм которых неизменно помогал и поддерживал меня во время выполнения работы.