Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль митохондрий в апоптозе клеток HeLa, индуцированном фактором некроза опухолей и стауроспорином

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Щепина, Лариса Анатольевна

Оглавление

Список сокращений.

1 Введение.

1.1 Актуальность проблемы.

1. 2 Цель и задачи исследования.

2 Обзор литературы.

2.1 Апоптоз и некроз — два варианта клеточной смерти.

2.2 Молекулярные механизмы апоптоза.

Получение сигнала и его первичная обработка

2.2.1 Получение сигнала через специфические рецепторы

2.2.2 Неспецифическая индукция апоптоза.

2.2.2.1 Окислительный стресс.

Последующая обработка сигнала, клеткой.

2.2.3 Каспазы - основные протеазы, участвующие в апоптозе

2.2.4 Пути передачи сигнала апоптоза.

2.2.4.1 Адаптерные молекулы, ассоциированные с Fas- и TNFрецепторами.

2.2.5 Другие ферменты, участвующие в регуляции апоптоза.

2.2.5.1 Тирозиновые киназы.

2.2.5.2 Стресс-киназы.

2.2.5.3 Участие белка р53 в апоптозе.

Конечная стадия апоптоза

2.2.6 Ядерные изменения. Нуклеазы.

2.2.7 Деградация ДНК при апоптозе.

2.2.8 Плазматическая мембрана.

2.3 Регуляция апоптоза.

2.3.1 Семейство генов bcl-2 и клеточная смерть.

2.3.2 Семейство белков Вс1-2. Структура Bel-2-подобных белков.

2.3.3 Биологические эффекты, оказываемые Вс1-2 на клетку

2. 4 Роль биоэнергетических функций митохондрий в апоптозе.

2.4.1 Строение митохондрий.

2.4.2 Митохондрии в апоптозе.

2.4.2.1 Выход цитохрома с

2. 4 . 2. 2 Неселективная пора и трансмембранная разность электрических потенциалов на митохондриальной мембране

2.4.2.3 Роль АТР в протекании апоптоза.

2.4.2.4 Транспорт Са2+.

2. 4.2.5 Активные формы кислорода.

2.4.2.6 Повреждение дыхательной цепи.

3 Материалы и методы.

3. 1 Материалы.

3.1.1 Культуры клеток.

3.1.2 Используемые реагенты.

3.2 Методы.

3.2.1 Приготовление растворов.

3.2.1.1 Приготовление фосфатного буфера.

3.2.1.2 Приготовление раствора трипсина.

3.2.1.3 Приготовление раствора ЭДТА.

3.2.1.4 Приготовление среды Игла, модифицированной Дальбекко

3.2.2 Пересев клеток.

3.2.3 Замораживание культур клеток.

3.2.4 Размораживание клеточных культур.

3.2.5 Подготовка материалов и клеток для экспериментов

3.2.5.1 Подготовка покровных стекол для экспериментов.

3.2.5.2 Пересев клеток для экспериментов.

3.2.5.3 Подсчет клеток в камере Горяева

3.2.6 Определение жизнеспособности клеток.

3.2.7 Окраска клеток трипановым синим.

3.2.8 Окраска клеток Hoechst

3.2.9 Определение продукции АФК

3.2.10 Регистрация дыхания клеток.

3.2.11 Иммунофлуоресцентное окрашивание цитохрома

3.2.12 Регистрация выхода цишохрома с при помощи вестерн-блота.

4 Результаты исследования.

4.1 Изучение действия митохондриальных. ингибиторов переноса электронов, разобщителей и олигомицина на клетки НеЬа.

4.1.1 Клетки карциномы человека линий НеЬа и НеЪа-Вс1-2 имеют высокий уровень дыхания.

4.1.2 Ингибиторы дыхания, разобщители и ингибитор Н+-АТФ-синтазы не вызывают гибели исследуемых клеток

4. 2 Исследование механизмов апоптоза, вызванного стауроспорином.

4.2.1 Апоптоз, индуцированный стауроспорином не подавляется ингибиторами дыхания, разобщителями и олигомицином.

4.2.2 СТС-зависимый апоптоз сопровождается выходом цитохрома с в цитоплазму, митохондриальные ингибиторы не влияют на этот процесс.

4.3 Исследование механизмов апоптоза, вызвнного фактором некроза опухолей.

4.3.1 Апоптоз, вызванный гТОТ не подавляется ингибиторами дыхания и разобщителями, но предотвращается ингибитором митохондриальной АТР-синтазы олигомицином.

4.3.2 Возможные механизмы действия олигомицина.

5 Обсуждение результатов

6 Выводы

Благодарности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль митохондрий в апоптозе клеток HeLa, индуцированном фактором некроза опухолей и стауроспорином"

1.1 Актуальность проблемы

В процессе эволюции у клеток различных живых организмов сформировались механизмы самоуничтожения - механизмы программируемой клеточной смерти (ПКС). Эти механизмы контролируются на генетическом уровне и инициируются как внутренними, так и внешними факторами. Одной из форм ПКС является апоптоз. Многие важные процессы, связанные с образованием органов и тканей, с исчезновением ненужных структур, с удалением потенциально опасных клеток реализуются посредством апоптоза (Jacobson et al., 1997).

ПКС участвует в защите многоклеточного организма выражающейся в элиминации отдельных клеток при заражении патогеном или при возникновении различных нарушений. Апоптоз сопровождает организм в течение всей его жизни, наряду с такими процессами, как пролиферация и дифференцировка.

Исследования в области программированной клеточной смерти имеют важное прикладное значение, связанное лечением многих заболеваний (гематологических, опухолевых, аутоиммунных, инфекционных, нейродегенеративных), а также с проблемой старения многоклеточных организмов (Скулачев, 1997; Хейфлик, 1997).

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Щепина, Лариса Анатольевна

6 Выводы

1. Митохондриальные ингибиторы (ротенон, антимицин А, миксотиазол), протонофорные разобщители (ХКФ, ДНФ) и ингибитор Н+-АТР-синтазы олигомицин не вызывают апоптоза клеток НеЬа, а в условиях блокирования гликолиза вызывают некротическую гибель этих клеток.

2. Ингибиторы электронтранспортной цепи и разобщители окислительного фосфорилирования не влияют на апоптоз и выход цитохрома с из межмембранного пространства митохондрий в цитозоль клетки, вызванные стауроспорином и фактором некроза опухолей. Эти результаты позволяют исключить механизм выхода цитохрома, основанный на гиперполяризации митохондрий в описанной клеточной модели.

3. Экспрессия онкобелка Вс1-2 предотвращает апоптозную гибель клеток НеЬа и выход цитохрома с из митохондрий под действием стауроспорина и гЮТ. Митохондриальные ингибиторы не препятствуют защитному действию белка Вс1-2.

4. Олигомицин ингибирует апоптоз и выход цитохрома с, вызванные фактором некроза опухолей, но не стауроспорином. Действие олигомицина не связано с подавлением активности АТР-синтазы и изменением мембранного потенциала. Селективный ингибитор митохондриальной поры циклоспорин А в комбинации с трифторпиразином действует аналогично олигомицину, что указывает на участие поры в апоптозе, индуцированном гТ№. По-видимому,

101

Благодарности

Выражаю благодарность моим научным руководителям профессору Самуилову Виталию Дмитриевичу и в.н.с. Черняку Борису Викторовичу. Особую благодарность выражаю с.н.с. отдела математических методов в биологии НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ Плетюшкиной Ольге Юрьевне. Большое спасибо всем сотрудникам отделов биоэнергетики и математических методов в биологии НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ и моим друзьям, которые помогали мне в осуществлении и написании данной работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Щепина, Лариса Анатольевна, Москва

1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. В 3 томах. М.: Мир, под редакцией Ченцова Ю.С., 1994.

2. Белки и пептиды: В 2 томах. М.: Наука, под редакцией Иванова В.Т и ЛипкинаВ.М, 1995.

3. Новиков B.C., Булавин Д.В., Цыган В.Н. Программированная клеточная гибель. Спб: Наука, под редакцией Новикова B.C., 1996.

4. Самуилов В.Д. Биохимия программируемуей клеточной смерти (апоптоза) у животных. Соросовский образовательный журнал, 2001, 7(10), 18-25.

5. Самуилов В.Д., Олескин A.B. Технологическая биоэнергетика. М.: Издательство МГУ, 1994.

6. Самуилов В.Д., Олескин A.B., Лагунова Е.М. Программируемая клеточная смерть. Биохимия, 2000, 65, 1029-1046.

7. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. М.: Наука, 1989.

8. Скулачев В.П. Старение организма особая биологическая функция, а не результат поломки сложной живой системы: биохимическое обоснование гипотезы Вейсмана. Биохимия, 1997, 62, 1394-1399.

9. Струве М.Е., Ченцов Ю.С. Действие циклогексимида на ультраструктуру и некоторые метаболические процессы клеток культуры СПЭВ. Цитология и генетика, 1977, 11(5), 409-418.

10. Ю.Хейфлик Л. Смертность и бессмертие на клеточном уровне. Биохимия, 1997, 62, 1380-1393.

11. П.Эллиот В., Эллиот Д. Биохимия и молекулярная биология. М.: Издательство НИИ Биомедицинской химии РАМН, 1999.

12. Ярилин А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах. Иммунология, 1996, 6, 10-23.

13. Alessenko, A.V., Boikov, P.Ya., and Filippova, G.N. Mechanisms of cycloheximide-induced apoptosis in liver cells. FEBS Lett., 1997, 416(1), 113116.

14. Alessenko A.V., Boikov, P.Ia., Drobot, L.B., Rusakov, S.A., and Filippova, G.N. Change in the level of sphingosine in rat liver nuclei and cells during oncogene superexpression induced by cycloheximide. Biokhimiia, 1994, 59(7), 1076-1087.

15. Baker, S.J. and Reddy, E.P. Modulation of life and death by the TNF receptor superfamily. Oncogene, 1998, 17, 3261-3270.

16. Barkett, M., and Gilmore, T.D. Control of apoptosis by Rel/NF-kappa В transcription factors. Oncogene, 1999 18, 6910-6924.

17. Blom, W.M., de Bont, H.J., Meijerman, I., Mulder, G.J., and Nagelkerke, J.F. Prevention of cycloheximide-induced apoptosis in hepatocytes by adenosine and by caspase inhibitors. Biochem Pharmacol., 1999, 58(12), 1891-1898.

18. Boise, L.H., Gonzalez-Garcia, M., Postema, C.E., Ding, L., Lindsten, T., Turka, L.A., Mao, X., Nunez, G., and Thompson, C.B. Bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death. Cell, 1993, 74, 597608.

19. Budihardjo, I., Oliver, H., Lutter, M., Luo, X., and Wang, X. Biochemical pathways of caspase activation during apoptosis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 1999, 15, 269-290.

20. Chai, F., and Truong-Tran, A. Q. Regulation of caspase activation and apoptosis by cellular zinc fluxes and zinc deprivation: A review. Immunol. Cell Biol. 1999, 77, 272-278.

21. Chernyak, B.V. Cyclosporine A-sensitive release of Ca2+ from mitochondria in intact thymocytes. FEBS Lett., 1997, 418, 131-134.

22. Chang, H.Y., and Yang, X. Proteases for cell suicide: functions and regulation of caspases. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2000, 64(4), 821846.

23. Clement, M. V., Ponton, A., and Pervaiz, S. Apoptosis induced by hydrogen peroxide is mediated by decreased superoxide anion concentration and reduction of intracellular milieu. FEBS Lett., 1998, 440, 13-18.

24. Crouch, S., Kozlowski, R., Slater, K., and Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of proliflration and cytotoxicity. J. Immunol. Methods, 1993, 160, 81-88.

25. Cryns, V.L., and Yuan, J. Proteases to die for. Genes and Development, 1998, 12, 1551-1570.

26. Denizot, F., and Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J. Immunol. Methods, 1986, 22, 89(2), 271-277.

27. Eguchi, Y., Shimizu, S., and Tsujimoto, Y. Intracellular ATP levels determine cell death fate by apoptosis or necrosis. Cancer reasearch, 1997, 57, 1835-1840.

28. Eizenberg, O., Faber-Elman, A., Gottlieb, E., Oren, M., Rotter, V., and Schwartz, M. Direct involvement of p53 in programmed cell death of oligodendrocytes. The EMBO Journal, 1995, 14(6), 1136-1144.

29. Ellis, R.E., Yuan, J.Y., and Horvitz, H.R. Mechanisms and functions of cell death. Annu. Rev. Cell Biol., 1991, 7, 663-698.

30. Ellis, R.E., Jacobson, D.M., and Horvitz, H.R. Genes required for the engulfment of cell corpses during programmed cell death in Caenorhabditis elegans. Genetics, 1991, 129, 79-94.

31. Enari, M., Sakahira, H., Yokoyama, H., Okama, K., Iwamatsu, A., and Nagata, S. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature, 1998, 391(6662), 43-50.

32. Evan, G., and Littlewood, T. A matter of life and cell death. Science, 1998, 281, 1317-1322.

33. Farber, J.L. Mechanisms of Cell Injury by Activated Oxygen Species. Enviromental Health Perspectives, 1994, 102(10), 17-24.

34. Fujita, H., Morita, I., and Murota, S. A possible involvement of ion transporter in tumor necrosis factor alpha and cycloheximide-induced apoptosis of endothelial cells. Mediators Inflamm., 1999, 8(4-5), 211-218.

35. Gao, W., Pu, Y., Luo, K.Q., and Chang, D.C. Temporal relationship between cytochrom c release and mitochondrial swelling during UV-induced apoptosis in living HeLa cells. Jourmal of Cell Science, 2001, 114(15), 2855-2862.

36. Gibson, L., Holmgreen, S.P., Huang, D.C., Bernard, O., Copeland, N.G., Jenkins, N.A., Sutherland, G.R., Baker, E., Adams, J.M., and Cory, S. bcl-w, a novel member of the bcl-2 family, promotes cell survival. Oncogene, 1996, 13, 665-675.

37. Goldstein, J.C., Waterhouse, N.J., Juin, P., Evan, G.I., and Green, D.R. The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant. Nat. Cell Biol., 2000, 2(3), 156-162.

38. Gonzalez, R.J., and Tarloff, J.B. Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity. Toxicol. In Vitro, 2001, 15(3), 257259.

39. Green, D.R. Apoptotic pathways: the roads to ruin. Cell, 1998, 94, 695-698.

40. Green, D.R., and Reed, J.C. Mitochondria and apoptosis. Science, 1998, 281(5381), 1309-1312.

41. Hale, A.J., Smith, C.A., Sutherland, L.C., Stoneman, V.E.A., Longhthorne, V.L., Culhane, A.C., and Williams, G.T. Apoptosis: molecular regulation of cell death. The European Journal of Biochemistry, 1996, 236, 1-26.

42. Hansen, M. B., Nielsen, S.E., and Berg, K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J. Immunol. Methods, 1989, 12, 119(2), 203-10.

43. Hippeli, S., and Elstner, E. F. Transition metal ion-catalyzed oxygen activation during pathogenic processes. FEBS Lett., 1999, 443, 1-7.

44. Hirsch, T., Marchetti, P., and Susin, S. A. The apoptosis-necrosis paradox. Oncogene, 1997, 15, 1573-1581.

45. Hirsch, T., Marzo, I., and Kroemer G. Role of the mitochondrial permeability transition pore in apoptosis. Biosc. Rep. 1997, 17, 225-231.

46. Isobe, I., Yanagisawa, K., and Michikawa, M. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) causes Akt phosphorylation and morphological changes in intracellular organellae in cultured rat. J. Neurochem, 2001,77(1), 274-80.

47. Jabs, T. Reactive oxygen intermediates as mediators of programmed cell death in plants and animals. Biochemical Pharmacology, 1999, 57, 231-245.

48. Jacobson, M.D., Weil, M., and Raff, M.C. Programmed cell death in animal development. Cell, 1997, 88, 347-354.

49. Kerr, J.F.R., Wyllie, A.H., and Currie, A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer, 1972, 26, 239-257.

50. Kim, D.H., Hong, H.N., Lee, J.H., and Park, H.S. Okadaic acid induces cycloheximide and caspase sensitive apoptosis in immature neurones. Mol. Cells, 2000, 10(1), 83-89.

51. Kroemer, G. The proto-oncogene Bcl-2 and its role in regulating apoptosis. Nature medicine, 1997, 3(6) 614-620.

52. Laemmli , U.K. Cleavage of structural proteins during the asembling of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, 227, 680-685.

53. Lewis, R. Apoptosis activity: cell death establishes itself as a lively research field. Scientist, 1995, 9(3), 15.

54. Leist, M., Single, B., Castoldi, A.F., Kuhnle, S., and Nicotera, P. Intracellular adenosine triphosphate (ATP) concentration: a switch in the decision between apoptosis and necrosis. J Exp Med., 1997, 185(8), 1481-1486.

55. Li, P., Nijhawan D., Budihardjo I. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-l/Caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell, 1997,91,479-489.

56. Linsinger, G., Wilhelm, S., Wagner, H., and Hacke, G. Uncouplers of oxidative phosphorylation can enhance a Fas death signal. Molecular Cell Biology, 1999, 19(5), 3299-3311.

57. Liu, Y., Peterson, D.A., Kimura, H., and Schubert, D. Mechanism of cellular 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction. J Neurochem., 1997, 69(2), 581-593.

58. Liu, X., Zou, H., Slaughter, C., and Wang, X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis. Cell, 1997, 89, 175-184.

59. Lockshin, R., Osborne, B., and Zakeri, Z. Cell death in the third millennium. Cell Death Differ., 2000, 7, 2-7.

60. Madesh, M., and Hajnoczky, G. VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. Journal of Cell Biology, 2001, 155(6), 1003-1016.

61. Marchetti, P., Decaudin, D., Macho, A., Zamzami, N.O., Hirsch, T., Susin, S.A., and Kroemer, G. Redox regulation of apoptosis: impact of thiol oxidation status on mitochondrial function. The European Journal of Immunology, 1997, 27, 289-296.

62. Martin, S.J., Green, D.R., and Cotter, T.G. Dicing with death: dissecting the components of the apoptosis machinestry. Elsevier Science Publishers, 1994, 26-30.

63. Maruoka, Y., Harada, H., Mitsuyasu, T., Seta, Y., Kurokawa, H., Kajiyama, M., and Toyoshima, K. Keratinocytes become terminally differentiated in a process involving programmed cell death. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997, 238, 886-890.

64. Miyashita, T., and Reed, J.C. Bcl-2 Oncoprotein blocks chemeotherapy-induced apoptosis in a human leukemia cell line. Blood, 1993, 81(1), 151-157.

65. Miquel, K., Pradines, A., Favre, G. Farnesol and geranylgeraniol induce actin cytoskeleton disorganization and apoptosis in A549 lung adenocarcinoma cells. Biochem. and Biophys. Res. Commun., 1996, 225, 869-876.

66. Miyashita, T., and Reed, J.C. Retardation of chemical hypoxia-induced necrotic cell death by Bcl-2 and ICE inhibitors: possible involvement of common mediators in apoptotic and necrotic signal transduction. Oncogene, 1996, 12, 2045-2050.

67. Miyashita, T., and Reed, J.C. Bcl-2 oncoprotein blocks chemeotherapy-induced apoptosis in a human leukemia cell line. Blood, 1993, 81(1), 151-157.

68. Nicotera, P., and Leist, M. Intracellular ATP, a switch in the decision between apoptosis and necrosis. Toxicology Lett., 1998, 102-103, 139-142.

69. Pervaiz, S., Ramalingam, J. K., Hirpara, J., and Clement, M. Superoxide inhibits drug-induced tumor cell death. FEBS Lett., 1999, 459, 343-348.

70. Raff, M.C. Cell suicide for beginners. Nature, 1998, 396, 119-122.

71. Rathmell, J.C., and Thompson, C.B. The central effectors of cell death in the immune system. Annual Review of Immunology, 1999, 17, 781-828.

72. Reed, J.C. Double identity for proteins of the Bcl-2 femily. Nature, 1997, 387, 773-776.

73. Richter, C. Prooxidants and mitochondrial Ca2+: their relationship to apoptosis and oncogenesis. FEBS Lett., 1993, 325, 5-10.

74. Richter, C., Schweizer, M., Cossarizza, A., and Franceschi, C. Control of apoptosis by the cellular ATP level. FEBS Lett., 1996, 378, 107-110.

75. Rosse T. et al. Bcl-2 prolongs cell survival after Bax-induced release of cytochrome c. Nature, 1998, 391, 496-499.

76. Rowan, S., and Fisher D.E. Mechanisms of apoptotic cell death. Leukemia, 1997, 11,457-465.

77. Schwarts, L.M., Smith, S.W., and Jones, M.E. Do all programmed cell deaths occur via apoptosis? Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 980-984.

78. Sidoti-de Fraisse, C., Rincheval, V., Risler, Y., Mignotte, B., and Vayssiere, J.-L. NF-alpha activates at least two apoptotic signaling cascades. Oncogene, 1998, 17, 1639-1651.

79. Siegel, R.M., Martin, D.A., Zheng, L., Ng, S.Y., Bertin, J., Cohen, J., and Lenardo, M.J. Death-effector filaments: novel cytoplasmic structures that recruit caspases and trigger apoptosis. The Journal of Cell Biology, 1998, 141, 1243-1253.

80. Song, Q., Wei, T., Lees-Miller, S., Alnemri, E., Waiters, D., and Lavin, M.F. Resistance of actin to cleavage during apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 157-162.

81. Studzinski, G.P. Apoptosis. A practical Approach. Oxford University Press,1999.

82. Sugano, N., Ito, K., and Murai, S. Cyclosporin A inhibits H202-induced apoptosis of human fibroblasts. FEBS Lett., 1999,447, 274-276.

83. Sundberg, S. Hidh-throughput and ultra-high-throughput screening: solution-and cell-based approaches. Curr. Opin. Biotehnol., 2000, 11, 47-53.

84. Tafani, M., Minchenko, D.A., Serroni, A., and Farber, J.L. Induction of the mitochondrial permeability transition mediates the killing of HeLa cells by staurosporine. Cancer Research, 2001, 61, 2459-2466.

85. Tatton, W.G., Olanow, C.W. Apoptosis in neurodegenerative diseases: the role of mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 1999, 1410, 195-213.

86. Thompson, C.B. Apoptosis in pathogenesis and treatment of disease. Science, 1995,267, 1456-1462.

87. Thornbery, N.A., and Lazebnik, Y. Caspases: enemies within. Science, 1998, 281, 1312-1316.

88. Tsujimoto, Y., and Shimizu, S. Bcl-2 family: Life-or-death switch. FEBS Lett., 2000, 466, 6-10.

89. Vander Heiden, M.G., Chandel, N.S, Williamson, E.K., Schumacker, P.T., and Thompson, C.B. Bcl-XL regulates the membrane potential and volume homeostasis of mitochondria. Cell, 1997, 91(5), 627-637.

90. Vaux, D.L. CED-4 the third horseman of apoptosis. Cell, 1997, 90, 389-390.

91. Vazquez-Laslop, N., and Dreyfus, G. The native mitochondrial Fj inhibitor protein complex carries out uni- and multisite ATP hydrolysis. The Journal of Biological Chemistry, 1990, 265(31), 19002-19006.

92. Wallach, D., Boldin, M., Varfolomeev, E., Beyaert, R., Vandenabeele, P., and Fiers, W. Cell death induction by receptors of the TNF family: towards a molecular understanding. FEBS Lett., 1997, 410, 96-106.

93. White, K., Grether, M.E., Abrams, J.M., Young, L., Farrell, K., and Steller, H. Genetic control of programmed cell death in Drosophila. Science, 1994, 264, 677-683.

94. Williams, G.T. Programmed cell death: apoptosis and oncogenesis. Cell, 1991, 65, 1097-1098.

95. Wolvetang, E.J., Johnson, K., Krauer, K., and Ralph, S. Mitochondrial respiratory chain inhibitors induce apoptosis. FEBS Lett., 1994, 339, 40-44.

96. Wodnicka, M., Guarino, R., Hemperly, J., and Timmins, M. Novel fluorescent technology platform for high throughput cytotoxicity and proliferation assays. J. Biomol. Screening, 2000, 5, 141-152.

97. Yang, E., and Korsmeyer, S.J. Molecular thanatopsis: a discourse on the Bcl-2 family and cell death. Blood, 1996, 88(2), 386-401.

98. Zhivotovsky, B., Burgess, D.H., Schlegel, J., Porn, I., Vanags, D., and Orrenius, S. Proteases in Fas-mediated apoptosis. The Jornal of Cellular Biochemistry, 1997, 63, 43-49.

99. Zhivotovsky, B., Orrenius, S., Brustugun, O.T., and Doskeland, S.O. Injected cytochrome c induces apoptosis. Nature, 1998, 391, 449-450.

100. Ziegler, A., Jonason, A.S., Leffell, D.J, Simon, J.A., Sharma, H.W, Kimmelman, J, Remington, L, Jacks, T, and Brash, D.E. Sunburn and p53 in the onset of skin cancer. Nature, 1994, 372, 773-776.

101. Zoratti, M, and Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1241(2), 139-76.

102. Zou, H, Henzel, W.J, Liu, X, Lutschg, A, and Wang, X. Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome independent activation of caspase-3. Cell, 1997, 90, 405-413.