Про- и антиапоптотическое действие нейролипинов на трансформированные и нормальные клетки нервной системы

Андрианова, Екатерина Львовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Про- и антиапоптотическое действие нейролипинов на трансформированные и нормальные клетки нервной системы
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Про- и антиапоптотическое действие нейролипинов на трансформированные и нормальные клетки нервной системы"

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА РАН

На правах рукописи

Андрианова Екатерина Львовна

ПРО- И АНТИАПОПТОТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ НЕЙРОЛИПИНОВ НА НОРМАЛЬНЫЕ И ТРАНСФОРМИРОВАННЫЕ КЛЕТКИ НЕРВНОЙ

СИСТЕМЫ

03.00.04.- биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2009

003491584

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор химических наук Ведущая организация:

Безуглов Владимир Виленович

Сапожников Александр Михайлович

Сергеева Марина Глебовна

Учреждение Российской академии наук институт физиологически активных веществ РАН

Защита состоится «40» февраля 2010 года в 0 о часов на заседании диссертационного совета Д 002.019.01 при Учреждении Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автореферат разослан "23" декабря 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор физ.-мат. наук

В.А.Олейников

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

В основе таких патологических процессов центральной нервной системы, как травмы, ишемические нарушения, нейродегенеративные заболевания, злокачественные новообразования, лежат сложные механизмы межклеточной и внутриклеточной регуляции. Апоптоз является одним из ключевых этапов развития нейропатологии. Так, при нарушении мозгового кровообращения именно за счет запуска апоптотической гибели клеток происходит увеличение зоны повреждения. В случае злокачественных новообразований, нарушение регуляции процессов апоптоза позволяет клеткам неограниченно делиться и приводит в итоге к развитию опухоли. В настоящее время ведется активный поиск соединений, позволяющих предотвращать развитие апоптоза при ишемических и нейродегенеративных заболеваниях. Поэтому в последние годы актуальным стал вопрос о возможности модулирования апоптотических процессов для профилактики и лечения заболеваний, сопровождающихся аномалиями в механизмах регуляции программированной гибели клеток.

Эндогенные соединения или схожие с ними агенты представляются наиболее подходящими кандидатами для создания препаратов против нейропатологических заболеваний, поскольку именно эндогенные соединения могут оказывать дифференцированный эффект в зависимости от типа клеток. В данной работе в качестве подобных соединений рассматривались нейролипины и их синтетические аналоги.

Нейролипины представляют собой семейство эндогенных амидных и эфирных производных жирных кислот, действующих на ключевые белки каннабиноидной и ванилоидной систем. Обе эти системы вовлечены в передачу внутриклеточных сигналов с цитоплазаматической мембраны в ядро, модулирующих физиологическое состояние клеток и влияющих на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз. К нейролипинам, в частности, относят такие эндогенные производные арахидоновой кислоты, как Ы-арахидоноилэтаноламин (анандамид, АА-ЕА), 2-арахидоноилглицерин (2-АС), Ы-арахидоноилглицина (АА-С1у), И-арахидоноилдофамина (АА-ОА).

Нейропатологические процессы существенно затрагивают системы регуляции с участием нейролипинов. Ранее было показано, что некоторые нейролипины, относящиеся к семейству эндоканнабиноидов, способны защищать культуры нейрональных клеток от различных токсических факторов. Агонисты каннабиноидного рецептора (СВШ) подавляют глутаматэргическую нейропередачу, ингибируя выброс глутамата и модулируя ингибиторную функцию ГАМК. К настоящему моменту доказана способность И-арахидоноилэтаноламида (АА-ЕА) и 2-арахидоноилглицерина (2-АС) ингибировать пролиферацию и индуцировать апоптоз в трансформированных клетках различных линий. Однако полученные ранее данные относятся только к наиболее изученным представитялям семейства АА-ЕА и 2-АО или

синтетическим экзоканнабиноидам - аналогам ТНК. При этом механизмы описанных нейропротективного и противоопухолевого эффектов неоднозначны. Исследования последних лет значительно расширили представления о липидных регуляторах в ЦНС, что позволило объединить две группы веществ: эндоканнабиноиды и эндованилоиды, а также их биологически активные метаболиты в семейство нейролипинов. Однако данные о механизмах их действия в норме и при патологии, а также о функциональной активности новых групп нейролипинов, в частности, ацил-дофаминов, крайне скудны. Изучение механизмов действия нейролипинов позволит расширить представление о функционировании соединений семейства в организме.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы было определение влияния нейролипинов на апоптоз в нормальных и трансформированных клетках нервной системы. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Выявление из 4-х групп эфирных и амидных производных жирных кислот соединений, оказывающих токсическое действие на трансформированные клетки нервной ткани;

2. Определение механизмов проапоптотического действия активных соединений;

3. Выявление из группы исследуемых соединений веществ, оказывающих нейропротективное действие на клетки нормальной нервной ткани в различных токсических моделях;

4. Определение механизмов нейропротективного действия активных соединений.

Научная новизна и практическая значимость

Проведенная работа позволила расширить представления о реализации сигнала нейролипинов в клетках нервной системы, как в норме, так и при патологии. В результате проведения скрининга на первичных и трансформированных клетках нервной системы крысы выявлены соединения, обладающие проапоптотическим действием в отношении трансформированных клеток и, напротив, проявляющие антиапоптотичекие свойства в отношении первичных культур. Установлены структурные особенности молекул, необходимые для реализации данных эффектов.

Впервые показано проапоптотическое действие нейролипинов и вновь синтезированных аналогов на культуры глиомы крысы и человека. Определены механизмы токсического действия активных веществ. На моделях нейронального апоптоза и эксайтотоксичности показаны нейропротективные свойства нейролипинов и вновь синтезировнных аналогов, а также механизмы их нейропротективного действия. Выявлено значение межклеточных взаимодействий для реализации нейропротективного стимула нейролипинов.

На основании полученных данных выдвинута гипотеза о пути передачи внутриклеточного сигнала под действием нейролипинов и их синтетических аналогов.

Таким образом, полученные данные могут быть использованы при разработке тактики лечения ряда заболеваний ЦНС, в частности, ишемических повреждений мозга.

Апробации работы

Основные материалы работы были доложены и обсуждены на 5-м Международном Симпозиуме аспирантов EMBL ( Гейдельберг, 2004); на симпозиуме «Современное состояние исследований, диагностики и терапии нейродегенеративных заболеваний» (Москва, 2005); на III Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007); на Конференции «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные результаты и их обсуждение, выводы, список литературы, включающий 198 ссылок. Диссертация содержит 21 рисунок и 8 таблиц.

И. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ1

В рамках данной работы были исследованы четыре группы аналогов нейролипинов:

■ аналоги анандамида (АА-ЕА) - в данную группу вошли наиболее активные каннабиноиды и их производные;

■ аналоги 2-арахидоноилглицерина (2-АО) - ранее были показаны нейропротективные свойства прототипа этой группы, а также увеличение его концентрации в очаге ишемического повреждения мозга человека;

■ аналоги №арахидоноилглицина (АА-Иу) - соединения данной группы не только взаимодействуют СВЯ, но и обладают способностью ингибировать РААН - основной фермент метаболизма нейролипинов;

■ аналоги И-арахидоноилдофамина (АА-БА) - в группу вошли ацилированные производные биогенных амидов; соединения данной группы с высокой аффинностью взаимодействуют как с СВ11, так и с ТИРУ.

На первом этапе работы был проведен скрининг нейролипинов на проапоптотическое и нейропротективное действие. Токсическое действие исследуемых соединений было изучено на клетках глиомы крысы Сб. В клетках данной линии синтезируются СВШ, СВИ2, ТЯРУ1. Кроме того, действие наиболее активных соединений было изучено на клетках глиомы человека Ш51. Для изучения нейропротективных свойств исследуемых соединений были выбраны две модели этапов ишемического повреждения нервной системы: модель глутаматной эксайтотоксичности и модель нейронального апоптоза в гранулярных нейронах мозжечка крысы.

На следующем этапе было проведено изучение механизмов действия наиболее активных соединений в выбранных моделях.

1 Проапоптотическое действие нейролипинов

1.1.Проапоптотическое действие на клетки глиомы крысы С6

Аналоги анандамида (АА-ЕА)

Исследовано действие 6 аналогов АА-ЕА на клетки глиомы крысы Сб. Наиболее эффективным в последней группе оказался АА-СРА, показавший значительный токсический эффект: 17,8% выживших клеток при концентрации 10 мкМ. В концентрации 100 мкМ токсическое действие проявляли И-арахидоноилпиперазин и М-арахидоноилнитроэтаноламин (1,8% и 10,8% от контроля, соответственно).

1 Принятые сокращения: CBR - каннабиноидный рецептор, TRPV - ванилоидный рецептор, АА - арахидоновая кислота, DHA - докозагексаеновая кислота, PI3K - фосфоинозитол-3-киназа, РКА - протеинкиназа А, РКС - протеинкиназа С, СаМКП - кальмодулинзависимая киназа II, ERK - киназа, регулируемая внеклеточными факторами (extracellular-regulated kinase), FAAH - амидогидролаза жирных кислот;

Аналоги 2-арахидоноилглицерина (2-АО

Была протестирована библиотека соединений, полученных путем модификации всех трех составных частей фармакофора эндоканнабиноида 2-арахидоноилглицерина, а именно, изменения жирнокислотного остатка, карбоксильной группы и альфа-углеродного атома жирной кислоты, а также полярной части молекулы (Таблица 1). Всего исследовано 12 соединений. В целом, можно охарактеризовать соединения данной группы как малотоксичные по отношению к клеткам глиомы крысы Сб. Слабовыраженный эффект в достаточно высокой концентрации 100 мкМ не имеет практического значения.

Таблица 1 Токсическое действие аналогов 2-арахидоноилглицерина на клетки глиомы С6

Полное название Короткое название количество живых клеток в % от контроля

1 мкМ 10 мкМ 100 мкМ

2-арахидоноилглицерин 2-AG 106,6±8,2 103,2±7,6 88,4±5,8

О-арахидоноилэтиленгликоль AA-EG 114,7±10, 106,8±9,1 105,2±9,3

О-эйкозапентаеноилэтиленгликоль EPA-EG 106,1 ±4,2 121,3±11,3 н/о

О-докозагексаеноилэтиленгликоль DHA-EG 110,8±5,6 103,6±6,2 116,1±13,3

а,а-диметил-эйкозапентаеноил-0-этиленгликоль DMEPA-EG 95,5±10,2 108,3±9,2 26,3±4,4*

Ы-арахидоноил-у-аминобутирил-О-этиленгликоль AA-GABA-EG 109,3±0,8 92,0±1,6 85,9±4,9

О-арахидоноилнитроэтиленгликоль AA-NEG 106,6±2,8 103,2±9,3 88,4±6,1

а,а-диметил-арахидоноил-0-нитроэтиленгликоль DMA-EG 102,1 ±2,4 103,9±8,5 44,4±4,7*

О-эйкозапентаеноилнитроэтиленгликоль EPA-NEG 102,4±5,1 75,9±2,5 н/о

2-эйкозапентаеноидцинитроглицерин EPA-DNG 95,8±4,1 102,8±9,3 н/о

Эйкозатетаеноилдиметилгидроксипропи лнат ЕТЕ-DMHPA 118,2±8,9 101,6±3,3 8,5±0,8*

Сукцинимидный эфир арахидоновой кислоты AA-o-Su 80,6±5,2 87,1 ±4,6 н/о

н/о-не определяли; * р<0.05

Аналоги Ы-арахидоноилглицина АА-С1у

До настоящего момента не проводилось исследований действия соединений данного класса на трансформированные клетки отмечалось только, что АА-С1у регулирует действие уровня АА-ЕА в клетке как ингибитор РААН. На основе этих данных было сделано предположение, что ацилированные

аминокислоты могут оказывать антипролиферативное действие как ингибиторы РА АН.

Были синтезированы и протестированы на противоопухолевое действие 6 аналогов арахидоноилглицина: ацилированные арахидоновой кислотой глицин, пролин, тирозин, триптофан, финилаланин и у-аминомасляная кислота. Выбор аминокислот был обусловлен их значением для процессов молекулярной регуляции в ЦНС. Исследование токсичности проводилось на клетка глиомы крысы Сб.

Среди соединений данной группы не было выявлено токсичных соединений при использовании концентраций до 100 мкМ. При концентрации исследуемых соединений 1, 10, 100 мкМ количество живых клеток в эксперименте достоверно не отличалось от контроля (р>0,05). В Таблице 2 приведен список аналогов, вошедших в данную группу, а также показатели их токсического действия на клетки глиомы крысы.

Таблица 2 Токсическое действие аналогов И-арахидоноилглицина на клетки

глиомы крысы С6

Номенклатурное название Короткое название количество живых клеток в % от контроля

1 мкМ ЮмкМ 100 мкМ

Ы-арахидоноилглицин АА-Иу 90,2±1,9 96,9±4,3 98,3±11,9

Ы-арахидоноилтирозин АА-Туг н/о 105,1±4,4 84,3±5,1

Л-арахидоношприптофан АА-Тгр н/о 99,6±2,4 92,7±4,6

И-арахилоноилпролии АА-Рго н/о 100,6±0,1 96,7±9,3

К-арахидоноилфенилаланин АА-РИе н/о 103,0±9,2 100,1±3,5

Ы-арахидоноил-у-аминобутират АА-вАВА 93,3±6,1 99,6±3,2 107,0±5,8

н/о - не определяли

Аналоги К-арахидоноилдофамина (АА-РА)

В данной группе были проанализированы свойства 12 соединений -ацилированнх производных биогенных аминов: дофамина, норадреналина, адреналина, серотонина (Таблица 3).

Ряд производных дофамина и серотонина содержали в липофильной части молекулы различные жирные кислоты. Ы-арахидоноилтриптамин и И-арахидоноилметокситриптамин были включены в эту группу как возможные эндогенные предшественники АА-БА и АА-5НТ, соответственно. Ы-арахидоноилванилиламин вошел в группу в качестве вещества сравнения как агонист ванилоидного рецептора.

Практически все производные, содержащие дофамин, оказывали токсическое действие на клетки глиомы С6 в концентрациях до ЮмкМ. Дофаминовые производные докозапентаеновой (С22:5 соЗ) и стеаридоновой (С 18:4 соЗ) кислот не обладали токсическим эффектом. Наиболее активными в

группе оказались АА-ОА и БНА-БА: 8.6% и 11,8% от контроля при концентрации 10 мкМ, соответственно. Диметильная трансформация АА-БА приводила к полной отмене проапоптотического действия.

АА-УАИ и АА-5НТ проявляли токсическое действие, но в более высокой концентрации (100 мкМ): 6,5% и 3,3% от контроля, соответственно. Наиболее активным в ряду серотониновых производных был № арахидоноилметокситриптамин (1,5% в концентрации 100 мкМ).

Таблица 3 Токсическое действие аналогов Ы-арахидоноилдофамина на клетки глиомы крысы С6___

Полное название Короткое название количество живых клеток в % от контроля

1 мкМ ЮмкМ 100 мкМ

N-арахидоноилдофамин (С20:4, соб) AA-DA 74,3±8,0* 8,6±0,9* 3,5±0,7*

N-эйкозапентаеноилдофамин (С20:5, соЗ) EPA-DA 79,6±11,3 14,4±3,2* 11,4±3,4*

N-докозагексаеноиддофамин (С22:6, шЗ) DHA-DA 86,6±7,5 11,8±7,1* 5,8±0,03*

N-a.a-диметиларахидоноилдофамин DMA-DA 102,3±5,1 110,4±9,0 н/о

N-докозапентаеноилдофамин (С22-.5, шЗ) C22:5-DA 112,9±8,2 108,0±4,5 н/о

N-стеаридоноилдофамин (С 18:4, соЗ) C18:4-DA 109,5±4,0 108,0±8,6 н/о

N-олеоилдофамин (С 18:1, to9) OL-DA 98,0±8,8 38,7±3,2* н/о

К-арахидоноил-у-аминобутирил-Ы-дофамин АА-GABA-DA 89,4±0,3 33,75±1,2* 7,5±1,1*

N-арахидоноилтирамин АА-ТА 83,8±11,3 73,9±4,1* 2,7±0,2*

N-арахидоноилнорадреналин AA-NAD 98,3±8,6 56,8±7,4* н/о

N-арахидоноиладреналин AA-AD 101,8±2,6 39,1±1,4* н/о

N-арахидоноилванилиламин AA-VAN 94,0±2,3 106,96±2,3 6,48±0,1*

н/о - не определяли; * р<0.05 Таблица 4 Токсическое действие аналогов Л-арахидоноилсеротонина на клетки глиомы крысы С6

Полное название короткое название количество живых клеток в % от контроля

1мкМ ЮмкМ 100 мкМ

М-арахидоноилсеротонин АА-5НТ 102,2±5,9 54,4±10,2* 3^±0,1*

К-эйкозапентаеноилсеротонин ЕРА-5НТ 91,5±4,07 77,8±7,5 6,5±2,3*

К-линоленоилсеротонин (С 18:3, соЗ ) С18:3-5НТ 91,8±3,7 63,2±1,6* 5,7±1,1*

¡Ч-наноилсерогонин С9-5НТ 82,6±7,4 67,3±3,4* 41,3±3,1*

Ы-арахидоноилметокситриптамин АА-МОТ 89,9±5,2 77,6±3,07 1,5±0,4*

1 р<0.05

Для трех дофаминовых производных: АА-ОА, БНА-БА были получены концентрационные зависимости (Рис.1).

-О—ЛЛ-БА -О-ЩА-БА

концентрация, мкМ

Рис.1 Концентрационная зависимость токсического действия АА-ОА и БНА-ОА на клетки глиомы крысы Сб. Клетки инкубировали с исследуемыми веществами в течение 24 часов. Количество живых клеток анализировали с помощью МТТ-теста.

1.2. Проапототическое действие нейролипинов на клетки глиомы человека 11521

На культуре клеток глиомы человека 11521 было проведено исследование цитотоксической активности соединений, показавших проапоптотический эффект в отношении культуры глиомы крысы Сб.

Изучение свойств нейролипинов на трансформированных клетках человека, безусловно, представляет практический интерес.

На настоящий момент не доказано, что клетки глиомы человека Ш51 экспрессируют гены каннабиноидных или ванилоидных рецепторов. Дофаминовые производные оказывают токсическое действие на клетки этой культуры (Таблица 5).

Таблица 5 Токсическое действие нейролипинов на клетки глиомы человека Ш51

количество живых клеток в % от контроля

2,5 мкМ ЮмкМ 25 мкМ 50 мкМ

АА-Ш 104,5±9,21 86,7±4,31 20,4±2,63* 17,7±1,11*

ЕРА-ЭЛ 66,7±3,59* 63,3±1,19* 64,7±4,54* 56,4±0,67*

йНА-йА 74,9±0,23* 49,3±1,55* 43,6±2,68* 33,2±4,54*

ОЮА 98,8±2,13 70,9±б,37* 43^1±2,91* 34,9±2,93*

АА-вАВА-ОА 115,0±8,33 40,7±0,65* 23,6±1,13 21,5±2,09*

АА-5НТ 117,7±8,30 10б,0±6,96 108,2±8,36 99,8±4,82

АА-ЫАй 76,2±5,06 104,5±5,80 86,6±4,41 81,5±2,91

С22:5-ОА 94,7±3,89 94,07±2,15 81,3±7,03 85,7±6,16

С18:4-ОА 95,4±6,23 87,8±8,37 90,0±9,29 88,65±6,29

АА-СРА 95,8±7,2 92,6±6,02 82,0±4,70 42,8±3,05*

АА-ЕА 89,5±6,4 б2,1±8,8* 40,5±5,4* 44,3±6,1*

* р<0.05

АА-СРА оказался практически неактивным в данной модели. Поскольку доказано, что АА-СРА является высокоаффинным антагонистом СВШ, можно сделать предположение об отсутствии СВШ на мембране клеток этой линии. Интересно, что на клетках человеческой глиомы АА-ЕА оказался более активен, чем на клетках глиомы крысы, в то время как АА-5НТ, напротив, не активен в данной модели.

13. Действие АА и ОНА на клетки культуры глиомы крысы С6 и культуры глиомы человека 11251

АА и БНА являются биологически активными соединениями, способными регулировать пролиферацию в различных клеточных линиях. Известно, что накопление АА приводит к индукции апоптоза в клетках нервной системы. Можно сделать предположение, что именно жирные кислоты, входящие в состав соединений, после гидролиза последних оказывают токсическое действие на культуры глиом. Результаты проведенных экспериментов показали, что обе жирные кислоты не только не оказывают токсического действия на глиомы, но и значимо стимулируют пролиферацию. По результатам МТТ-теста, АА на 40% увеличивала количество клеток относительно контроля, а БНА - на 60%. Таким образом, проапоптотический стимул нейролипинов и их синтетических аналогов не является результатом действия жирных кислот, высвобождаемых при гидролизе исследуемых соединений.

1.4. Механизм проапоптотического действия нейролипинов

Влияние антагонистов каннабиноидных. ванилоидных и дофаминовых рецепторов на активность нейролипинов

В первую очередь, был протестирован цитотоксический эффект наиболее активных соединений (АА-БА и БНА-БА) в присутствии антагонистов каннабиноидных (8Ш41716А, 811144528), ванилоидных (капсазепин) и дофаминовых (галлоперидол) рецепторов в клетках глиомы Сб. Ни один из антагонистов не оказал влияния на цитотоксическое действие исследуемых нейролипинов в данной модели.

Кроме того, было проведено изучение связи цитотоксического действия АА-СРА с активацией СВШ, СВЯ2, ТЯРУ1. Антагонист СВШ 5Я 141716А

(рис.2) полностью ингибировал цитотоксическое действие АА-СРА, в то время как антагонисты СВЯ2, ТЯРУ1 не оказывали влияния на активность АА-СРА в данной модели.

Рис.2 Действие АА-СРА на клетки глиомы крысы С6 на фоне антагонистов каннабиноидных, ванилоидных и дофаминовых рецепторов. Нн1-галоперидол srl-SR141716A; sr2-SR144528; Сар-капсазепин. Клетки инкубировали с исследуемыми веществами в течение 24 часов. Количество живых клеток

анализировали с помощью МТТ-теста. Все группы, кроме (*), достоверно не отличались друг от друга; р > 0.05.

Влияние ингибиторов передачи внутриклеточного сигнала на проапоптотическую активность нейролипинов

Было проанализировано действие ингибиторов передачи внутриклеточного сигнала в клетках линии глиомы крысы Сб. Ранее в литературе уже рассматривались, как возможные мишени действия каннабиноидов, участники сигнального каскада Raf/MEK/ERK. В данной работе были использованы ингибиторы киназ этого пути, а также сигнального пути PI3K/Akt. На цитотоксический эффект AA-DA и DHA-DA исследовалось влияние ингибиторов РКА (КТ-5720), PI3K (вортманин), MEKl(PD-98059); МЕК2 (sl-327), РКС (GF-109203X), CaMKII (KN-62). Ни один из ингибиторов ферментов передачи внутриклеточного сигнала не оказал достоверно значимого эффекта на проапоптотическое действие исследуемых соединений (р>0,05).

AA-DA и DHA-DA вызывают апоптоз в клетках крысы глиомы С6

Для определения механизмов клеточной гибели была проведена оценка морфологических изменений в ядрах клеток глиомы, а также проведен анализ активности каспазы-9 и каспазы-3.

Окраска красителем, связывающимся с ДНК, - Hoechst 33342, показала, что уже через два часа под воздействием 10 мкМ AA-DA и DHA-DA наблюдается суперконденсация хроматина и фрагментация ядер клеток исследуемой культуры и, как следствие, образование апоптотических телец. Данная картина характерна для гибели клеток путем апоптоза. Уже через три часа большая часть клеток погибает (рис.3).

Анализ активности каспаз с помощью флуоресцентных субстратов показал значительное увеличение активности каспазы-9 и каспазы-3 через 15 часов после внесения исследуемых соединений (AA-DA и DHA-DA) в культуру клеток глиомы (Таблица 6).

100 80

60 "

е 40*

пн . m . i -

АА-СРА

без антагонистов □ +На] □ +sr2 £3 +Сар Ц +srl

Таблица 6 Активность каспазы-3 и каспазы-9 в клетках глиомы крысы Сб.

AADA DHA-DA

15 часов 24 часа 15 часов 24 часа

Каспаза - 3 2325% 158% 317% 743%

Каспаза - 9 460% 194% 940%; 547%

Данные приведены в % от контроля

Проведенные исследования продемонстрировали, что АА-ОА и ОНА-ОА вызывают апоптоз в клетках глиомы крысы, причем апоптотический каскад развивается по каспазозависимому пути.

Control DHA-DA 2Ъ DHADA 3h

Рис.З Морфологические изменения в ядре клетки глиомы крысы С6 на фоне действия нейролипинов: A. AA-DA 10 мкМ; В. DHADA 10 мкМ. Окраска Hoechst 33342. Белыми стрелками обозначены образующиеся апоптотические тельца.

1.5. Токсическое действие нейролипинов на первичные культуры глии крысы

В экспериментах на глиоме наиболее выраженный токсический эффект продемонстрировали АА-САВА-ОА АА-ОА и ОНА-ОА. Именно эти соединения были протестированы на токсичность по отношению к первичной культуре глии крысы.

Эксперименты проводились по той же схеме, что и с трансформированными клетками, однако нейролипины не оказывали токсического эффекта в исследуемых концентрациях. Отсутствие токсичности у наиболее активных ингибиторов пролиферации глиом (АА-ОА и ОНА-ОА) в

отношении первичной культуры глии делает перспективным их изучение как фармакологических агентов для лечения глиом.

Антиапоптотическое (нейропротективное) действие нейролипинов

2.1. Антиапоптотическое действие нейролипинов в модели К+ - депривации

Данная модель апоптоза в нервной ткани представляет собой культуру гранулярных нейронов мозжечка крысы; клетки этого типа нуждаются в повышенной концентрации ионов К+ (25 мМ). Снижение концентрации ионов калия вызывает постоянную деполяризацию мембран клеток, что впоследствии приводит к индукции апоптоза.

Несмотря на то, что 2-AG является эндогенным нейропротектором при ишемическом повреждении головного мозга (Karanian D., 2005), соединения группы эфирных производных не проявили нейропротективное действие в данной модели.

В группе амидных наиболее выраженными защитными свойствами обладали дофаминовые производные. По убыванию нейропротективной активности дофаминовые производные можно расположить в следующий ряд: AA-DA > DHA-DA > EPA-DA. Исключение составляет DMA-DA, не проявивший нейропротективного эффекта. Таким образом, и про- и антиапоптотическй эффект производных AA-DA исчезает при диметильной модификации ацильной части молекулы.

Для наиболее активных соединений были получены дозовые зависимости нейропротективного эффекта (Рис.4).

80 60 40 20 0

- Y*......"

sjy

/ _ _____^ —А—-,-,-

DHA-DA AA-DA

5 10 15 20 25 концентрация, мкМ

Рис.4 Зависимость нейропротективного действия в модели К+- депривации от концентрации для АА-ЭА ОНА-ОА. Результаты приведены в % нейропротективного действия.

АА-УАН также оказывал нейропротективное действие, что полностью согласуется с литературными данными (УеМЬшв \У., 2003).

В незначительной степени нейропротективным действием обладали АА-СРА и АА-ЕА. Этот эффект не превышал 20%.

В высоких концентрациях АА-БА и БНА-ВА полностью теряют защитное действие и даже становятся токсичными. Так АА-БА теряет

нейропротекторные свойства в концентрации 25 мкМ, а БНА-БА - в концентрации 35 мкМ.

2.2. Действие АА и ЭНА на клетки первичной культуры гранулярных нейронов мозжечка крысы в модели К+депривации.

Кроме вышеописанных групп нейролипинов и их синтетических аналогов, в модели К+-депривации было проведено изучение

нейропротективного действия жирных кислот как возможных гидролитических производных исследуемых соединений. Арахидоновая кислота (АА) проявляет незначительное нейропротективное действие в данной модели. Докозагексаеновая кислота (БНА) оказалась эффективным нейропротектором, проявляя защитные свойства практически на уровне БНА-БА. Диметилмодифицированная докозагексаеновая кислота полностью теряла нейропротективное действие.

2.3.Механизмы нейропротективного действия нейролипинов в модели К+ -депривации

Нейропротективное действие нейролипинов на первичные культуры гранулярных нейронов мозжечка крысы с пониженным содержанием глии При использовании стандартной методики выделения гранулярных нейронов мозжечка через неделю культивирования в полученной смешанной культуре количество клеток глии составляет до 30%. Для выяснения вовлеченности глиальных клеток в механизмы нейропротекции были проведены эксперименты на культурах клеток с минимальным содержанием глии. Пролиферацию глии подавляли внесением в инкубационную среду 10 мкМ АгаС.

100

§ ■

| 70 -

I 60 -\

§ 40

I 30 — ■

■I 20

«и ШШ/,

к ю —Щ-

БНА-ОА АА-БА 20 мкМ 10 мкМ ■ в присутствии пжи в без глии Количество глиальных клеток в культуре при этом не превышало 5%. Сравнительные эксперименты показали, что нейропротективное действие исследуемых соединений напрямую зависит от количества глиальных клеток в культуре (рис.5). Можно сделать предположение, что действие, оказываемое

Рис. 5 Нейропротективное действие АА-ЭА и БНА-ОА на смешанные культуры нейронов мозжечка крысы и культуры гранулярных нейронов с минимальным содержанием глии (♦) в модели К+ -депривации. Результаты приведены в % нейропротективного действия.

неиролипинами, направлено именно на клетки глии, которые, в свою очередь, защищают нейроны от апоптоза.

Влияние антагонистов каннабиноидных. ванилоидных и дофаминовых рецепторов на нейропротективный эффект нейролипинов

Антагонисты СВ112 (811144528) и ванилоидного рецептора (капсазепин) полностью нейтрализовали нейропротективное действие АА-БА и БНА-ОА в модели К+-депривации (рис.6). Антагонист СВШ (8Ш41716А ) и антагонист дофаминовых рецепторов (галоперидол) не оказывали влияния на нейропротективное действие АА-БА и ВНА-БА. Поскольку СВ112 экспрессируется на глиальных клетках, полученные данные подтверждают предположение о ключевой роли межклеточных взаимодействий между нейронами и клетками глии в реализации нейрозащитных свойств нейролипинов.

80 60 4020'

-20

-40-

без

антагонистов

не--

Я БНА-ВА АА-ЛА

4-На1

н Сар

Рис.6 Действие АА-БА ОНА-БА в модели К+-депривации на фоне действия антагонистов каннабиноидных, ванилоидных и дофаминовых рецепторов. На1-галоперидол; вг1-8К141716А; $г2-8К.144528; Сар-капсазепин. Анализ количества живьк клеток проводили с помощью МТТ-теста. Все группы, кроме (*), достоверно не отличались друг от друга; р > 0.05

Влияние ингибиторов передачи внутриклеточного сигнала на нейропротективную активность нейролипинов

Литературные данные из различных источников указывают на связь антиапоптотического действия каннабиноидов с активностью протеинкиназ, вовлеченных в передачу внутриклеточного сигнала. В свою очередь, активация рецепторов каннабиноидно-ванилоидной системы приводит к ингибированию фосфорилирования киназ проапоптотического пути. Нами было исследовано влияние ингибиторов основных киназных каскадов МАРК/Е]1К(МЕК) и РВК/АИ, вовлеченных в процессы гибели-выживания клетки. В частности, из (рис.7) видно, что ингибирование активности Р13К приводит к практически полной блокаде нейропротективного действия БНА-БА и значительно снижает

защитный эффект AA-DA (р<0,05). В экспериментах были использованы селективные ингибиторы PI3K вортманин и LY294002, а также ингибитор широкого действия стауроспорин.

Ингибирование активности ферментов группы МЕК (МЕК1 и МЕК2) (рис.9) не оказывало значимого эффекта на действие обоих исследуемых соединений (р>0,05). Для анализа вовлеченности в механизм нейропротективного действия AA-DA и DHA-DA данного пути передачи внутриклеточного сигнала были использованы ингибиторы ферментов семейства МЕК PD98059 и SL327.

Таким образом, можно сделать вывод об участии в механизме нейропротективного действия пути передачи сигнала через PI3K, без вовлечения МЕК.

Кроме того, было изучено влияние ингибиторов РКА, РКС и CaMKII на нейропротективное действие AA-DA и DHA-DA. Ингибитор РКА КТ-5720 не оказывал достоверно значимого влияния на нейропротективные свойства DHA-DA (р>0,05), однако значимо снижал эффект AA-DA - до 15% нейропротективного действия (р<0,05) (рис.8), т. о. молекулярный механизм действия производных дофамина зависит от структуры незаряженной части молекулы. Селективный ингибитор CaMKII KN-62, напротив, практически полностью ингибирует действие DHA-DA, не оказывая эффекта на защитные свойства AA-DA (рис.9). В то же время, активация РКС является ключевым этапом в механизме нейропротективного действия обоих исследуемых соединений в модели нейронального апоптоза: селективный ингибитор РКС GF109203X практически полностью блокировал нейропротективное действие как AA-DA, так и DHA-DA (рис.8).

Подводя итог, можно сделать вывод о вовлечении в реализацию нейропротективного эффекта производных дофамина следующих регуляторных белков: PI3K, РКС, РКА и СаМК II. PI3K и РКС являются ключевыми белками для обоих исследуемых веществ; РКА вовлечена в механизм защитного действия AA-DA, a CaMKII является ключевым ферментом для проведения антиапоптотического сигнала DHA-DA.

Ингибирование активности каспаз нейролипинами и их аналогами

Модель нейронального апоптоза, использованная в данной работе, на настоящий момент описана в литературе достаточно хорошо. В частности, неоднократно отмечалось, что в данном случае индукция апоптоза осуществляется через активацию каспазного пути, включающего в себя каспазу-9 и каспазу-3.

Было протестировано влияние AA-DA и DHA-DA на активность каспаз в модели К+ - депривации. Показано, что оба соединения ингибируют активность каспазы-9 и каспазы-3. Полученные результаты подтверждают предположение о вовлечении в механизм действия данных соединений пути передачи внутриклеточного сигнала через ферментативную систему PI3K/Akt. В нейрональной клетке активация PI3K приводит к активации Akt, которая, в свою очередь, ингибирует активность каспазы-9.

dha-da

I 15

_ г rb _

- Г*1 —

.70

aa-da

| ВО"

J sol—

3 40 -;30-[20-S101— o

Рис.7 Нейропротективная активность АА-БА (10 мкМ) и ОНА-БА (15 мкМ) в модели К+-депривации на фоне ингибиторов Р13К и РКА. Ьу - ЬУ294002, селективный ингибитор Р13К (5 мкМ); wor - вортманин, селективный ингибитор Р13К (5 мкМ); 1й57 - КТ-5720, селективный ингибитор РКА (1 мкМ). (*) - Группы, достоверно отличающиеся от контроля (р<0.05).

пна-ра

AA-DA

dha-da

+gf

+1пв2

aa-da

Рис.8 Нейропротективное действие АА-ЭЛ (10 мкМ) и ОНА-ЭА (15 мкМ) в модели К+-депривациии на фоне ингибиторов РКС и СаМКН. вГ - СР109203Х, селективный ингибитор РКС (1мкМ); кп62 - селективный ингибитор СаМКИ (1мкМ). (*) - Группы, достоверно отличающиеся от контроля (р<0.05).

бна-ба

i_L

dha-da

+pd

+51327

aa-da

+pd

+sd27

Рис.9 Нейропротективная активность AA-DA (10 мкМ) DHA-DA (15 мкМ) в модели К+-депривации на фоне ингибиторов МЕК. pd - PD98059, ингибитор МЕКК (ЮмкМ); sl327 -селективный ингибитор МЕК1 и МЕК2 (1мкМ). Все группы достоверно не отличались друг от друга (р>0.05).

2.4. Антиапоптотическое действие иейролипинов в модели глутаматной токсичности

Гдутаматная токсичность является моделью ключевого этапа ишемического повреждения в нервной системе.

В модели глутаматной токсичности проводили исследование нейропротективного действия АА-ВА, ВНА-ВА, АА-СРА, АА-ЕА. В данной модели АА-ВА и БНА-ВА проявляли защитный эффект на уровне 50%. АА-СРА показал незначительный нейропротективный эффект, в то время как АА-ЕА не проявлял нейропротективного действия.

2.5. Механизмы нейропротективного действия нейролипинов и их аналогов в модели глутаматной токсичности

Антагонист дофаминовых рецепторов (галоперидол) не оказывал действия на нейропротективный эффект АА-БА и ВНА-БА.

В модели глутаматной токсичности профиль действия антагонистов рецепторов каннабиноидно-ванилоидной системы отличался для АА-БА и ВНА-БА. 8Ш41716А не оказывал действия на нейропротективный эффект АА-БА, при этом практически полностью нейтрализуя защитный эффект БНА-БА. БЯ144528 на 50% снижал эффективность действия для БНА-БА и на 85% для АА-БА. Капсазепин был неактивен в данной модели. Основываясь на полученных результатах, можно сказать, что СВЯз в разной степени вовлечены в нейропротективное действие АА-БА и БНА-БА в модели глутаматной токсичности, причем СВ112 вовлечен в механизм действия обоих соединений.

2.6. Нейропротективное действие нейролипинов на срезы гиппокампа крысы в модели глутаматной токсичности

Эксперименты, проведенные на органотипических гиппокампальных культурах, также продемонстрировали защитный эффект АА-БА и ВНА-БА в модели глутаматной токсичности (Рис. 10).

До воздействия

После воздействия

контроль

Глутамат 200мкМ 15 мин

Рис.10 Нейропротективное действие АА-ОА (10 мкМ) на органотипические культуры гиппокампа в модели глутаматной эксайтотоксичности. Срезы помещали на 10 мин в буфер, содержащий 200 мкМ глутамата. После двухкратной отмывки Ьоск-буфером срезы помещали в кондиционированную среду, содержащую исследуемые вещества. Окраска пропидиумом иодидом.

Заключение

В рамках данной работы был проведен анализ цитотоксичности и нейропротективной активности 36 аналогов нейролипинов. Анализ проводился с использованием как трансформированных, так и первичных культур. После скрининга на модели глиомы крысы С6 и модели нейронального апоптоза в первичной культуре гранулярных нейронов мозжечка крысы были выявлены два наиболее активных соединения: AA-DA и DHA-DA. Данные соединения оказывали токсический эффект на клетки глиомы С6 и глиомы человека U251, а также защищали гранулярные нейроны от апоптоза, вызванного пониженным содержанием К+, и от глутаматной токсичности. Все эффекты данных соединений были дозозависимы.

Изучение механизмов действия AA-DA и DHA-DA продемонстрировало, что в клетках глиомы и первичных культурах мишенями служат различные белки. Так, нейропротективное действие нейролипинов связано с CBR2 и TRPV1, в то время как мишени цитотоксического действия AA-DA и DHA-DA в глиоме обнаружить не удалось. Поскольку в исследовании использовались антагонисты каннабноидных и ванилоидных рецепторов, а также ингибиторы регуляторных киназ, возможно, проапоптотический эффект исследуемых соединений реализуется за счет не активации, а, напротив, ингибирования данных регуляторных белков; не исключено также, что в клетках нервной системы существуют другие мишени нейролипинов.

Влияние ингибиторов ферментов, не связанных цепью последовательной активации, на реализацию эффекта нейролипинов, а также вовлеченность в регуляцию их нейропротективного действия как каннабиноидного, так и ванилоидного рецептора, дают возможность говорить о мультифункциональном воздействии нейролипинов на пути передачи внутриклеточного сигнала в клетках нервной системы. Отдельно стоит остановиться на взаимодействии каннабиноидных и ванилоидных рецепторов. Так, известно, что каннабиноидные рецепторы ингибируют активность аденилатциклазы (Howlett А.С; 1995), предотвращая активацию РКА, в то время как РКА фосфорилирует TRPVI, приводя его в активное состояние (De Petrocellis L., Harrison S., 2001; Mohapatra D.P, 2003). Таким образом, несмотря на то, что в рамках данной работы не удалось обнаружить мишени AA-DA и DHA-DA в клетках глиомы крысы, можно сказать, что вектор действия данных нейролипинов определяется балансом воздействия на различные пути передачи внутриклеточного сигнала, в вершине каскада, которого стоят каннабиноидные и ванилоидные рецепторы. Это, в свою очередь, дает возможность объединить каннабиноидные и ванилоидные рецепторы в единую систему передачи внутриклеточного сигнала.

липофильной части молекулы, нужно отметить, что наиболее эффективными оказались соединения, имеющие в липофильной части молекулы 20-22 атома улерода, а также четное количество двойных связей (4 или 6). Введение двух метальных групп в альфа-положение жирной кислоты делает молекулу более устойчивой к гидролизу, но полностью лишает возможности реализации как про-,так и антиапоптотического эффекта.

При анализе эффективности метаболитов нейролипинов было показано, что БНА проявляла нейропротективные свойства и не обладала цитотоксическим эффектом. При этом АА оказалась неактивной в обоих тестах. Не приходиться также говорить об активности дофамина, так как антагонист дофаминовых рецепторов галоперидол не оказывал влияния на действие нейролипинов во всех использованных моделях. Таким образом, можно сделать вывод, что значимыми для реализации про- и антиапоптотического действия нейролипинов являются не их метаболиты, а структурные характеристики молекулы.

Полученные в настоящей работе данные позволяют рассматривать ЛАБА и БНА-БА как перспективные протекторные соединения и дают новые подтверждения вовлеченности каннабиноидно-ванилоидной системы в процессы жизнедеятельности нейрональной клетки.

III. выводы

1. На синтетической библиотеке аналогов нейролипинов изучены их про- и антиапоптотические свойства в отношении клеток нервной системы и выявлены наиболее активные соединения - AA-DA и DHA-DA.

2. Выявлены наиболее активные аналоги арахидонолдофамина, оказывающие на клетки глиомы крысы С6 проапоптотическое действие, которое не снимается антагонистами каннабиноидных, ванилоидных и дофаминовых рецепторов.

3. AADA и DHADA вызывают апоптоз в клетках глиомы крысы С6 через активацию каспазного каскада.

4. AADA и DHADA не оказывают цитотоксического действия на нейроны и глиальные клетки крысы.

5. AADA и DHADA оказывают нейропротективное действие в моделях нейронального апоптоза и глутаматной токсичности только в присутствии глиальных клеток. Этот эффект снимается антагонистами каннабиноидного рецептора 2-го типа и ванилоидного рецептора, а также ингибиторами фосфоинозит-3-киназы и протеинкиназы С.

СПИСОК ПУБЛИКАКЦИЙ С ОСНОВНЫМИ РЕЗУЛЬТАТАМИ РАБОТЫ

Статьи

1. Бобров М.Ю., Лыжин А.А., Андрианова Е.Л., Грецкая Н.М., Зинченко Г.Н., Фрумкина Л.Е., Хаспеков Л.Г., Безуглов В.В. Антиоксидантные и нейропротекторные свойства N-докозагексаеноилдофамина. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2006. — Т. 142 — № 10 — С. 406-408.

2. Фрумкина Л.Е., Бобров М.Ю., Лыжин А.А., Андрианова Е.Л., Королев С.К., Боброва Н.А., Хаспеков Л.Г. Влияние фармакологической блокады каннабиноидных рецепторов 1-го типа на ультраструктуру синапсов в органотипической культуре ткани гиппокампа.// Неврологический вестник — 2007. — Т.4 — №4 -— С. 60-63.

3. Frumkina L.E., Bobrov M.Yu., Lyzhin A.A., Andrianova E.L., Koroleva S.K, Bobrova N.A., Khaspekov L.G. Plastic reorganization of hippocampal synapses resulted from pharmacological blockade of type 1 cannabinoid receptors // Annals of clinical and experimental neurology. — 2007. — V.2 —P. 17-21.

4. Bobrov M.Yu., Lyzhin A.A., Andrianova E.L., Gretskaya N.M., Frumkina L.E., Khaspekov L.G., Bezuglov V.V. Antioxidant and neuroprotective properties of N-arachidonoyldopamine // Neuroscience Letters. — 2008. —V. 431. —P. 6-11.

5. Андрианова ЕЛ., Бобров М.Ю., Грецкая Н. М., Зинченко Г. Н., Серков И. В., Фомина-Агеева Е. В., Безуглов В. В. Действие нейролипинов и их синтетических аналогов на нормальные и трансформированные глиальные клетки // Нейрохимия. — 2010. — Т.27 — №1 — С. 1-10.

Тезисы

1. Andrianova E.L., Bobrov M.Yu., Gretskaya N.M., Fedenyuk A.V., Bezuglov V.V. Antiproliferative and cytotoxic effects of endocannabinoid analogs on rat C6 glioma cells II 5th International EMBL PhD Students Symposium «Design of life», Hedelberg, 2-6 December 2004 — Symposium handbook — P.33.

2. Безуглов B.B., Бобров М.Ю., Андрианова ЕЛ., Блаженова А.В., Грецкая Н.М. Функциональная роль нейролипинов в процессах нейродегенерации // Симпозиум «Современное состояние исследований, диагностики и терапии нейродегенеративных заболеваний» — Москва, 17-18 ноября 2005 — Тезисы докладов — С. 54.

3. Андрианова ЕЛ., Бобров М.Ю., Безуглов В.В., Грецкая Н.М., Лыжин А.А., Хаспеков Л.Г., Мясоедов Н.Ф. Действие пептолипинов и их структурных компонентов на трансформированные и нормальные клетки нервной системы // III Российский симпозиум «Белки и пептиды» — 12-17 сентября 2007 — Тезисы стендовых сообщений — С. 87.

4. Андрианова ЕЛ., Бобров М.Ю., Безуглов В.В., Грецкая Н.М., Лыжин А.А., Хаспеков Л.Г. Действие нейролипинов на нормальные и трансформированные клетки нервной системы. // Конференция «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга»; Санкт-Петербург-Колтуши; 10-12 сентября 2008 —С. 24.

Подписано в печать 21.12.2009 Тираж 100 экз. Усл.п.л. 1,3 Отпечатано в ООО «Реглет» http:wwwZreglet.ru 514-7747; 790-4777

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Андрианова, Екатерина Львовна

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Андрианова, Екатерина Львовна

Выводы

3. AADA и DHADA вызывают апоптоз в клетках глиомы крысы С6 через активацию каспазного каскада.

4. AADA и DHADA не оказывают цитотоксического действия на нейроны и глиальные клетки крысы.

5. AADA и DHADA оказывают нейропротективное действие в моделях нейронального апоптоза и глутаматной токсичности только в присутствии глиальных клеток. Этот эффект снимается антагонистами каннабиноидного рецептора 2-го типа и ванилоидного рецептора, а также ингибиторами ключевых ферментов PI3K/Akt пути передачи внутриклеточного сигнала.

Заключение

В рамках данной работы был проведен анализ цитотоксичности и нейропротективной активности 39 аналогов нейролипинов. Анализ проводился с использованием как трансформированных, так и первичных культур. После скрининга на модели глиомы крысы С6 и модели нейронального апоптоза в первичной культуре гранулярных нейронов мозжечка крысы были выявлены два наиболее активных соединения: AADA и DHA-DA. Данные соединения оказывали токсический эффект на клетки глиомы С6 и глиомы человека U251, а также защищали гранулярные нейроны от апоптоза, вызванного пониженным содержанием К+, и от глутаматной токсичности. Все эффекты данных соединений были дозозависимы.

Анализируя структуру молекулы, являющейся активатором данной системы, на основании проведенного скрининга можно сказать, что для реализации внутриклеточного сигнала значимым являются как неполярная, так и амидная части молекулы. Среди исследованных нейролипинов, именно дофаминовые производные обладали наиболее высокой активностью. Говоря о липофильной части молекулы, нужно отметить, что наиболее эффективными оказались соединения, имеющие в липофильной части молекулы 20-22 атома улерода, а также четное количество двойных связей (4 или 6). Введение двух метальных групп в альфа-положение жирной кислоты делает молекулу более устойчивой к гидролизу, но полностью лишает возможности реализации как про-,так. и антиапоптотического эффекта.

При анализе эффективности метаболитов нейролипинов было показано, что DHA проявляла нейропротективные свойства и не обладала цитотоксическим эффектом. При этом АА оказалась неактивной в обоих тестах. Не приходиться также говорить об активности дофамина, так как антагонист дофаминовых рецепторов галоперидол не оказывал влияния на действие нейролипинов во всех использованных моделях. Таким образом, можно сделать вывод, что значимыми для реализации про- и антиапоптотического действия нейролипинов являются не их метаболиты, а структурные характеристики молекулы.

Полученные в настоящей работе данные позволяют рассматривать AA-DA и DHA-DA как перспективные протекторные соединения и дают новые подтверждения вовлеченности каннабиноидно-ванилоидной системы в процессы жизнедеятельности нейрональной клетки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Андрианова, Екатерина Львовна, Москва

1. Cadogan А.К., Alexander S P., Boyd E. A., Kendall D.A. Influence of cannabinoids on electrically evoked dopamine release and cyclic AMP eneration in the rat striatum // J Neurochem.—1997.—V.9.— P.l 131—1137.

2. Romero J., Garcia L., Cebeira M., Zadrozny D., Fernandez-Ruiz J. J., Ramos J. A. The endogenous cannabinoid receptor ligand, anandamide, inhibits the motor behavior: role of nigrostriatal dopaminergic neurons. // Life Sci. — 1995. — V.56 — P.2033—2040.

3. Devane W.A., Hanus L, Breuer A, et al. Isolation and structure of a brain constituent that binds to the cannabinoid receptor // Science. — 1992 .— V.258 — P. 1946—1949

4. Das S.K., Paria B.C., Chakraborty I., Dey S.K. Cannabinoid igand-receptor signaling in the mouse uterus // Proc. Nat. Acad. Set USA. — 1995. — V.92 — P.43332—43336.

5. Gormez del Pulgar, Т., Velasco, G., Samchez, С., Haro, A., Guzmarn, M. De novo-synthesized ceramide is involved in cannabinoid-induced apoptosis. // Biochem. J. — 2002.1. V.363. —P.183—188.

6. Zhang, W., Liu, H.T. МАРК signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells. // Cell Res. — 2002. — V.12 — P.9-18.

7. Wartmann M., Campbell D., Subramanian A., Burstein S.H., Davis RJ. The MAP kinase signal transduction pathway is activated by the endogenous cannabinoid anandamide. // FEBS Lett. — 1995. — V.359 — P.133-136

8. Stefano G.B., Salzet В., Salzet M. Identification characterization of the leech CNS cannabinoid receptor: coupling to nitric oxide release. // Brain Res. — 1997. — V.753 — P.219—224.

9. Smart D.,Gunthorpe M.J., Jerman J.C., Nasir S., Gray J., Muir A.I., Chambers J.K., Randall A.D., Davis J.B. The endogenous lipid anandamide is a full agonist at the human vanilloid receptor (hVRl). // Br. J. Pharmacol. — 2000. — V.129 — P. 227-230.

10. Hanus L., Gopher A., Almong S., Mechoulam R. Two new unsaturated fatty acid etanolamides in brain that bind to the cannabinoid receptor // J Med Chem. — 1993. — V.361. P.3032-3034.

11. Fride E., Barg J., Levy R., Saya D., Heldman E., Mechoulam R., Vogel Z. Low doses of anandamides inhibit pharmacological effects of delta 9-tetrahydrocannabinol. // J Pharmacol Exp Ther. — 1995. — V.272 — P.699—707.

12. Kuehl F.A., Jacob Т.A., Ganley O.H., Ormond R.E., Meisinger M. The identification of N-3(hydroxyethyl)-palmitamide as a naturally occurring anti-inflammatory agent. // J Am Chem Soc. — 1957. — V.79 — P.5577—5578.

13. Lambert D.M., Vandevoorde S., Jonsson K.O., Fowler CJ. The palmitoylethanolamide family: a new class of anti-inflammatory agents? // Curr Med Chem. —2002. — P.663—674.

14. Schmid H.H., Berdyshev E.V. Cannabinoid receptor-inactive N-acylethanolamines and other fatty acid amides: metabolism and function // Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids— 2002. — V.66. — P.363—376.

15. Calignano A., La Rana G., Giuffrida A., Piomelli D. Control of pain initiation by endogenous cannabinoids // Nature—1998.—V.394.— P.277—281.

16. Calignano A., La Rana G., Piomelli D. Antinociceptive activity of the endogenous fatty acid amide, palmitylethanolamide // Eur J Pharmacol.—2001.—V.419. —P. 191—198.

17. Heldlund P.B., Carson J.G. Allosteric regulation by oleamide of the binding properties of 5-hydroxytryptamine7 receptors // Biochem Pharmacol.— 1999.— V.58.— P. 1807—1813.

18. Thomas E.A., Cravatt B.F. The endogenous lipid oleamide activates serotonin 5-HT7 neurons in mouse thalamus and hypothalamus. // J Neurochem.— 1999.—V.72.— P.2370— 2378.

19. Boger D.L., Patterson J.E. Chemical requirements for inhibition of gap junction communication by the biologically active lipid oleamide // PNAS— 1998.— V.95 — P.4810—4815.

20. Guan X., Cravatt B.F. The sleep-inducing lipid oleamide deconvolutes gap junction communication and calcium wave transmission in glial cells // J Cell Biol.— 1997.— V.139 — P. 1785—1792.

21. Lees G., Edwards M.D., Hassoni A.A. Modulation of GABA(A) receptors and inhibitory synaptic currents by the endogenous CNS sleep regulator cis-9,~10-octadecenoamide (cOA) // Br J Pharmacol —1998. V.24—P.873—882.

22. Yost C.S., Hampson A.J. Oleamide potentiates benzodiazepine-sensitive gamma-aminobutyric acid receptor activity but does not alter minimum alveolar anesthetic concentration // Anesth Analg.— 1998.— V.86— P. 1294—1300.

23. Rakhshan F., Day T.A., Blakely R.D., Barker E.L. Carrier-mediated uptake of the endogenous cannabinoid anandanride in RBL-2H3 cells // J Pharmacol Exp Ther.— 2000. —V.292— P.960—967.

24. Karava V., Fasia L., Siafaka-Kapadai A. Anandamide axnidohydrolase activity, released in the medium by Tetrahymena pyriformis. Identification and partial characterization // FEBS Lett.—2001.—V.508 — P.327—331.

25. Maccarrone M., Attina M., Bari M., Cartoni A., Ledent C., Finazzi-Agro A. Anandamide degradation and N-acylethanolamines level in wild-type and CB1 cannabinoid receptor knockout mice of different ages // J Neurochem.— 2001.— V.78 — P.339—348.

26. Voth E., and Schwartz R. Medicinal applications of d-9-tetrahydrocannabinol and marijuana//Ann. Intern. Med.—1997,—V.126 —P.791—798.

27. Sugiura Т., Kondo S., Sukagawa A., Nakane S., Shinoda A., Itoh K., Yamashita A., Waku K. 2-Arachidonoylglycerol: a possible endogenous cannabinoid receptor ligand in brain // Biochem Biophys Res Commun—1995. — Y.215 —P.89—97.

28. Fride E., Ginzburg Y., Breuer A., Bisogno Т., Di Marzo V., Mechoulam R. Critical role of the endogenous cannabinoid system in mouse pup suckling and growth // Eur J Pharmacol.— 2001.— V.419—P.207—214.

29. Hanus L., Abu-Lafi S., Fride E., Breuer A., Vogel Z., Shalev D.E., Kustanovich I., Mechoulam R. 2-arachidonyl glyceryl ether, an endogenous agonist of the cannabinoid CB1 receptor // Proc Natl Acad Sci USA— 2001.—V.98—P.3662—3665.

30. Sheskin Т., Hanus L., Slager J., Vogel Z., Mechoulam R. Structural requirements for binding of anandamide-type compounds to the brain cannabinoid receptor // J Med Chem.— 1997. V.40— P.659—667.

31. Burstein S.H., Rossetti R.G., Yagen В., Zurier R.B. Oxidative metabolism of anandamide // Prostaglandins Other Lipid Mediat.— 2000. 61—P.29—41.

32. Prusakiewicz J.J., Kingsley P.J., Kozak K.R., Marnett L.J. Selective oxygenation of Narachidonylglycine by cyclooxygenase-2 // Biochem Biophys Res Commun.— 2002.— V.296—P.612—617.

33. Toth A., Kedei N., Wang Y., Blumberg P.M. Arachidonyl dopamine as a ligand for the vanilloid receptor VR1 of the rat // Life Sci.— 2003.— V.73— P.487-^98.

34. Premkumar L.S., Qi Z.H., Van Buren J., Raisinghani M. Enhancement of potency and efficacy of NADA by PKC-mediated phosphorylation of vanilloid receptor // J Neurophysiol.— 2004.—V.91— P.1442—1449.

35. Huang S.M., Walker J.M. Enhancement of spontaneous and heat-evoked activity in spinal nociceptive neurons by the endovanilloid/endocannabinoid N-arachidonoyldopamine (NADA) // J Neurophysiol.— 2006.— V.95— P1207—1212.

36. Castellano C., Cabib S. The effects of anandamide on memory consolidation in mice involve both D1 and D2 dopamine receptors // Behav Pharmacol. — 1997.— V.8 —P.707— 712.

37. Mallet P.E., Beninger R.J. The cannabinoid CB1 receptor antagonist SR141716A attenuates the memory impairment produced by delta9-tetrahydrocannabinol or anandamide. // Psychopharmacology. — 1998. — V. 140 — P. 11—29.

38. Wenger Т., Jamali K.A. Arachidonyl ethanolamide (anandamide) activates the parvocellular part of hypothalamic paraventricular nucleus. // BBRC. — 1997. — Y.237 — P.724—728.

39. Weidenfeld J., Feldam S. Effect of the brain constituent anandamide, a cannabinoid receptor agonist, on the hypothalamo-pituitary-adrenal axis in the rat. // Neuroendocrinology.1994.— V.59 — 110-112.

40. Manzanares J., Corchero J. Pharmacological and biochemical interactions between opioids and cannabinoids // Trends Pharmacol Sci. — 1999. — V.20 — P.287—294.

41. Fuentes J.A., Ruiz-Gayo M. Cannabinoids as potential new analgesics // Life Sci. — 1999.1. V.65 — P.675—685.

42. Walker J.M., Hohmann A.G. The neurobiology of cannabinoid analgesia. // Life Sci. — 1999. — V.65 — P.665—673.

43. Sugiura T, Kishimoto S, Oka S, Gokoh M. Biochemistry, pharmacology and physiology of 2-arachidonoylglycerol, an endogenous cannabinoid receptor ligand.// Prog Lipid Res. — 2006. — V.45 — P .405—446.

44. Ueda N, Kurahashi Y, Yamamoto S, Tokunaga T. Partial purification and characterization of the porcine brain enzyme hydrolyzing and synthesizing anandamide // J Biol Chem. — 1995. — V.270 — 23823—23827.

45. Schmid H.H. Pathways and mechanisms of N-acylethanolamine biosynthesis: can anandamide be generated selectively? // ChemPhys Lipids. — 2000. — V.108 — P.71—87.

46. Di Marzo V., Fontana A., Cadas H., Schinelli S., Cimino G., Schwartz J.C., Piomelli D. Formation and inactivation of endogenous cannabinoid anandamide in central neurons // Nature. — 1994.— V.372—P.686-691.

47. Piomelli, D., Giuffrida, A., Calignano, A., and Rodry'guez de Fonseca, F. Theendocannabinoid system as a target for therapeutic drugs // Trends Pharmacol. Sci.— 2000.—V.21 -218-224.

48. Guzman M., Galve-Roperh I., Sanchez C. Ceramide: a new second messenger of cannabinoid action // Trends Pharmacol Sci —2001.—V.22—P.19-22.

49. McFarland M.J., Barker E.J. Anandamide transport // Pharmacol. Therap.—2004.— V.104—P.117—135.

50. Cravatt B.F., Giang D.K., Mayfield S.P., Boger D.L., Lemer R.A., Gilula N.B. Molecular characterization of an enzyme that degrades neuromodulatory fatty-acid amides // Nature— 1996,—V.384—P.83—87.

51. Desarnaud F., Cadas H. Anandamide amidohydrolase activity in rat brain microsomes. Identification and partial characterization. // J Biol Chem.—1995.— V.270—P.6030—6035.

52. Watanabe K., Ogi S. Distribution and characterization of anandamide amidohydrolase in mouse brain and liver // Life Sci.—1998.— V.62—P.1223—1229.

53. Schmid P.C., Zuzarte-Augustin M.L., Schmid H.H. Properties of rat liver N-acylethanolamine amidohydrolase//J. Biol. Chem.—1985.—.V.260—P.14145—14149.

54. Goparaju S.K., Ueda N. Enzymes of porcine brain hydrolyzing 2-arachidonoyIglycerol, an endogenous ligand of cannabinoid receptors. // Biochem Pharmacol.—1999.—V.57— P.417—423.

55. Lang W., Qin C. Substrate specificity and stereoselectivity of rat brain microsomal anandamide amidohydrolase. // J Med Chem.—1999.— V.42—P.896—902.

56. Dinh T.P., Carpenter D., Leslie F.M., Freund T.F., Katona I., Sensi S.L., Kathuria S., Piomelli D. Brain monoglyceride lipase participating in endocannabinoid inactivation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.—2002.—V.99—10819—10824.

57. Sim L.J., Selley D.E., Xiao R., Childers S.R. Differences in G-protein activation by mu and delta opioid, and cannabinoid, receptors in rat striatum // Eur J Pharmacol.—1996.— V.307—P.97—105.

58. Lutz B. On-demand activation of the endocannabinoid system in the control of neuronal excitability and epileptiform seizures // Biochem Pharmacol.—2004.—V.68—P. 1691—1698.

59. Di Marzo V., Izzo A.A. Endocannabinoid overactivity and intestinal inflammation // Gut.—2006.—V.55—P.1373—1376.

60. Mackie K. Cannabinoid receptors as therapeutic targets //Annu Rev Pharmacol Toxicol .—2006.—V.46—P. 101—122.

61. Pertwee R.G. The pharmacology of cannabinoid receptors and their ligands: an overview // Int J Obes (Lond)—2006.—Y. 30(Suppl. 1)—P.13—S18.

62. Freund T.F., Katona I., Piomelli D. Role of endogenous cannabinoids in synaptic signaling // Physiol Rev.—2003.—"V.83—P.l017—1066.

63. Ramirez B.G., Blazquez C., del Pulgar T.G., Guzman N., de Ceballos M.A. Prevention of Alzheimer's disease pathology by cannabinoids: neuroprotection mediated by blockade of microglial activation // J Neurosci.—2005,—V.25-P.1904-1913.

64. Ledent C., Valverde G. Unresponsiveness to cannabinoids and reduced addictive effects of opiates in CB1 receptor knockout mice. //Scince.—1999.—V.283—P.401—404.

65. Mu J., Zhuang S-Y., Kirby M. Т., et al. Cannabinoid receptors differentially modulate potassium A and D currents in hippocampal neurons in culture // J. Pharmacol. Exp. Ther.— 1999.—V.291—P.893— 902.

66. Pertwee R. G. Pharmacology of cannabinoid CB1 and CB2 receptors // Pharmacol. Ther.—1997.—V.74—P. 129—180.

67. Gebremedhin D.,. Lange A. R,. Campbell W. B, et al. Cannabinoid CB1 receptor of cat cerebral arterial muscle functions to inhibit L-type Ca2+ channel current // Am. J. Physiol.— 1999.—V.276—H2085 H2093.

68. Gudermann Т., Schoneberg Т., Schultz G. Functional and structural complexity of signal transduction via G protein-coupled receptors // Annu Rev Neurosci.—1997.—V.20—P.399-427.

69. Howlett A.C. Pharmacology of cannabinoid receptors // Annu Rev Pharmacol Toxicol.— 1995.— V.35—P.607-634.

70. Howlett A.C. Cannabinoid inhibition of adenylate cyclase. Biochemistry of the response in neuroblastoma cell membranes // Mol Pharm.—1985.—V.27—P.429^3 6.

71. Bouaboula M., Poinot-Chazel C., Bourne В., Canat X., Calandra В., Rinaldi-Carmona M., Le Fur G., Casellas P. Activation of mitogen-activated protein kinases by stimulation of the central cannabinoid receptor CB // Biochem J.—1995,—Y.312—P.637—641.

72. Pertwee R. G.,. Ross R. A. Cannabinoid receptors and their ligands // Prostaglandins Leukotrienesand Essential Fatty Acids.—2002.—V.66—101—121.

73. Katona I., Rancz E.A., Acsady L., Ledent C., Mackie K., Hajos N., Freund T.F. Distribution of CB1 cannabinoid receptors in the amygdala and their role in the control of GABAergic transmission // J Neurosci.— 2001,—V.21—P.9506-9518:

74. Wager-Miller J., Westenbroek R., Mackie K. Dimerization of G protein-coupled receptors: CB1 cannabinoid receptors as an example // Chem Phys Lipids —2002.—V.121—P.83-89.

75. Mackie K. Cannabinoid receptor homo- and heterodimerization // Life Sci —2005.— V.77—P. 1667—1673.

76. Derkinderen P., Valjent E., Toutant M., Corvol J.C., Enslen H., Ledent C., Trzaskos J., Caboche J., Girault J.A. Regulation of extracellular signal-regulated kinase by cannabinoids in hippocampus // J Neurosci.—2003.—V.23—2371—2382.

77. Rueda D., Galve-Roperh I., Haro A., Guzman M. The CB1 cannabinoid receptor is coupled to the activation of c-Jun N-terminal kinase // Mol Pharmacol.—2000.—V.58— P.814—820.

78. Jin W., Brown S., Roche J.P., Hsieh C., Celver J.P., Kovoor A., Chavkin C., Mackie K. Distinct domains of the CB1 cannabinoid receptor mediate desensitization and internalization // J Neurosci.—1999.—Y.19—P.3773—3780.

79. Keren O., Same Y. Multiple mechanisms of CB1 cannabinoid receptors regulation // Brain Res.—2003.—V.980—P.197—205.

80. Hsieh C., Brown S., Derleth C., Mackie K. Internalization and recycling of the CB1 cannabinoid receptor // J Neurochem.—1999.—V.73—P.493—501.

81. Al-Hayani A., Wease K.N., Ross,R.A., Pertwee R.G., Davies, S.N. The endogenous cannabinoid anandamide activates vanilloid receptors in the rat hippocampal slice // Neuropharmacology.—2001 .—V.41—P.1000-1005.

82. Hogestatt E.D., Zygmunt P.M. Cardiovascular pharmacologyof anandamide // Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids.—2002.—V.66—P.43-351.

83. Caterina M.J., Julius D. The capsaicin receptor: a heat-activatedion channel in the pain pathway // Nature.—1997.—V.398—P.816-824.

84. Bevan S., Szolcsanyi J. Sensory neuron-specific actions of capsaicin: Mechanisms and applications // Trends Pharmacol. Sci.- 1990. V.l 1,- P. 330-333.

85. Gunthorpe M. J. Identification and characterization of SB-366791, a potentive and selective vanilloid receptor (Vrl/TRPVl) antagonist // Neuropharmac- 2004- V.46- P. 133-149.

86. Harrison S., De Petrocellis L., Trevisani M., Benvenuti F., Bifulco M., Geppetti P., Di Marzo V. Capsaicin-like effects or N-arachidonoyl-dopamine in the isolated guinea pig bronchi and urinary bladder // Eur. J. Pharmcol.- 2003.- V. 475,- P. 107-114.

87. Sugiura Т., Tominaga M., Katsuya H., Mizumura K. Bradykinin lowers the threshold temperature for heat activation of vanilloid receptor 1 // J. Neurophysiol 2002 - V.88 - P. 544-548.

88. Clapham D.E. TRP channels as cellular sensors //Nature.—2003.—V.426—P.517-524.

89. Schumacher M.A., Jong B.E., Frey S.L., Sudanagunta S.P., Capra N.F., Levine J.D. The stretch inactivated channel, a vanilloid receptor variant, is expressed in small-diameter sensory neurons in the rat // Neurosci Lett (2000)287:215-218.

90. Sanchez J.F., Krause J.E., Cortright D.N. The distribution and regulation of vanilloid receptor VR1 and VR1 5' splice variant RNA expression in rat // Neuroscience.—2001.— V.7—P.373—381.

91. Kedei N., Szabo Т., Lile J.D., Treanor J.J., Olah Z., Iadarola M.J., Blumberg P.M. Analysis of the native quaternary structure of vanilloid receptor 1 // J Biol Chem.—2001.— V.276—P.28613—28619.

92. Hellwig N., Albrecht N., Harteneck C., Schultz G., Schaefer M. Homo- and heteromeric assembly of TRP V channel subunits // J Cell Sci.—2005.—V.l 18—P.917-928.

93. Goswami C., Dreger M., Jahnel R., Bogen O., Gillen C., Hucho F. Identification and characterization of a Ca2+ -sensitive interaction of the vanilloid receptor TRPV1 with tubulin // J Neurochem.—2004.—V.91—P. 1092-1103.

94. Chuang H.H., Prescottt E.D., Kong H., Shields S., Jordt S.E., Basbaum A.I., Caho M.V., Julius D. Bradykinin and nerve growth factor release the capsaicin receptor from Ptdlns4,5 P2-mediated inhibition //Nature.—2001.—V. 411—P.957-962.

95. Caterina M. J., Julius D. The vanilloid receptor: a molecular gateway to the pain pathway //Annu. Rev. Neurosci.—2001.—V.24.—P.487—517.

96. Jung J., Shin J. S., Lee S. Y., Hwang S. W., Koo J., Cho H., Oh U. Phosphorylation of vanilloid receptor 1 by Ca2+/calmodulin- dependent kinase II regulates its vanilloid binding. J. Biol. Chem.—2004.—V.279.—P.7048—7054.

97. Marshall I. C., Owen D. E., Gripps Т. V., Davis J. В., McNulty S., Smart D. Activation of vanilloid receptor 1 by resiniferatoxin mobilizes calcium from inositol 1,4,5-triphosphte sensitive stores //Br. J. Pharmacol—2003.—V.138.—P.172—176.

98. Rosenbaum Т., Gordon-Shaag A., Munari M., Gordon S. E. CaCa2+/calmodulin modulates TRPV1 activation by capsaicin // J. Gen. Physiol.— 2004 — V.123.—P. 53-62.

99. Szallasi A., Appendino G. Vanilloid receptor TRPV1 antagonists as the next generation of painkillers. Are we putting the cart before the horse? // J. Med. Chem.—2004.-V.47.— P.2717—2723.

100. Holzer P. Capsaicin: Cellular targets, mechanisms of action, and selectivity for thin sensory neurons // Pharmacol. Rev.—1991.—V.43.—P. 143—201.

101. Szallasi A., Blumberg P. M. Vanilloid (capsaicin) receptors and mechanisms // Pharmacol. Rev.—1999.—V.51 .—P. 159—211.

102. Wang D.H. The vanilloid receptor and hypertension // Acta Pharmacol. Sin.—2005.— V.26.—P.286—294.

103. Eun SY, Jung SJ, Park YK, Kwak J, Kim SJ, Kim J (2001) Effects of capsaicin on Ca2+ release from the intracellular Ca2+ stores in the dorsal root ganglion cells of adult rats // Biochem Biophys Res Commun.— V.285—P. 1114-11120.

104. Karai L.J., Russell J.T., Iadarola M.J., Olah Z. Vanilloid receptor 1 regulates multiple calcium compartments and contributes to Ca2+-induced Ca2+ release in sensory neurons // J Biol Chem.—2004,—V.279—P. 16377-16387.

105. Ahluwalia J., Yaqoob M., Urban L., Bevan S., Nagy I. Activation of capsaicin-sensitive primary sensory neurones induces anandamide production and release // J Neurochem.— 2003.— V.84—P.585-591

106. Jordt S.E., Julius D. Molecular basis for species-specific sensitivity to "hot" chili peppers // Cell.—2002,—V. 2108—P.421-430.

107. Xu H., Blair N.T., Clapham D.E. Camphor activates and strongly desensitises the transient receptor potential vanilloid subtype 1 channel in a vanilloid-independent mechanism // J Neurosci.—2005.—V.25—P.8924-8937.

108. Mandadi S., Tominaga Т., Numazaki M., Murayama N., Saito N., Armati P.J., Roufogalis B.D., Tominaga M. Increased sensitivity of desensitized TRPV1 by PMA occurs through PKCs-mediated phosphorylation at S800 // Pain.—2006,—V. 123—106—116.

109. Mohapatra D.P., Nau C. Regulation of Ca2+-dependent desensitization in the vanilloid receptor TRPV1 by calcineurin and cAMP-dependent protein kinase // J Biol Chem.— 2005.—V.280—P. 13424-13432.

110. Munson A. E., Harris L. S., Friedman M. A., Dewey W. L., Carchman R. A . Antineoplastic activity of cannabinoids // J. Natl Cancer Inst.—,1975.—V.55—P.597—602.

111. De Petrocellis L.? Melck D., Palmisano A., Bisogno Т., Laezza C., Bifulco M., Di Marzo V. The endogenous cannabinoid anandamide inhibits human breast cancer cell proliferation // Proc. Natl Acad. Sci USA.—1998.—V.95—P.8375-8380.

112. Sanchez C., Galve-Roperh I., Canova C., Brachet P., Guzman M. D9-Tetrahydrocannabinol induces apoptosis in C6 glioma cells // FEBS Lett.—1998.—V.436— P.6-10.

113. Ruiz L., Miguel A., Dyaz-Laviada I. D9-Tetrahydrocannabinol induces apoptosis in human prostate PC-3 cells via a receptor-independent mechanism // FEBS Lett.—1999.— V.458—P.400—404.

114. Jacobsson S.O., Wallin Т., Fowler C.J. Inhibition of rat C6 glioma cell proliferation by endogenous and synthetic cannabinoids. Relative involvement of cannabinoid and vanilloid receptors // J Pharmacol Exp Ther.—2001—V.299—P.951—959.

115. Maccarrone M., Bari M., Lorenzon Т., Bisogno Т., Di Marzo V., Finazzi-Agro A. Anandamide uptake by human endothelial cells and its regulation by nitric oxide // J Biol Chem.—2000.—V.275—P.13484—13492.

116. Liebmann C., Regulation of MAP kinase activity by peptide receptor signaling pathway: paradigms of multiplicity. // Cell Signal.—2001.—Y.l 3—777—785.

117. Lutrell L.M., Activation and targeting of mitogen-activated protein kinases by G-protein-coupledreceptors// Can. J. Physiol. Pharmacol.—2002—V.80—P.375—382.

118. Terada Y., Nakashima O., Inoshita S., Kuwahara M., Sasaki S., Marumo F., Mitogen-activated protein kinase cascade and transcription factors: the opposite role of MKK3/6-p38K and MKK1-МАРК//Nephrol. Dial. Transplant.—1999.—V.14(Suppl 1)—P.45-47.

119. Qiao S., Li W., Tsubouchi R., Haneda M., Murakami K., Yoshino M. Involvement of perxynitrite in capsaicin-induced apoptosis of C6 glioma cell. // Neurosci Res.—2005.— Y.51—P. 175.

120. Blarzquez C., Casanova M.L., Planas A., Gormez del Pulgar Т., Villanueva C., Fernarndez-Acenero M.J., Aragoners J., Human J.W., Jorcano J.L., Guzmarn, M. Inhibition of tumor angiogenesis by cannabinoids // FASEB J—2003—V. 17—P.529-531.

121. Erecinska M., Silver I.A. Relationships between ions and energy metabolism: cerebral calcium movemaents during, ischaemia and subsequent recovery // Can J Physiol Pharmacol.—1992.—V.70-P.83-109.

122. Baker D., Pryce G., Croxford J. L., Brown P., Pertwee R. G., Huffman J. W., Layward L. Cannabinoids control spasticity and tremor in a multiple sclerosis model // Nature.—2000.— V.404—P.84-87.

123. Jin K.L., Мао X.O., Goldsmith P.C., Greenberg D.A. CB1 cannabinoid receptor induction in experimental stroke. Ann // Neurol.—2000.—V.48—P.257-261.

124. Parmentier-Batteur S., Jin К., Мао X.O., Xie L., Greenberg D.A. Increased severity of stroke in CB1 cannabinoid receptor knock-out mice // J. Neurosci.—2002.—V.22—P.9771-9775.

125. Maher E.A., Furnari F.B., Bachoo R.M., Rowitch D.H., Louis D.N., Cavenee W.K., DePinho R.A. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter //Genes Dev.— 2001.—V.15—P.1311-1333.

126. Panikashvili D., Simeonidou C., Ben-Shabat S., Hanus L., Breuer A., Mechoulam R., Shohami E. An endogenous cannabinoid (2-AG) is neuroprotective after brain injury // Nature.—2001,—V.413-P.527-531.

127. Panikashvili D., Mechoulam R., Beni S.M., Alexandrovich A., Shohami. E.CB1 cannabinoid receptors are involved in neuroprotection via NF-kappa В inhibition // J. Cereb. Blood Flow Metab.—2005.—V.25—P.477-484.

128. Louw D.F., Yang F.W., Sutherland G.R. The effect of delta-9-tetrahydrocannabinol on forebrain ischemia in rat // Brain Res.—2000.—V.857—P.83-187.

129. Nagayama Т., Sinor A.D., Simon R.P., Chen J., Graham S.H., Jin K., Greenberg D.A. Cannabinoids and neuroprotection in global and focal cerebral ischemia and in neuronal cultures // J. Neurosci.—1999.—V. 19— P.2987-2995.

130. Mauler F., Hinz V., Augstein K.H., Fassbender M., Horvath E. Neuroprotective and brain edema-reducing efficacy of the novel cannabinoid receptor agonist BAY 38-7271 // Brain Res.—2003.—V.989—P.99-111.

131. Braida D., Pozzi M., Sala M. CP 55,940 protects against ischemia-induced electroencephalographic flattening and hyperlocomotion in Mongolian gerbils // Neurosci. Lett.—2000.—V.296-P.69-72.

132. Zhuang S.-Y., Bridges D., Grigorenko E. Cannabinoids produce neuroprotection by reducing intracellular calcium release from ryanodine-sensitive stores // Neuropharmacology—2005.—V.481086—1096.

133. Abood M.E., Rizvi G., Sallapudi N., McAllister S.D. Activation of the CB1 cannabinoid receptor protects cultured mouse spinal neurons against excitotoxicity // Neurosci. Lett.— 2001.—V.309—P. 197—201.

134. Shen M., Thayer S.A. Cannabinoid receptor agonists protect cultured rat hippocampal neurons from excitotoxicity // Mol. Pharmacol.—1998.—V.54—P.459—462.

135. Kim S.H., Won S.J., Мао X.O., Jin K, Greenberg D.A. Involvement of protein kinase A in cannabinoid receptor-mediated protection from oxidative neuronal injury // J. Pharmacol. Exp. Therap.—2005,—V.313—P.88—94.

136. Bobrov M., Gretskaya N., Payet O., Bezuglov V., Durand Т., Maurin L., Tourrel F., Adjali O., Rinaldi-Carmona M., Muller A. Different pharmacological profile of two closely related endocannabinoid ester analogs // Life Sci.—2005.—V.77—P. 1425—1440.

137. Sinor A.D., Irvin S.M., Greenberg D.A. Erythropoietin protects cultured cortical neurons, but not astroglia, from hypoxia and AMPA toxicity // Neurosci. Lett.— 2000.—V.278— P.157—160.

138. Sinor A.D., Irvin S.M., Greenberg D.A. Erythropoietin protects cultured cortical neurons, but not astroglia, from hypoxia and AMPA toxicity // Neurosci. Lett.— 2000.—V.278— P.157—160.

139. Stoppini L.; A simple method for organotpic cultures of nervous tissue. // J.Neurosci. Meth.— 1991.—V.37—P.173—178.

140. Zhang W., Long Y., Zhang J., Wang C. Modulatory effects of EPA and DHA on proliferation and apoptosis of pancreatic cancer cells // J. Huazhong. Univ. Sci. Technolog. Med. Sci.—2007.—V.27—P. 547—550.

141. Tang D.G., Chen Y.Q., Honn K.V. Arachidonate lipoxygenases as essential regulators of cell survival and apoptosis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.—1996.—V.93—P.5241-5246.

142. Sheskin Т., Hanus L., Slager J., Vogel Z. et al. Structural requirements for binding of anandamide-type compounds to the brain cannabinoid receptor // J. Med.Chem.—1997.— V.40—P.659-667.

143. Sugiura Т., Kondo S., Sukagawa A., Nakane S. et al. 2-Arachidonoylglycerol: a possible endogenous cannabinoid receptor ligand in brain. // Biochem. Biophys. Res. Commun.— 1995.—Y.215—P.89—97.

144. Panikashvili D., Shein N.A., Mechoulam R., Trembovler V. et al. The endocannabinoid 2-AG protects the blood-brain barrier after closed head injury and inhibits mRNA expression of proinflammatory cytokines //Neurobiol. Dis.—2006.—V.22—P.257—264.

145. Facchinetti F., Del Giudice E., Furegato S., Passarotto M., et al. Cannabinoids ablate release of TNFalpha in rat microglial cells stimulated with lypopolysaccharide // Glia.— V.41—P.161—168.

146. Серков И.В., Безуглов B.B. // Успехи химии. 2009. Т. 78. С. 442-465.

147. Chu С. J., Huang S.M., De Petrocellis L., Bisogno T. et al. N-oleoyldopamine, a novel endogenous capsaicin-like lipid that produces hyperalgesia // J. Biol. Chem.—2003.— V.278—P. 13633—13639.

148. Toth A., Kedei N., Wang Y., Blumberg P.M. Arachidonyl dopamine as a ligand for the vanilloid receptor VR1 of the rat // Life Sci.—2003.—V.73—P.487—498.

149. Di Marzo V., Griffin. G., De Petrocellis L.; Brandi I. ey al. A structure/activity relationship study on arvanil, an endocannabinoid and vanilloid hybrid // J. Pharmacol. Exp. Ther.—2002.—V.300—P.984—991.

150. Devane W.A., Hanus L., Breuer A., Pertwee R.G. et al. Isolation and structure of a brain constituent that binds to the cannabinoid receptor // Science.—1992.—V.258—P. 1946-1949.

151. Guzman M. Cannabinoids: potential anticancer agents // Nat. Rev. Cancer.—2003.— V.3—P.745-755.

152. Hillard С J., Manna S., Greenberg M.J., DiCamelli R. et al. Synthesis and characterization of potent and selective agonists of the neuronal cannabinoid receptor (CB1) // J. Pharmacol. Exp. Ther.—1999.—V.289—P.1427—1433.

153. Bouaboula M., Poinot-Chazel C., Bourrie В., Canat X. et al. Activation of mitogen-activated protein kinases by stimulation of the central cannabinoid receptor CB1 // Biochem. J.—1995.—"V.312—P.637-641.

154. Van der Stelt M., Di Marzo V. Cannabinoid receptors and their role in neuroprotection // NeuromolecularMed—2005.—V.7—P.37—50.

155. Beni S., Kohen R., Reiter R., Tan D., Shohami E. Melatonin-induced neuroprotection after closed head injury is associated with increased brain antioxidants and attenuated late-phase activation ofNF-kappaB and AP-1 // FASEB J.—2004.—V.l 8—P.l 49—51.

156. Karanian D., Brown Q., Makriannis A., Bahr B. Blocking cannabinoid activation of FAK and ERK1/2 compromises synaptic integrity in hippocampus // Eur J Pharmacol.— 2005.—V.508—P.47—56.

157. Bobrov M.Y, Lizhin A.A, Andrianova E.L, Gretskaya N.M, et al. Antioxidant and neuroprotective properties of N-arachidonoyldopamine // Neurosci Lett.—2008.—V.431— P.6—11.

158. Bobrov M.Y, Lyzhin A.A, Andrianova E.L, Gretskaya N.M, et al. Antioxidant and neuroprotective properties of N-docosahexaenoyl dopamine // Bull Exp Biol Med.—2006.— V.142—P.425—427.J

Информация о работе

Андрианова, Екатерина Львовна
кандидата химических наук
Москва, 2009
ВАК 03.01.04

Диссертация

Про- и антиапоптотическое действие нейролипинов на трансформированные и нормальные клетки нервной системы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы