Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Программируемая гибель клеток и окислительный стресс, вызванные ингибиторами митохондриальных функций
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология
Автореферат диссертации по теме "Программируемая гибель клеток и окислительный стресс, вызванные ингибиторами митохондриальных функций"
Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова
Биологический факультет
На правахрукописи
Изюмов Денис Сергеевич
ПРОГРАММИРУЕМАЯ ГИБЕЛЬ КЛЕТОК И ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС, ВЫЗВАННЫЕ ИНГИБИТОРАМИ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ФУНКЦИЙ
03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва —2005
Работа выполнена на кафедре физиологии микроорганизмов биологического факультета Московского Государственного Университета им. М В. Ломоносова и в отделе биоэнергетики научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского.
Научный руководитель: доктор биологических наук,
профессор В. Д. Самуилов
Научный консультант: кандидат биологических наук,
ведущий научпый сотрудник Б. В. Черняк
Официальные оппоненты: доктор биологических наук,
старший научный сотрудник И. Б. Алиева
доктор медицинских наук, профессор В. Г. Пинелис
Ведущая организация: Институт биохимии им А. Н. Баха
Защита состоится 21 апреля 2005 г. в 15 ч 30 мин на заседании диссертационного совета Д.501.001.52 при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, д 1, кор. 12, биологический факультет МГУ, ауд. М-1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.
Автореферат разослан 21 марта 2005 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук
¡и^
Е. Н. Калистратова
Актуальность проблемы
В последние годы мы стали свидетелями революционных событий в митохондриологии. Привычное представление о митохондриях, как об энергетических станциях клетки, производящих АТР, общие принципы действия которых известны (хемиосмотическая теория сопряжения), сменилось на представление о них, как об органеллах, содержащих факторы, определяющие судьбу клетки. Ранее роль митохондрий в развитии патологий ограничивалась нарушением энергообеспечения при повреждениях. Теперь на передний план вышли процессы митохондрий, такие как продукция активных форм кислорода (АФК) и развитие окислительного стресса, нарушение внутриклеточной передачи сигналов и выход из митохондрий белков, способных активировать программу гибели клеток (апоптоз) (Самуилов и др., 2000). Среди этих белков центральное место занимает цитохром с, который, оказавшись в цитоплазме, участвует в активации каспаз -специфических протеаз апоптоза. Механизмы выхода проапоптозных белков из митохондрий до конца не выяснены. АФК, производимые митохондриями, рассматриваются в качестве факторов, усиливающих внутриклеточный окислительный стресс. Практически ко всем компонентам окислительного фосфорилирования найдены селективные ингибиторы (в основном антибиотики) и расшифрованы механизмы их действия. Использование этих ингибиторов позволило прояснить механизмы многих биоэнергетических процессов. Выяснены многие детали генерации АФК в митохондриях, но общая картина процесса пока не ясна. Нехватка фактических данных пока еще не позволяет достаточно полно обосновать представления о роли митохондрий в окислительном стрессе. Вклад митохондриальных АФК в случае различных патологий представляется весьма возможным, но пока не доказан (Андреев и др., 2005). Митохондрии способны воспринимать сигналы, поступающие из внеклеточной среды (через специфические рецепторы, как в случае цитокинов, или без них, как при различных стрессах) и от других клеточных структур (ядра, цитоскелета, ретикулума и др.), перерабатывать их и выдавать сигнал, который может привести клетку к гибели. Для этих стадий не установлены принципиальные механизмы, не идентифицированы компоненты сигнальных путей, не прослежена их связь и соотношение этих процессов с основными биоэнергетическими функциями митохондрий.
Исследования в данной области, без сомнения, актуальны. Выяснение роли энергетических процессов митохондрий в развитии окислительного стресса и программируемой гибели клеток позволит более эффективно бороться с
заболеваниями, в основе которых лежат повышенная продукция АФК и нарушения апоптоза.
Цель и задачи исследования
Цель данной работы — исследование роли биоэнергетических функций митохондрий в апоптозе и окислительном стрессе клеток HeLa. Задачи исследования:
1. Исследование действия митохондриальных ингибиторов на апоптоз и продукцию АФК в клетках HeLa, индуцируемые фактором некроза опухолей-а (ФНО-а) и стауроспорином (СТ).
2. Исследование действия ингибиторов на продукцию АФК в митохондриях, индуцированную фотодинамической обработкой клеток HeLa.
3. Исследование механизмов окислительного стресса и гибели клеток HeLa, вызванных временным снижением уровня АТР.
Научная новизна работы
В работе проведено исследование влияния митохондриальных ингибиторов на гибель клеток HeLa и окислительный стресс в различных экспериментальных моделях. Установлено, что ингибиторы электронтранспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий и разобщители окислительного фосфорилирования не вызывали гибели клеток HeLa в течение 24-48 ч. Кроме этого они не влияли на продукцию АФК и апоптоз, вызванные обработкой клеток ФНО-а и СТ. Экспрессия белка Bcl-2 подавляла окислительный стресс и апоптоз, индуцированные действием ФНО- и СТ. Ингибитор АТР-синтазы олигомицин подавлял проявления апоптоза (продукцию АФК, фрагментацию ядра и выход цитохрома с из митохондрий), индуцированные ФНО-а, но не СТ. Предполагается, что защитное действие олигомицина опосредовано ингибированием неспецифической митохондриальной поры (МП) и не связано с ингибированием АТР-синтазы и влиянием олигомицина на мембранный потенциал митохондрий.
Разработана модель митохондриальной продукции АФК, индуцированной фотоактивацией специфического митохондриального красителя Mitotracker Red (хлорметил-Х-розамина, MR). В этой модели показано, что ингибиторы комплекса I (ротенон и пиерицидин А) и комплекса III (миксотиазол) дыхательной цепи митохондрий стимулировали продукцию АФК. Этот процесс подавлялся ингибитором флавинов дифенилениодонием (DPI) и антиоксидантами N-ацетилцистеином и митохондриальным mitoQ. Полученные данные позволяют предположить, что источником АФК в данном случае являлся флавиновый компонент комплекса I.
Показано, что временное снижение уровня АТР в клетках, вызванное одновременным ингибированием гликолиза 2-дезокси^-глюкозой (ДОГ) и ингибированием окислительного фосфорилирования вызывает апоптозную гибель клеток HeLa. В качестве митохондриальных ингибиторов использовали олигомицин, миксотиазол и разобщитель окислительного фосфорилирования карбонил-п-трифторметоксифенилгидразон (FCCP). Глубина снижения уровня АТР (примерно на 60% от исходного уровня) и гибель клеток не зависели от типа используемого митохондриального ингибитора Апоптоз сопровождался повышенной продукцией АФК, но не был чувствителен к действию антиоксидантов. Более глубокое или более длительное снижение уровня АТР в клетках вызывало преимущественно некротическую гибель клеток, которая в отличие от апоптоза не была чувствительна к экспрессии белка Bcl-2 и не подавлялась ингибитором каспаз zVADfmk. Предполагается, что существуют "АТР-метры", отслеживающие изменения уровня АТР в клетках и запускающие программы гибели. Практическая ценность работы
Исследование роли митохондрий в продукции АФК и развитии апоптоза в последнее время приобретает все большее значение. Этот интерес связан с участием этих процессов в развитии многих патологий человека. Понимание роли митохондрий в механизмах продукции АФК и гибели клеток поможет обрести новые средства борьбы с различными заболеваниями, такими как инсульт, инфаркт, нейродегенеративные заболевания. Апробация работы
Результаты работы были представлены на X Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2003" (Москва, 2003); на Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2003); на XI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2004" (Москва, 2004); на 29-м Конгрессе FEBS (Варшава, Польша, 2004), на 13-й европейской конференции биоэнергетиков "ЕВЕС" (Пиза, Италия, 2004). Работа также была апробирована на заседании кафедры физиологии микроорганизмов МГУ им. М. В. Ломоносова.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 14 работ. Структура и объем диссертации
Диссертация написана по стандартному плану и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов работы и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на
127 страницах, иллюстрирована 32 рисунками. Список литературы содержит 224 источника.
Объекты исследования
В работе использовали линии клеток карциномы человека HeLa и HeLa-Bd-2, любезно предоставленные сотрудником института полиомиелита РАМН Г. А. Беловым. Культуры клеток выращивали в среде DMEM (Dulbecco-modified Eagle medium, среда Игла, модифицированная Дальбекко), с высоким содержанием глюкозы (25 мМ), без пирувата, с добавлением антибиотика гентамицина сульфата (0,08 мг/мл) в присутствии 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, Gibco) в атмосфере 95% воздуха и 5% СО2 при 37° С.
Клетки линии HeLa-Bcl-2 содержали трансфецированный вектор pLPC-bcl-2, содержащий ген устойчивости к пуромицину под контролем LTR-вируса лейкоза мышей Молони. Это позволяло отбирать трансформированные клетки путем добавления в среду инкубации 1 мкг/мл пуромицина. Высокое содержание белка Bcl-2 в клетках HeLa-Bcl-2 в отличие от исходной линии было подтверждено с помощью Westem-блота с использованием специфических антител. Результаты и обсуждение
Дыхание клеток линий HeLa и HeLa-Bcl-2
Клетки карциномы HeLa, представляют собой быстрорастущую и недифференцированную опухолевую линию клеток, обладающую высоким уровнем гликолиза (характерным для большинства опухолевых линий) и окислительного фосфорилирования. Работа посвящена исследованию роли митохондрий в апоптозе и окислительном стрессе, поэтому в ее начале было проведено титрование различных ингибиторов митохондриальных функций и подборка их рабочих концентраций. Скорость потребления кислорода клетками HeLa и HeLa-Bcl-2 измеряли в среде DMEM, с пониженным содержанием глюкозы (5,5 мМ), что позволило избежать торможения дыхания и окислительного фосфорилирования в присутствии субстрата гликолиза (эффект Крэббтри). В этих условиях ингибиторы FoFrATP-синтазы олигомицин и ауровертин В существенно подавляли дыхание клеток, что говорит о его высокой сопряженности. Максимальная скорость дыхания достигалась в присутствии разобщителей окислительного фосфорилирования, причем при повышении их концентраций выше определенного уровня происходило подавления дыхания. Вероятно, при максимальной стимуляции дыхания еще сохранялся мембранный потенциал митохондрий, а при дальнейшем повышении концентрации разобщителя потенциал падал, прекращался синтез АТР, но одновременно, снижалась скорость дыхания. Этот эффект связан с торможением
переноса электронов по дыхательной цепи в нескольких ее участках и характерен практически для всех протонофорных разобщителей.
Ингибиторы различных участков дыхательной цепи ротенон, антимицин А, миксотиазол, цианид практически полностью блокировали дыхание клеток. В случае ротенона, ингибирующего комплекс I, эти данные означают, что остановка окисления NADH в цепи тормозит образование сукцината в цикле Кребса и его окисление не дает заметного вклада в дыхание. Гиперэкспрессия белка Bd-2 не препятствовала действию ингибиторов дыхания и разобщителей (рис. 1).
Рис. 1. Эффект митохондриальных ингибиторов на дыхание клеток HeLa (1,2) и HeLa-Bcl-2 (3). Среда с низким содержанием глюкозы. Добавки: олиго - олигомицин, 5 мкг/мл; ауро -ауровертин В, 10 мкМ;ДНФ- 2,4-динитрофенол, 100 мкМ; рот- ротенон, 2 мкМ
Влияние митохондриальных ингибиторов на гибель клеток
После подбора действующих концентраций ингибиторов митохондриальных функций было проверено их влияние на жизнеспособность клеток. Использованные нами ингибиторы не вызывали гибели клеток HeLa и Hela-Bcl-2 за 24-48 ч инкубации в среде DMEM, содержащей сыворотку и глюкозу в высокой концентрации (25 мМ). Они не влияли на уровень АТР в клетке, что подтверждает способность гликолиза полностью обеспечивать энергетические потребности клетки. Таким образом, ингибиторы окислительного фосфорилирования можно было использовать для изучения окислительного стресса и апоптоза в различных моделях.
В нормальных клетках наблюдается эффект Пастера - ингибирование гликолиза при активном дыхании. Однако в большинстве опухолевых клеток, к числу которых относятся и HeLa, высокий уровень гликолиза сохраняется в аэробных условиях (эффект Вартбурга). Добавление конкурентного ингибитора гликолиза 2-дезоксиглюкозы (ДОГ) не влияло на выживаемость клеток HeLa, но в комбинации с любым из использованных в работе митохондриальных ингибиторов вызывало некротическую (более 80% за 24 ч) гибель клеток. Таким образом, и окислительное
фосфорилирование, и гликолиз могут по отдельности поддерживать жизнедеятельность клеток HeLa.
Влияние биоэнергетических функций митохондрий на апоптоз клеток HeLa, индуцированный стауроспорином и фактором некроза опухолей-а
Для исследования роли биоэнергетических функций в апоптозе в работе были использованы две модели, в которых активация различных сигнальных систем приводила к гибели клеток. В первой модели клетки обрабатывали стауроспорином (СТ), ингибитором протеинкиназ, который широко используется для индукции апоптоза пот. н. "внутреннему", зависимому от митохондрий пути. Во второй модели использовали фактор некроза опухолей-а (ФНО-а), являющийся представителем семейства цитокинов. ФНО-а участвует в активации апоптоза, связываясь с рецепторами плазматической мембраны (ПМ). При этом ФНО-а через проапоптозный белок tBid может усиливать мигохондриальный путь апоптоза. Обработка клеток СТ и ФНО (в комбинации с ингибитором синтеза белка эметином) в обоих случаях приводила к гибели клеток, сопровождавшейся появлением вздутий ПМ, конденсацией и фрагментацией хроматина (рис. 2). Эти признаки являются характерными для апоптоза.
Рис. 2. Конденсация и фрагментация хроматина, индуцированные стауроспорином по прошествии 8 ч инкубации. Окраска Hoechst 33342, 1 мкг/мл.
Флуоресцентная микроскопия: а - контрольные клетки HeLa, б - клетки HeLa, обработанные СТ, в - клетки HeLa-Bcl-2, обработанные СТ. Масштаб - 30 мкм.
Апоптоз клеток сопровождался также выходом цитохрома с из митохондрий и олигонуклеосомной фрагментацией молекул ДНК Экпрессия белка Bcl-2 и добавление ингибитора каспаз zVADfmk практически полностью блокировали СТ- и ФНО-з-индуцированный апоптоз.
Использованные нами митохондриальные ингибиторы и разобщители не влияли на выход цитохрома с и апоптоз, индуцированные СТ и ФНО-а. Защитное действие белка Bcl-2 не зависело от митохондриальных ингибиторов, (рис. 3,4).
Рис. 3. Эффект митохондриальных ингибиторов на апоптоз, индуцированный стауроспорином (СТ). Инкубация 8 ч. Концентрации ингибиторов: СТ - 1 мкг/мл, ротенон -2 мкМ, антимицин А - 2 мкМ, миксотиазол - 2 мкМ, ДНФ - 100 мкМ, олигомицин - 5 мкг/мл, циклоспорин а (Цс А) - 5 мкМ, трифторпиразин (ТФП) - 20 мкМ. Гибель клеток определялась путем подсчета клеток с конденденсированным и фрагментированным ядром. Окраска Hoechst 33342. Приведены данные 5 независимых экспериментов.
Рис. 4. Действие
митохондриальных
ингибиторов на апоптоз клеток HeLa и HeLa-Bcl-2,
индуцированный ФНО-а. Концентрации ингибиторов, как на рис. 3. Фактор некроза опухолей-а (ФНО)- 5 нг/мл, эметин - 1 мкг/мл. Инкубация 8 ч. Окраска Hoechst 33342. Данные 5 независимых экспериментов.
Опыты показали, что выход цитохрома с и апоптоз могут быть не связанны с гиперполяризацией внутренней мембраны митохондрий, вызванной остановкой синтеза АТР, а также с какими-либо потенциал-зависимыми процессами, например, накоплением Са2+ в митохондриях.
В некоторых моделях было показано, что выход цитохрома с может осуществляться в результате открытия ги гантской митохондриальной поры (МП) и набухания матрикса. В наших условиях ингибитор МП циклоспорин А (Цс А) в
комбинации с ингибитором фосфолипазы А,, пролонгирующим его действие, не влияли на СТ-индуцированный выход цитохрома с и апоптоз клеток НеЬа (рис. 3), но подавляли апоптоз, индуцированный ФНО-а (рис. 6 далее).
При исследовании действия митохондриальных ингибиторов было обнаружено, что олигомицин, ингибирующий ^-комплекс АТР-синтазы, подавлял выход цитохрома с (рис. 5) и апоптоз (рис. 6), индуцированный Ф Н О -а в комбинации с эметином в отличие от СТ-индуцированного апоптоза.
Рис. 5. Выход цитохрома с из
Концентрации добавок, как на рис. 4. цит- цитозольная фракция, мит- митохонприальная фракция
1 - эметин, 2 - ФНО-а + эметин, 3 - ФНО-а +эметин + олигомицин
При этом защитное действие олигомицина не было связано с ингибированием синтеза АТР или с изменениями мембранного потенциала митохондрий, поскольку:
а) добавление ДНФ не препятствовало защитному эффекту олигомицина;
б) ауровертин, ингибирующий F,-комплекс АТР-синтазы не влиял на выход цитохрома с из митохондрий и апоптоз, индуцированный ФНО-а.
Следовало определить критическую точку, до которой сохраняется защитное действие олигомицина. В наших экспериментах защитное действие олигомицина исчезало при его инкубации с ФНО-а и эметином более 24 ч. Это, по-видимому, может объясняться наличием большого количества путей передачи сигнала в ФНО--индуцированном апоптозе. Следовательно, олигомицин скорее замедляет апоптоз, чем предотвращает его.
Таким образом, антиапоптозный эффект олигомицина не был связан с биоэнергетическими функциями митохондрий. Единственной известной немитохондриальной мишенью олигомицина является Ыа+/К+-АТРаза плазматической мембраны. Однако селективный ингибитор этого фермента оуабаин не подавлял ФНО-а-индуцированный апоптоз в наших условиях Защитное действие олигомицина совпадало с действием ингибитора МП митохондрий Цс А (в комбинации с ТФП), который блокировал выход цитохрома с и апоптоз, индуцированные ФНО-а,, но не СТ (рис. 6). Олигомицин и ЦсА не влияли на защитное действие белка Bcl-2.
митохоцприй при апоптозе, индуцированном ФНО-а и защитное действие олигомицина. Western blot, окраска антителами к цитохрому с.
Цит Мит Цит Мит Цит Мит 1 1 2 1 3
Рис. 6. Защитное действие олигомицина и Цс А на апоптоз клеток HeLa, индуцированный ФНО-а,. Окраска Hoechst 33342. Концентрации добавок, как на рис. 4. Олигомицин - 5 мкг/мл, циклоспорин А (Цс А) - 5 мкМ, 2,4-динитрофенол (ДНФ) -1 00 мкМ, трифторпиразин (ТФП) -20 мкМ, оуабаин - 0,5 мМ. Данные трех независимых экспериментов.
Участие митохондриальной поры в апоптозе является предметом многих работ. По-видимому, механизм открытия МП, который зависит от белка tBid в случае ФНО-а-индуцированного апоптоза, отличается от активации, наблюдаемой при действии Са2+ или разобщителей на изолированных митохондриях. Ясно, что этот механизм может обеспечить выход цитохрома с, благодаря осмотическому набуханию матрикса и разрыву наружной митохондриальной мембраны (НММ), однако, в ряде клеточных моделей открытие поры оказывалось недостаточным для выхода цитохрома с. Можно предположить, что ФНО-а--зависимый выход цитохрома с требует совместного участия комплексов поры и Fo, что и определяет эффект олигомицина (Shchepina et а!.. 2002; Lyamzaev et al., 2004).
Окислительный стресс, индуцируемый ФНО-с, и действие митохондриальных ингибиторов
Ранее было предположено, что открытие МП, индуцированное ФНО-а, приводит к повышенной продукции АФК в клетках. Однако источники АФК остаются не выясненными. Мы пытались выяснить роль митохондрий в этом процессе. Продукция АФК в клетках HeLa и HeLa-Bcl-2 в экспериментах детектировалась с помощью флуоресцентного красителя 2', 7'-дихлорофлуоресцина (DCFH-DA).
Повышенная продукция АФК, наблюдаемая в апоптозных клетках НвЬа после 3-5 ч инкубации в присутствии ФНО-а„ была не чувствительна к обработке клеток миксотиазолом и ротеноном. Эта продукция подавлялась при добавлении ингибитора каспаз :УДР1тк и экспрессии белка Вс1-2. Олигомицин также блокировал образование АФК, индуцированное ФНО--а (рис. 7).
Данные позволяют предположить, что образование АФК в нашей модели происходило после 1В^-зависимого повреждения митохондрий и открытия МП. Можно предположить, что источником АФК не был обратный перенос электронов через комплекс I. Кроме этого данные позволяют также исключить комплекс III как источник АФК.
Эметин ФНО-а + эметин ФНО-а + эметин + олиго
А
Эметин ФНО-а + эметин ФНО-о + эметин + олиго
олигомицина.
А - флуоресцентная микроскопия. Клетки окрашивали красителем ЭСРН-ЭД (20 мкМ). Б - данные проточной цитофлуорометрии. Клетки окрашивали красителями ЭСРНОД (20 мкМ) и пропидием иодидом (2 мкг/мл). В каждом варианте анализировали 10" клеток. Фактор некроза опухолей-а (ФНО--а) - 5 нг/мл, эметин - 1 мкг/мл, олигомицин (олиго) - 5 мкг/мл.
Антиоксиданты N-ацетилцистеин (NAC) и, селективно накапливающийся в митохондриях 10-(6'-убихинол)децилтрифенилфосфоний (mitoQ), в наших условиях не влияли на апоптоз клеток HeLa, индуцированный ФНО-а. MitoQ представляет собой производное убихинона, связанного с трифенилфосфонием. За счет катионной природы mitoQ способен селективно накапливаться в митохондриях под действием Дф. Возможно, наблюдаемая нами продукция АФК была следствием активации апоптозной программы и ее подавление не влияло на гибель клеток. В нашей лаборатории О. Ю. Плетюшкиной и др. было показано, что продукция АФК, индуцированная ФНО-а, может являться сигналом, вызывающим гибель клеток-соседей, не обработанных ФНО-а. Этот т. н. bystander effect ("эффект соседства") подавлялся при добавлении каталазы во внеклеточную среду. Вероятно, посредником, запускающим гибель клеток соседей, являлся в этом случае пероксид водорода. В этой модели антиоксидант mitoQ также подавлял гибель клеток, индуцированную сигналом, выделяемым клетками, обработанными ФНО-а. Данный результат позволяет предположить, что источником пероксида водорода являлись митохондрии.
Исследование продукции АФК митохондриями клеток HeLa, индуцированной фотоактивацией флуоресцентного красителя Mitotracker Red
Для выяснения роли дыхательной цепи митохондрий в продукции АФК и возможной гибели клеток нами была разработана модель, в которой эта продукция индуцировалась фотодинамической обработкой. В качестве индуктора образования АФК был выбран флуоресцентный краситель Mitotracker Red (MR), хлорметил-Х-розамин, селективно накапливающийся в митохондриях под действием мембранного потенциала митохондрий (Дф) и взаимодействующий с тиолами митохондрий. MR — фотосенсибилизатор, не токсичный для клеток, однако его фотоактивация приводит к продукции АФК (вероятно, в форме синглентного кислорода), что может вызывать гибель клеток (Minamikawa et al., 1999).
Фотоактивация MR возбуждающим светом (568 нм) приводила к продукции АФК в митохондриях, что было видно по солокализации окисленного АФК-чувствительного красителя CM-DCF и MR в клетках. Через 10 минут инкубации в темноте после фотоактивации флуоресценция CM-DCF была ярче и диффузно распределялась по клетке (рис. 8). В контрольных опытах (с окрашиванием клеток только CM-DCF) было показано, что этот краситель исходно не накапливался в митохондриях.
Локальное облучение лазером части клетки приводило к продукции АФК митохондриями именно в облученной части. При этом через 10 мин после облучения наблюдалась яркая диффузная флуоресценция ОМ-РОР по всей области засвеченных клеток.
Вероятно, фотоактивация МЯ первоначально вызывала продукцию АФК в матриксе митохондрий. Позднее, проникнув в цитоплазму, они, возможно, запустили вторичную продукцию АФК в клетке. Такую последовательность событий подтверждают опыты с локальным облучением части клетки.
Предполагается, что фотоактивация МЯ могла вызвать ухудшение работы антиоксидантных систем клетки за счет снижения уровня глутатиона и ЫДР(Р)Н в матриксе митохондрий.
После фотоактивации МЯ с помощью видеокамеры через пятиминутные темновые промежутки времени производили снимки флуоресценции ОМ-РОР и, таким образом, анализировали продукцию АФК в клетках.
Д Е
Рис. 8. Продукция АФК в клетках HeLa, вызванная фотоактивацией красителя MR. Клетки окрашивали с помощью флуоресцентных красителей MR (200 нМ, 15 мин) и CM-DCFH-DA (5 мкМ, 15 мин). А и Б - флуоресценция CM-DCF до фотоактивации MR, В и Г -флуоресценция CM-DCF сразу после фотоактивации MitoTracker Red, Д и Е -флуоресценция CM-DCF через 10 минут после фотоактивации MR. На фотографиях Б, Г, Е показана флуоресценция Mitotracker Red и CM-DCF одновременно.
Измерения интенсивности флуоресценции CM-DCF сразу после фотоактивации показали, что фотоактивация MR вызывала слабое увеличение продукции АФК. Ингибиторы комплекса I дыхательной цепи ротенон (рис. 9) и пиерицидин А, а также ингибитор комплекса III миксотиазол (рис. 10) значительно усиливали продукцию АФК митохондриями во время фотооблучения. Кроме этого ингибиторы значительно ускоряли увеличение флуоресценции CM-DCF при инкубации клеток в темноте после фотооблучения. Эти данные позволили предположить, что значительная часть АФК в нашей модели образовывалась восстановленными компонентами комплекса I.
Ингибитор флавинов дифенилен иодоний (DPI) блокировал ротенон-индуцированную продукцию АФК (рис. 9). Это позволило предположить, что источником АФК в нашей модели являлся флавиновый компонент комплекса I или кофакторы FeS-центра, осуществляющие перенос электронов между флавинами и хиноном. В работе Li и др. было показано, что обработка клеток лейкемии человека HL-60 с помощью DPI, наоборот, вызывала у них повышенную продукцию супероксидного анион-радикала и приводила клетки к гибели. В этом случае источник АФК, вероятно, был иной, чем в нашей модели (Li et al, 2003).
Времнмин
Рис. 9 Влияние митохондриальных ингибиторов на накопление АФК в клетках HeLa, индуцированное фотоактивацией MR. После фотоактивации через пятиминутные промежутки времени производили снимки флуоресценции CM-DCF. Интенсивность флуоресценции определяли с помощью программы Scion Image. Концентрации добавок: ротенон - 2 мкМ, дифенилен иодоний (DPI) - 10 мкМ, N-ацетилцистеин - 20 мМ. Данные трех независимых экспериментов.
В ходе экспериментов было обнаружено, что засвечивание клеток во время снимков, производимых через пятиминутные промежутки инкубации клеток в темноте вызывало некоторую фотоактивацию красителя CM-DCF-DA и увеличение его флуоресценции. Поэтому в ряде опытов для снижения влияния фотоактивации CM-DCF-DA производили только два снимка его флуоресценции: сразу после фотоактивации MR и через 20 минут (без промежуточных снимков) Данные представлены на рис. 10.
Антиоксиданты NAC и mitoQ также подавляли ротенон-индуцированную продукцию АФК (рис. 10). При этом перед фотоактивацией клетки преинкубировали с NAC (20 мМ) в течение 2 ч. Достоверный защитный эффект mitoQ наблюдался только при длительной преинкубации клеток в течение 8 суток, при этом защитный эффект проявлялся при небольшой (20 нМ) концентрации антиоксиданта. В нашей модели разобщитель FCCP не влиял на ротенон- и пиерицидин А-индуцированную продукцию АФК в данной модели. Олигомицин, ингибирующий АТР-синтазу, не влиял на продукцию АФК, индуцированную фотоактивацией MR Данные результаты говорят о том, что ни деполяризация, ни нарушение окислительного фосфорилирования не критичны для продукции АФК в исследуемой модели.
Экспрессия белка Bcl-2 не влияла на ротенон- и пиерицидин А-индуцированное образование АФК.
Контроль Ротенон Ротенон + Ротенон* Ротенон* Пиерицидин Миксотиаэол DPI NAC mltoQ А
Рис. 10. Флуоресценция CM-DCF через 20 мин после фотоактивации красителя MR. Концентрации ротенона, DPI, NAC - как на рис. 9. Пиерицидин А-10 мкМ, миксотиазол -2 мкМ. С антиоксидантом mitoQ (20 нМ) клетки преинкубировали 8 суток. Интенсивность флуоресценции определялась в программе Scion Image. Данные трех независимых экспериментов.
Таким образом, нами разработана модель, в которой удается регистрировать продукцию АФК в комплексе I дыхательной цепи митохондрий в интактной клетке. Предполагаемым источником АФК являлся флавиновый компонент комплекса I.
Фотоактивация MR вызывала гибель клеток HeLa после длительной темновой инкубации. При этом в зависимости от дозы облучения преобладали признаки апоптоза (при низких дозах облучения) или некроза (при высоких дозах облучения). В некоторых случаях некроз предотвращался при добавлении ингибитора каспаз zVADfmk. Вероятно, в этих случаях некроз имел вторичный характер. При этом некрозная гибель клеток, вызванная фотоактивацией MR в значительной степени подавлялась в присутствии пиерицидина А и миксотиазола. Предполагается, что пиерицидин А и миксотиазол в клетках препятствовали окислению пула NADH/NADPH в клетке после фотодинамического повреждения митохондрий и таким образом способствовали сохранению антиоксидантных систем.
Наблюдаемый нами эффект MR сходен с эффектами широкого круга фотосенсибилизаторов, используемых в фотодинамической терапии опухолей.
Наши данные показывают, что важную роль в этих системах могут играть АФК, производимые комплексом I дыхательной цепи митохондрий.
В наших экспериментах показано, что повышенная продукция АФК и гибель клеток могут быть индуцированы действием на клетки комбинаций митохондриальных ингибиторов (миксотиазола + олигомицина, олигомицина + FCCP и миксотиазола + FCCP) в безсывороточных условиях Предполагается, что гибель клеток вызывалась повышенной продукцией АФК в начальных сегментах дыхательной цепи.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что митохондриальные ингибиторы могут увеличивать продукцию АФК, вызывать окислительный стресс и способствовать гибели клеток. Повышенная продукция АФК в комплексе I наблюдалась при развитии различных патологий, включая ишемию/реперфузию, болезнь Паркинсона и др. (Fleury, 2002).
В дальнейшей части работы стояла задача разработки модели апоптоза, индуцированного митохондриальными ингибиторами. За основу были взяты результаты первой части работы, показывающие, что одновременное ингибирование гликолиза и окислительного фосфорилирования вызывает некротическую гибель клеток HeLa.
Комбинация ДОГ и митохондриальных ингибиторов вызывает снижение уровня АТР в клетках HeLa
Клетки HeLa в норме инкубируются в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (25 мМ). Этот уровень глюкозы гораздо выше физиологической нормы. Показано, что недостаток субстратов гликолиза может в значительной степени подавлять рост твердых опухолей. Если клетки помещали в среду DMEM с низким содержанием глюкозы (5,5 мМ) и добавляли конкурентный ингибитор гликолиза 2-дезокси^-глюкозу (ДОГ, 5 мМ), то клетки не теряли жизнеспособность в течение 2448 ч. Инкубация клеток HeLa с среде с низким содержанем глюкозы в присутствии ДОГ в комбинации с одним из митохондриальных ингибиторов (олигомицином, миксотиазолом или FCCP) вызывала во всех случаях быстрое (менее чем за 1 ч) и примерно одинаковое (на 60%) снижение уровня АТР в клетках. Используемые нами ингибиторы окислительного фосфорилирования и ДОГ, взятые по отдельности, вызывали снижение уровня АТР в клетках не более чем на 25% от исходного уровня.
Отмывка клеток через 3 ч после индукции снижения уровня АТР с заменой среды DMEM на новую, содержащую высокий уровень глюкозы (25 мМ) с 10%
эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и добавлением использованного ранее митохондриального ингибитора (олигомицина, миксотиазола или FCCP), приводила к восстановлению уровня АТР в клетках практически до исходного уровня (рис. 11).
Рис. 11. Комбинированное действие ингибиторов
гликолиза (ДОГ) и
окислительного фосфорилирования (олигомицина) вызывает
снижение уровня АТР в клетках HeLa. Клетки инкубировали 3 ч в среде, содержащей 5,5 мМ глюкозы в присутствии ДОГ (5 мМ) и олигомицина (5 мкг/мл). Затем была произведена смена среды (на DMEM, содержащую 25 мМ глюкозы) и вновь добавлен олигомицин.
Концентрации ингибиторов: ДОГ - 5 мМ, олигомицин - 5 мкг/мл. Данные трех независимых экспериментов.
В дальнейших экспериментах стояла задача выяснить возможное влияние временного снижения АТР на гибель клеток HeLa.
Временное снижение уровня АТР вызывает гибель клеток HeLa
Инкубация клеток HeLa в присутствии олигомицина, миксотиазола или FCCP не приводила к сколь-нибудь значимой гибели клеток в течение 48 ч даже в среде с низким содержанием глюкозы. При этом инкубация клеток в присутствии ДОГ и используемых нами ингибиторов окислительного фосфорилирования в течение 3 ч и последующая инкубация в течение 48 ч после восстановления уровня АТР в клетках в присутствии только митохондриального ингибитора приводила к значительной гибели клеток, при этом гибель практически не зависела от используемого нами митохондриального ингибитора (рис. 12). Наблюдаемый эффект не был связан с повышением или снижением мембранного потенциала митохондрий, поскольку олигомицин (индуцирует гиперполяризацию), FCCP и миксотиазол (индуцируют деполяризацию) вызывали гибель клеток только в присутствии ДОГ. По этим же причинам гибель клеток не была связана со сдвигом внутриклеточного редокс-потенциала в более восстановленное состояние (в присутствии олигомицина) или в более окисленное (в присутствии FCCP). Предполагается, что в клетке существуют некоторые "АТР-метры", которые могут активировать программу гибели клетки при
Время инкубации, ч
изменении уровня ATP в клетке Основным стимулом к апоптозу было, вероятно, временное энергетическое голодание клеток.
Рис. 12. Гибель клеток HeLa, вызванная временным снижением уровня АТР в клетках. Инкубация: 3 ч в среде с низким содержанием глюкозы в присутствии ДОГ и митохондриального ингибитора (олигомицина, миксотиозола или FCCP) + после отмывки 48 ч в среде с высоким содержанием глюкозы в присутствии только митохондриального ингибитора. Гибель клеток оценивали путем подсчета апоптозных клеток (с конденсированным и фрагментированным ядром) и некрозных клеток (проницаемых по пропидиум иодиду) Клетки окрашивали флуоресцентными красителями Hoechst 33342 (1 мкг/мл) и пропидиум иодидом (2 мкг/мл). Концентрации ингбиторов: ДОГ- 5 мМ, олигомицин (олиго) - 5 мкг/мл, миксотиазол (миксо) - 2 мкМ, FCCP - 10 мкМ. Данные трех независимых экспериментов.
В следующей серии экспериментов стояла задача охарактеризовать гибель клеток в разработанной нами модели и попытаться выяснить механизмы этой гибели.
Сверхэкспрессия антиапоптозного белка Bcl-2 или обработка клеток неспецифическим ингибитором каспаз zVADfmk полностью подавляли апоптоз клеток, индуцированный временным снижением уровня АТР. При этом ингибитор каспаз повышал некротическую гибель клеток (рис 13) Экспрессия Bcl-2 и добавление zVADfmk не препятствовали падению уровня АТР в клетках
Рис. 13.
Ингибирование апоптоза, индуцированного временным снижением уровня АТР в клетках HeLa. Bcl-2 - линия клеток HeLa, сверхэкспрессир ующая белок Bcl-2.
Концентрации добавок, как на рис. 13. zVADfmk -50мкМ.
Апоптоз клеток HeLa, индуцированный временным снижением уровня АТР, сопровождается транслокацией белка Вах к митохондриям и выходом цитохрома с из митохондрий в цитозоль
Характерными признаками апоптоза, наряду с фрагментацией ядра и образованием апоптозных телец, являются транслокация проапоптозного белка Вах к митохондриям и выход цитохрома с из митохондрий в цитозоль. Показано, что вышедший цитохром с может участвовать в образовании апоптосомы и активации прокаспазы-9. В наших экспериментах анализ производился с помощью антител к белкам Вах и цитохрому с.
Из рис. 14 видно, что в клетках, обработанных только ДОГ, не вызывающей гибели клеток, белок Вах диффузно распределен в цитоплазме, а цитохром с локализован в митохондриях (это было видно по солокализации цитохрома с и МЯ в клетках). В апоптозных клетках белок Вах транслоцирован (собран, вероятно, у митохондрий), а цитохром с вышел из митохондрий и диффузно распределен по клетке. Вероятно, транслокация Вах предшествует выходу цитохрома с в цитоплазму. Гибель клеток, вызванная временным снижением уровня АТР сопровождалась олигонуклеосомной фрагментацией молекул ДНК, что также является одним из признаков апоптоза.
Рис 14 Фрагментация ядра, транслокация белка Вах из цитозоля к митохондриям при апоптозе клеток HeLa, вызванным временным снижением уровня АТР в клетках
Клетки окрашивали одновременно с помощью Hoeschst 33342 и антител к белкам Вах и цитохрому с 1-ДОГ(5мМ)
2 - ДОГ + миксотиазол (2 мкМ) Стрелки показывают апоптозные клетки с фрагментированным ядром, транслоцированным белком Вах и вышедшим цитохромом с из митохондрий Концентрации ингибиторов, как на рис 13
Hoechst 33342
Вах
цитс
Глубокое снижение уровня АТР вызывает преимущественно некротическую гибель клеток HeLa
Для индукции более глубокого падения уровня АТР в клетках вместо среды DMEM была использована солевая безглюкозная среда Рингера-Кребса. Клетки инкубировали в этой среде 3 ч, при этом, как и в предыдущих условиях, добавляли 5 мМ ДОГ и один из митохондриальных ингибиторов (олигомицин, миксотиазол, или FCCP). В этих условиях уровень АТР в клетках падал примерно на 90% за 30 мин При этом через 24 ч после восстановления уровня АТР наблюдалась преимущественно некротическая гибель клеток, не чувствительная к экспрессии белка Bcl-2 и действию ингибитора каспаз zVADfmk. Добавление глицина (5 мМ) значительно снижало некротическую гибель клеток. Механизм этой защиты не выяснен
Апоптоз клеток HeLa, вызванный временным падением уровня АТР сопровождается окислительным стрессом
Продукцию АФК исследовали с помощью двух флуоресцентных красителей CM-DCF-DA и BODIPY-C11. Апоптозная, но не некрозная гибель клеток (через 24 ч после восстановления уровня АТР) сопровождалась продукцией АФК, наблюдаемой по повышению флуоресценции CM-DCF. Этот эффект полностью предотвращался при экспресси белка Bcl-2 и добавлении ингибитора каспаз zVADfmk.
Для исследования накопления АФК в гидрофобных областях клетки использовали специфический краситель BODIPY-C11. Этот краситель, локализующийся в мембранах клетки, в восстановленном состоянии флуоресцирует в красной области спектра, в окисленном с помощью АФК состоянии - в зеленой.
Из рисунка 15 видно, что в клетках, обработанных только ДОГ, краситель BODIPY-C11 находится в восстановленном состоянии. В клетках, обработанных ДОГ в присутствии миксотиазола, наблюдалось снижение флуоресценции BODIPY-C11 в красной области спектра и повышение в зеленой области, что говорит о его окислении в мембранах клетки. В отличие от CM-DCF-DA, окисление BODIPY-C11 в клетках детектировалось намного раньше (через 8 ч после восстановления уровня АТФ в клетках), при этом в клетках еще не начали происходить морфологические изменения, характерные для апоптоза.
Рис. 15
Окисление флуоресцентного красителя BODIPY С-11 (20 мкМ, 15 мин), индуцированное временным снижением уровня АТР в клетках HeLa Фотографии сделаны через 8 ч после восстановления уровня АТР. Концентрации ингибиторов, как на рис 13 1-ДОГ
2 - ДОГ + миксотиазол
NAC и mitoQ не влияли в условиях на гибель, индуцированную снижением уровня АТР в клетках. Роль АФК в этой модели остается не ясной (Izyumov et al, 2004; Черняк и др., 2005).
выводы
1. Ингибиторы дыхания (ротенон, миксотиазол) и разобщители (2,4-динитрофенол, FCCP), снижающие мембранный потенциал митохондрий, не вызывали гибели клеток HeLa в течение 24-48 ч, а в условиях длительного подавления гликолиза вызывали некроз.
2. Ингибиторы дыхания и разобщители не влияли на выход цитохрома с из митохондрий в цитоплазму, апоптоз клеток HeLa, индуцированный фактором некроза опухолей-а(ФНО-а), стауроспорином и на антиапоптозное действие белка Bcl-2. Олигомицин подавлял апоптоз, индуцированный ФНО-а, но не
Флуоресценция BODIPY-C11
стауроспорином. Эффект олигомицина не был связан с торможением активности митохондриальной АТР-синтазы и был, вероятно, обусловлен ингибированием выхода цитохрома с из митохондрий.
3. Апоптоз, индуцированный ФНО-а, сопровождался повышенной продукцией активных форм кислорода (АФК), которая не блокировалась ингибитором комплекса I ротеноном и ингибитором комплекса III миксотиазолом. Продукция АФК подавлялась при добавлении олигомицина и при сверхэкспрессии белка Bcl-2. Предполагается, что образование АФК происходит в результате повреждения митохондрий при участии комплекса I дыхательной цепи.
4. Исследована продукция АФК в клетках HeLa при фотодинамической активации митохондриального красителя хлорметил-Х-розамина (Mitotracker Red). Ингибиторы комплексов I и III дыхательной цепи стимулировали темновую продукцию АФК в митохондриях. Предполагается, что основным источником АФК при фотодинамической обработке клеток являлись восстановленные компоненты комплекса I.
5. Временное (3 ч) подавление гликолиза и окислительного фосфорилирования приводило к апоптозной гибели клеток HeLa через 24-48 ч. Апоптоз сопровождался транслокацией белка Вах к митохондриям и выходом цитохрома с из митохондрий и подавлялся при экспрессии белка Bcl-2. Апоптоз, вызванный снижением уровня АТР, сопровождался повышенной продукцией АФК, однако антиоксиданты не защищали клетки от апоптоза. Гибель клеток не зависела от типа митохондриального ингибитора. Предполагается, что основным сигналом, запускающим гибель клеток, являлось снижение уровня АТР.
6. Массовый апоптоз клеток HeLa наблюдался при временном снижении уровня АТР (на 60% от исходного уровня). Более длительное или более глубокое снижение уровня АТР с последующим его восстановлением приводило преимущественно к некротической гибели клеток. Выдвигается гипотеза о существовании особых систем ("АТР-метров"), запускающих программированную гибель клеток при снижении уровня АТР в клетках.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Изюмов Д. С, Аветисян А. В., Плетюшкина О. Ю., Черняк Б. В. (2003) Роль АТФ в гибели животных клеток. Материалы X Международной научной
конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов", Москва, 15-18 апреля, стр. 21.
2. Изюмов Д. С, Лямзаев К. Г., Аветисян А. В., Плетюшкина О. Ю., Черняк Б. В.
(2003) Индукция апоптоза митохондриальными ингибиторами. Международная конференция "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", Пущино, 16-18 июня, стр. 237-239.
3. Shchepina L A., Pletjushkina О. Yu., Avetisyan А. V., Bakeeva L. Е., Fetisova Е. К., Izyumov D. S., Saprunova V. В., Vyssokikh M. Yu., Chernyak B. V., Skulachev V. P. (2002) Oligomycin, inhibitor of the Fo part of H+-ATP-synthase, suppress the TNF-induced apoptosis. Oncogene, 21(53), 8149-57.
4. Изюмов Д. С, Плетюшкина О. Ю., Черняк Б. В. (2004) Продукция активных форм кислорода комплексом I дыхательной цепи, индуцированная фотодинамической обработкой культуры клеток HeLa. Тезисы докладов XI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2004", Москва, 12-15 апреля, стр. 53-54.
5. Izyumov D. S.t Avetisyan А. V., Pletjushkina О. Yu., Sakharov D. V., Wirtz K. W., Chernyak B. V. (2004) Oxidative stress induced by temporary mild ATP depletion in HeLa cells. Abstracts of the 29th Meeting of the Federation of the European Biochemical Societies, Warsaw, Poland, 26 June - 1 July. Abstracts of the 29th Meeting of the Federation of the European Biochemical Societies, Warsaw, Poland, 26 June-1 July, p. 174.
6. Izyumov D. S., Pletjushkina 0. Yu., Sakharov D. V., Wirtz K. W., Chernyak B. V.
(2004) Production of reactive oxygen species in complex I of respiratory chain induced by photodynamic treatment of HeLa cells. Abstracts of the 29th Meeting of the Federation of the European Biochemical Societies, Warsaw, Poland, 26 June -1 July. Abstracts of the 29th Meeting of the Federation of the European Biochemical Societies, Warsaw, Poland, 26 June-1 July, p. 178.
7. Avetisyan A. V., Izyumov D. S., Chernyak B. V., Skulachev V. P. (2004) ATP depletion-induced in HeLa cells. Abstracts of the 29th Meeting of the Federation of the European Biochemical Societies, Warsaw, Poland, 26 June - 1 July. Abstracts of the 29th Meeting of the Federation of the European Biochemical Societies, Warsaw, Poland, 26 June -1 July, p. 178.
8. Lyamzaev K. G., Izyumov D. S., Avetisyan A. V., Yang F., Pletjushkina 0. Yu., Chernyak B. V. (2004) Inhibition of mitochondrial bioenergetics: the effects on
structure of mitochondria in the cell and apoptosis. Acta Biochimica Polonica, 51(2), p. 553-62.
9. Izyumov D. S., Avetisyan A. V., Pletjushkina O. Yu., Sakharov D. V., Wirtz K. W., Chernyak B. V., Skulachev V. P. (2004) 'Wages of fear": transient decrease in intracellular ATP level imposes apoptosis. Biocimica et Biophysica Acta, 1658 (1-2), p. 141-7.
10. Izyumov D. S., Pletjushkina 0. Yu., Sakharov D. V., Wirtz K. W., Chernyak B. V.
(2004) Induction of reactive oxygen species production in complex I of mitochondrial respiratory chain by photodynamic treatment of HeLa cells. Abstracts of the 13th European Bioenergetics Conference. Pisa, Italy, 21 August-26 August, p. 55.
11. Pletjushkina O. Yu., Lyamzaev K. G., Izyumov D. S., Bakeeva L. E., Saprunova L V., Chernyak B. V., S kulachev V. P. (2004) Selective elimination of mitochondria ("mitoptosis") induced by the inhibitors of respiration and uncouplers. Abstracts of the 13th European Bioenergetics Conference. Pisa, Italy, 21 August-26 August, p. 183.
12.Chernyak B. V., Izyumov D. S., Avetisyan A. V., Lyamzaev K. G., Pletjushkina O. Yu., Skulachev V. P. (2004) Inhibitors of mitochondrial bioenergetics in studies on structure of mitochondria in the cell, oxidative stress and apoptosis. Abstracts of the 13th European Bioenergetics Conference. Pisa, Italy, 21 August-26 August, p. 204.
13. Avetisyan A. V., Izyumov D. S., Chernyak B. V., Skulachev V. P. (2004) Transient depletion of ATP induces apoptosis in HeLa cells. Abstracts of the 13th European Bioenergetics Conference. Pisa, Italy, 21 August-26 August, p. 244-245.
14.Черняк Б. В., Плетюшкина О. Ю., Изюмов Д. С, Лямзаев К. Г., Аветисян А. В.
(2005) Биоэнергетика и смерть. Биохимия, 70, с. 294-301.
Принято к исполнению 19/03/2005 Исполнено 20/03/2005
Заказ №715 Тираж: 100 экз..
ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)747-64-70 (095) 318-40-68 www.autoreferat.ru
M
£ 5 í - *• 5 /
1509
2 2
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Изюмов, Денис Сергеевич
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
Актуальность проблемы.
Цель и задачи исследования.
Научная новизна работы.
Практическая ценность работы.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
Общие положения о программированной смерти клеток.1Г
Участие каспаз в апоптозе.
Активация апоптоза с участием рецепторов./
Митохондриалъный путь активации каспаз.
Проапоптозные белки митохондрий.
Независимая от каспаз гибель клеток.
Роль белков семейства Bcl-2 в апоптозе.
Участие кальция в апоптозе.
Активные формы кислорода и азота.
Роль комплекса I дыхательной цепи в продукции АФК,.
Роль комплекса III дыхательной цепи в продукции АФК.
Антиоксидантные системы клетки.
Влияние А ФК на гибель клеток.
Регуляция апоптоза с помощью АФК и А ФА.
Продукция АФК при фото динамической обработке клеток.
Механизмы гибели клеток, индуцированной истощением АТР.
Сенсоры уровня АТР в клетках.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Использованные культуры клеток.
Использованные реагенты.
Приготовление растворов и сред для культивирования клеток.
Приготовление фосфатного буфера.
Приготовление безглюкозной поддерживающей среды Рингера-Кребса.
Приготовление растворов трипсина и ЭДТА.
Приготовление питательной среды Игла, модифицированной Дальбекко.
Методы работы.
Пересев клеток.
Замораживаие и размораживание клеточных культур.
Пересев клеток для экспериментов.
Определение концентрации клеток с помощью камеры Горяева.
Определение жизнеспособности клеток.
Определение жизнеспособности клеток с использованием флуоресцентных красителей.
Определение продукции АФК.
Регистрация дыхания клеток.
Иммунофлуоренсцентное окрашивание клеток.
Регистрация выхода цитохрома с с помощью Western блота.
Истощение уровня АТР в клетках и его восстановление.
Разделение фрагментированных молекул ДНК с помощью электрофореза.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Измерение дыхания клеток линий Hela и HeLa-Bcl-2.
Влияние митохондриальных ингибиторов на гибель клеток.
Влияние биоэнергетических функций митохондрий на апоптоз клеток, индуцированный стауроспорином.
Влияние биоэнергетических функций митохондрий на апоптоз клеток, индуцированный фактором некроза опухолей-а. олигомицин ингибирует апоптоз клеток hela, индуцированный ФНО-а.
Окислительный стресс, индуцируемый ФНО-а и действие митохондриальных ингибиторов.
Исследование продукции АФК митохондриями клеток Hela, индуцированной фотоактивацией флуоресцентного красителя Mitotracker Red.
Исследование окислительного стресса и апоптоза, индуцированных временным снижением уровня АТР в клетках HELA.
Комбинация 2-ДОГ и митохондриальных ингибиторов вызывает снижение уровня АТР в клетках
HeLa.
Временное снижение уровня АТР вызывает гибель клеток HeLa.
Апоптоз клеток HeLa, вызванный временным снижением уровня АТР в клетках, сопровождается транслокацией белка Вах и выходом цитохрома с из митохондрий.
Дробление молекул ДНК при апоптозе.
Апоптоз клеток HeLa, вызванный временным падением уровня АТР, сопровождается окислительным стрессом.
Глубокое снижение уровня АТР вызывает преимущественно некротическую гибель клеток HeLa.
Вляние удаления сыротки из среды инкубации на гибель клеток HeLa, индуцированную митохондриальными ингибиторами.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ.ОШИБКА! ЗАКЛАДКА НЕ ОПРЕДЕЛЕНА.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Программируемая гибель клеток и окислительный стресс, вызванные ингибиторами митохондриальных функций"
Актуальность проблемы в последние годы мы стали свидетелями революционных событий в митохондриологии. Привычное представление о митохондриях как об энергетических станциях клетки, производящих АТР, общие принципы действия которых известны (хемиосмотическая теория сопряжения), сменилось на представление о них, как об органеллах, в котором заключены факторы, определяющие судьбу клетки. Ранее роль митохондрий в развитии патологий ограничивалось нарушением энергообеспечения при токсических и гипоксических повреждениях. Теперь на передний план вышли "побочные" процессы, в которых участвуют митохондрии, такие как продукция активных форм кислорода (АФК), нарушение внутриклеточной передачи сигналов и выход из митохондрий белков, способных активировать программу гибели клеток (апоптоз) (Черняк и др., 2005).Среди этих белков центральное место занимает цитохром с, который, оказавшись в цитоплазме, участвует в образовании апоптосомы, катализирующей активацию каспаз - специфических протеаз, участвующих в апоптозе.Окислительный стресс считается основным компонентом в развитии многих серьезных патологий и естественного старения организма. АФК, производимые митохондриями, рассматриваются в качестве одного из факторов, усиливающих внутриклеточный окислительный стресс. Исследования последних лет прояснили многие детали механизмов генерации АФК в митохондриях, но общая картина процесса пока не ясна. Нехватка фактических данных пока еще не позволяет достаточно полно обосновать представления о роли митохондрий в окислительном стрессе. Кроме того вклад именно митохондриальных АФК предстоит продемонстрировать в случае различных патологий (Андреев и др., 2005).Митохондрии способны воспринимать разнородные сигналы, поступающие из внеклеточной среды (через специфические рецепторы, как в случае цитокинов, или без них, как при физических стрессах) и от других клеточных структур (ядра, цитоскелета, ретикулума и др.), перерабатывать их и выдавать сигнал, который может практически неизбежно привести клетку к гибели. На каждой из этих стадий не установлены многие принципиальные механизмы, не идентифицированы все компоненты сигнальных путей, не прослежена их связь и соотношение этих процессов с основными биоэнергетическими функциями митохондрий.Практически ко всем компонентам окислительного фосфорилирования были найдены селективные ингибиторы (в основном антибиотики), а затем были расшифрованы механизмы их действия. Использование этих ингибиторов позволило прояснить механизмы многих биоэнергетических процессов.Таким образом, исследования в описанной области являются, без сомнения, достаточно актуальными. Прояснение роли биоэнергетических процессов ^ митохондрий в развитии окислительного стресса и программируемой гибели клеток (ПКС) позволит человеку более эффективно бороться с заболеваниями, в основе которых лежит повышенная продукция АФК и нарушения реализации апоптоза.Цель и задачи исследования Целью данной работы являлось исследование роли биоэнергетических функций митохондрий в апоптозе и окислительном стрессе клеток HeLa, активируемых через рецепторы плазматической мембраны (ПМ), ингибирование протеинкиназ, путем фотодинамической обработки клеток и временным iky снижением уровня АТР в клетках.Задачи исследования: 1. Исследование действия митохондриальных ингибиторов на апоптоз и окислительный стресс клеток HeLa, индуцируемые фактором некроза опухолей-а (ФНО-а) и стауроспорином (СТ).2. Исследование действия митохондриальных ингибиторов на продукцию АФК в митохондриях, индуцированную фотодинамической обработкой клеток HeLa.Ц 3. Исследование механизмов окислительного стресса и гибели клеток HeLa, вызванных временным снижением уровня АТР. Научная новизна работы в работе проведено исследование влияния митохондриальных ингибиторов на гибель клеток HeLa и окислительный стресс, активируемые в различных экспериментальных моделях, лежащих в основе развития многих патологий человека. Установлено, что ингибиторы электронтранспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий, разобщители окислительного фосфорилирования не вызывают гибели клеток HeLa в исследуемые промежутки времени. Кроме этого они не влияли на окислительный стресс и апоптоз клеток, вызванные обработкой клеток ФНО-а и СТ. Экспрессия белка Вс1-2 подавляла окислительный стресс и апоптоз, индуцированные действием ФНО-о; и СТ. Ингибитор АТР-синтазы олигомицин подавлял все проявления апоптоза (продукцию АФК, фрагментацию ядра и выход цитохрома с из митохондрий), индуцированные ФНО-о; но не СТ. Предполагается, что защитное действие олигомицина опосредовано ингибированием ^v неспецифической митохондриальной гигантской поры (ГП) и не связано с ингибированием АТР-синтазы и влиянием олигомицина на трансмембранный потенциал митохондрий.Разработана модель митохондриальной продукции АФК, индуцированной фотоактивацией специфического митохондриального красителя Mitotracker Red. В этой модели показано, что ингибиторы комплекса I (ротенон и пиерицидин А) и комплекса III (миксотиазол) дыхательной цепи митохондрий значительно стимулировали продукцию АФК комплексом I. Этот процесс подавлялся при добавлении ингибитора флавинов дифенилениодония (DPI) и антиоксидантов NJ , ацетилцистеина и митохондриально-направленного mitoQ. Полученные данные позволяют предположить, что источником АФК в данном случае являлся флавиновый компонент комплекса I.Показано, что временное снижение уровня АТР в клетках, вызванное одновременным ингибированием гликолиза (с помощью конкурентного ингибитора гликолиза 2-дезокси-В-глюкозы (ДОГ)) и окислительного фосфорилирования вызывает апоптоз клеток HeLa. В качестве митохондриальных ингибиторов использовали олигомицин, миксотиазол и разобщитель ^ окислительного фосфорилирования FCCP. Глубина падения уровня АТР (примерно на 60% от исходного уровня) и гибель клеток не зависели от типа используемого митохондриального ингибитора. Апоптоз сопровождался повышенной продукцией АФК, но не был чувствителен к действию антиоксидантов. Более глубокое или более длительное снижение уровня АТР в клетках вызывало преимущественно некротическую гибель клеток, которая в отличие от апоптоза не была чувствительна к экспрессии белка Вс1-2 и не подавлялась ингибитором каспаз у zVADfmk. Предполагается, что существуют некоторые "АТР-метры", отслеживающие изменения уровня АТР в клетках и запускающие сигнал к гибели.Практическая ценность работы Исследование роли митохондрий в развитии окислительного стресса и апоптоза в последнее время приобретает все большее значение. Этот интерес связан с возрастающим количеством доказательств участия этих процессов в развитии многих патологий человека. Большее понимание механизмов окислительного стресса и гибели клеток, понимание роли митохондрий в этих процессах поможет обрести новые средства борьбы с различными заболеваниями, такими как инсульт, инфаркт, нейродегенеративные заболевания и др.
Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Изюмов, Денис Сергеевич
1. Ингибиторы дыхания (ротенон, миксотиазол) и разобщители (2, 4-
динитрофенол, FCCP), снижающие мембранный потенциал митохондрий, не вызывали гибели клеток HeLa в течение 24-48 ч, а в условиях длительного подавления гликолиза вызывали некроз.2. Ингибиторы дыхания и разобщители не влияли на выход цитохрома с из митохондрий в цитоплазму, апоптоз клеток HeLa, индуцированный фактором некроза опухолей-се (ФНО-а), стауроспорином и на антиапоптозное действие белка Вс1-2. Олигомицин подавлял апоптоз, индуцированный ФНО-о, но не стауроспорином. Эффект олигомицина не был связан с торможением активности митохондриальной АТР-синтазы и был, вероятно, обусловлен ингибированием выхода цитохрома с из митохондрий.3. Апоптоз, индуцированный ФНО-о, сопровождался повышенной продукцией активных форм кислорода (АФК), которая не блокировалась ингибитором комплекса I ротеноном и ингибитором комплекса III миксотиазолом.Продукция АФК подавлялась при добавлении олигомицина и при сверхэкспрессии белка Вс1-2. Предполагается, что образование АФК происходит в результате повреждения митохондрий при участии комплекса I дыхательной цепи.4. Исследована продукция АФК в клетках HeLa при фото динамической активации митохондриального красителя хлорметил-Х-розамина (Mitotracker Red). Ингибиторы комплексов I и III дыхательной цепи стимулировали темповую продукцию АФК в митохондриях. Предполагается, что основным источником АФК при фотодинамической обработке клеток являлись восстановленные компоненты комплекса I.5. Временное (3 ч) подавление гликолиза и окислительного фосфорилирования приводило к апоптозной гибели клеток HeLa через 24-48 ч. Апоптоз сопровождался транслокацией белка В ах к митохондриям и выходом цитохрома с из митохондрий и подавлялся при экспрессии белка Вс1-2.Апоптоз, вызванный снижением уровня АТР, сопровождался повышенной продукцией АФК, однако антиоксиданты не защищали клетки от апоптоза.Гибель клеток не зависела от типа митохондриального ингибитора.Предполагается, что основным сигналом, запускающим гибель клеток, являлось снижение уровня АТР.
6. Массовый апоптоз клеток HeLa наблюдался при временном снижении уровня АТР (на 60% от исходного уровня). Более длительное или более глубокое снижение уровня АТР с последующим его восстановлением приводило преимущественно к некротической гибели клеток. Выдвигается гипотеза о существовании особых систем ("АТР-метров"), запускающих программированную гибель клеток при снижении уровня АТР в клетках.Благодарности Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю д. б. н.профессору В. Д. Самуилову и научному консультанту к. б. н. ведущему научному сотруднику Б. В. Черняку за полученные знания, заботу, внимание и ценные советы, полученные мной во время выполнения данной работы. Особую благодарность выражаю к. б. н. ведущему научному сотруднику О. Ю. Плетюшкиной.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Изюмов, Денис Сергеевич, Москва
1. Андреев А. Ю., Кушнарева Ю. Е., Старков А. А. (2005) Метаболизм активных форм кислорода в митохондриях. Биохимия, 2, 246-264.
2. Новиков Б. П., Новожилова А. П., Плужников Н. Н. (1996) Программированная клеточная смерть (под ред. Новикова В. С) , СПб, Наука.
3. Самуилов В Д., Олескин А. В., Лагунова Е. М. (2000) Программируемая клеточная смерть. Биохимия, 65, 1029-1046.
4. Скулачев В.П. (1989) Энергетика биологических мембран. М.: Наука
5. Черняк Б. В., Плетюшкина О. Ю., Изюмов Д. С , Лямзаев К. Г., Аветисян А. В. (2005) Биоэнергетика и смерть. Биохимия, 70, 294-301.
6. Щепина Л. А., Попова Е. П., Плетюшкина О. Ю., Черняк Б. В. (2002) Апоптоз клеток HeLa и антиапоптозное действие белка Вс1-2 не зависят от дыхания и мембранного потенциала митохондрий. Биохимия, 67, 265-270.
7. Adams Jr. J. D., Chang M. L., Klaidman L. (2001) Parkinsons disease- redox mechanisms. Curr. Med. Chem., 8, 809-814.
8. Adams and Cory (2002) Apoptosomes: engines for caspase activation. Curr. Opin. Cell Biol., 14, 715-720.
9. Agostinis P., Vantieghem A., Merlevede W., de Witte P. A. (2002) Hypericin in cancer treatment: more light on the way. Intern. J. Biochem. Cell Biol., 34, 221-241.
10. Aksenov M. Y., Aksenova M. V., Butterfield D. A., Geddes J. W., Markesbery (2001). Protein oxidation in the brain in Alzheimers disease. Neuroscience, 103, 373-383.
11. Aon M. A., Cortassa S., Marban E., O'Rourke B. (2003) Synchronized whole cell oscillations in mitochondrial metabolism triggered by a local release of reactive oxygen species in cardiac myocytes. J. Biol. Chem., 278, 44735-44744.
12. Amoult D., Gaume В., Karbowski M., 8Ьафе J. C , Cecconi F., Youle R. J. (2003) Mitochondrial release of AIF and EndoG requires caspase activation downstream of Bax/Bak-mediated permeabilization. The EMBO Journal, 11, 4385-4399.
13. Bai J., Rodriguez A. M., Melendez J. A., Cederbaum A. L. (1999) Overexpression of catalase in cytosolic or mitochondrial compartment protect HepG2 cells against oxidative injury. J. Biol. Chem., 274, 26217.
14. Bamham K. J., Masters С L., Bush A. I. (2004) Neurodegenerative diseases and oxidative stress. Nat. Rev. Drug Discov., 3, 205-214.
15. Betarbet R., Sherer T. B, MacKenzie G., Garcia-Osuna M., Panov A. V. Grrenmyre J. T. (2000) Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson's disease. Nature Neur о science, 3, 1301-1306.
16. Bauer G. (2000) Reactive oxygen and nitrogen species: efficient, selective, and interactive signals during intercellular induction of apoptosis. Anticancer Research, 2{S,An5-A\A(i.
17. Bauer G. (2002) Signaling and proapoptotic functions of transformed cell- derived reactive oxygen species. Prostaglaglandins Leucot. Essen. Fatty Acids, 66, 41-56.
18. Beckman J. S., Koppenol W. H. (1996) Nitric oxide, superoxide and peroxynitrite: the good, the bad , and the ugly. Am. J. Physiol. Cell Physiol, 271, C1424-1437.
19. Bossy-Wetzel E., Newmeyer D. D., Green D. (1998) Mitochondrial cytochrome с release in apoptosis occurs upstream of DEVD-specific caspase activation and independently of mitochondrial transmembrane depolarization. The EMBO Journal, 17, 37-49.
20. Bratton S. В., Cohen G. M. (2001) Apoptotic death sensor: an organelle's alter ago? Trends Pharmacol. Sci, 22, 306-314.
21. Bringold U., Ghafourifar P., Richter C. (2000) Peroxynitrite formed by mitochondrial NO synthase promotes mitochondrial Ca release. Free Rad. Biol. Med, 29, 343.
22. Bruckdorfer R. (2005) The basics about nitric oxide. Mol. Aspects Med., 26, 3-31.
23. Cai J., Jones D. P. (1998) Superoxide in Apoptosis. Mitochondrial generation triggered by cytochrome с loss. J. Biol. Chem., 273, 11401-11404.
24. Carmody R. J., McGowan A. J., Gotter T. G. (1999) Reactive oxygen species as mediators of photoreceptor apoptosis in vitro. Exp. Cell Res., 248, 520-530.
25. Carmody R. J., Cotter T. G. (2000) Oxidative stress induces caspase- independent retinal apoptosis in vitro. Cell Death Differ., 7, 282-291.
26. Chandel N. S., Schumacker P. Т., Arch R. H. (2001) Reactive Oxygen Species Are Downstretim Products of TRAF-mediated Signal Transduction. J. Biol. Chem., 276, 42728-42726.
27. Chandra J., Samali A., Orrenius S. (2000) Triggering and modulation of apoptosis by oxidative stress. Free Radic. Biol. Med., 29, 323-333.
28. Chang H. Y., Yang X. (2000) Proteases for Cell Suicide: Functions and Regulation of Caspases. Microbio. Mol. Biol. Rev., 64, 821-846.
29. Chen Q., Vazquez E. J., Moghaddas S., Hoppel C. L., Lesnefsky E. J. (2003) Production of Reactive Oxygen Species by Mitochondria. Central role of complex III. J. Biol. Chem., 278, 36027-36031.
30. Cheng E. H., Kirsch D. G., Clem R. J., Ravi R., Kastan M. В., Bedi A., Ueno K., Hardwick J. M. (1997) Conversion of Bcl-2 to a Bax-like death effector by caspases. Science, 278, 1966-1968.
31. Clement M. V., Pervaiz S. (1999) Reactive oxygen intermediates regulate cellular response to apoptotic stimuli: an hypothesis. Free Radic. Res., 30, 247-252.
32. Cleveland J. L., Kastan M. B. (2000) A radical approach to treatment. Nature, 401, 309-3 n.
33. Cory S., Huang D. C , Adams J. M. (2003) The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis. Oncogene, 22, 8590-8607.
34. Creagh E. M., Carmody R. J., Gotter T. G. (2000) Heat shock protein 70 inhibits caspase-dependent and -independent apoptosis in Jurkat T Cells. Exp. Cell Res., 151, 5^-66.
35. Cryns v. , Yuan J. (1998) Ptoteases to die for. Genes Dev., 12, 1551-1570.
36. Curtin J. F., Donovan M., Gotter T. G. (2002) Regulation and measurement of oxidative stress in apoptosis. J. Immunol. Methods, 265, 49-72.
37. D'Acquisto F., de Cristofano F., Maiuri M. C , Tajana G., Camuccio R. (2001) Protective role of nuclear factor kappa В against nitric oxide-induced apoptosis in J774 macropahges. Cell Death Differ., 8, 144151.
38. Da Silva Xavier G., Leclerc I., Salt I. P., Doiron В., Hardie D. G., Kahn A., Rutter G. A. (2000) Role of AMP-activated protein kinase in the regulation by glucose of islet beta cell gene expression. PNAS, 97, 4023-4028.
39. Davis R. J. (2000) Signal Transduction by the JNK Group of MAP Kinases. Cell, 103, 239-252.
40. Dawson T. L., Gores G. J., Nieminen A. L., Herman В., Lemasters J. J. (1993) Mitochondria as a source of reactive oxygen species during reductive stress in rat hepatocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol, 264, C961-C967.
41. Debatin K. M., Krammer P. H. (2004) Death receptors in chemotherapy and cancer. Oncogene, 20, 2950-2966.
42. Demin O. V., Kholodenko B. N., Skulachev V. P. (1998) A model of Oj-" generation in the complex III of the electron transport chain. Mol. Cell. Biochem., 184,21-33.
43. Dennis P. В., Jaeschke A., Saitoh S. L., Fowler В., Kozma S. C , Thomas G. (2001) Mammalian TOR: a homeostatic ATP sensor. Science, 294, 1102-1105.
44. Djavaheri-Mergny M., Javelaud D., Wietzerbin J., Besancon F. (2004) NF- KB activation prevents apoptotic oxidative stress via an increase of both thioredoxin and MnSOD levels in TNFa-treated cells. FEBSLett., 578, 111-115. I l l
45. Duchen М. R. (1999) Contributions of mitochondria to animal physiology: from homeostatic sensor to calcium signalling and cell death. J. Physiol, 516, 1-17.
46. Eguchi Y., Tomaselli K. J., Shimizu S., Tsujimoto Y. (1999) ATP- dependent steps in apoptotic signal transduction. Cancer Research, 59, 2174-2181.
47. Fariss M. W. (1997) in Handbook of synthetic antioxidants (Packer L., Cadenas E.). Dekker, New York, pi39-175.
48. Finkel T. (2000) Redox-dependent signal transduction. FEBSLett, 476, 52- 54.
49. Fiorucci S., Mencarelli A., Palazzetti В., Del Soldato P., Morrelli A., Ignarro L. J. (2001) An NO derivative of ursodeoxycholic acid protects against Fas-mediated liver injury by inhibiting caspase activity. PNAS, 98, 2652-2657.
50. Fleury C , Mignotte В., Vayssiere J.-L. (2002) Mitochondrial reactive oxygen species in cell death signaling. Biochimie, 84, 131-141.
51. Gatenly R. A., Gawlinski E. T. (2003) The glycolytic Phenotype in Carcinogenesis and Tumor Invasion: Insights through Mathematical Models. Cancer Research, 63, 3847-3854.
52. Gille L., and Nohl H. (2001) The ubiquinol/bcl redox couple regulates mitochondrial oxygen radical formation. Arch. Biochem. Biophys., 388, 34-38.
53. Goglia F., Skulachev V. P. (2004) A function for novel uncoupling proteins: antioxidant defense of mitochondrial matrix by translocating fatty acid peroxides from the inner to the outer membrane leaflet. FASEB, 17, 1585-1591.
54. Gorman A. M., Heavey В., Creagh E., Cotter T. G., Samali A. (1999) Antioxidant-mediated inhibition of the heat shock response leads to apoptosis. FEBSLett., 445, 9S-\02.
55. Green D. R. (1998) Apoptotic pathways: the roads to ruin. Cell, 94, 695- 698.
56. Halliwell В., Clement M. V., Ramalingam J., Long L. H. (2000) Hydrogen Peroxide. Ubiquitous in Cell Culture and In vivo? JUBMIB, Life, 50, 251-257.
57. Hampton M. В., Orrenius S. (1997) Dual regulation of caspase activity by hydrogen peroxide: implications for apoptosis. FEBSLett., 414, 552-556.
58. Hanahan D., Weinberg R. A. (2000) The hallmarks of cancer. Cell, 100, 57- 70.
59. Hardie D. G., Carling D., Carlson M. (1998) The AMP-activated/SNFI protein kinase subfamily: metabolic sensors of the eukayotic cell? Ann. Rev. B/oc/zew., 67, 821-855.
60. Haunstetter A., Izumo S. (1998) Apoptosis. Basic Mechanisms and Implications for Cardiovascular Disease. Circulation Research, 82, 1111-1129.
61. Haynes V., Elfering S., Traaseth N., Giulivi С (2004) Mitochondrial nitric- oxide synthase: enzyme expression, characterization, and regulation. J. Bioenerg. Biomembr. 36, 341-346.
62. Heigold S., Bauer G. (2002) Raw 264.7 macrophages induce apoptosis selectively in transformed cells: intercellular signaling based on reactive oxygen species. JLeukoc. Biol, 11, 554-563.
63. Izyumov D. S., Avetisyan A. V., Pletjushkina O. Yu., Sakharov D. V., Wirtz K. W., Chemyak B. V., Skulachev V. P. (2004) "Wages of Fear": transient threefold decrease in intracellular ATP level imposes apoptosis. Biochim. Biophys. Acta, 1658, 141-147.
64. Jacobson M. D., Raff M. С (1995) Programmed cell death and Bcl-2 protection in very low oxygen. Nature, 374, 814-816.
65. Jacobson M. D., Weil M., Raff M. С (1997) Programmed cell death in animal development. Cell, 88, 347-354.
66. Jaustin M. L., Meier Т., Smith R., Murphy M. (2003) Mitochondria- targeted antioxidants protect Friedreich Ataxia fibroblasts from endogenous oxidative stress more effectively than untargeted antioxidants. FASEB, 17, 1972-1974.
67. Jou M. J., Jou S. В., Chen H. M., lin С H., Peng T. I (2002) Critical role of mitochondrial reactive oxygen species formation in visible laser irradiation-induced apoptosis in rat brain astrocytes (RBA-1). J. Biomed. Set., 9, 507-516.
68. Jaattela M., Tschopp J. (2003) Caspase-independent cell death in T lymphocytes. Nat. Immunol, 4,416-423. 1^
69. Kane D. J., Sarafian R., Anton H., Hahn H, Gralla E., Valentine J., Ord Т., Bredesen D. (1993) Bcl-2 inhibition of neural death: deceased generation of reactive oxygen species. Science, 262, 365-369.
70. Kelso G. F., Poteous С M. (2001) Selective targeting of a redox-active ubiquinone to mitochondria within cells. J. Biol. Chem., 276, 4588-4596.
71. Kemp B. E., Mitchelhill K. I., Stapleton D., Michell B. J., Chen Z. P., Witters L. A. (1999) Dealing with energy demand: the AMP-activated protein kinase. Trends Biochem. Sci., 24, 22-25.
72. Kessel D., Luo Y. (1999) Photodynamic therapy: a mitochondrial inducer of apoptosis. Cell Death Differ, 6, 28-35.
73. Kharbanda S., Pandey P., Schefield L., Israels S., Roncinske R., Yoshida K., Bharti A., Yuan Z-M. Saxena S., Weichselbaum R., Nalin C , Kufe D. (1997) PNAS, 94, 6932-6942.
74. King A., Gottlieb E., Brooks D. G., Murphy M. P., Dunaief J. L. (2004) Mitochondria-derived reactive oxygen species mediate blue light-induced death of retinal pigment epithelial cells. Photochem. Photobiol, 79, 470-475.
75. Kowaltowski A. J., Castilho R F. Vercesi A. E. (2001) Mitochondrial permeability transition and oxidative stress. FEBSLett., 495, 12-15.
76. Krasilnikov M. A. (2000) Phospatidylinositol 3-kinase dependent pathways: the role in control of cell growth, survival, and malignant transformation. Biochemistry (Moscow), 65, 59-67.
77. Kushnareva Y., Murphy A. N., Andreev A. (2002) Complex I-mediated reactive oxygen species generation: modulation by cytochrome с and NAD(P)^ oxidation-reduction state. Biochem. J., 368, 545-553.
78. Kuwana Т., Newmeyer D. D. (2003) Bcl-2 proteins and the role of mitochondria in apoptosis. Curr. Opin. Cell Biol., 15, 691-699.
79. Kuznetsov A. V., Janakiraman M., Margreiter R., Troppmair J. (2004) Regulating cell survival by controlling cellular energy production: novel functions for ancient signaling pathways? FEBS Letters, 577, 1-4.
80. Lam M., Oleinick N. L., Nieminen A. L. (2001) Photodynamic therapy- induced apoptosis in epidermoid carcinoma cells. Reactive oxygen species and mitochondrial inner membrane permeabilization. J. Biol. Chem., 276, 47379-47386.
81. Lambert A. J., Brand M. D. (2004) Inhibitors of the quinone-binding site allow rapid superoxide production from mitochondrial NADHiubiquinone oxidoreductase (complex I). J. Biol. Chem., 279, 39414-39420.
82. Latta M., Kunstle G., Leist M., Wendel A. (2000) Metabolic depletion of ATP by fructose inversely controls CD95- and tumor necrosis factor receptor 1-mediated apoptosis. J. Exp. Med., 191, 1975-1985.
83. Leeuwenburgh C , Hansen P., Shaish A., Holloszy J. O., Heinecke J. W. (1998) Markers of protein oxidation by hydroxyl radical and reactive nitrogen species in tissues of aging rats. Am. J. Physiol. Cell Physiol.. 274, 453-461.
84. Le Goffe C , Vallette G., Charrier L., Candelon Т., Bou-Hanna C., Bouhours J.-F., Laboisse C. L. (2002) Metabolic control of resistance of human epithelial cells to H2O2 and NO stresses. Biochem. J., 364, 349-359.
85. Leff T. (2003) AMP-activated protein kinase regulates gene expression by direct phosphorylation of nuclear proteins. Biochem. Soc. Trans., 31, 224-227.
86. Lewis Т. S., Shapiro P. S., Ahn N. G. (1998) Signal transduction through MAP kinase cascades. Adv. Can. Res., 74, 49-139.
87. Li P. F., Dietz R., von Harsdorf R. (1997) Differential effect of hydrogen peroxide and superoxide anion on apoptosis and proliferation of vascular smooth muscle cells. Circulation, 96, 3602-3609.
88. Li P. F., Dietz R., von Harsdorf R. (1999) p53 regulates mitochondrial membrane potential through reactive oxygen species and induces cytochrome c-y^ independent apoptosis blocked by Bcl-2. The EMBO Journal, 18, 6027-6036.
89. Li F., Mao H. P., Ruchalski K. L., Wang Y. H., Choy W., Schwartz J. H., Borkan S. С (2002) Heat stress prevents mitochondrial injury in ATP-depleted renal epithelial cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol, 283, C917-C926.
90. Li C , Wright M. M., Jackson R. M. (2002) Reactive species mediated «1 injury of human lung epithelial cells after hypoxia-reoxigenation. Exp. Lung Res., 28, 373-389.
91. Li N., Ragheb K., Lawler G., Sturgis J., Rajwa В., Melendez J. P., Robinson J. P. (2003) DPI induces mitochondrial superoxide-mediated apoptosis. Free Radic. Biol. Med, 34, 465-411.
92. Linsinger, G., Wilhelm, S., Wagner, H., and Hacke, G. (1999) Uncouplers of oxidative phosphorylation can enhance a Fas death signal. Molecular Cell Biology, 19,3299-3311.
93. Liu В., Andrieu A. N., Levade Т., Zhang P., Obeid L. M., Hannun Y. A. (1998) Glutathione regulation of neuronal sphingomyelinase in tumor necrosis factor-alpha-induced cell death. J. Biol. Chem., 273, 11313-11320.
94. Liu Y., Peterson D. A., Kimura H., Schubert D. (1997) Mechanism of cellular 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction. J. Neurochem., 69, 581-593.
95. Lundberg A. S., Hahn W. C , Gupta P., Weinberg R. A. (2000) Genes hjr involved in senescence and immortalization. Curr. Opin. Cell Biol., 12, 705-709.
96. Madesh, M., and Hajnoczky, G. (2001) VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome с release, y. Cell Biol, 155, 1003-1016.
97. Marchetti P., Decaudin D., Macho A., Zamzami N., Hirch Т., Susin S., Щ Kroemer G. (1997) Redox regulation of apoptosis: impact of thiol oxidation status on mitochondrial function. Eur. J. Immun., 27, 289-296.
98. Marchetti P., Susin S. A., Decaudin D., Gamen S., Castedo M., Hirsch Т., Zamzami N., Navai J., Senik A., Kroemer G. (1996) Apoptosis-associated derangement of mitochondrial function in cells lacking mitochondrial DNA. Cancer Research., 56, 2033-2038.
99. McClintock D. S., Santore M. Т., Lee V. Y., Brunelle J., Budinger G. R., Zong W. X., Thompson C. В., Hay N., Chandel N. S. (2002) Mol. Cell. Biol, 12, 94-104.
100. McPherson B. C , Yao Z. (2001) Signal transduction of opioid-induced cardioprotection in ischemia-reperfusion. Anesthesiology, 94, 1082-1088.
101. Mignotte В., Vayssiere J.-L. (1998) Mitochondria and apoptosis. Eur. J Biochem, 252, 1-15.
102. Mikhailov V., Mikhailova M., Pulkrabek D. J., Dong Z., Venkatachalam M. A., Sailumar P. (2001) Bcl-2 prevents Bax oligomeization in the mitochondrial outer membrane. J. Biol. Chem., lib, 18361-18374.
103. Mikhailov V., Mikhailova M., Degenhardt K., Venkatachalam A., White E., Saikumar P. (2003) Association of Bax and Bak Homo-oligomers in Mitochondria. J. Biol. Chem., IIH, 5367-5376.
104. Minamikawa Т., Sriratana A., "Williams D. A., Bowser D. N., Hill J. S., Nagley P. (1999) Chloromethyl-X-rosamine (MitoTracker Red) photosensitizes mitochondria and induce apoptosis in intact human cells. J. Cell Sci., 112, 2419-2430.
105. Miwa S., St-Pierre J., Partridge L., Brand M. D. (2003) Superoxide and hydrogen peroxide production by Drosophila mitochondria. Free Radic. Biol. Med, 35, 938-948.
106. Moan J., Berg K. (1991) Photochemotherapy of cancer: experimental research. Photochem. PhotobioL, 53. 549-553.
107. Moor A. С E. (2000) Signalling pathways in cell death and survival after photodymanic therapy. J. Photochem. PhotobioL, B57, 1-13.
108. Mosser D. D., Caron A. W., Bourget L., Denis-Larose C , Massie B. (1997) Role of the human heat shock protein hsp70 in protection against stress-induced apoptosis. Mol. Cell. Biol, 17, 5317-5327.
109. Murphy T. H., De Long M. J., Coyle J. T. (1991) Enhanced NAD(P)H: quinine reductase activity prevents glutamate toxicity produced by oxidative stress. J. Neurochem., 56, 990-995.
110. Murphy K. M., Streips U. N., Lock R. B. (2000) Bcl-2 inhibits a Fas- induced conformational change in the Bax N terminus and Bax mitochondrial translocation. J. Biol. Chem., 215, 17225-17228.
111. Nedergaard J., Golozoubova V., Matthias A., Asadi A., Jacobsson A., Cannon B. (2001) UCPl; the only protein able to mediate adaptive non-shivering thermogenesis and metabolic inefficiency. Biochim. Biophys. Acta, 1504, 82-106.
112. Novgorodov S. A., Gudz T. I., Mohr Yu., Goncharenko E. N. Yaguzhinski 1.. S. (1989) ATP-synthase complex: the mechanism of control of ion fluxes induced by cumene hydroperoxide in mitochondria. FEBS Lett., 247, 255-258.
113. Nylandsted J., Rohde K., Bastholm L., Elling F., Jaatela M. (2000) Inhibition of Hsp70 synthesis activates a novel caspase-independent and Bcl-2 resistant death pathway in breast cancer cells. PNAS, 97, 7871-7876.
114. Oda Т., Sadakata N., Komatsu N., Muramatsu T. (1999) Specific efflux of glutathione from the basolateral membrane domain in polarized MDCK cells during ricin-induced apoptosis. J. Biochem. (Tokyo), 126, 715.
115. Oleinick N. L., Evans H. H. (1998) The photobiology of photodynamic therapy: cellular targets and mechanisms. Radiat. Res., 150, 146-156.
116. Oleinick N. L., Morris R. L., Belichenko I. (2002) The role of apoptosis in response to photodynamic therapy: what, where, why, and how. Photochem. Photobiol. Sci., 1, 1-21.
117. Ott M., Robertson J. D., Gogvadze V., Zhivotovsky В., Orrenius S. (2002) Cytochrome с release from mitochondria proceeds by a two-step process. PNAS, 99, 1259-1263.
118. Owuor E. D., Kong A.-N. T. (2002) Antioxidants and oxidants regulated signal transduction pathways. Biochem. Pharmac, 64, 765-770.
119. Pap E. H., Drummen G. P., Winter V. J., Kooij T. W., Rijken P., Wirtz K. W., Op den Kamp J. A., Hage W. J., Post J. A. (1999) Ratio-fluorescence microscopy of lipid oxidation in living cells using Cll-BODIPY (581/591). FEBS 1.ett., 453, 278-282.
120. Parthasarathi K., Ichimura H., Quadri S., Issekutz A., Bhattacharya J. (2002) Mitochondrial Reactive Oxygen Species Regulate Spatial Profle of Proinflammatory Responses in Lung Venular Capillaries. J. Immunol, 169, 7078-7-86.
121. Pastorino, J.G., Simbula, G., Yamamoto, K., Glascott, P.A., Rothman, R.J., and Farber, J. (1996) The cytotoxicity of tumor necrosis factor depends on induction of the mitohondrial permeability transition. J. Biol. Chem., 271, 29792-29798.
122. Paul K., Bauer G. (2001) Promyelocytic HL60 cells induce apoptosis specifically in transformed cells: involvement of myeloperoxidase, nitric oxide and target cell-derived superoxide anions. Anticancer Research, 21, 3237-3246.
123. Peachman K. K., Lyles D. S., Bass D. A. (2001) Mitochondria in eosinophils: functional role in apoptosis but not respiration. PNAS, 98, 1717-1722.
124. Pereverzev M. O., Vygodina T. V., Konstantinov A. A., Skulachev V. P. (2003) Cytochrome c, an ideal antioxidant. Biochem. Soc. Trans., 31, 1312-1315.
125. Perez D., White E. (2000) TNF-a Signals Apoptosis through a Bid- Depeandent Conformational Change in Bax that is Inhibited by ElB 19K. Mol. Cell, 6, 53-63.
126. Pinton P., Ferrari D., Rapizzi E., Magalhaes P., Schulze-Osthoff K., Di Virgillio F., Pozzan Т., Rizzuto R. (2000) A role for calcium in Bcl-2 action? J. Cell Biol., 148,^57-^62.
127. Proskuryakov S. Y., Konoplyannikov A. G., Gabai V. L. (2003) Necrosis: a specific form of programmed cell death? Exp. Cell Res., 283, 1-16.
128. Raff M. (1998) Cell suicide for beginners. Nature, 396, 119-122.
129. Raha S., Robinson B. H. (2000) Mitochondria, oxygen free radicals, disease and ageing. Trends in Biochem. ScL, 25, 502-508.
130. Ramsay R., Singer T. P. (1992) Relation of superoxide generation and lipid peroxidation to the inhibition of NADH-Q oxydoreductase by rotenone, piericidin ^ A, and MPP^. Biochem. Biophys Res Com, 189, 47-52.
131. Rizzuto R., Pinton P., Ferrari D., Chami M., Szabadkai G., Magalhaes P. J., Di Virginio F., Pozzan T. (2003) Calcuim and apoptosis: facts and hypotheses. Oncogene, 22, 8619-8627.
132. Robinson B. H. (1996) Use of fibroblast and lymphoblast cultures for detection of respiratory chain defects. Methods Enzymol., 264, 454-464.
133. Ruiz-Ruiz C , Robledo G., Font J., Izquierdo M., Lopez-Rivas A. (1999) Protein Kinase С inhibits CD95 (Fas/APO-l)-mediated apoptosis by at least two different mechanisms in Jurkat T cells. J. Immunol, 163, 4737-4746.
134. Ruiz-Steward L, Tiyyagura S. R., Lin J. E., Kazerounian S., Pitari G. M., Schulz S., Martin E., Murad F., Waldman S. A. (2004) Guanyl cyclase is an ATP sensor coupling nitric oxide signaling to cell metabolism. PNAS, 101, 37-42.
135. Saikumar P., Dong Z., Patel Y., Hall K., Hopfer U., Weinberg J. M., Venkatachalam M. A. (1998) Role of hypoxia-induced Bax translocation and cytochrome с release in reoxigenation injury. Oncogene, 17, 3401-3415.
136. Sakharov D. V., Bunschoten A., van Weelden H., Wirtz K. W. A. (2003) Photodynamic treatment and H202-induced stress result in different patterns of cellular protein oxidation. Eur. J. Biochem., 270, 4859-4865.
137. Sambandam N., Lopaschuk G. D. (2003) AMP-activated protein kinase (AMPK) control of fatty and glucose metabolism in the ischemic heart. Prog. 1.ipid Res., 42, 23S-256.
138. Saran M., Bors W. (1994) Signalling by Ог'' and NO: how far can either radical, or any specific reaction product, transmit a message under in vivo conditions? Chemico-biological interactions, 90, 35-45.
139. Scorrano L., Ashiya M., Buttle K., Weiler S., Oakes S. A., Mannelle C. A., Korsmeyer S. J.(2002) A distinct pathway remodels mitochondrial cristae and ,% mobilizes cytochrome с during apoptosis. Dev. Cell, 2, 55-67.
140. Semenza G. L. (2003) Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) activates the transcription of genes that are involved in crucial aspests of cancer biology, including angiogenesis, cell survival, glucose metabolism. Nature Review. Cancer, 3,721-732.
141. Shi Z. Z., Osei-Frimpong J., Kala G., Kala S. V., Barrios R. J., Habib G. M., Lukin D. J., Danney С M., Matzuk M. M., Lieberman M. W. (2000) Glutathione synthesis is essential for mouse development but not for cell growth in culture. PNAS, 97, 5101.
142. Shoffner J. M., Wallance D. С (1995) Oxidative phosphorylation diseases. In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease (7 edition)(Scriver С R., Beaudet A. L., Sly W. S., Valle D.), pp. 1535-1629. McGraw Hill.
143. Sidoti-de Fraisse С , Rincheval V., Rister Y., Mignotte В., Vayssiere J.-L. (1998) TNF-alpha activates at least two apoptotic signalling cacades. Oncogene, 17,1639-1651.
144. Single В., Leist M., Nicotera P. (2001) Differential Effects of Bcl-2 on Cell Death Triggered under ATP-Depleted Conditions. Exp. Cell Res., 262, 8-18.
145. Skulachev V. P. (2000) Mitochondria in the programmed death phenomena; a principle of biology:"It is better to die than to be wrong". lUBMMLife, 49, 365-373.
146. Skulachev V. P. (2001) Mitochondrial filaments and clusters as intracellular power-transmitting cables. Trends Biochem Sci, 26, 23-29.
147. Skulachev V. P. (2002) Programmed death phenomena: from organelle to organism. Ann. N. Y. Acad. Sci., 959, 214-237.
148. Sobolev A. S., Jans D. A., Rozenkranz A. A. (2000) Targeted intracellular delivery of photosensitizers. Prog. Biophys. Mot. Biol., 73, 51-90.
149. Starkov A. A., Fiskum G. (2001) Myxothiazol induces H2O2 production from mitochondrial respiratory chain. Biochem. Biophys Res. Com. 281, 645-650.
150. Sugano, N., Ito, K., and Murai, S. (1999) Cyclosporin A inhibits H2O2- induced apoptosis of human fibroblasts. FEBS Lett., 441, 274-276.
151. Suh Y-A., Arnold R. S., Lassegue В., Shi J., Xu X., Sorescu D., Chung A. В., Griendling K. K., Lambeth J. D. (1999) Cell transformation by the superoxide-generating oxidase Mox-1. Nature, 401, 79-82.
152. Susin S. A., Lorenzo H. K., Zamzami N., Marzo I., Brenner C , Larochette N., Prevost M. C , Alzari P. M., Kroemer G. (1999) Mitochondrial release of caspase-2 and -9 during the apoptotic process J. Exp. Med., 189, 381-394.
153. Tanito М., Nishiyama A., Tanaka Т., Masutani H., Nakamura H,, yodoi J., Ohira A. (2002) Change of redox status and modification by thiol replenishment in retinal photooxidative damage. Investig. Ophtalmol. Vis. Sci., 43, 2392-2400.
154. Taylor S. W., Fahy E., Murray J. (2003) Oxidative Post-translational modification of Tryptophan Residues in Cardiac Mitochondrial Proteins. J. Biol. Chem., lis, 19587-19590.
155. Therade-Matharan S., Laemmel E., Duranteau J., Vicaut E. (2004) Reoxigenation after hupoxia and glucose depletion causes reactive oxygen species production by mitochondria in HUVEC. Am. J. Regul. Integr. Сотр. Physiol., 287, 1037-1043.
156. Tokunaga C , Yoshino K.-i., Yonezawa K. (2004) mTOR integrates amino acid- and energy-sensing pathways. Biochem. Biophys. Res. Commun., 313, 443-446.
157. Tome M. E., Baker A. F., Powis G., Payne С M., Briehl M. M. (2001) Catalase-overexpressing thymocytes are resistant to glucocorticoid-induced apoptosis and exhibit increased net tumor growth. Cancer Research, 61, 2766.
158. Trunpower B. L. (1990) The protonmotive Q cycle. Energy transduction by coupling of proton translocation to electron transfer by the cytochrome bcl complex. J. Biol. Chem., 265, 11409-11412.
159. Varfolomeev E. E., Ashkenazi A. (2004) Tumor Necrosis Factor: An Apoptotic JuNKie? Cell, 116, A^\-\91.
160. Vazquez-Laslop, N., and Dreyfus, G. (1990) The native mitochondrial Fi - inhibitor protein complex carries out uni- and multisite ATP hydrolysis. J. Biol. Chem.,265, 19002-19006.
161. Voehringer D. W., McConkey D. J., McDonnell T. J., Brisbay S., Meyn R. E. (1998) Bcl-2 expression causes redistribution of glutathione to the nucleus. PNAS, 95, 2956-2960.
162. Wajant H., Pfizenmaier K., Scheurich P. (2003) Tumor necrosis facror signalling. Cell Death Differ., 10, 45-65.
163. Weber Т., Dalen H. (2003) Mitochondria Play a Central Role in Apoptosis Induced by oTocopheryl Succinate an Agent with Antineoplastic Activity: Comparison with Receptor-Mediated Pro-Apoptotic Signaling. Biochemistry, 42, 4277-4291.
164. Wu J., Seregard S., Sprangberg В., Oskarsson M., Chen E. (1999) Light- induced apoptosis in rat retina. Eye, 13, 577-583.
165. Xu G., Kwon G., Cruz W. S., Marshall С A., McDaniel M. L. (2001) Metabolic regulation by leucine of translation initiation through the mTOR-signalling pathway by pancreatic beta-cells. Diabetes, 50, 353-360.
166. Xu K., Thomalley P. J. (2001) Involvement of glutathione metabolism in the cytotoxisity of the phenethyl isothiocyanate and its cysteine conjugate to human leukaemia cells in vitro. Biochem. Pharmacol, 61, 165-177.
167. Yaglom J. A., Ekhterae D., Gabai V. L., Sherman M. Y. (2003) Regulation of Necrosis of H9c2 Myogenic Cells upon Transient Energy Deprivation. J. Biol. С/гет., 278, 50483-50496.
168. Yethon J. A., Epand R. F., Leber В., Epand R. M., Andrews D. A. (2003) Interaction with a Membrane Surface Triggers a Reversible Conformational Changew in Bax Normally Associated with Induction of Apoptosis. J. Biol. С/гет., 278, 48935-48941.
169. Yi X., Yin X. M., Dong Z. (2003) Inhibition of Bid-induced apoptosis by Bcl-2. tBid insertion, Bax translocation, and Bax/Bak oligomerization suppressed. J. Biol. Chem., 278, 16992-16999.
170. Zhang L., Yu J., Park B. H., Kinzler K. W., Vogelstein B. (2000) Role of Bax in the Apoptotic Response to Anticancer Agent. Science, 290, 989-992.
-
Изюмов, Денис Сергеевич
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2005
-
ВАК 03.00.25
- Изучение прооксидантного действия p66shc в клетках человека
- Механизмы защиты клетки при дисфункции митохондрий
- Регуляция свободнорадикальных процессов и апоптоза при окислительном стрессе
- Продукция активных форм кислорода и митохондриальный мембранный потенциал при температурном воздействии в клетках растений и дрожжей
- Роль митохондрий в апоптозе клеток HeLa, индуцированном фактором некроза опухолей и стауроспорином
