Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Наследование и физико-химические свойства маркерных белков хлопчатника

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Наследование и физико-химические свойства маркерных белков хлопчатника"

АКАДЕМИЯ НАУК УЗБЕКСКОЙ ССР "' Институт биохимии

На правах рукописи

ШУСХАНОВ ШАВКАТ

УДК 547.962:633.511

НАСЛЕДОВАНИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МАРКЕРНЫХ БЕЛКОВ ХЛОПЧАТНИКА

03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Ташкент - 1389

Работа выполнена в лаборатории нуклеиновых кислот Института биохимии АН УзССР (1971-1976 гг.) и в лаборатории молекулярной генетики хлопчатника Института экспериментальной биологии растений АН УзССР (1976-1988 гг.).

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор И.А.Вайнтрауб, доктор биологических наук М.А.Белозерский, доктор биологических наук, профессор М.Н.Валиханов

Ведущее учреждение:

Всесоюзный научно-исследовательский институт растениеводства им. Н.И.Вавилова (г. Ленинград).

Защита состоится "_"_ 1990 г.

в час. на заседании специализированного Совета

Д 015.16.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биохимии АН УзССР (Ташкент, 700143, пр. Горького, 56).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии АН УзССР.

Автореферат разослан "_"_ 1990 г.

Учений секретарь специялпзттроврниого Совета гпгтор ('чтолотрч.еских нчук

К.Н.Нишанбаев

: ->/, Актуальность проблемы. Сравнительное исследование белков различных сортов и видов растений - их аминокислотного состава, молекулярной структуры, биосинтеза - и поиск на их основе молекулярных маркеров, ответственных за те или другие признаки, представляет собой одну из важных задач биохимии.

Белки являются участниками почти всех метаболических процессов в организме, ответственны за морфологические признаю! и генетически детерминированы. На свойствах белков основаны разрабатываемые в настоящее время методы определения видовой и сортовой идентификации зерновых и бобовых культур и методы прогнозирования хозяйственно-ценных признаков(Конарев,1975-1983, Конарев, Гавршпок,1977, Созинов, 1982-1985, Созинов Попереля,1975, Сози-нов, Кмеля.1983, Нао, Регпо11е1;,1981 ). Хлопчатник в этом отношении изучен недостаточно.

Исследование физико-химических и функциональных свойств белков хлопчатника необходимо для понимания механизма процессов, протекающих в клетке, и тем самым создания возможности направленного воздействия на различные метаболические пути в организме хлопчатника. Выделение запасных белков семян хлопчатника и изучение их физико-химических свойств имеет большое значение для оценки питательной ценности семян этой культуры, поскольку семена являются богатым источником бежа. Креме того, запасные белки семян являются удобными моделями для изучения механизмов синтеза белков в процессе эмбриогенеза и их распада при прорастании семян.

В Советском Союзе наиболее культивируемыми видами хлопчатника являются й.Мгз^ит ь. и О.ЬагЬабепзе ь. Представители вида в. Ыгвц-Ьшв I. относительно скороспелые и высокоурожайные, а представители вида о.ЬагЬадепзе Ь. обладают хорошими технологическими качествами волокна, хотя более позднеспелые и низкоурожайные.

Создание новых сортов, сочетающих хозяйственно-полезные качества обоих видов хлопчатника, является одной из актуальных задач современной селекции. Сорта, полученные на основе межвидовой гибридизации, должны проходить многолетные испытания на константность. Разработка ускоренных методов отбора константных форы, основанных на биохимических признаках, невозможна без наличия данных по сравнительному изучению белков различных сортов и видов хлопчатника, а такие данных по наследованию отдельных компонентов белков.

К началу настоящей работы данные по белкам хлопчатника были немногочисленны, а сведения, касающиеся ядерных белков, отсутствовали вообще.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было сравнительное изучение белков хлопчатника видов а.Шгвц1;ит ь., й. ЪагЪайепве ь, и их диплоидных доноров, выявление маркерных белков, установление закономерности их наследования и их биохимическая характеристика. Нами были поставлены следующие задачи:

- изучить белковые спектры семян различных сортов хлопчатника С.Мгаи-Ьиы ь. ,0,ЬагЬас1еп8е и выявить белковые маркеры;

- изучить взаимосвязь в наследовании маркерных белков с некоторыми морфобиологическиш признаками хлопчатника;

- изучить в сравнительном аспекте белки семян хлопчатника геномной группы А и Д, в качестве возможных доноров аллотетрапло-идных форм;

- выделить маркерные, а также основные по содержанию белки из семян хлопчатника в очищенном состоянии и изучить их физико-химические свойства;

- изучить динамику накопления и распада маркерных белков в онтогенезе хлопчатника;

- изучить ядерные белки хлопчатника.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые показано, что различные сорта хлопчатника С.Ыгзи1д1ш ь. содержат белковый маркер с электрофоретической подвижностью 0,13, а в. ЪагЬааепБе ь. - 0,18. Изучение распределения белков Н-0,13 и В-0,18 в семенах межвидовых гибридов позволило установить монофак-ториальный характер их наследования, а также взаимосвязь их наследования с белками Н-0,70 и В-0,70 и с генами Рс, контролирующими развитие подпушка на халазальной части и боковой поверхности семян. Выявлена система маркерных белков с компонентами 0,44, 0,55 и 0,50, 0,60. Вид О.Мгаи1;ит ь. по содержанию этих белков делится на две группы: одна группа содержит белки 0,44 и 0,55, а другая - белки 0,50 и 0,60. Семена различных сортов хлопчатника с.ЪагЪааепве ь. не отличаются друг от друта и содержат компоненты 0,44 и 0,55. Эти белки оказались генетически детерминированными.

Выявленные белковые маркеры использованы для изучения происхождения ам£идиплоидов. Полученные данные позволили установить, что 1-йд с.га1Еоп<ш не может служить общим донором для двух ам-

фИДИПЛОИДОВ G.hirsutum Ь. и G.barbaöense L.

Установлены физико-химические характеристики и функциональные свойства ряда электрофоретических кошонентов водорастворимой фракции белков семян хлопчатника. Один из кошонентов, обладающий диафоразной активностью, выделен в электрофоретически гомогенном состоянии.

Выделены в электрофоретически гомогенном состоянии маркерные белки И-0,13 и В-0,18, 7S и "аргшшновый" глобулины. Глобулины названы "госсипулинаки". Изучены физико-хикические свойства выделенных белков, а также время их накопления при созревании и их распада при прорастании семян хлопчатника. Показано, что полипептиды 7S глобулина синтезируются при эмбриогенезе хлопчатника в виде предшественников и их распад при прорастании семян имеет ступенчатый характер, с образованием полипептидов с молекулярной массой 33 ООО и 30 ООО.

Исследование ядерных белков показало, что гистоны хлопчатника представлены 5 основными компонентами. Для этой группы белков не обнаружены межвидовые и межсортовые различия. В случае же негис-тоновых белков ядер наблюдается тканевая и сортовая специфичность.

Полученные в настоящей работе данные являются новыми в биохимии хлопчатника и могут быть использованы в генетике и селекции, а также в генной инженерии для выделения и клонирования генов изученных белков. На основании полученных результатов разработана и предложена рекомендация для определения константности форм хлопчатника, выведенных путем межвидовой гибридизации.

Апробация работы. Результаты исследований, включенные в диссертацию были доложены на II в III Всесоюзных биохимических съездах (Ташкент,1969, Рига,1974), Всесоюзных симпозиумах "Структура и функции нуклеиновых кислот растений" (Ташкент,1974, 1977), Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Новосибирск, 1975), Всесоюзном симпозиуме по зашии п биохимии белка (Ташкент,1976), Конференциях биохимиков республик Средней Азии и Казахстана (Фрунзе,1976, Душанбе,1981), Советско-французком симпозиуме "Взаимодействие белков и нуклеиновых кислот" (Ташкент,1977), Всесоюзных съездах ВОГг.С ил Н.И.Вавилова (Ленинград,1977, Кишинев,1982), 1У и У съездах Узбекского республиканского общества генетиков и селекционеров (Ташкент,1981, 1986), Всесоюзной конференции Теном растений" (Черновцы,1983),

Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва,1987).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 42 работы, из них 2 монографии и 2 методические рекомендации.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного выделению и физико-химической характеристике белков семян растений, ядерным белкам и белкам хлопчатника, экспериментальной части, обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитированной . литературы (464 наименований, из них 148 на русском языке). Во 2-ой главе представлены характеристики изученных видов и гибридов хлопчатника и описаны использованные в работе методы исследования. Глава 3 посвящена сравнительному исследованию белков семян О.МгзиЪиш Ь., О.ЪагЪасЗепэе Ь. и их межвидовых гибридов, а также некоторых диплоидных видов хлопчатника геномной группы А и Д. В главе 4 представлены результаты исследования по выделению и изучению физико-химических и функциональных свойств белков хлопчатника. В этой главе представлены также данные по изучению накопления маркерных белков Н-0,13, В-0,18 и 7з глобулина семян хлопчатника при эмбриогенезе и их распада при прорастании семян хлопчатника. Глава 5 посвяшена исследовании ядерных белков хлопчатника.

Работа изложена на 318 страницах машинописного текста, иллюстрирована 62 рисунками и 45 таблицами.

Сравнительное изучение белков семян хлопчатника и выявление белковых маркеров.

Из обезжиренной муки семян хлопчатника путем последовательной экстракции различными растворителями можно выделить три группы белков: I)-водорастворимые, 2)-солерастворимне и 3)-щелочерас-творимые. При электрофоретпческом разделении наиболее многокомпонентными являются водорастворимые белки. Солерастворимые и ще-лочерастворимые белки на электрофореграммах в кеденатуриругацпх условиях ввиду ограниченной растворимости в растворах с низкой ионной силой, дают диффузные зоны с малоразличимнш полосами.

При изучении электрофоретического спектра водорастворимых белков семян различных сортов хлопчатника вида О.МгвоЬит ь, няблрдэлась довольно общая картина распределения белковых компо-нгнтот». Мржсортовне различия обнаруживались только в содержании

Рис. I. Схемы электрофореграмм водорастворимых белков семян хлопчатника: а)-Ташкент I, б)-81?3-И, в)-Ташкент I + 8173-И, г)-гибрид Ташкент I х 8173-И, д)-АН-402.

а б в г д

минорных-электрофоретических компонентов (рис. I). Лишь у сорта АН-402 компонент с относительной электрофоретической подвижностью 0,59, являющийся в других сортах шторным, представлен как одага из основных.

Белки семян различных сортов хлопчатника о.ЪагЪааепэе ь, также близки: по основным электрофоретическим компонентам каких-либо визуально заметных межсортовых различий не наблюдается. Электрофореграмш белков двух видов хлопчатника различаются по подвижности первых от старта компонентов: относительные электро-форетические подвижности этих компонентов составляли 0,13 для первого и 0,18 для второго. Всего изучено более 100 сортов хлопчатника о.мгзи^т ь. и более 60 сортов вида о.ьагьабепзе ь. Во всех случаях получены электрофоретические картины, идентичные электрофореграммам белков семян хлопчаишка Ташкент I и 8173-И. Эти данные позднее подтверндены С.А.Рахманкуловым с соавт.(1980), Р.Абидовшл (1982). Согласно электрофоретической подвижности мы обозначали эти компоненты символами Н-0,13 и В-0,18, где Н- и В-начальные буквы от Ыгэи^т и ЪагЬайепзе, соответственно.

Электрофоретические спектры белков отдельных семян сортов хлопчатника Ташкент I (100 шт.), 108-Ф (100 шт.), 1306-ДВ (50 шт.) - О.МгаоЬит Ь. п С-6030 (50 шт.), 5904-И (50 шт.), 8173-И (50 шт.) - о.ЪагЬайепзв ь. были идентичными, что свидетельствует об отсутствии внутривидового полиморфизма по данному признаку.

Электрофореграммы белков семян гибридов Ташкент I х 8173-И, Ташкент I х 9696-И, 8173-И х Ташкент I идентичны электрофореграммам характерным смеси белков семян сортов Ташкент I и 8173-И (рис. I). Изучение реципрокных гибридов показало, что наследова-

0,130,18-

0,59-

.Табл. I

Расщепление гибридов хлопчатника по наличию в семенах белков Н-0,13 и В-0,18

:Количество семян, со- :

: держащих белки_: 2

Гибридная комбинация :Н-0,13:В-0,18:Н-0,13 Л

: :В-0,18 :

Семена

С-6040 х Л-501 12 6 19 2,531 0,20-0,30

Л-100 х Д-80 7 9 20 0,666 0,70-0,80

Л-ЮО х Т-7 6 7 8 1,285 0,50-0,70

Л-101 х Т-7 17 16 36 0,160 0,90-0,95

Л-101 X Д-80 15 7 14 5,333 0,05-0,10

Семена

(С-6040хЛ-501) х Л-501 33 - 29 0,258 0,50-0,70

(Л-100хД-80) х Л-ЮО 24 - 40 4,ОСО 0,02-0,05

(Л-Ю0хД-80) X Л-101 29 - 31 0,066 0,70-0,80

(Л-100хД-80) х Д-80 - 35 29 0,562 0,30-0,50

(Л-501хТ-7) х Л-101 30 - 34 0,250 0,500,70

ние компонентов Н-0,13 и В-0,18 не зависит от направления скрещивания и имеет кодоминантный характер.

Результаты, приведенные в табл. I, свидетельствуют о монофак-ториальном характере наследования белковых компонентов Н-0,13 и. В-0,18.

Для изучения наследования белков Н-0,13 и В-0,18 брали также диплоидные гибриды, полученные от скрещивания видов, содержащих компоненты Н-0,13 и В-0,18. Такими видами оказались С^гИоЪит и о^ЬигЪег! из геномной группы Д: семена первого вида содержат в качестве основного компонента белок с подвижностью 0,13, а семена второго - белок с подвижностью 0,18, хотя общий спектр белков семян этих видов резко отличается от спектра белков семян аллотетраплоидов.

Всего изучено 87 семян гибрида О.Ъг11оЪшшсО.Ш1гЪег1 в Соотношение полученных спектров, содержащих белки Н-0,13, одновременно Н-0,13 и В-0,18 и В-ОДВ было следующее: 23:43:21, при этом значение сС^ было 0,103, соответствующее Р=0,95.

Итак, нами было установлено, что электрофоретические компо-

центы Н-0,13 л В-0,18 семян хлопчатника могут рассматриваться как менделирующий признак и наследование пх в изученных гибридных комбинациях носит монофакториальный характер.

Для изучения наследования других компонентов электрофорети-ческого спектра и установление генетической взаимосвязи между различными белками необходимо создайте коллекции хлопчатника по белковому спектру и другим морфо-биологическим и хозяйственно-ценным признакам.

Линия Л-1, содержащая белок Н-0,13 с нуль аллелышм вариантом бежа Н-0,70 была отобрана из потомства гибрида Ташкент I х G. thurberl х G.raimondii и самоопыляли в течение 3 лет. Эта лигам была использована для изучения наследования белка Н-0,70 во взаимосвязи с маркерными белками Н-0,13 и В-0,18. Другими донорами для этой цели служили сорт Ташкент I и лигам хлопчатника Л-2, отобранная из популяции гибрида Ташкент I х 8173-И в F3 и самоопыленной в течение последующих 4 лет. Семена Л-2 характеризуются наличием белка В-0,18, наличием подпушка на микропиле и халазальной части, а также подпушка на боковой поверхности в виде узкой полосы.

Семена гибрида Fj Ташкент I х Л-1 были близки по электрофоре-тпческой картине белков к родительской форме Ташкент I (рис. 2А), а в ?2 п0 присутствию (р~ present) и отсутствию (a- absent) белка Н-0,70 получено два класса расщепления в следующем отношении: рр чра аа фактическое • 108 30 = 0,775

ожидаемое 103,5 34,5 0,3<Р<0,5.

Полученные результаты свидетельствуют о ионофакториальном характере наследования белка Н-0,70.

Семена Pj реципрокных гибридов от скрещивания линий Л-1 и Л-2, содержат все компоненты родителей, в Fg идет расцепление по наличию белков Н-0,13, В-0,18 и В-0,70 (рис. 2Б). Семена этих гибридов по электрофоретической картине белков-разделились, в основном, на три группы: I)-содержащие Н-0,13, у которых отсутствует белок В-0,70, 2)-содержащие одновременно белки Н-0,13 и В-0,18, а также В-0,70 и 3)-содеряащие В-О,18 и В-О,70. Спектрофотсметрическое определение электрофоретических компонентов белков показало, что количество белка В-0,70 у промежуточной формы семян в два раза меньше по'сравнению с его содержанием у семян с маркером В-0,18. Представлешшс в табл. 2 данные с большой вероятностью гов^ят

□

"0,13 -0,18-

-0,70-

А Б

Рис. 2. Схемы электрофореграмм водорастворимой фракции белков семян хлопчатника: А - Л-1 (а), гибрида Ташкент I х Л-1 (б) и Ташкент I (в); Б - гибрида Ташкент I х Л-1 (а, б, в) и Л-1 х Л-2 в Р2 б> г* Д>

о том, что свободное комбинирование локусов Б-0,13 и Н-0,70 недостоверное. Аналогичный вывод можно сделать на основании данных по изучению электрофорётического состава белков семян от бек-1фоссированных коробочек:

В-0,70 ра аа

Н-0,13

Вс (Л-1 х Л-2) х Л-1

РР ра

45

34 I

РЬОДЗ + В-0,18

38 X2 = 0,590 0,3<Р<0,5

Вс (Л-1 х Л-2) х Л-2

I х2 = о.ззз

39 0,5<Р<0,7 Следовательно, белки Н-0,13 и Н-0,70 с одной стороны и В-0,18 и В-0,70 с другой, наследуются совместно и их гены тесно сцеплены. Процент кроссинговера, рассчитанная по расщеплению гибридов, составляет 2,1%.

Изучение взаимосвязи наследования белков Н-0,13 и В-0,18 с некоторыми морфобиологическими признаками хлопчатника.

1!сслелова!шй отдельных семян гибридных комбинаций Ташкент I х «г73-И и Тчткзнт Т. х 9696-И в показало, что в белковом составе

а

Табл. 2

Расщепление реципрокных гибридов (Л-1хЛ-2 и Л-2хЛ-1) по маркерным белкам Н-0,13, В-0,18 и В-0,70.

Локус : Н-0,13 :Н-0,13-Д-0.18 : В-0.18 : Всего

дп 7П :Факти-:0жида:Факти-:0ш1да- :Факти-:0жида-:Факти-:0;шда-' :ческое:емое :ческое:емое :ческое:емое :ческое:емое

Л-1 х Л-2

рр 0 23,125 3 46,25 79 23,125 82 92,5

ра 2 46,25 185 92,5 5 46,25 192 185

аа 87 23,125 2 46,25 0 23,125 89 92,5

Всего 89 92,5 190 185 84 92,5 370

= 1,048, 0,50< Р< 0,75 - Для локусов Н-0,13 и В-0,18,

4 = 1,589, 0,25^Р<0,50 - для локусов Ь-0,70 и В-0,70,

об2 = 611,68, Р<0,01 - для локусов Н-0,13 и Ь-0,70.

Л-2 х Л-1

РР 0 20,31 2 40,63 78 20,31 80 81,25

ра 2 40,63 169 81,25 3 40,63 174 162,5

аа 71 20,31 0 40,63 0 20,31 71 81,25

Всего о 73 81,25 171 162,5 81 81,25 325

X2 = 1,284, 0,50< Р<0,70 - для локусов Н-0,13 и В-0,18, X2 = 2,126, 0,30<Р<0,50 - для локусов Ь-0,70 и В-0,70, X2 = 574,71, Р<0,01 - для локусов Н-0,13 иЬ-0,70.

семян, имеющих неполное опушение, обнаруживается компонент В-0,18, семена же с полным опушением, идентичные по внешности родительской форме Ташкент I, в преобладающем большинстве случаев содержали компонент Н-0,13. Далее были изучены белки семян индотборов гибридных растений Ташкент I х 8763-И в Р2 (табл. 3). Полученные результаты указывают на то, что белки Н-0,13 и В-0,18 взаимосвязаны с признаком наличия подпушка на поверхности семян хлопчатника.

Наличие подпушка у семян хлопчатника О.Мгзи-Ьип ь. зависит от четырех неаллельных независимо комбшшругацихся генов (Мусаев, 1972, 1979, Мусаев, Абзалов,1972): I - ген ингибитор, подавляющий действие генов опушения семян, р^ и ~ основные гены, контролирующие развитие опушения в области г/лкропиле семян, Рс - дополнительный ген, обуславливающий развитие подпушка на халазаль-ной и боковой поверхностях семян.

.Табл. 3

Расщеплете фенотипических групп межвидовых гибридов хлопчатника по наличию в семенах растении белков Н-0,13 и В-0,18.

Характер опушения семян количество растений содержащих белок

: Н-0,13 :Н-0,13*В-0,18: В-0,18

Ташкент I х 8763-И

I. Полуоголенше, идентичные

к 8763-И 0 0 48

2. Плещистые 2 5 I

3. Опушенные, идентичные .

к Ташкент I 43 20 2

4. Опушенные, разные 33 100 38

Коэффициент взаимной сопряженности К = 0,508.

Л-2 х голосемянная форма

I. Подпушек на микропиле 16 5 0

2. Плещистые I 22 I

3. Полуоголенные, идентичные

к Л-2 0 0 15

4. Опушенные 0 8 5

Коэффициент взаимной сопряженности К = 0,722.

Распределение белковых маркеров в семенах гибридов, родительские пары которых различались по альтернативному состоянию генов и было близко к соотношению 1:2:1. Следовательно, полученные результаты свидетельствуют в пользу сцепленности гена белкового компонента Н-0,13 с геном Рс. Очевидно, что ген белка В-0,18 может быть сцеплен с аналогичным геном у С.ЪагЬаЗепзе ь. (обозначим его символом

В следующей серии экспериментов для получения гибридной комбинации использовалась такая форма в.Ыгви^т ь., у которой ген ?с находится в рецессивном состоянии. Из данных табл. 3 видно, что I группа растений гибрида Л-2 х голосемянная форма содержит белок Н-0,13. В этой группе не обнаружены растения, имеющие белок В-0,18.

Растения 3-ей группы, идентичные по опушению материнской форме Л-2, содержали компонент В-0,18. На основании полученных данных можно сделать закличете о том, что ген или гены белка В-0,18 сцеплен(ы) с геном В свою очередь ген или гены белка Н-0,13

сцеплен(ы) с геном ?с.

Ген контролирует развитие антоцкановой окраски куста хлопчатника и локализован в III группе сцепления признаков ( Ко11е1, 1972, РЫПрз, 1974, Захаров, 1979). Для исследования взаимосвязи наследования белков Н-0,13 и В 0,18 с геном Д1 анализу подвергали семена индотборов гибрида С--6030 х краснолистная акала в Результаты исследования показали, что соотношение изучаемых белковых компонентов в группах растений, различающихся по наличию антоциановой окраски равно 1:2:1.

Изучение биохимической природы гена а, показало, что наличке антоциановой окраски стеблей большинства сортов хлопчатника зависит от рН клеточного сока: фенотипические классы гибридных популяций хлопчатника, имеющие антоциановуга окраску, обладают более низким значением рН клеточного сока. Сняжешге рН клеточного сока у проростков, рецессивных по гену 1Ц приводит к развитию у этих фенотипов антоциановой окраски. В проростках, доминантных по гену 1Ц уровень диафоразной активности в 1,5 раза больше чем в проростках, рецессивных по отсму гену. Сорта хлопчатника, рецессивные по гену Я,, содержат актшщановый пигмент в лейкофор-ме п рН клеточного сока проростков генотипов Н^Я,, й1г1 и г1г1 определяет их фенотип.

Взаимосвязь в наследовании белков Н-0,13 и 5-0,18 с вилтоус-тойчивостыо изучали на материалах здоровых и пораженных верти-циллезным вилтом гибридных растений хлопчатника Ташкент I х 8763-И и Ташкент I х 9696-И в В растениях этих гибридов соотношение белков Н-0,13:Н-0,13нВ-0,18:В-0,18 равно 1:2:1. Это относится к популяциям как здоровых, так и пораженных вшггем растений.

Таким образом, полученные данные говорят в пользу сцепленнос-ти трех генов, а именно гена белка Н-0,13, гена белка Н-0,70 и гена Рс у хлопчатника е.МгзиЪат ь. и гена белка В-0,18, гена белка В-0,70 и гена у хлопчатника о.ЪагЬааспэв Ь.

г

' Буферорастворимке маркерше белки семян хлопчатника.

При изучении фракционного состава белков различных экстрактов ми заметили, что содержание отдельных компонентов электрофоре ти-ческого спектра в области с пОднгансстыо 0,42-0,60 увеличивается во втором и третьем экстрактах и становится возможном я-швить межвидовые и межсортовые различия по составу этих белков. В сгл-

спаси си вэ 1£з везсезюа

ЕЕасЕЗЕзеэ с^а «га

ей о ЕЖ тщсэкаю!

сасззсзсз «ка в»

I 2 34 567 8 9 10 II 12 Рис. 3. Схемы электрофореграмм буферорастворимых белков семян хлопчатника: 1-108-Ф, 2-0ктябрь-60, З-кра^колист-ная акала, 4-ЛН-402, 5-С-4727, 6-Ташкент 6, 7-Радиому-тант, 8-С-6037, 9-8763-И, 10-Карши-4, И-10&-Ф х Радиомутант, 12- Радиомутант х 108-Ф.

зи с этим для сравнительного изучения белков различных сортов использовали остаток муки после третьей водной экстракции для экстракции различными буферами. Наилучшие результаты получены при экстракции 0,20-0,35 М трис-НС1 буфером рН 8,0-8,6.

На рис. 3 представлены схемы электрофореграмм белков буферного экстракта из семян различных сортов хлопчатника. По спектру этих белков различные сорта хлопчатника в.ЪагЪааовде ь. не от-л!гчались друг от друга (рис. 3-8, 9, 10). Белки семян хлопчатника 108-Ф, краснолистной а калы, 0ктябрь-60 вида с.Ыгаи-Ьиа ь. близки по спектру к белкам семян хлопчатника о.ЪагЪааепзе ь. и содержат компоненты 0,44 и 0,55. Семена хлопчатника С-4727, Ташкент 6, АН-402, Радиомутант содержат кошоненты 0,50 и 0,60. Для доказательства генетической детерминации буферорастворимых белков изучали семена Р| различных комбинаций гибридов. При этом было обнаружено, что белки семян гибридов от прямого и обратного скрещивания содержат полный набор компонентов родительских форм.

При исследовании буферорастворимых белков 30 сортов вида о. ЪагЬайепзе Ь, и 75 сортов вида С.МгвцЪии ь. выявили, что: I)-различные сорта й.ЪагЪа<Зегше 1. не отличаются друг от друга по белковому составу; 2)- у G.hirвutгш ь. наблюдается более шпро-кий спектр изменчивости в составе буферорастворимых белков.

Большинство районированных в Советском Союзе сортов хлопчатника вида о.Мгзи1дш ь. по спектру белков буферного экстракта делится на две группы: I) - содержащая белки с подвижностью 0,44 и 0,55, которые характерны и для сортов О.ЪагЪабепзе ь. и 2) - содержащая белки 0,50 и 0,60.

0,44 0,50

0,55' 0,60

Исследование свободных аминокислот и белков семян хлопчатника Ташкент I и его родительских форм.

Сорт Ташкент I выведен путем гибридизации хлопчатника С-4727 с диким видом аар.шех1оапит уаг.пегуозит (Мирахмедов,1974). Для обнаружения маркерных различий были изучены свободные аминокислоты и водорастворимые белки семян методом изоэлектрического фокусирования в ПААГ в интервали рН 3-10.

Содержание свободных аминокислот в семенах хлопчатника Ташкент I и в семенах родительских форм различно (табл. 4). Наиболее значительные различия обнаружены в содержании гнети дина, аргинина, аспарагиновой кислоты и серина. По уровню свободных аминокислот сорт Ташкент I занимает как бы промежуточное положение между родительскими формами: количество гистидина, аспарагиновой кислоты, серина и тирозина примерно такое же, как у сорта С-4727,

Табл. 4

Соотношение свободных аминокислот в семенах хлопчатника Ташкент I и в семенах его родительских форм, тл.%.

Аминокислота ; : Ташкент I : 0-4727 : взр,шех1сапиш уаг.пегтовит

Лизин 7,15*0,20 6,15*0,20 7,15*0,23

Гистпдин 2,90*0,30 3,58*0,15 7,48*0,20

Аргинин 8,75*0,32 17,65*0,65 9,65*0,35

Аспарагиновая кислота 30,00*1,26 22,36*0,90 13,32*0,52

Треонин 1,78-20,15 1,98*0,12 2,66*0,18

Серии '9,83*0,49 11,00*0,56 16,70*0,70

Глутаминовая кислота 22,55*0,65 18,80*0,70 21,00*0,75

Пролин 1,93*0,11 2,25*0,13 2,04*0,19

Глицин 3,71*0,11 3,90*0,16 3,11*0,18

Алании 5,31*0,14 4,37*0,12 4,57*0,10

1/2 Цистин 1,24*0,15 1,23*0,10 0,44*0,13

Валлн 2,75*0,10 2,65*0,10 2,07*0,19

1,1етио1шн 0,71*0,10 Следы 0,18*0,05

Изолейцин 0,48*0,05 0,41*0,05 0,40*0,06

Лейцин 1,29*0,12 0,88*0,06 0,82*0,10

Тирозин 0,91*0,13 0,74*0,11 1,46*0,18

Фешыалашга 1,98*0,15 0,12*0,10 2,61*0,20

Рис. 4. Схема распределения белков при изоэлектрическом фокусировании в ПМГ:

а - 0-4727,

б - Ташкент I,

В - ssp.mexicanum var.nervosum.

а б В

а остальных аминокислот - как у ssp.mexicanum var,nervosum. Следует отметить, что у сорта Ташкент I количество аспарагино-вой кислоты достигает 30% от суммы всех аминокислот. Аналогичные результаты получены Р.К.Шадмановым и Х.А.Алимухамедовым (1983) при изучении содержания свободных аминокислот в семенах хлопчатника Ташкент I и С-4727.

При электрофокусировании водорастворимых белков семян хлоп- , чатника обнаружили, что сорт Ташкент I содержит 18, С-4727 - 19 и ssp.mexicanum var.nervosum - 20 компонентов (рис. 4). Аминокислотный состав этих белков у различных сортов хлопчатника различен. Содержание глутаминовой кислоты и аргинина у вида вер. mexlcanum var.nervosum выше, а пролина, аланина и некоторых аминокислот ниже, чем у сортов Ташкент I и С-4727. Различие в аминокислотном составе водорастворимых белков семян вышеуказанных сортов, по-видимому, обусловлено характерным для каждого сорта белковым спектром.

Диафоразная активность белков семян хлопчатника-.

Проведенные исследования показали, что уровень диафоразной активности у семян хлопчатника G.hireutum L. в 2 раза выше, чем у семян вида G.barbadcnse L. Уровень диафоразной активности у

белков семян гибрида Ташкент I х 8763-И в поколении Р2 различен. Взаимосвязи между наследованием бежевых маркеров Н-0,13 и В-0,18 л уровнем диафоразной активности не отмечено.

При электрофоретическом изучении локализации диафоразной активности удалось обнаружить дг э зоны, соответствующие этой активности, как для семян сорта 108-Ф, так и для семян сорта 5904-И (представители двух видов). Первая зона с подвижностью 0,45 била более активна по проявлению, а вторая с подвижностью 0,70 - менее активна. Эти зоны являются основными по содержанию при проявлении белковыми красителями. У G.barbadense l. белковая полосе с подвижностью 0,45 состоит из двух близкорасположенных компонентов.

Исследование белков семян хлопчатника геномной группы А и Д в связи с происхождением аллотетраплоидов.

Виды хлопчатника G.hirsutum L. иG.barbedense L. являются амфидиплоидами и, согласно имеющимся предположениям и экспериментальным данным, сочетают в себя диплоидные наборы хромосом хлопчатника геномной группы Л и Д (Hutchinsoa et al., 194-5, Sarvella, 1953, Cherry et а1.1970\При этом считается, что хлопчатник G. raioondil является одним из общих доноров амфидиплоидных видов. Белки Н-0,13 и В-0,18, а также полипептиды легкорастворимых белков являются удобными маркерами для изучения происхождения указанных амфядиплоидов.

В белках семян хлопчатника геномной группы А отсутствуют компоненты Н-0,13 я В-0,18 (рис. 5А). Представители геномной группы Д по наличию этих компонентов делятся на классы, содержащие маркеры: a)-H-0,I3 (G.trilobum, G.raiccndii), 6)-B-0,I8(G.thurberl) и в)- Н-0,13 и В-0,18 одновременно (остальные изученные виды). Следовательно, белки Н-0,13 и В-0,18 в аллотетраплоидах являются, по-видимому, продуктами генома Д. Расщепление гибридов хлопчатника G.hirsutum L.x ЯоЪггЬаЗепзе Ь. по наличию белков Н-0,13 и В-0,18, происходящее по принципу конофакториального наследования у доплоидоз, согласуется с отсутствием отfix маркеров в геноме А.

По данным электрофореза роль донора для видов G.hirsutum L. и G„fcarba<5enss L. мояет играть один из представителей хлопчатника геномной группы Д, не содержащий одновременно обоих маркеров. Тахтма видами являются G.trilobua^ S.thurberl я s.rainendli» По числу и расположению компонентов совокупность фракций белков семян хлопчатника одного из представителей геномной группы А я

ке

01 -— еэ сэ Еза са еа ЕЭ

0,18— са св си вея ея

0,25'— вя> шгвэигава еасэсасас=з

123456789 10

кДа

22,020,515,5-

СаЭ Е2Э бзэ са

ез бз

езэ кэ йтв ея сэ саз

ЕЯ

1 2 3 4 56 7 89 10

Рис. 5. Схемы электрофореграмм легкорастворимой фракции белков семян различных видов хлопчатника при рН 8,9 (А) и в присутствии ДСН (Б): 1 - С.агЬогеиа Ь., 2 - С.Ьег-Ъасеша Ь., 3 - в^гИоЬит, 4 - 0.^игЬег1, 5 - в.га!-топаи, б - О.ЬагкпеэвИ, 7 - 0.к1о1Жг8сЫапшп, 8 - в." дау1ааоп11, 9 - 0.Ы.гви1д1т Ь., 10 - О.ЬагЬабепзе Ь.

в.ъгиоъит или о.га1поп(311 соответствует белковому спектру о.Ыгви^ш х,. Точно также при сочетали одного из представителей хлопчатника геномной группы А с с.1Ли:гЪег1 получили спектр, соответствующий спектру белков семян в.ЬагЬааепэе Ь.

При изучении методом ДСН-ПААГ электрофореза белки семян были разделены на легкорастворимые и труднорастворимые. Состав легкорастворимых белков всех изученных видов хлопчатника разделяемых ДСН-ПААГ электрофорезом, одинаков. Во всех образцах обнаруживаются более 20 компонентов, их молекулярные кассы от 13 000 до 90 000. Некоторые из компонентов являются основными по количественному содержанию и именно по этим компонентам наблюдаются межвидовые различия (рис. 5Б).

По составу полипептидов семена хлопчатника представителей геномной группы А не различаются и содержат компоненты с молекул-

ярлыки массам! 15 500. Представители геномной группы Д по спектру псшшептидов делятся на три группы. Так, спектр белков семян G.raimondli близок к спектру белков семян геномной группы А. Спектр белков у хлопчатника видов G.trilobum и G.thurberi не различался: преобладали полипептиды с молекулярной массой 20 ООО и 22 500. Аналогичный спектр получен и для белков семян G.harknessii. У хлопчатника вида G.davidsonii И G.klothzschi-anum электрофореграмш белков были идентичными, в качестве основного компонента отмечался один полипептид с молекулярной массой 21 500.

Основные полипептиды белков семян G.hirsutum X,. и G.barba-denae l. имели молекулярные массы 15 500 и 21 ООО. Такое сочетание полипептидов не встречалось ни у одного из представителя диплоидных видов хлопчатника, изученных в данной работе.

По составу полипептидов труднорастворимых белков семена изученных видов хлопчатника мало отличаются друг от друга. В белках трех видов, а именно представителей геномной группы А и G.raimondli из геномной группы Д полипептид с молекулярной массой

20 ООО отсутствует. Следовательно, вид G.raimondli по спектру как легкорастворимых, так и труднорастворимых белков, по данным ДСН-ПААГ электрофореза близок к представителям геномной группы А. В связи с этим представляло интерес выявить злектрофоретичес-кий состав белков семян гибридов и искусственных амфидашгоидов, полученных от скрещиваний, где одним из родителей являются виды G.trilobum, G.thurberi, G.ralnondii, а также представители хлопчатника геномной группы А.

Мы изучали электрофоретический состав белков семян гибрида хлопчатника G.thurberi х G.raimondii В Fg Двух типов плоиднос-ти: 2пз2б ц 2п=52. Тетраплоидаое потомство растений получено от обработанных в растворе колхицина семян Pj данного гибрида.

Семена диплоидного гибрида Fg ио содержанию полипептидов с молекулярными массами 22 ООО, 21 ООО и 15 500 расщепляются па группы с различным набором псшшептвдов, а в случае тетраплонд-ного гибрида образование полкпептпда с молекулярной массой 22 ООО ингибируется. В подавляющем большинстве семян этого гибрида имеются одновременно полипептпда с молекулярной массой

21 ООО и 15 500, которые на расщепляются, что характерно и для хлопчатника G.hiroutum L. И G.barbadense L.

При изучении диафоразной активности оказалось, что белки сем-

ЯН G.arboreum L. И G.herbaoeua L. ПОЧТИ не отличались ПО уровню диафоразной активности. Уровень диафоразной активности у видов хлопчатника геномной группи Д различен: самое высокое значение активности получено душ белков семян G.klothzschianum, самое низкое - для G.thurberi.

Совокупность полученных результатов указывает на участие двух различных видов представителей геномной группы Д в качестве возможных доноров ДЛЯ G.hirsutum L. И G.barbadense Ь. Донором ИЗ геномной группы Д для G.hirsutum l. мог быть G.trilobum, а для G.barbadense L. - G.thurberi. В пользу такого предположения говорит, по-видимому, и тот факт, что при получении амфидиплоида G.hirsutum L. х G.thurberi проявились такие признаки, как зеле-нсватый подпушек и очень тонкое, крепкое, сильноизвитое волокно длиной 22-25 мм, встречающееся у G.barbadense L. (Семинихина и др., 1979).

Далее в диссертации описаны результаты исследования белков искусственно полученных амфидишгаидов хлопчатника и белков семян некоторых внутри- и межгеномных гибридов, а также семян некоторых хемемутантов хлопчатника.

В ходе этих исследований было установлено появление в белках езмян G.hirsutum L. и некоторых гибридов, подвергнутых действию колхицина, с целью удвоения набора хромосом, компонента с подвижностью 0,59. Аналогичный спектр получен для белков семян хе-момутантов. В составе белков семян хлопчатника сортов 108-Ф, С-4727 И вида esp, mexicanum var.nervosum компонент с подвижностью 0,59 отсутствует или присутствует только в виде минорной фракции. Напротив, в семснах всех изученных хемомутантов этот компонент представлен в качестве основной фракции. Появление данной белковой фракции свидетельствует о том, что ген этого белка в геноме большинства сортов, по-видимому, находится в репрессированном или малоактивном, состоянии, а при действии экстремальных условий или при отдаленной гибридизации с последующим колхицинироваиием происходит его индукция.

Выделение и изучение физико-химических свойств белков хлопчатника.

Белок H-0.I3 был выделен путем хроматографичес!.ого разделешш на ДЭАЭ-целлюлозе водного экстракта семян хлопчатника 108-Ф и Ташкент I. При элюции адсорбированных на колонке белков исходным

* íperraВ

Рис, 6. Разделение водорастворимых белков семян хлопчатника сорта 108-Ф на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой.

буферным раствором получается до 5 пиков, которые при электрофорезе в ПААГ дают по одной полосе, одинаковой по подвижности (рис. 6). Отношение £;?6c/%80 в этих пиках было'самое высокое в первом пике, в других фракциях оно убывало и было наименьшим в 5 фракции. Во всех фракциях были обнаружены углеводы. Количество их в 1-ом пике составило 30$, в последующих пиках содержание углеводов снижалось и в 5-ом пике составило 1%.

Фракция первого пика, являющаяся основной по количественному выходу, была гомогенной при электрофорезе в ПААГ, а при ДСН-ПААГ электрофорезе в присутствии 2—Г.5Э разделялась на 2 полипептидныэ цепя с молекулярными массами 20 ООО и 15 500 (psc. 7).

При хроматографии белков семян хлопчат;шка 5904-И и 8763-И на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой в аналогичных дсловиях получить в гомогенном состоянии бэлок В-0,18 удается ке всегда: при электрофорезе в ПААГ чаще всего обнаруипзпотся 2 полосы с подвиж-ностякл 0,18 и 0,25.

Белок П-0,13 характеризуется высокие содержанием гдутамкновсй кислоты и аргинина. В его составе обнаруживается 2 компонента, идентифицированные как каннозамкн и глюкозадан в отношеши 3:1.

—' —

аш

г ш

кДа

—20,0 —15,5

Рис. 7. Схемы электрофореграмм белка Н-0,13 в ПЛАТ: а - при рН 8,9, б - в присутствии ДСН.

Сравнительный аминокислотный анализ препаратов белков, выделенных методом электрофореза в ПААГ показал, что белки Н-0,13 и В-0,18 отличаются друг от друга по содержанию гистидина и глута-миновой кислоты (табл. 5). Белок В-0,18 характеризуется относительно высоким содержанием глутаминовой кислоты и низким гистидина по сравнению с белком Н-0,13.

Белки Н-0,13 и В-0,18 можно выделять также путем гель-фильтрации на сефадексах Г-100 ели Г-150. При этом суммарный экстракт разделяется на два пика: 1-ый состоит из белка Н-0,13, а элюаты второго пика содержат как маркерный белок, так и все остальные компоненты водорастворимой фракции белков семян хлопчатника.

Табл. 5

Аминокислотный состав белков Н-0,13 и В-0,18, ьюл.%.

Аминокислота :Н-0,13:В-0,18:Аминокислота:Н-0,13:В-0,18

Лизин 5,64 5,37 Алании 6,64 7,02

Гистлдин 4,68 3,50 1/2 Дистин + +

Аргинин 9,09 9,25 Валин 5,03 5,47

Аспарагиновая кислота 10,27 10,46 Метионин + +

Треонин 6,03 5,54 Изолейцин 4,88 4,39

Серии 7,36 7,29 Лейцин 9,29 9,73

Глутаминовая кислота 14,85 16,41 Тирозин 2,63 2,24

Пролии 4,86 5,20 Фенилаланин 3,83 3,34

Глицин 4,91 4,81

Молекулярные массы белков Н-0,13 из первого и второго пиков составляет 140 ООО и 35 ООО, соответственно. Белки Н-0,13 из первого и второго пиков, обработанные 2-МЭ, при ДСН-ПААГ электрофорезе образуют две полосы с молекулярными массами 20 500 и 15 500. Следовательно, белок Н-0,13, локализованный в первом пике, состоит не менее чем из четырех субъединиц, т.е. является тетрамером, а белок Н-0,13 второго пика - мономер. Мономерная форма состоит из двух неидентичных по молекулярной массе полипептидов.

Аналогичные результаты получены нами при изучении водных экстрактов семян хлопчатника сортов 5904-И и 8763-И. Белок В-0,18 также существует в двух формах - тетра- и мономерной.

В качестве N-концевых аминокислот белков Н-0,13 и В-0,18 методом дансилирования идентифицировали одну аминокислоту-аргинин.

При введении флуоресцииругащей метки оба белка мигрировали с относительной электрофоретической подвижностью равной I. Следует отметить, что белок Н-0,13 связывает флуоресцеинизотиоцианат в большей степени, чем белок В-0,18, что обусловлено, по-видимому, структурными особенностями этих белков.

Злектрофоретический анализ белкового состава созревающих семян хлопчатника Ташкент I и 8763-И установил, что синтез белков Н-0,13 и В-0,18 происходит на поздних стадиях эмбриогенеза. Белок Н-0,13 появляется в тепличных условиях у эмбрионов 62 дневного возраста, а в полевых - у эмбрионов 42-дневного возраста; белок В-0,18 на 65 и 48 дней созревания в тепличных и полевых условиях, соответственно.

Накопление этих белков в семенах относительно скороспелых сортов АН—чилякп и Карши-2 происходит по другому: белок Н-0,13 появляется в семенах АН-чиляки начиная с 40 дня, а В-0,18 в семенах сорта Карши-2 с 30 дневного возраста. В семенах реципрок-ных гибридов этих сортов оба маркерных белка появляются у 30 дневных эмбрионов. Эти данные свидетельствуют о тем, что экспрессия генов белков 11-0,13 и В-0,18 могут контролироваться одними и теми яе индукторами.

Исследование электрофоретических спектров созревающих семян хлопчатника радиомутанта, Л-302 и АРМ 02 показало, что белок с подвижностью 0,59 появляется на самых последних этапах созревания семян. Например, раскрытие коробочек исследованных линий хлопчатника происходило за 52-55 дней, а появление белка 0,59

наблюдалось при этом на 50-52 день после цветения.

На начальных этапах прорастания семян количество белков Н-0,13 и В-0,18 на электрофореграммах резко снижается. Полное исчезновение этих белков происходит у 3-4 дневных проростков.

Диафораза хлопчатника. Диафоразная активность суммарного водного экстракта семян хлопчатника в присутствии ДХФИФ проявляется в широком диапазоне рН. Максимумы активностей при различных рН как в случае 1Ш)Н так и 1'АПРН в общих чертах сходны. Термическая обработка экстракта не влияет на активность фермента.

Диафоразная активность белков семян О.ЫгзиЪиш ь. выше, чем у в.ЪагЪааепзе ь. Наибольшая интенсивность её выявляется на электрофореграммах в зоне с подвижностью 0,45. У белков в.Ъаг-Ьадепзе в этой зоне две полосы.

Исследования проводили с диафоразой, выделенной из семян а. Ыгеи1;ит ь. Зоны электрофореграмм, соответствующие подвижности 0,45, вырезали и из собранных гелей белок элюировали дистиллированной водой. Судя по активности полученная фракция белка очищена в 5 раз (табл. 6). Такая низкая активность очищенной фракции может быть обусловлена высокой лабильностью этого фермента.

Табл. 6

Очистка диафоразы из семян хлопчатника

Этап очистки :Выход в ^¡Удельная активность, %

I. Водный экстракт обезжиренной

муки семян 100 100

II.Экстракт диафоразы после

электрофореза - 2,5 500

В спектре УФ-абсорбции выделенного белка отмечается один максимум поглощения при 275 ммк. Белок с подвижностью 0,45 при гель-фильтрации на сефадексе Г-150 выходит в одной фракции (рис. 8) и имеет молекулярную массу 59 ООО. Молекулярная масса этого компонента, определенная ДСН-ПААГ электрофорезом, составляет 13 600. Выделенный белок имеет два оптимума рН, равных 7,20 и 8,70. Данный фермент является относительно термоустойчирчм (рис- 9): заметного снижения диафоразной активности не наблюдается вгоют до 80°С. При 90°С фермент теряет почти 50¡? своей активности. В случае же суммарного экстракта семян даже длительное кипячение не приводит к снижению ферментативной активности, что указывает на

280 1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

36 128 Ойъси, м

н. 103

250

200

Рис. 8. Гель-фильтрация диафоразы хлопчатника на сефадексе Г-150 (Размер колонки 1,5 х 85 см). (---оптическая плотность; -- активность).

дЕЛтш.Ю3 100

80

60

40

20

4<г-

Рис. 9. Влияние температуры на ШШРН-ДХ5ЙФ ■ оксидоредуктазной активности диафоразы хлопчатника.

60 во юо

Теютерзтура, С0

возможное присутствие в семенах стабилизирующего фактора, предохраняющего данный фермент от денатурации при действии неблагоприятных факторов среды. Фактор низкомолекулярной природа из

хлопчатника, стабилизирующий некоторые ферменты, был обнаружен и другими авторами (Purvis et al., 1980).

Результаты исследования диафоразной активности в nad(p)h-ДХФИФ системе представлены в виде графика Лайнуивера-Берка (рис. 10). кш в этой системе равняется для наш - 3,13.10"%, для hadph - 7,19.10-41; VDax для hadh = 0,78, для hadph = 0,73. Близкие значения к^ получены в менадион-цитохром С системе. Лучшими акцепторами были р-бензохинон, витамин К3 и ДХФИФ. к для р-бензохинона равняется 7,69.Ю~6М, для витамина Kg - I,I6.I0~5M. Максимальная скорость больше для р-бензохинона, чем для витамина

р-Бензохинон и витамин К3 - хорошие медиаторы переноса водорода от диафоразы хлопчатника к цитохрому С. В отсутствии медиаторов цитохром С не акцептировал водород. 2-Гидрокси-1,4-нафгохи-нон также не обладал акцепторной активностью.

X /

4 /

2

'"«»пи

-12,5 -?,5 -2,5 О 2,5 7,5

^KlDtPJB-IO5»

Рис. 10. График Лайнуивера-Берка для диафоразы хлопчатника в системе nad(p)h- ДХФИФ.

Выделение 78 глобулина. Глобулины из солевой вытяжки осаждали путем разведения экстракта дистиллированной водой. При гель-фильтрации этого глобулина на калогасе с ссфарозой 6В разделение белка на составляющие компоненты не происходило. Однако, изучением электрофоретического состава отдельных элюат ;в установили, что фракция белка, элюирующаяся в начале и фракция белка, элюи-рущаяся в конце пика различаются между собою по субъединичному составу. Первая фракция состоит не менее чем из 6 полипептидных

цепей с молекулярными массами 26 000-15 500, разделяющихся в присутствии 2-МЭ, а вторая фракция - из двух полкпептидов с молекулярными массами 52 ООО и 48 ООО, одинаково разделяющихся гак в присутствии, так и в отсутствии 2-МЭ.

При разделении суммарного глобулина на ДЭАЭ-сефадексе А-50 получены два пика. Выход белка 1-ой фракции составил 40-50$, во 2-$й - 7-10% от общего"количества, внесенного в колонку.

N-Концевая аминокислота первой фракции глобулина - гистидин. При ультрацентрифугировании выделенный препарат белка оказался относительно гомогенным. Константа седиментации равняется 7s. Константа диффузии его равна 5,5.10~7см2/сек; молекулярная масса, рассчитанная на основании этих данных, составляет 140 ООО дэль-тсн. Содержание общего азота в нем составляет 17,5$.

ДСБ-ПААГ электрофорез показал, что 7S глобулин состоит из 2-х полипептидов с молекулярными массами 52 600 и 47 600. Следовательно, этот глобулин соответствует второй фракции белка, элюи-руемой в конце пика из колошей с сефарозой 6В.

Аминокислотный состав 7S глобулина характеризуется высоким содержанием дикарбоновых аминокислот и аргинина. Для С-концевого участка 7s глобулина методом глрбоксипептидазного отщепления нашли следующую последовательность: -лей-вал-ала-треонлн.

Выделение "аргининового" глобулина проводили при помощи хроматографии солевого экстракта семян хлопчатшпеа на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой в присутствии 8 И мочевины. Эта фракция белка roMoreima по данным электрофореза и названа нами условно "аргини-новым" глобулином, вследствие содержания на и-конце аминокислоты аргинина. В аришиновом глобулине при ДСН-ПААГ электрофорезе в присутствии 2-МЭ обнаруживались три полипептида с молекулярными массами 23 ООО, 20 ООО и 15 500; при электрофорезе без 2-ГО -две основные (23 ООО и 15 500) и несколько минорных полос. Таким образом, полипептид с молекулярной массой 20 ООО, по-видимому, способен к агрегации.

Аргининовый глобулин характеризуется ббльшим содержанием дикарбоновых аминокислот и аргинина. При прорастании семян количество аргининового глобулина уменьшается; з 3-х дневных проростках оно составляет 18% со.черастворимых белков> в 10-дневкых всего лишь 2,6$, тогда как в покоящихся семенах оно достигает

Для общего наименова:шя запасных глобулинов семян хлопчатника

мы предлагали название "госсипулины" (1975). Это предложение, по-видимому, было принято и другими исследователями (Ли, 1985).

Глобулины при созревании и при прорастании семян хлопчатника.

Созревание семян хлопчатника в условиях теплицы происходило примерно за 70 дней после цветения. При этом до 35-дневного возраста в семенах полосы белков на электрофореграммах не обнаруживаются. В семенах 40 дневного возраста присутствуют уже 5 компонентов, а в 45-50 дневных - появляются ряд полипептидов, характерных для зрелых семян (рис. II).

кДа

68,460,552,0 Я 48,0'

26,0" 23,0"

15,510,0—

сет ssza кия ваш №ывз вгаа ва

- ffirai.TH fEEBSi

-вядя bbss

Рис. II. Схемы алектрофоре-грамм белков созревающих семян хлопчатника: 1-40 дн., 2 - 45 дн.,

3-50 дн. после цветения, 4 - 7 Б глобулин.

I

4

Полипептиды с молекулярной массой 68 400 и 60 500 в зрелых семенах отсутствуют. .Как было показано, эти компоненты являются предшественниками полипептидов с молекулярными массами 52 ООО и 48 ООО (Dure et al.,1980,1981). Аналогичные данные были получены Р.М.УсманоЕым (1981). В отличие от этих работ в наших экспериментах синхронность б появлении компонентов с молекулярными массами 68 400 и 60 500 не наблюдается: сначала появляется полипептид с молекулярной массой 60 500, в дальнейшем - 68 400.

Интересно отметить, что з белковых телах семян хлопчатника обнаруживается четыре полипептида, близкие по молекулярным даосам полииептидам 7s глобулина и белка H-0SI3: 52 700, 45 600. 19 700 и 14 ООО (King, Larnkin, 1977, King, Leflor^ 979)* Почти аналогичная картина ДСН-ПААГ электрофореграм^ получена А.Л.Ли (1985) при изучении одного из глобулинов семян хлопчатника, названный им "конгоссипулином". Таким образом, не исключена возможность того, что белки Н-0,13 и 7s глобулин в семенах находятся в едином комплексе.

Полученные данные позволяют заключить, что в процессе созревания семян хлопчатника одним из первых синтезируемых белков является полипептиды 7б глобулина, и только потом других белков.

При прорастании семян хлопчатника распад полипентидов, составляющих 7э глобулин, происходит постепенно и неодновременно. Быстрее всего распадается полипептид с молекулярной массой 48 ООО, распад полипептида с молекулярной массой 52 600 происходит лишь к 10-дню прорастания. По мере прорастания семян на электрофореграммах отмечается увеличение полосы с молекулярной массой 30 ООО с одновременным уменьшением полосы, соответствующей полипептиду с молекулярной массой 48 ООО. В ходе дальнейшего прорастания появляется полоса, соответствующая полипептиду с молекулярной массой 33 ООО с одновременным уменьшением полосы с молекулярной массой 52 600.

Характер распада глобулинов се млн хлопчатника видов в.Мгзи-Шв Ь. и й.ЪагЪабепзе Ь. одинаковый, ХОТЯ у О.ЪагЬа<1еп8е Ь. распад их несколько 'замедлен.

Полученные данные позволяют предположить о том, что полипептиды 73 глобулина сначала распадаются до промежуточных полипептидов с молекулярными массами 33 ООО и 30 ООО, и только потом происходит их дальнейший распад. В случае других исследованных белков семян хлопчатника такой ступенчатый протеоллз не обнаружен.

Ядерные белки хлопчатника.

Состав гистонов из ядер корешков 2-дневных проростков хлопчатника сортов 108-Ф, Ташкент I и С-4727 сходен (рис. 12А). На электрофореграммах гистонов хлопчатника обнаруживались пять основных фракций, содержание которых в гистонах из корешков и листьев различалось. В фазах массового цветения и плодоношения также наблюдалось варьирование в содержании гистоновых фракций из листьев хлопчатника. По-видимому, это связано с тем, что в различные периоды вегетации хлопчатника количество гистонов, лабильно связанных с ДНК, неодинаково. Таким образом, состав основных фракций гистонов в онтогенезе хлопчатника не изменяется.

В отличие от гистонов негистоновые белки ядер хлопчатника обнаруживают сортовую и тканевую специфичность. Негистоновые белки корешков 2-дневных проростков хлопчатника сорта 108-Ф разделяется на 20 электрофоретических компонентов, из них 6 - основные по содержанию (рис. 12Б). В составе негистоновых белков хлопчатника

_ —

кДа — — —

49,30 гаа ваз С2

32,00 30,00 23 25 22,00 ж ■ВШ гаэ ВЗ*

15,30 11,20

А Б

Рис. 12. Схемы электрофореграмм гистонов (А) и негистоновых белков (Б) хлопчатника: I - 108-Ф, 2 - С-4727, 3 - Ташкент I.

сортов С-4727 и Ташкент I компонент с молекулярной массой 20 ООО, входящий в состав негистоновых белков сорта 108-Ф отсутствует, в то же время содержится компонент, являющийся одним из основных по содержании, с молекулярной массой II 200, отсутствующий у сорта 108-Ф.

Все компоненты негистоновых белков ядер хлопчатника характеризуются высоким содержанием дикарбоновых аминокислот, глицина, аланина и лейцина. Электрофоретический компонент с молекулярной массой II 200 характеризуется самым низким содерганием глутамино-вой кислоты и самым высоким - валина.

В негистоновых белках из листьев и стеблей 14-ти дневных проростков отмечается повышенное по сравнению с белками 2-дневных корешков содержание компонентов с молекулярными массами от 30000 до 100 ООО, а при выделении их из стеблей обнаруживаются также компоненты с молекулярными массами 150 000-170 ООО.

Белки, прочно связанные с ДНК также относятся к негистоновым белкам хроматина и локализованы в метаболически активных сайтах

ДНК ( Ноппап, ВекЬог, 1931, Кио,1982).В аминокислотном составе белков, связанных с ДНК хлопчатника, после 8-, 3- и 5-кратной фенольной дэпротеинйзации преобладали кислые аминокислоты (сумма глутаминовой и аспарагиновой кислот составляла 50% всех аминокислот), причем основная доля :риходилась на аспарагиновую кислоту. В составе белков связанных с нативными фракциями ДНК резко уменьшается количество аспарагиновой кислоты, снижается содержание серкна. В белках же, связанных с денатурированными фракциями ДШ количество серина увеличивается и происходит значительные количественные изменения в содержании ряда аминокислот. Аналогичная картина наблюдается при исследовании белков, связанных с ДНК гриба УегЬ1с1111цш ааЬИе К1. Правда, в данном случае преобладает глутаминовая кислота.

При изучении температуры плавления реконструированного нуклео-гистона было получено 5 пиков (рис. 13). Первый пик, плавящийся при 52°С, соответствует свободному участку ДНК, не связанному с белками, а остальные 4 (57,5°С, 66,5°С, 78°С и 81°С) - участка!.! ДНК, образующим комплекс с различными группами белков.

Тмдараггрв, с°

Рис. 13. Производная кривой плавления ДНК (I), реконструированного куклеогисто-на (3) и комплекса ДНК-не-гистоновые белки (2).

При изучении те?дтературы плавления дезоксинуклеопротеида, полученный из ДНК и негистоновых белков ядер хлопчатника, было получено 2 пика при 52,5°С и 56,5°С. Сопоставляя пики плазленпя.

полученные для ДНК, комплекса ДНК-негистоновые белки можно прийти к заключению, что в случае нуклеогистона при 57,5°С плавится участок ДНК, занятый белками негистонового характера, а при 66,5°С, 78°С и 81°С - с различными фракциями гистопов. Близкие данные были получены при изучении хроматина и ДНП проростков кукурузы (сиволап, Дьяченко, 1975).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время достигнуты значительные успехи в изучении белков семян злаковых и бобовых культур. К сожалению, этого нельзя сказать в отношении хлопчатника, являющегося экономически важной технической культурой.

В работе проведено сравнительное исследование белкового состава различных сортов и мутантов двух видов хлопчатника 0.1Иг-8и"Ьша ь., о.ЪагЪааегше I. и их предполагаемых доноров, а также различных межвидовых гибридов. В результате исследований выявлены впдоспецифкчные маркерные белки Н-0,13 и В-0,18, которые оказались консервативными в эволюционном отношении.

Полученные данные свидетельствуют о существенном различии структурной организации геномов б.Мгви-Ьип Ь. И С.ЬагЪа<Зспае ь. Белки семян С.Мгси-Ьит ь. обнаруживают внутривидовой полшорфизм и наблюдается внутривидовая изменчивость белкового состава под влиянием различных мутагенных факторов. Обнаружено два белка, гены которых являются, по-видимому, наиболее мутабилышми: ген белка Н-0,59 может активироваться под влиянием мутагенных факторов (ионизирующее излучение, химические мутагены, пестициды) и ген белка Н-0,70, который может репрессироваться с определенной частотой в потомствах межвидовых гибридов и в потомстве растений, подвергнутых действию колхицина. Утрата белкового компонента Н-0,70 происходит и в обычных сортах с частотой менее 0,1$ (в самоопылении в течение нескольких лет растений хлопчатника Ташкент I). Такие изменения с подобными белками у вида с.ЬагЬаеЗепзс Ь. не обнаружены.

Известно, что все важнейшие свойства организма обуславливается белками и через белки реализуется генетическая функция нуклеиновых кислот. Еероятно, геном вида в.Мгеи^т Ь. является более пластичным и приспособляемым к различным стресс факторам, чем геном вида о.ЬагЬайрпзр т<.

Получены данные о том, что в тетраплоидном хлопчатнике боль-

иинстео генов белков могут находится в репрессированном или малоактивном состоянии. Например, при удвоении набора хромосом диплоидных гибридов с.Ш1гЬеП х а.га1шопаи ген, контролирующий биосинтез полипептида с молекулярной массой 22 ООО, избирательно репрессируется. Следовательно, диплоидные и тетраплоидные организмы для своего существования требуют функционирования различного ансамбля белковых веществ.

Из различных групп белков хлопчатника наиболее изменчивыми оказались водорастворимые белки семян и негистоновые белки ядер хлопчатника. Солерастворимая фракция белков по полипептидному составу оказалась одинаковой как у диплоидов, так и у тетраплои-дов, за небольшими исключениями: у представителей геномной группы А и а.га1поп<ш отсутствует полипептид с молекулярной массой 20 ООО.

Анализ белкового состава диплоидных и тетраплоидных видов хлопчатника указывает на необходимость пересмотра существующей концепции о происхождении амфидиплоидов: вид о.га1топ(1:1.1, считающийся донором видов с.Мгзи-ьит ь. и с.ЪагЪааепзе ь., -не может выступать в качестве такового в сочетании с представителями геномной группы А. Полипептидный состав с.гад.топ<заЛ одинаков с полипептидным составом представителей геномной группы А. По белковому составу диплоидных, тетраплоидных видов и гибридов можно сделать заключение об участии 0.-(;г:11оЪит в образовании о.ш.г-за-Ьиш Ь. а в.-ЬЬигЪег! - В образовании Й.ЬагЬабепзе ь. Такое заключение находится в хорошем согласии с новейшими результатами систематиков хлопчатника ИНЭЕР АН УзССР.

В работе установлена 'взаимосвязь маркерных белков с некоторыми морфобиологическикп признаками хлопчатника. Эти исследования открывают возможность для выявления маркерных показателей, коррелирующих с такими хозяйственно-ценными признаками, как вилтоустой-чивость, урожайность, скороспелость и т.д.

Установлены физико-химические свойства ряда компонентов водорастворимой и солерастворимой фракции белков. Полученные данные внесли ясность в существующие разногласия между ИХРВ АН УзССР и ИНЭЕР АН УзССР по составу глобулинов семян хлопчатника. Маркерный белок Н-0,13 оказался близким к 73 глобулину семян хлопчатника, изученному в ИХРВ АН УзССР (Кученкова, 1981). Таким образом, глобулины семян хлопчатника представлены двумя 7б компонентами: один из них состоит из двух полипептидных цепей о молекулярными масса-

ми 20 ООО и 15 500, а другой - из полипептидов с молекулярными массами 52 600 и 47 600.

Результаты, полученные при изучении белков в динамике развития хлопчатника, являются основой для развития теоретических представлений в физиологии и биохимии роста и развития и могут быть использованы в дальнейшем в генно-инженерных работах, поскольку для выделения генов этих белков необходимо установление срока их экспрессии.

Полученные в диссертации данные являются новыми в биохимии хлопчатника и служат основой для развития нового направления -биохимической генетики хлопчатника.

ВЫВОДЫ

I. Изучен электрофоретический состав и некоторые ферментативные активности белков семян различных сортов хлопчатника G.hirsutum L.и G.barbadense L. и их межвидовых гибридов, а также некоторых межвидовых и межгеномных гибридов. При этом установлено следующее: а)-водорастворимые белки семян хлопчатника G.hirsutum L. и G.barbadense L. различаются по электрофоретической подвижности одного из основных компонентов, который обозначен символом Н-0,13 для первого и В-0,18 для второго; б)-наследование белков Н-0,13 и В-0,18 в потомствах межвидовых гибридов имеет монофакто-риальный характер, происходит как у диплоидов и взаимосвязано с генами белков Н-0,70 и В-0,70, а также с генами Fc и F^, контролирующими развитие подпушка на халазальной и боковой поверхности семян; в)-под влиянием мутагенных факторов индуцируется синтез белка с подвижностью 0,59; г)-по составу буферорастворимых белков семян различные сорта хлопчатника G.hirsutum L. делятся на две группы, одна из которых содержит компоненты 0,44, 0,55, другая -компоненты 0,50, 0,60, а у вида G.barbadense L. содержатся только компоненты 0,44 и 0,55; д)-более высокий уровень диафоразной активности белков семян хлопчатника G.hirsutum L. по сравнению с белками семян G.barbadense L. (0,19-0,27 мкмоль/мг/мин. и 0,130,15 мкмоль/мг/мин., соответственно); е)-наследование белка Н-0,70 является кодоминантним и контролируется одним локусом; х)-белки Н-0,13 и В-0,18 в аллотетраплоидах хлопчатника являются продуктами Д генома. На основании полученных данных сделано заключение о том, что вид G.raimondii считающийся одним из доноров

амфидиплоидных видов хлопчатника, не может выступать в качестве такового в сочетании с представителями геномной группы Л; донором для С.Мгзц-Ьит Ь. может являться С.-ЬгИоЪит, а для О.ЪагЬааепэе Ь. - G.thuгbeгi.

2. Изучены белки Н-0,13 и Е 0,18 при созревании и при прорастании семян хлопчатника. Установлено, что накопление белков Н-0,13 и В-0,18 происходит на более поздних стадиях созревания, причем для большинства сортов характерно более раннее накопление белка Н-0,13 по сравнению с белком В-0,18. Распад белков Н-0,13 и В-0,18 происходит на ранних этапах прорастания семян.

Показано, что эти белки существуют в мономерной (35 ООО) и тетрамерной (140 ООО) формах, состоящих из двух иеидентичных по молекулярной массе полипептидов (20 ООО и 15 500). И-Концевыми аминокислотами белков Н-0,13 и В-0,18 является аргинин. В качестве углеводного остатка белки содержат глюкозамии и маннозамин в соотношении 1:3.

3. Из водорастворимой фракции семян хлопчатника выделен белок с диафоразной активностью и флавопротеид. Диафораза хлопчатника окисляет ШН и ИАВШ в присутствии следующих акцепторов электронов: даШ, менадион и нафтохлноны. Менадион и нафтохиноны являются также хорошим медиаторами переноса электронов от диафора-зы хлопчатника к цитохрому С. Фермент имеет два оптимума рН 7,2 и 8,7 и относительно устойчив к термической обработке (80°С).

Флавопротеиды из семян и из стеблей 14-ти дневных проростков хлопчатника содержат в больших количествах аспарагиновую и глута-миновую кислоты.

4. Из солерастворимой фракции семян хлопчатника выделе!ш в гомогенном состоянии 7з глобулин и фракция, содержащая в качестве

н-концевого остатка аргинин. 7Б глобулин, являющийся одним из основных компонентов запасных белков семян хлопчатника имеет молекулярную массу равную 140 ООО дальтоиам, й-концевую аминокислоту -гистидин, С-концевую аминокислотную последовательность: -лей-вал-ала-треонин. Белок состоит из Двух полипеЬтидных цепей с молекулярными массами 52 600 и 47 600. Эти полипептиды синтезируются при созревании семян хлопчатника в виде предпествснннков с молекулярными массами 68 400 и 60 500, соответственно. При прорастании семян хлопчатштка 7э глобулин подвергается ступенчатому гидролизу, продуктами которого являются полипептшш с молекулярными массами 33 300 и 30 ООО.

Фракция белка, содержащая в качестве и-концевого остатка аргинин, состоит из трех типов полипептидных цепей с молекулярными массами 23 ООО, 20 ООО и 15 500.

5. Изучены гистокы и негистоновые белки ядер, выделенные из корешков 2-дневных проростков, а также из листьев и стеблей разновозрастных растений хлопчатника. Состав гистонов в онтогенезе растений хлопчатника не меняется и характеризуется присутствием

5 основных компонентов. Негистоновые белки ядер хлопчатника обнаруживают сортовую и тканевую специфичность. 7 основных по количественному содержанию компонентов этих белков из ядер корешков 2-дневных проростков охарактеризованы по молекулярной массе и аминокислотному составу. Характерной особенностью аминокислотного состава этих компонентов является высокое содержание в них аспарагиновой, глутаминовой кислот, серина, глицина, аланина, вали-на и лейцина.

Установлена гетерогенность прочно связанных с ДНК негистоновых белков хлопчатника. Эта группа белков в больших количествах содержит дикарбоновые аминокислоты (5055 от всей суммы аминокислот), с преобладанием аспарагиновой кислоты (34$). Фракции белков, прочно связанные с нативными и денатурированными фракциями ДНК, резко различаются по содержанию аспарагиновой, глутаминовой кислот и серина. В случае белков, прочно связшпшх с ДНК из мицели-ев гриба УеП;1с1111ит ааЫЛае К1. - преобладает глуташновая кислота {21%).

6. Большая изменчивость белкового состава О.Мгзи^т ь. по сравнению с б.ЪагЬасЗепзе ь. позволяет сделать заключение о том, что геном хлопчатника О.Ь1гви1д1и ь. является более пластичным и более приспособляемым к условиям внешней среды, чем геном вида в.ЪагЪабепве Ь.

Рекомендации

I. Рекомендуется способ определения константности хлопчатника, полученных на основе межвидовой гибридизации, а также чистоты промышленных селекционных материалов по маркерным белкам Н-0,13, Н-0,5Э, Н-0,70, В-0,18 и по составу буферорастворимых белков (0,44, 0,55 и 0,50, 0,60), а также по уровню диафоразной активности белков. Указанные показатели являются удобными тест->.'яркерг»ги тгрогнояирования качества хлопчатника в лабораторных

2. Рекомендуется использовать белковые маркеры в селекционно-генетических исследованиях, а также при изучении происхождения полиплоидных форм хлопчатника.

3. Результаты, полученные при выделении и исследовании физико-химических свойств отдельных компонентов белков семян хлопчатника рекомендуется использовать для выделения и изучения генов этих белков.

Список сокращений ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота. ДСН - додецилсульфат натрия. ДХФИФ - 2,6-дихлорфенол-индофенол. ДЭАЭ - диэтиламиноэтил. 2-МЭ - 2-меркаптоэтанол.

nadh - восстановленный никотинамидадениндинуклеотид. nadeh - восстановленный никотинамидадениндинуклеотид фосфат. ПААГ - полиакриламидный гель.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Ибрагимов А.П., Юнусханов Ш., Туйчиев A.B. Выделегае 7S глобулина из семян хлопчатника и изучение его аминокислотного

состава//Биохимия.-1969.-т.34. 6.-С. II07-III2.

2. Ибрагимов А.П., Юнусханов Ш., Турсунбаев П. Выделение аргини-нового глобулина из семян хлопчатника и изучение его аминокислотного состава//Докл. АН УзССР.-1970.-К З.-С. 48-49.

3. Ибрагимов А.П., Юнусханов Ш. Получение обогащенных некоторыми аминокислотами пептидных фрагментов из триптического гид-ролизата ДНФ-73 глобулина семян хлопчатника/Димия природашх соединений.-1970.-й З.-С. 348-350.

4. Ибрагимов А.П., Юнусханов Ш. Исследование глобулинов семян хлопчатника 108-Ф и радномутантов//Хикия природных соединений. -1970.-Ji 6.-С. 728-732.

5. Ибрагимов А.П., Юнусханов Ш. Глобулины семян хлопчатника при отдаленном последействии гамма-облучения//Физиология и биохимия культ, растений.-1972.-т. 4.-й I.-C. 96-98.

6. Юнусханов Ш., Ибрагимов А.П., Ибрагимходжаева М.П. Распад ар-гининового глобулина при прорастании семян хлоичатника//Уз-

бекский биол. ж.-1973.-Jé З.-С. 3-5.

7. Ибрагимов А.П., Юнусханов Ш., Ибрагимходааева М.П., Абдурах-манова Б., Саидова Г.Б. Исследование гистонов хлопчатника. //Докл. АН УзССР.-1975.-№ 2.-С. 53-55.

8. Ибрагимов А.П., Юнусханов Ш.; Турсунбаев П., Туйчиев А.В., Абдурахыанова Б. О неидентичности субъединиц 7S глобулина сешн хлопчатника (госсипулина)//Биохимия.-1975.-т. 40.-Jé 3,-С. 605-609.

9. Юнусханов Ш., Турсунов У., Усманов Т., Ибрагимов А.П. Об аминокислотном составе и гетерогенности белков нрочно связанных С ДНК хлопчатника И гриба Verticillium dahliae К1. //Узбекский биол. К.-1975.-К 4.-С. 6-8.

Ю.Юнусханов Ш., Ибрагимходааева М.П., Ибрагимов А.П. О белковом составе семян хлопчатника Ташкент I и его родительских форм //Физиол. и биохимия культ. раст.-1975.-т. 7.-Я 4.-С. 387-392.

11.Ибрагимов А.И., Туйчиев А.В., Турсунбаев П., Юнусханов Ш. Субъединицы 7S глобулина из сешн хлопчатника//Растительные белки и их биосинтез. М.: Наука, 1975.-С. 156-162.

12. Ибрагшов А.П., Юнусханов Ш., Абдурахыанова Б., Саидова Г.Б. Выделение и изучение взаимодействия ядерных белков с ДНК хлоп-' чатншса//Тезисы У Всесоюзк. симп. "Структура и функции клеточного ядра". Новосибирск, 1975.-С. 102-103.

13.Ибрагимов А.П., Юнусханов Ш., Саидова Г.Б. О негистоновых белках ядер хлопчатника//Докл. АН УзССР.-1376.-й 2.-С. 63-65.

14.Юнусханов Ш., Саидова Г.Б. Сортовая и тканевая специфичность негистоновых белков ядер хлопчатника//Тезисы II конференции . биохимиков республик Средней Азии и Казахстана. Биохимия растений. Фрунзе: Игам, 1976.-С. 234-235.

15.Юнусханов Ш., Ибрагимов А.П. Взаимодействие ядерных белков с .ЩП<У/Узбекский биол. ж.-1977.-Jé I.-C. 3-6.

16.Ибрагимов А.П., Юнусханов Ш., Омельченко B.C., Мухитдинов Т., Садиков С.С. Исследование белковых маркеров хлопчатника g.hiг-sutum L. И G. barbad ens е L. //Докл. АН Уз ССР.-1977.-.te 9.-С.

61-63.

17.Юнусханов Ш., Ибрагимов А.П., Саидова Г.Б. Изучение аминокислотного состава отдельных компонентов негистоновых белков ядер хлопчатш1ка//Узбекский биол. ж.-1978.-Je I.-C. 57-58.

18.Юнусханов Ш., Ибрагимов А.П., Джалилов Б.Д. Выделение маркерного белка Н-0,13 из семян хпопчатника/Дзбекский биол. K.-I98I.-

I.-C. 73-74.

19. Юнусханов Ш. Исследование белков семян хлопчатника G.hirsu-tum L., G.barbadense L. и их возможных доноров//Тезисы III конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана. Душанбе, I98I.-T. I.-C. б17,

20. Юнусханов Ш. Наследование белковых маркеров и гена 5?с в поколениях межвидовых гибридов хлопчатника/Дезисы докл. 1У съезда ВОГиС. Кгашнев, 1982.-ч. З.-С. 281.

21. Юнусханов Ш., Халилова Г.В., Абдурахманова Б., Ибрагимходжаевя И.П. Ядер!ше б е.пси различных сортов хлопчатника//Физиол. л биохимия культ. раст.-1983.-т. 15.-.'5 З.-С. 277-279.

22. Юнусханов Ш., Ибрагимов А.П. Изучение диафоразной активности белков семян хлопчатника G.hirsutua L., G.barbadense L. И ИХ гибридов//Докл. АН УзССР.-1983.-№ 7.-С. 50-52.

23. Алимухамедов С.С., Юнусханов Ш. Изучение распада и синтеза маркерных белков Н-0,13 и В-0,18 хлопчатника//Тезисы научной конференции "Геном растений". Черновцы, 1983,-С. 3.

24. Юнусханов Ш. Исследование генеалогии амфщщплоидоз хлопчатншса G.hirsutum L. И G.barbadense L. при ПОМОЩИ маркерных белков //Тезисы научной конференции "Геном растений". Черновцы, I9B3.-С. 87-88.■

25. Юнусханов Ш., Ибрагимов А.П., Ризаева С.М., Абдуллаев A.A. Исследование белков семян хлопчатника G.trilobum, G.thurberi и их гибридов//Докл. АН Уз ССР.-1983.-Je 9.-С. 47-49.

25. Джалилов В.Д., Юнусханов Ш., Ибрагимов А.П. Выявление двух форм маркерного белка Н-0,13 семян хлопчатника, разделяемых гель-фшьтрацией на сефадексе Г~150//Докл. АН УзССР.-1983.-№ Ю.-С. 47-48.

27. Юнусханов Ш., Эргашев А.К. Ген и некоторые свойства клеточного сока проростков хлопчатншса//Цитология и генетика.-1983.-т. 17.-й 5.-С. 13-18.

28. Юнусханов Ш., Ибрагимов А.П. Выявление белковых маркеров семян хлопчатншса видов G.hireutum L., G.barbadense L. п изучение взаимосвязи их наследования с некоторым прпзпаками//Генетика.-1984.-т. 2Q.-H 6.-С. 989-997.

29. Юнусханов Ш. Сравнительное изучение белков семян хлопчатника геномных групп А и Д в связи с происхождением аллотетраплоидов G.hirsutum L. и G.barbadense L. //Генетика.-1984.-т. 20.-JS 6.-С. 998-1006.

30. Юнусханов Ш., Ибрагимов А,П. Метод белковых маркеров в генетике и селекции//Хлопководство.-1984.-й 6.-С. 38-39.

31. Юнусханов Ш., Юлдашев А.Х., Ибрагимов А.П., Отаханов И., Эгамбердиев А., Пайзиев П., Султанов А., Даминов М. Белки семян и мутагены//Хлопководство.-1986.-№ I.-C. 37.

32. Юнусханов Ш. 0 наследовании маркерных белков хлопчатника//Те-зисы У съезда УзОГиС. Ташкент: Фан, 1986.- С. 46-47.

33. Юнусханов Ш. Изучение накопления глобулинов при созревании семян хлопчатника и их распада при прорасташш//Тезисы 1У конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана. Ашхабад, 1986.- С. 324-325.

34. Юнусханов Ш., Джалилов Б.Д. Изучение водорастворимых белков семян хлопчатника G.hirsutum L. и G.barbadense L. //Химия природных соедин. -1985. - й 4.- С. 488-491.

35. Юнусханов Ш., Ризаева С.М., Бабаев С.К., Ибрагимов А.П., Лбдуллаев A.A. Изучение белков семян хлопчатника G.thurberi

х G.raimondii при полиплоидизации//Тезисы У1 Бсесоюзн. сиш. "Молекулярные механизмы генетических процессов". М., 1987,-С. 150.

36. Юнусханов Ш., Ризаева С.М., Бабаев С.К., Абдуллаев A.A. Изучение электрофоретического состава белков семян гибрида 0. thurberi х G.raimondii в связи с нолиплоидизацкей//Докл. АН УзССР,- 1987.- 16 3.- С. 50-51.

37. Юнусханов Ш. Выделение белка с диафоразной активностью из семян хлопчатника и изучение некоторых его свойств//Химия природных соединений.-1987.-й 3.- С. 416-421.

38. Юнусханов Ш. .К вопросу о происхождении амфидиплоидов хлопчатника G.hirsutum L. И G.barbaderwe L. //Тезисы У съезда ВОГиС. т.4. 4.4. Генетика и селекция растений. М., 1987.-С. 323.

Монографии

1. Молекулярные механизмы биосинтеза белков и нуклеиновых кислот хлопчатника/А.П.Ибрагимов, Ш.А.Арипджанов, Л.С.Плеханова,

Ш.Юнусханов,-Ташкент: Фан, 1975.- 165 с.

2. Юнусханов II!., Ибрагимов А.П. Белки хлопчатника. Ташкент: Фан, 1988,- 152 с.

Рекомендации

Т. Юнусханов ш. t Ибрагимов A.II., Алпмухамедов С.С. Рекомендации im ропод1:?о1*оппю методе белковых мпркероя для определения

константности гибридных форы хлопчатника. Ташкент: МСХ Уз CCI", 1983.- 6 с.

2. Шдашев А.Х., Юнусханов III., Ибрагимов А.II. Рекомендация по использованию метода белковых маркеров для оценки влияния пестицидов на семена хлопчатника. Ташкент: УзРПВХО им. Д.И. Менделеева, 1986.- 6 с.