Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и исследование альбеферона - искусственного белка с биологической активностью

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение и исследование альбеферона - искусственного белка с биологической активностью"

На правах рукописи

<§о АФАСИЖЕВА ИННА ЮРЬЕВНА

§

ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ АЛЬБЕФЕРОНА -ИСКУССТВЕННОГО БЕЛКА С БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ

03.00.03- Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических ваук

Москва 1998

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН и Институте Биоорпшической химии имени М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

академик РАН, доктор биологических наук М.П. Кирпичников и доктор биологических наук Д. А. Долгих

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор А В. Иткес

кандидат биологических наук И. А Костанян

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Центр «Биоинженерия» РАН

Защита состоится

ЛЗ-Огб 1998 г в //

часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии имени В. А Энгельгардта РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии имени В.А Энгельгардта РАН, по адресу: 117984, г. Москва, ул. Вавилова, 32.

Автореферат разослан

1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Логическим продолжением изучения процесса сворачивания белка в условиях /л vitro явилось создание такого направления в науке, как дизайн и инженерия искусственных белков. Идея создания искусственных белков (белков dc novo) основывалась на предположении о том, что наибольшие знания о белках и процессах их сворачивания и разворачивания белков можно получить, если синтезированная нами аминокислотная последовательность свернется в предсказанную нами же пространственную струюуру. Развитие молекулярной биологии и биоорганической химии привели к возможности не только моделировать искусственные системы, но и создавать белки de novo в реальных биологических условиях.

Исследования структурно-функциональных свойств природных белков часто сталкиваются с непреодолимыми препятствиями, обусловленными двумя особенностями белковых молекул. Во-первых, белки представляют собой большую и сложную структуру, работать с которой очень тяжело и неудобно. Во-вторых, функции белков строго зависят от определенного расположения аминокислот, поэтому любые случайные изменения, как в белковой последовательности, так и в пространственном расположении аминокислот, открывают бесчисленное количество вариантов изменения свойств. Логика развития науки о белках привела к необходимости поиска путей, которые позволили бы предсказывать и контролировать сворачивание и разворачивание белков. С помощью белкового дизайна и методов белковой инженерии стало возможным усовершенствование природных белков для медицинских и биотехнологических целей и создание не существующих в природе белков, используя природные мотивы.

Многие ферме!ггы сблздагот несколькими активностями, за которые могут отвечать различные субъединицы молекулы. Искусственные белки, используемые в качестве носителей биологических активностей, являются удобной моделью для исследования свойств отдельных активностей, влияния активных пептидов на структуру белка и процесс сворачивания белка.

Научная новизна работы. В работе впервые был получен альбеферон -биологически активный искусственный белок и исследованы его свойства. Установлено, что введение в состав аминокислотной последовательности альбебетина пептида из восьми аминокислот улучшает структуру белка de novo, делая его более стабильным. Было показано, что альбеферон, представляющий собой альбебегин с присоединенным при помощи генно-инженерных методов на N-конец фрагментом 130-137 человеческого интерферона а2, обладает ангапролиферативной и цитопатической активностями. Мы впервые показали, что альбеферон наряду со сродством к рецепторам на Т- лимфоцитах мыши, обладает высоким сродством к рецепторам на Т- лимфоцитах человека, воспроизводя оба вида активностей пептида rhTFN-a2- Нами было показано, что альбеферон, обладает низкой иммуногенностью. Это свойство белка позволяет использовать его как носитель биологической активности.

Практическая ценность работы. Полученные в работе данные подтверждают предположение о том, что искусственные белки можно использовать в качестве иммунологически инертных носителей биологических активностей. Такого рода носители можно использовать для изучения механизмов действия как отдельной активности, так и комбинированной функции из нескольких активных пептидов. Обладающий такими свойствами искусственный белок может использоваться в качестве каркаса для пептидных факторов, имеющих медицинское значение. Апробация работы. Результаты доложены на Международной конференции, посвящешюй памяти А. А. Баева ( май 1996 г., Москва); на Втором съезде Биохимического Общества РАН (19-23 мая 1997г., Москва); на конференции, посвященной 30-летию журнала «Молекулярная биология» (декабрь, 1997 г., Москва)

Основные положения диссертации обсуждены и представлены к защите на заседании коллоквиума группы белковой инженерии в лаборатории спектрального анализа Института биоорганической химии им. ММ Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН 30 февраля 1998 г.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения,

выводов и списка литературы. Работа изложена на 125 страницах машинописного текста, содержит 1 таблицу и 18 рисунков. Библиография включает 213 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В данной работе были использованы лабораторные штаммы Exoli XL-Blue ("Stratogenc", США), BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS ("Bio-Rad", США). В качестве векторов использовали pET23d+(Novagen) и pMAL™-c (New England Biolabs). Для выращивания бактериальных штаммов использовали среды М9, LB и ТВ с добавлением антибиотиков при необходимости. Трансформация, выделение плазмияной ДНК, обработка ДНК ферментами, гель-элеетрофорез в агарозном геле, выделение фрагментов ДНК in агарозного геля проводили по лабораторному руководству Самбрука и Маниатиса и др. [1988]. Клонировадае фрагментов ДНК и ПЦР проводили в соответствии с методиками, описанными в лабораторных протоколах фирмы Promega [1991], SDS-гель электрофорез в трис-глициновом буфере и SDS-гель электрофорез в трис-трициновой буферной системе, а также выделение белка проводили согласно протоколам, приведенным в сборнике «Current protocols in Molecular Biology» [1994]. Очистка слитного белка (мальтозосвязывающего с альбефероном) проводилась на автоматическом хроматографе класса FPLC фирмы (Bio-Rad) с последовательным использованием колонок MonoQ (30) (Pharmacia), Q-superosa (5) (Pharmacia) и MonoQ (10) (Pharmacia). Реакцию отщепления алъбеферона от мальтозосвязывающего белка фактором Ха и очистку искусственного белка аффинной хроматографией осуществляли по протоколам фирмы New England Biolabs. Иммунизацию кроликов (2 кг, порода шиншилла), очистку антител, титрование антител и иммуноблотинг проводили по стандартным методикам [Антитела. Методы. «Мир», 1991]. Лимфоциты выделяли по методу [Boyum А,1968], белки метали по методике [Marchalonis J.J., 1969], модифицированной использованием твердофазной лактопероксидазы. Исследование связывания белков с рецепторами и процесса ингибирования в присутствии РНА проводили по методикам [Weiland G. Et al., 1981] и [Bennett J. et al., 1985], соответственно. Олигонуклеотиды для

клонирования гена альбеферона были синтезированы в лаборатории синтеза олигонуклеотидов (ИБХ).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Альбеферон представляет собой искусственный белок с пришитым на М- конец фрагментом из восьми аминокислот, который отвечает за некоторые активности в интерфероне человека (рисунок 1).

Рисунок 1. Предполагаемая пространственная структура альбеферона. Показаны N- и С- концы белка и аминокислотная последовательность фрагмента интерферона.

Ген альбеферона был клонирован в pMal™-c вектор с помощью метода ПЦР. Максимального уровня и высокой стабильности экспрессия слитного белка достигала в клетках штамма XL-Blue ("Stratogene", США), который и был использован для наработки искусственного белка. Оптимизация условий экспрессии позволила получить от 30% до 50% слитного белка с одного литра, и отработанный метод очистки альбеферона позволил получить до 8 мг искусственного белка с литра культуралыгой среды. 1. Исследование структуры альбеферона 1.1. Спектры кругового дихроизма

На рисунке 2 представлены спектры КД альбеферона в сравнении со спектрами алъбебепша. Из рисунка видно, что спектр альбеферона в ближней ультрафиолетовой (УФ) области (рис. 2А) содержит специфические сигналы,

отсутствующие в спектре альбебетина. Как известно, спектр КД в этой области отражает жесткое асимметричное окружение ароматических аминокислотных остатков в молекуле белка [Alder A. ct al., 1973].

Рисунок 2. Сравнение спектров КД альбеферона (—) и альбебетина (-)

в ближней (А) и дальней (В) УФ области. Измерения проводились в 100 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 8,0 при температуре 25°С. Концентрация белка при исследованиях в ближней и дальней УФ областях составляла 1,7 и 0,88 мг/мл, толщина кювет - 10 и 0,148 мм, соответственно.

Отсутствие выраженного спектра в случае альбебетина (рис. 2А) объясняется тем, что в составе альбебетина нет ароматических аминокислотных остатков. В альбефероне имеется остаток тирозина (Туг7), который, по-видимому, и приводит к появлению выраженных специфических сигналов в спектре. Отсюда можно сделать вывод, что в молекуле альбеферона имеется некоторая относительно жесткая асимметричная структура. На рисунке 2В приведены спектры КД альбеферона и альбебетина в дальней УФ области. Анализ формы и интенсивности спектров КД в этой области позволяет рассчитать содержание регулярной вторичной структуры в рассматриваемом белке [РютепсЬет Б е1 а!, 1981]. Из рисунка 2В следует, что искусственные белки имеют весьма близкие спектры КД в дальней УФ области. Анализ этих спектров по известной методике Провенчера и ГлСкнера [РгоуспсЬег 8. й а!., 1981] показал, что в альбефероне содержится 27% а- и 35% (3-структуры, в то

время как альбебетин состоит из 29% а- и 40% р- структуры. Необходимо отметить, что эти величины достаточно близки к расчетным, при условии, что фрагмент интерферона в составе альбеферона не обладает регулярной вторичной структурой, как и в самом интерфероне. 1.2. Конформационная стабильность

На рисунке 3 показана зависимость спектра КД альбеферона от температуры в

Я тг^и^й уЛЫрйфиСЛуТОВОЙ ОбЛмСТ!'

§ &

Ъ -18

2» 200 270 280 , 390 300 310 120

Дтма »олны (нм)

20 40 00 60 1М

Теилсрати» СО

Рисунок 3. Температурная зависимость спектра КД альбеферона в ближней УФ области. А - Спектры КД, измеренные при различных температурах: 1-2.5°С, 2- 55°С и 3- 95°С. В - Зависимость эллиптичности при длине волны 275 нм от температуры. Скорость прогрева составляла 0,9 град/ мин, концентрация белка 1,7 мг/мл, толщина кюветы 10 мм.

Из рисунка можно сделать вывод, что молекула альбеферона (по крайней мере в области Туг7 и его окружения) имеет наиболее жесткую и упорядоченную пространственную структуру при температуре ~55°С, в то время как уменьшение или увеличение температуры приводит к снижению интенсивности спектра. При 95°С в спектре белка практически не наблюдается специфических сигналов, что говорит о полной денатурации белковой молекулы. На рисунке ЗВ показана зависимость эллиптичности поглощения на длине волны 275 нм от температуры. Видно, что абсолютная величина [9]275 увеличивается с ростом температуры в интервале от 0сС до 50°С, в диапазоне от 50°С до 60°С она остается неизменной, а дальнейшее

увеличение температуры приводит к уменьшению этого параметра. При этом охлаждение раствора белка и повторный прогрев показывают полную обратимость наблюдаемых процессов.

УФ области. А - Спектры КД, измеренные при различных температурах'. 1-2.5°С, 2- 55°С и 3- 95°С. В - Зависимость эллиптичности при длине волны 220 нм от температуры. Скорость прогрева составляла 0,9 град/мин, концентрация белка 0,88 мг/мл, толщина кюветы 0,148 мм.

На рисунке 4А приведены спектры КД в дальней УФ области при разных температурах. Рисунок 4В показывает зависимость от температуры эллиптичности на длине волны 220 нм. Из рисунка 4 ввдно, что имеются две ясно выраженные стадии изменения эллиптичности поглощения: вначале наблюдается увеличение абсолютной величины этого параметра, отражающее некоторый рост содержания, вторичной структуры, затем происходит уменьшение эллиптичности, связанное с индуцированным температурой разрушением вторичной структуры белка. На рисунке 5 для сравнения приведена аналогичная кривая для альбебетина, из которой видно, что в случае этого белка увеличение температуры приводит только к плавному уменьшению сигнала (от ~ - 10000 до ~ - 7000 град см2 дмоль"1).

эллиптичности при длине волны 220 нм от температуры. Скорость прогрева составляла 0,9 град/мин, концентрация белка 0,88 мг/мл, толщина кюветы 0,148 мм.

Для того, чтобы сравнить влияние температуры на третичную и вторичную структуру альбеферона, данные, приведенные на рисунках ЗВ и 4В были пересчитаны согласно формуле:

СпгО^-Ум„1|)/(Умам:-Ум1[Н),

где У- абсолютная величина эллиптичности поглощения на длине волн 275 и 220 нм при данной температуре, У^ - максимальная величина этих параметров (соответствующая температурному интервалу от ~50°С до 60°С), а -минимальная величина, наблюдаемая при температуре ~95°С. Зависимость величины (которая может быть интерпретирована как доля менее упорядоченного состояния в зоне перехода) от температуры представлена на рисунке 6.

Температура (°С)

Рисунок 6. Температурный переход в альбефероне по эллиптичности при 275 нм (-) и 220 нм ( ).

Из рисунка видно, что температурные изменения спектров КД альбеферона в ближней УФ области, регистрируемые по эллиптичности на 275 нм, происходят синхронно с изменениями в спектрах КД в дальней УФ области, регистрируемыми по эллиптичности при 220 нм.

Для исследования тепловой денатурации альбеферона и альбебетана мы использовали также метод дифференциальной сканирующей микрокалориметрии [Рп\'а!о\' Р., 1979]. Как известно, характерные пики теплопоглощения на калориметрической кривой отражают процесс кооперативного разрушения пространственной структуры белковой молекулы [Рп\'а1оу Р., 1979]. На рисунке 7 показаны калориметрические кривые зависимости парциальной удельной теплоемкости от температуры для альбеферона и альбебетина

2,5 2,0

£11.0 |

ü"

o.s 0.0

280 300 320 340 360 380

Температура CK)

Рисунок 7. Зависимость парциальной удельной теплоемкости от температуры для альбебетина (1) и альбсферона (2). Измерения проводили в 100 мМ натрий-фосфатном буфере pH 8.0. Концентрация белка составляла 1,5 - 2,0 мг/мл, __скорость прогрева 0,9 град/мин.

В случае альбебегана калориметрическая кривая не имеет сколько-нибудь заметного пика теплопоглощения, что говорит об отсутствии в этом искусственном белке жесткой пространственной структуры, кооперативно плавящейся при нагревании. В то же время при плавлении альбеферона наблюдаются некоторые тепловые эффекты, которые, однако, по амплитуде существенно уступают природным глобулярным белкам подобной молекулярной массы.

Полученные результаты позволяют сделать выводы, существенные для создания новых и улучшения дизайна уже сконструированных искусственных белков. Из нашей работы следует, что молекула альбебетина не имеет жесткой кооперативно плавящейся третичной структуры, но она относительно компактна (1^=17,2+0.5 Е). Ранее было установлено, что альбебетин устойчив к разворачиванию мочевиной

[Долгих Д.А. и др., 1993]. На основании этих данных можно утверждать, что молекула альбебетина является типичной расплавленной глобулой, как и большинство искусственных белков [Tanaka Т. et al., 1994]. Включение в состав альебетина фрагмента интерферона не только не ухудшает структурные характеристики белка, а, напротив, приводит к их некоторому улучшению, и именно этот результат представляется нам наиболее интересным. Действительно, после включения фрагмента интерферона, альбебетин становится более компактным (R,=16,0±0.5 Е, в сравнении с 1^=17,210.5 Е) и приобретает заметно большую устойчивость к разворачиванию мочевиной. При этом молекула альбеферона содержит выраженную вторичную структуру (рисунок ЗА). Спектр КД в ближней УФ области (рисунок 2А) показывает, что, по крайней мере, в районе Т\т7 молекула альбеферона обладает определенной упорядоченной пространственной структурой, а данные микрокалориметрии говорят о наличии также некоторой кооперативно плавящейся пространственной структуры (рисунок 7). Исходя из совокупности полученных данных, можно сделать вывод, что по своим струюурным характеристикам альбеферон заметно более близок к нативным природным белкам, чем альбебетин. Это позволяет нам предположить, что по классификации Добсона [Dobson С. et al., 1994] конформация альбеферона может быть отнесена к состоянию высоко структурированной расплавленной глобулы. Эффект стабилизации структуры искусственного белка, возможно, связан с появлением новых электростатических взаимодействиях между отрицательно заряженным альбебетином и положительно заряженным октапептадом - фрагментом интерферона. Интересно отметить, что наши данные хорошо согласуются с аналогичными результатами, полученными для природных белков. Например, известно [Shortle D. et al., 1989; Flanagan J. ct al., 1992; Flanagan J. et al., 1993], что удаление относительно короткого пептида (13 аминокислотных остатков) с С-конца стафилоккоковой нуклеазы приводит к денатурации белковой молекулы и потере части ее вторичной структуры. При этом белковая молекула все еще остается компактной и мономерной при физиологических условиях.

2. Изучение биологической активности альбеферона.

Октапегпид H-LKEKK.YSP-OH, использованный нами как активный фрагмент для присоединения к искусственному белку, способен связываться со специфическими рецепторами на тимоцитах мыши и фибробластах человека. Мы исследовали влияние трех белков: альбебетина, альбеферона и альбеферона с заменой первого метионина на изолейцин на бласт-трансформацию клеток крови в ответ на

ПОЛККЛОНаЛЬКЫИ тИТСГСп - фгпСГСмаГшСТгциш (РНА), S jíCCüupfíA'ulíTuX «1 v'i.CTüEíí

себе цель проследить молекулярный механизм связывания альбеферона с рецепторами.

2.1. Лнтипролиферативная активность фрагмента интерферона и альбеферона в Т-лимфоцитах человека in vitro.

На рисунке 8 представлены результаты исследования влияния rhIFN -а2, альбеферона, альбеферона (Не) и альбебетина на индуцированную РНА пролиферацию Т-клеток крови человека.

-7 л

X

т—I-1-Г%"1-1—"I-1

012345678 В, (М х Ю10)

концентрация белков 10х, М

Рисунок 9. График по Скэтчарду специфического связывания

Рисунок 8. Индуцированное РНА ингибирование пролиферации

Т -лимфоцитов гЫШ-а2 (линия 3), [125Л-А1Ша2 (линия 1) и ['"^-альбеферона

альбефероном (линия 4), альбефероном (Не) (лшшя 2) с Т_лнмф0цитами чеЛовека. (линия 5), альбебстином (линия 6). Прямые лшши 1 и 2 соответствуют только РНА (1) и только среде (2). Величина разброса не превышала 10%.

Было показано, что белки: rhIFN -а2 и альбеферон в концентрациях от 1О"!0 M до 10"7 M ингибируют пролиферацию Т- лимфоцитов человека в присутствии РИА. Альбеферон (Tie) имеет слабо выраженную антипролиферативную активность, а альбебетин не проявляет подобной активности ионсе. Важно отметить, что альбеферона в используемых концентрациях не обладает цитотоксической активностью, оцениваемой по подсчетам процента гибели клеток в сравнении с контролем. Таким образом, мы показали, что альбеферон, подобно молекуле природного пептида rhIFN -а2, может ингкбирсвзтъ спонсированную митсгеном пролиферацию Т- клеток человека in vitro.

2.2 Взаимодействие с Т- лимфоцитами человека интерферона человека и альбеферона.

Ранее было показано, что rhIFN-a2 и альбеферон, полученный из бес клеточной системы трансляции, в концентрациях от 10"и до 105 M активируют пролиферацию тимоцигов мьппи, индуцированных конкавалдаом A (Con A) in vitro [Долгах ДА. и др., 1993; Dolgikh D.A. et al, 1996]. Видовое разнообразие интерферонов [Turell D.A., 1959] не является проявлением шиш. специфического взаимодействия интерферон - рецептор, так как, например, mIFN может связываться с рецепторами на плазматической мембране человеческой линии КВ-3, которая невосприимчива к обоим видам интерферонов: mIFN и hlFN. К тому же, человеческий интерферон может взаимодействовать с плазматическими мембранами мышиных клеток [Kohn L. et al., 1976]. Эффекты, показанные для rhIFN -0-2 и альбеферона в мышиных и человеческих клетках, являются совершенно противоположными. В экспериментах с меченным йодом [,25J] октапегпидом H-LKEKK.YSP-OH, было показано, что этот фрагмент имеет высокое сродство к рецегггорам на внешней стороне мембраны тимоцитов мыши (Kd = 4,2х10"12 М), общими для интерферона мыши hTM - аь интерферона человека (hlFN - aj) и альбеферона [До.1 mix Д.А, и др., 1993; Zav'yalovetal., 1991]. На рисунке 9 приведены результаты анализа по Скэтчарду. Видно, что связывание обоих иодированных белков имеет специфический характер. Расчетные значения Kd] для [,25J]-aIFNcx2 (рис. 9, линия 1) и Kd2 для [|23.Г]-альбеферона (рис. 9, линия 2) равны (1,8 ± 0,2) х Iff8 M и (9,8 ± 0,1) х 10"9 М, соответственно.

Подтверждением того факта, что альбеферон и rhIFN -а2 способны связываться с рецепторами на мембранах тимоцитов мыши, являются результата экспериментов с конкурентным связыванием rhIFN -а2, альбеферона, альбеферона (Ile) и альбебетина (рисунок 10). ----

Рисунок 10. Конкурентное связывание ['".^-альбеферона в концентрации 10"8 М и немеченного гЫШ -а, (линия 1), альбеферона (Не) (линия 2) и альбебетина (линия 3). По оси ординат (У) отложен процент ингибирования специфического связывания ['"^-альбеферона в Т-лимфоцитах человеческих клеток. Концентрация конкурирующего белка отложена по оси абсцисс. Разброс не превышает 11%.

Приведенные на рисунке 10 данные показывают, что альбеферон и гЫЖ-а2 конкурируют за одни рецепторы, хотя значения их констант ингибирования различны (таблица 1). Альбеферон и гЫЩ -а2 характеризуются меньшими значениями Кс1 и Ю по сравнению с альбефероном (Пе), для которого значение И > 10"6 М."'. Значения констант ингибирования согласуются со сродством белка к рецептору и потенциалом ингибирования белков.

Результаты проведенных исследований показывают, чю гЫШ-а2 и альбеферон связываются с общим сайтом, антипролиферативная активность этих белков согласуется с их сродством к рецепторам на Т -лимфоцитах крови человека Молекула гЫШ-а2 имеет несколько функционально значимых участков, которые были локализованы с помощью мышиных антител. Три из них отвечают каждый за

10-Ю 1()-9 1(Г» 10-7 (0^ Ю5

одну активность, а два могут соответствовать различным биологическим активностям [КоЬп Ь. й а1., 1976]. Исследование биологического действия посредством создания рекомбинашных молекул и гибридов позволило определить субтипы 1Ш-а2, демонстрирующие антивирусную и антипролиферативную активности, но не поддерживающие природную способность интерферонов препятствовать действию цитотоксинов. Это дает возможность предполагать существование осооых функциональных доменов молекулы 1гг1, стие'1а10из?х за рагтичные биологические активности [ОПаМо I. й а1., 1984].

Лиганд Kd(M) 1СЯ1а (М) Ki(M)

[lbJ] -альбеферон (9,8 ± 0,1) х 10"9 - -

rhIFN-a26 (1,8 ± 0,2) х 10"8 (8,0 ± 0,5) х 10"9 (4,0±0,6)х 10"9

альбеферон - (lie) - >10^ >10"®

альбебетин - >10^ >10"6

Таблица 1. Кинетические характеристики связывания rhIFNa2, альбеферона, альбеферона (Не) и альбебепша с человеческими Т - лимфоцитами, а - значения оценивались, исходя из кривых ингибирования специфического связывания [l:5J]- альбеферона в концентрации 10"8 М б - Кц определяли для [12iJ]- rhffiN-a2.

Клонирование гена IFN-a^ с помощью сайт - направленного мутагенеза показало, что С - конец молекулы играет важную роль в антипролиферативной и антивирусной активностях интерферона [Fish Е., 1992], в то же время этот участок отвечает за связывание с рецепторами [Weber Н. et al., 1987; Kontsek D. et al., 1991]. Вышеизложенные результаты показывают, что биологическое действие IFN может быть различным, управляться разными механизмами, используя определенные части молекулы интерферона [Danilovich А. et al., 1995]. Наш искусственный белок с биологической активностью, опосредованной фрагментом из восьми аминокислот 130-137 из человеческого интерферона a2i пришитым с

помощью генно-инженерных методов на N- конец альбебетина, обладает антипролиферативной и антивирусной активностями. Поскольку пептид rhIFN-a2 (130-137) не воспроизводит шггивирусной активности и отличается сродством только к антипролиферативному сайту на молекуле IFN-a2, то наши результаты являются подтверждением гипотезы о том, что отдельные биологические активности опосредованы различными частями молекулы интерферона. 3 Исследование иммунологических свойств альбеоерока. Полученный искусственный белок, обладающий некоторой компактностью и стабильностью с улучшенной структурой, обладающий явно выраженной биологической активностью, является интереснейшим объектом для изучения ряда биологических активностей в отдельности. Однако возникла необходимость исследовать возможное влияние самого искусственного белка на иммунную сисгему животных. Мы использовали метод получения антител. Поскольку апьбеферон маленький кислый белок, то для иммунизации кроликов мы использовали технику слитных белков, тем более, что существующая конструкция для получения альбеферона в слиянии с мальтозосвязывающим белком (-50 кДа) вполне удовлетворяла нас в качестве антигена. На этот слитный белок была получена кроличья антисыворотка, из которой были выделены антитела По кривой титрования (рисунокИ) антител была определена концентрация сыворотки для иммуноблошнга. Рабочее разведение сыворотки было 1:10000. lía рисунке 12 приведет! фотографии ПААГ-геля и рентгеновской пленки с отпечатками проведенного на мембране иммуноблотинга Образцами на них служат очищенные мальтозосвязывающий белок и мальтозосвязывающий белок в слиянии с альбефероном, а также антитела к ним, соответственно. Из рисунка видно, что интенсивность сишала от антител к слитному белку на иммуноблотинге значительно превышает интенсивность от антител к МВР. Кроме того, интенсивность полос на иммуноблотинге зависит от концетпрации МВР-ABBI, тогда как для МВР такой зависимости не наблюдается. Данные рисунка 12 указывают на то, что иммунизация кроликов MBP-ABBI прошла успешно и титр антител к антигену высокий. Однако, интересна для нас была реакция иммунной системы кролика на альбеферон.

12000

10000 - »

8000 -

6000 -

4000 -

2000 -

0 ' о о » Ф » » ♦ о Ф 5 1: 1: 1: 1: 1: 1: 1: 1: 1: 100 500 2000 4000 80001600032000 40000 50000

Рисунок 11. Кривая титрования антител. По оси абсцисс отложено разведение сыворотки. По оси ординат отложены относительные единицы хемилюминисценции люминола. Ошибка измерений составляет не более 2 % .

На рисунке 13 приведены фотографии ПААГ-геля и рентгеновской пленки, полученной с мембраны иммуноблотинга. Из данных эксперимента отчетливо видно, что на том уровне, где на электрофоретическом геле располагается полоса, соответствующая альбеферону, па иммуноблотинге сигнал полностью отсутствует, хотя разрешающая способность иммуноблотинга на три порядка превышает чувствительность ПААГ- электрофореза. Отсутствие сигналов указывает' на то, что альбсферон, используемый в качестве антигена, не узнается антителами кролика, что свидетельствует о низкой иммуногенности нашего искусственного белка. Также из рисунка 13 видно, что ни один из анализируемых искусственных белков не дает сигнала на иммуноблотинге. На рисунке 14 показана прокрашенная шпропеллюлозная мембрана, на которую осуществлялся перенос искусственных белков. Таким образом, полученные нами результаты свидетельствует о низкой иммуногенности как альбеферона, так и искусственного белка альбебетина, являющегося в данном случае каркасом для активного фрагмента интерферона. Это означает, что альбебетнн действительно может служить удобным носителем различных биологических активностей в случаях, когда необходима низкая иммуногенность получаемых активных конструкций. В литературе нет данных, исследовались ли иммунологические свойства каких-либо

- МВР Е-' МВР-ABBI1

Рисунок 12. Радиоавтографы электрофорстического разделения мальтозосвязывающего белка (МВР) и слитного белка МВР-альбеферон (МВР-АВВ1) -А и иммуноблотинга антител к ним -В.

МВР МВР- ABB ABBI ABBI-ABBI 11с

МВР МВР- ABB АВВ1 ABBILD ABBI He

6-+

3.5 '

Рисунок 13. Радиоавтографы электрофоретического разделения тестируемых белков (А) и иммуноблотинга антител к ним (В). МВР - мальтозосвязьшающий белок, МВР-ABBI - слитный белок МВР-альбеферон, ABB - альбебетин, ABBI - альбеферон, АВВ-Пе - альбеферон с заменой первого остатка метиошша на изолейцин.

1 2

Рисунок t4. Нитроиеллюлозная мембрана, прокрашенная после переноса белков с электорфоретичес.кого геля. 1 - ABB, 2 - ABBI, 3 - ABBI-I!e.

других искусственных белков, однако можно предположить, что, если при их конструировании использовали структурные подходы, близкие к тому, каким был получен альбебетин П?е<к>гоу А. е1 а1., 1992; СИетспя V. 1994], они, по-видимому, также не будут обладать выраженной иммуногенностъю.

выводы

1. Впервые генно-инженерными методами в клетках Е.соН был получен искусственный белок с биологической активностью. Показано, что молекула альбеферона, искусственного белка с пришитым на № конец фрагментом интерферона человека, компактна, обладает выраженной вторичной структурой и имеет, по крайней мере, в районе Туг7, определенную упорядоченную третичную структуру. Это позволяет характеризовать состояние данного белка как высоко упорядоченную расплавленную глобулу.

2. Впервые показано, что альбеферон с высоким сродством связывается с рецепторами на Т-лимфощггах крови человека и также проявляет антипролиферативную и цитопатическую активности. Подтверждены данные, полученные на мышах, об антипролиферативной и антивирусной активности альбеферона, выделенного из бесклеточной системы трансляции, с использованием

-чистого белка, наработанного в клетках Е.соН.

3. Искусственные белки альбеферон и альбебетин, являющийся каркасом для активного фрагмента интерферона в альбефероне, обладают низкой иммуногешюстъю, что является важным показанием к применению искусственных белков в качестве модели для исследования различных биологических активностей природных пепгидов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. L. Yu. Aphasizheva, D.A. Dolgikh, E.V. Navolotskaya, V.M. Abramov, V.P. Zav'yalov, MP. Kirpichnikov. Biological Activity of de novo proteins with Incorporated Interferon Fragment. - Russian Journal of Immunology, i997, v. 2, N.l.p. 59-61.

2. I. Yu. Aphasizheva D.A. Dolgikh, Т.К. Abdullaev, V.N. Uversky, MP. Kirpichnikov, O.B. Ptitsyn. Grafting of an octapeptide can improve structure of a de novo protein? - FEBS Lett., Vol. 425/1,1998, pp. 101-104.

3. И.Ю. Афасижева, Д.А. Долгих, З.Х. Р.Ф. Латыпов, Е.И. Тиктопуло, В.Н. Уверский, O.B. Tlmuifbin, МП. Кирпичников. Исследование влияния биологически активного фрагмента интерферона на структуру искусственного белка носителя. - Биофизика, 1998,

4. И.Ю. Афасижева, З.Х. Абдуллаев, Д.А. Долгих, МП. Кирпичников. Получение и исследование различных систем экспрессии генов искусственных белков в E.coli. Международная конференция, посвященная памяти акад. Л. А. Баева Тезисы. Москва. 1996. с. 76

5. И.Ю. Афасижева, ДА. Долгих, КВ. Навалограш, В.М Абрамов, В.П. Завьялов, МП. Кирпич/¡иков. Изучение биологической активности белка de novo с фрагментом человеческого интерферона. Второй съезд Биохимического общества Российской академии наук. Тезисы стендовых сообщений. Часть П, Пущине, 1997, с. 100.

6. И.Ю. Афасижева, Д.А. Долгих, МП. Кирпичников. Искусственный белок с заданной структурой и биологической активностью обладаегг низкой иммуногенностью. Конференция, посвященная 30-летию журнала "Молекулярная биология"