Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурные изменения гипокампа у белых мышей при стрессе и действии производного фосфорилуксусной кислоты

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Структурные изменения гипокампа у белых мышей при стрессе и действии производного фосфорилуксусной кислоты"

На правах рукописи

005058233

БАЛАШОВ Алексей Владимирович

СТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ГИППОКАМПА У БЕЛЫХ МЫШЕЙ ПРИ СТРЕССЕ И ДЕЙСТВИИ ПРОИЗВОДНОГО ФОСФОРИЛУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саранск 2013

005058233

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО "Мордовский государственный университет имени Н.П.Огарева"

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Ангелина Владимировна Зорькина

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Челышев Юрий Александрович

доктор медицинских наук, профессор Диндяев Сергей Валерьевич

Ведущее учреждение:

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова

Защита диссертации состоится «18» мая 2013 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 212.117.01 при ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева» по адресу: 430005, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева» по адресу: 430005, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68.

Автореферат диссертации опубликован на официальном сайте ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева» www.mrsu.ru: E-mail: dsovet@mrsu.ru

Автореферат разослан « »_2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Л.В. Кузьмичева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Морфофункциональные закономерности стрессорного повреждения организма и его структур представляют значительный интерес для анатомов, гистологов, физиологов и клиницистов (Меер-сон Ф.З., 1986; Пшенникова М.Г., 2000; Батышева Т.Т., 2007; Путилина М.В., 2011; Румянцева С.А., 2007). На сегодняшний день можно утверждать, что, не смотря на несомненные достижения в изучении данной проблемы, она все-таки очень далека от своего окончательного разрешения, особенно в плане изучения адаптации к стрессу нервной системы и её структурных компонентов.

В индустриально развитых странах человек постоянно подвергается воздействию различных стрессорных факторов разнообразной природы. В сочетании с другими этиопатогенетическими факторами это приводит к усугублению течения патологии центральной нервной системы (Бобровицкий И.П., Ушаков И.Б., 1998; Бурчинский С.Г., 2008; Гурович И.Я. с соавт., 2000; Гу-рович И .Я., 2001; Дмитриева Т.Б., 2001; Акарачкова Е.С., 2006). В частности, по данным статистики, в течение последних десятилетий среди ведущих медицинских и социальных проблем на первые позиции выходят цереброваску-лярные заболевания (Батышева Т.Т 2007; Гусев Е.И с соавт 2010; Суслина З.В., 2008; Шахпаронова Н.В., 2008; Шальнова С.А. с соавт., 2011; Путилина М.В., 2011; Камчатнов П.Р., 2011; Kwon D.Y. et al. 2008; Chen C.F. et al., 2011), в том числе и в республике Мордовия (Блинов Д.С., с соавт., 2011).

В рамках анализа указанной проблемы, следует отметить, что патогенез цереброваскулярных заболеваний и стрессорных расстройств, несмотря на ряд особенностей, имеет многие общие звенья. В частности: сложный многокомпонентный характер повреждения, напряжение симпатоадреналовых механизмов ауторегуляции, чрезмерная активация процесса перекисного окисления липидов, что приводит к церебральной гипоксии, апоптозу и некрозу нейроцитов (Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г., 1988, 1989; Гельфанд Б.Р. с соавт., 2007).

Важная роль стресс-реализующих систем и гипоксии в патогенезе цереброваскулярных расстройств подтверждается многочисленными данными литературы об эффективности антигипоксантов и стресспротекторов в экспериментальных условиях и в комплексной терапии данной патологии (Зорькина A.B., 1997; Блинов Д.С. с соавт., 2010; 2012). Перспективным направлением поиска эффективных нейропротекторов является изучение синтетических антиоксидантов из группы фосфорорганических неантихолинэстеразных средств. Ранее рядом авторов (Хафизьянова Р.Х., 1991; Цыбулькина В.Н., 1999) продемонстрирован нейропротекторный эффект димефосфона в эксперименте и у больных с цереброваскулярной патологией. Особое внимание привлекают к себе производные фосфорилуксусной кислоты, обладающие анксиолитическим, антидепрессивным и ноотропным эффектами (Семина И.И., 1988; 1999; 2002; Хафизьянова Р.Х, 1991; Ржевская Г.Ф. и соавт., 1996). Анализ литературы, посвященной данной группе веществ, свидетель-

ствует, что механизмы их фармакологических эффектов основаны на антиги-поксических (Курмышева Т.В., 2005), антиоксидантных (Семина И.И. с со-авт., 2002; Курмышева Т.В., 2005), мембраностабилизирующих (Семина И.Г. с соавт., 2001) и стресспротекторных свойствах (Балашова Г.В., 2009).

Среди ряда изученных соединений наибольшую стресспротекторную и кардиопротекторную активность (Кулькова Н.П., 2007; Альмяшева М.И. с соавт., 2006; Балашов В.П. с соавт., 2007; 2008) проявила трифторуксусно-кислая соль 4 - диметиламинофенил - 2 - хлорэтоксифосфорилацетилгид-разида (лабораторный шифр соединения - ХС-3635). Однако влияние данного вещества на структурные изменения нейронов в отделах центральной нервной системы, ответственных за поведенческие и двигательные реакции млекопитающих животных при стрессе ранее не изучались, что и предопределило цель нашего исследования.

Цель работы: изучить морфологические изменения зоны СА3 гиппо-кампа в условиях хронического стресса и действия трифторуксуснокислой соли 4 - диметиламинофенил - 2 - хлорэтоксифосфорилацетилгидразида (ХС 3635).

Задачи исследования:

1. Провести анализ структурных изменений нейроцитов зоны СА3 гиппокампа лабораторных грызунов на светооптическом уровне при действии стресса в сочетании с ХС 3635.

2. Изучить особенности ультраструктуры нейроцитов, глиоцитов и компонентов сосудистой стенки в зоне СА3 гиппокампа мышей при комбинированном действии стресса и ХС 3635.

3. Оценить некоторые механизмы нейропротекторных свойств ХС 3635.

Научная новизна. В тесте окраски зоны СА3 гиппокампа мышей кре-зиловым фиолетовым показана способность ХС 3635 уменьшать долю нейроцитов, находящихся в состоянии стресс-опосредованной деструкции. При иммуногистологическом исследовании показано усиление синтеза антиапоптотического белка Ьс1-х1 в клетках зоны СА3 гиппокампа крыс в условиях стресса на фоне действия ХС 3635.

При ультраструктурном исследовании выявлено цитопротекторное действие вещества ХС 3635, проявляющееся в поддержании типичного строения нейроцитов и глиоцитов зоны СА3 гиппокампа мышей, подвергнутых хроническому стрессу. Число нейроцитов с признаками дегенеративных изменений ультраструктуры ядра и цитоплазмы было относительно невелико. Преобладающей группой нейронов являлись «светлые» нейроны с хорошо развитой гранулярной эндоплазматической сетью. В них определялось крупное, богатое эухроматином ядро, имеющее ровные контуры поверхности. В нейропиле сохранялись многочисленные синаптические контакты, реже наблюдались нарушения ультраструктуры компонентов стенки сосудов микроциркуляторного русла, зоны периваскулярного отека были существенно уменьшены.

О протекторном действии ХС3635 свидетельствует повышение выживаемости мышей в тесте гиперкапнической гипоксии (при введении за 20 минут до прекращения доступа кислорода). Вещество увеличивает способность дезокси-гемоглобина присоединять кислород. Эффекты ХС3635 не могут быть объяснены блокадой реполяризующего калиевого тока нейронов.

Практическая ценность работы. Результаты проведенных исследований расширяют представления о закономерностях стрессорного повреждения нервной ткани в условиях применения потенциальных нейропротекторов. Данные, полученные о закономерностях и характере повреждения нейронов зоны САз гиппокампа, а также выявленные гистофармакологические эффекты ХС 3635 дополняют современные представления о молекулярно-генетических основах патологии нейрона и могут служить предпосылкой для разработки нового лекарственного средства.

Результаты исследования внедрены в научно-исследовательскую работу и учебный процесс кафедры цитологии, гистологии и эмбриологии с курсом медицинской биологии и кафедры фармакологии ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П.Огарева».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Стресс-опосредованное увеличение доли гиперхромных нейро-цитов в зоне СА3 гиппокампа уменьшается при действии ХС 3635, при этом активизируется синтез антиапоптотического белка bcl-xl.

2. Нарушения ультраструктуры компонентов нервной ткани в зоне СА3 гиппокампа, вызванные хроническим стрессом, корригируются ХС 3635.

3. Цитопротекторное действие производного фосфорилуксусной кислоты основано на его антигипоксических свойствах.

Апробация работы. Материалы, представленные в диссертации, докладывались и обсуждались на: ежегодных Огаревских чтениях и конференциях молодых ученых Мордовского государственного университета (Саранск 2006-2012); Российской конференции «Фармакология и токсикология фосфо-роорганических соединений и других биологически активных веществ» (Казань, 2008); IV съезде нейрохирургов Украины (Днепропетровск, 2008); научно практической конференции «Молодежь и наука: модернизация и инновационное развитие страны (Пенза, 2011), Молодежной научной конференции "Здравоохранение XXI века: проблемы и пути решения"; XI конгрессе международной ассоциации морфологов (Самара, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, 4 из которых - в изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста, документирована 4 таблицами и иллюстрирована 30 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), изложения собственных результатов (глава 3, 4 и 5), заключения (глава 6), выводов и библиографического указателя, включающего 193 источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования. Работа выполнена на 60 нелинейных белых мышах обоего пола массой 18-23 г и 15 не линейных белых крысах. Все животные содержались в условиях вивария при естественном режиме освещения. Животные были поделены на три равные по численности группы: 1 - животные интактного контроля, 2 - группа стресс-контроля и 3 -животные, в условиях стресса получавшие коррекцию ХС 3635 в дозе 4,3 мг/кг.

Стресс моделировали, помещая мышей в тесные пеналы, объемом 43 см3 (Коломейцева И.А., 1988; Hecht et al., 1971). Режим иммобилизации: один раз в сутки по 10 часов в течение 5 суток. Крыс иммобилизировали на спине по 3 часа 1 раз в сутки в течение 5 суток.

После завершения сеансов иммобилизации мышей и крыс выводили из эксперимента декапитацией под эфирным наркозом с соблюдением всех требований, изложенных в приложении №4 к «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных». Перед декапитацией всем животным интракардиально вводили 10% раствор параформа с добавлением глутарового альдегида (2 капли на 50 мл раствора параформа). После извлечения головного мозга из полости черепа орган фиксировали в 10% нейтральном формалине (для окраски крезиловым фиолетовым), 10% пара-форме (для иммуногистохимического исследования) или 3% растворе глутарового альдегида (для электронной микроскопии).

Прошедший фиксацию головной мозг промывали и проводили по спиртам возрастающей концентрации и заливали в парафин. На санном микротоме изготавливали серии фронтальных срезов мозга толщиной 5 мкм. Полученные срезы окрашивали крезиловым фиолетовым.

Окрашенные препараты изучали на световом микроскопе Jenaval (Австрия). Использовали малое увеличение (10x10x1,25) и большое увеличение (10x40x1,25). Фотосъёмку препаратов производили цифровой камерой САМ V 200 (Vision, Австрия) с последующей обработкой изображения в Adobe Photoshop 7,0. Выявляли и считали количество жизнеспособных («светлых») и «погибших» («темных») клеток в поле зрения при помощи программы Видеотест - Мастер Морфология.

Для иммуногистохимического исследования использовали антитела и разбавитель фирмы Spring Bioscience, США, стекла фирмы Menzel-Glaser с поли-Ь-лизиновым покрытием Thermo Scientific. Использовали антитела к bcl-xl (Rabbit monoclonal Sp.) 0,1 ml в разведении 1:200. Ядра докрашивали гематоксилином Эрлиха. Срезы просветляли в ксилоле, заключали в полистирол.

Для электронномикроскопического исследования кусочки головного мозга, содержащие гиппокамп, промывали в 0,15 М фосфатном буфере (pH 7,2) (три смены), проводили дополнительную постфиксацию в 1% осмиевой кислоте в течение 2 часов при 4° С. Обезвоживание образцов осуществляли их проведением через спирты возрастающей концентрации до абсолютного

этанола и окиси пропилена. Перед заливкой проводили пропитку материала в смеси эпоксидных смол с окисью пропилена в соотношении 1: 1 в течение 3 часов при непрерывном встряхивании. Заливку материала осуществляли в эпон — аралдит с последующей полимеризацией в течение 2 суток при 60 С. Ультратонкие срезы (50-80 нм) изготавливали на ультрамикротоме Ultracut (Австрия). Срезы монтировали на сетки и контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Полученный материал изучали на электронном микроскопе ЭМ-125.

Антигипоксическую активность ХС 3635 изучали на мышах на модели гиперкапнической гипоксии в герметических сосудах объемом 200 мл. Сразу после герметизации сосудов включали секундомер для определения времени потери животными естественного положение в пространстве и достижения ими горизонтального положения. Это время мы условно назвали «временем положения на бок».

Для выявления некоторых аспектов влияния тестируемого производного фосфорилуксусной кислоты на процессы транспорта кислорода гемоглобином использовали метод спектроскопии комбинационного рассеивания (Максимов Г.В., 2011; Юсипович А.И., 2008). Измерения проводили на рама-новском спектрометре in via Basis фирмы Renishaw с короткофокусным высокосветосильным монохроматором (фокусное расстояние не более 250 мм). Для возбуждения рамановских спектров использовали лазер с длиной волны излучения 532 нм, мощностью излучения 100 мВт. Регистратор данных -CCD детектор (1024x256 пикселей) с решеткой 1800 штр/мм. Оцифрованные спектры обработаны в программе WIRE 3.3. Исследовали мазки крови доноров. В контрольных опытах в мазок добавляли каплю 0,9% раствора хлорида натрия, а в опытных сериях - растворы ХС 3635 до конечных концентраций 5, 50 и 500 мкг/мл.

Для анализа конформации гемопорфирина и Ог-связывающих свойств гемоглобина использовали определенные характерные полосы спектра КР: 1355, 1375, 1548-1552, 1580 - 1588. Полосы 1355 и 1375 см"1 опосредованы симметричными колебаниями пиррольных колец в молекулах дезоксигемо-глобина и оксигемоглобина соответственно. Определяли соотношение ин-тенсивностей I1375 /(I1355 + I1375), отражающее относительное количество оксигемоглобина в крови. Полосы 1548-1552 и 1580 - 1588 см"1 связаны с колебанием метановых мостиков между пирролами в молекулах гемоглобина с растянутым и деформированным гемопорфирином соответственно. Отношение интенсивностей I1355 /I1550 свидетельствует об относительной способности всего гемоглобина в пробе связывать О2, а соотношение I1375 Л^о - об относительной способности гемоглобина освобождать О2.

Изменение калиевого проведения регистрировали с помощью точечной фиксации потенциалов на одиночных калиевых каналах замедленного выпрямления изолированных нейронов глоточного кольца большого прудовика ПЭТЧ-методом (Неер Э.И.,Сакман Б., 1992).

С помощью чистой стеклянной поверхности кончика микроэлектрода (диаметр — 1 мкм) образовывали плотный электрический контакт (>10 ГОм) с

мембраной клетки (конфигурация «cell-atached»). Это позволяло регистрировать токи с мембранного фрагмента под кончиком микроэлектрода, в котором содержался единственный калиевый канал (в конфигурации «singlechannel»). Контакт между клеткой и микроэлектродом отличался высокой механической прочностью, поэтому, при удалении микроэлектрода от пипетки, фрагмент мембраны отрывался от клетки, и формировалась конфигурация «Inside-out», при которой внутренняя сторона мембраны оказывалась обращенной в экспериментальную камеру, что позволяло проверять действие тестируемого соединения на ионный канал с внутренней стороны (конфигурация «whole-cell»).

Для перфузии камеры использовали раствор Тироде слудующего состава (мМ): NaCl-145; КС1-4; СаС12-1,8; MgCl2-l; трис-5; глюкоза-10; рН раствора доводили соляной кислотой до 7,2 - 7,4. Раствор насыщали чистым кислородом при температуре 38°С, температура в камере составляла 35°С, время полной смены раствора - около 100с.

Результаты исследований обработаны методом вариационной статистики. Достоверность различий между сравнительными рядами данных оценивали методами «х2» и t-критерия Стьюдента (Беленький M.JL, 1963; Закс, 1978; Сернов JI.H., Гацура В.В., 2000).

В работе исследовали свойства трифторуксуснокислой соли 4 - диме-тиламино-фенил - 2 - хлоэтоксифосфорилацетилгидразида (ХС - 3635).

ХС 3635 — белый кристаллический порошок без запаха. Вещество неограниченно растворимо в воде, метиловом и этиловом спиртах, ацетоне, хлороформе, бензоле. В работе использовали водные растворы вещества, вводимые в дозе 4,3 мг/кг.

Вещество синтезировано и предоставлено нам для исследования ведущим научным сотрудником Казанского государственного химико-технологического университета к.х.н. Тарасовой Р.И. в виде химически чистой субстанции.

Результаты исследования и их обсуждение. На первом этапе работы мы оценили наличие стресс-протекторного эффекта ХС 3635, используя различные методы выявления интенсивности повреждения нейроцитов зоны СА3 гиппокампа лабораторных грызунов, в условиях моделирования иммо-билизационного стресса. Для решения поставленной задачи были выбраны две методики: окрашивания тканей крезиловым фиолетовым (рис. 1) и имму-ногистохимическая реакция нейроцитов и глиоцитов зоны СА3 гиппокампа к антиапоптозному белку bcl-xl.

В группе интактных животных окрашивание срезов САз - зоны гиппокампа мышей крезиловым фиолетовым выявило относительно невысокое содержание гиперхромных клеток. Большинство нейронов и глиоцитов имели светлую цитоплазму и содержали светлые ядра, в которых выявлялось относительно небольшое количество глыбок гетерохроматина. Видимо, это связано с хорошим функциональным состоянием нейронов исследуемой зоны гиппокампа.

У животных, находившихся в условиях длительного иммобилизацион-ныго стресса, светомикроскопическая картина зоны СА3 гиппокампа существенно менялась. При окраске крезиловым фиолетовым визуализировалось значительное увеличение числа «темных» нейронов и глиоцитов. Распределение таких клеток в разных участках зоны заметно варьировало. Наблюдались как участки с небольшим числом интенсивно окрашенных клеток, так и участки с высокой плотностью расположения таких нейронов. Полиморфизм проявлялся и тем, что в гиппокампе в условиях стресса могли быть видны нейроны, полностью заполненные красителем, тогда как часть клеток, содержала крезиловый фиолетовый только в цитоплазме. Близкие результаты были получены в условиях аудиогенного стресса Е.В. Кудиновой (2004). Кроме того, в исследуемом отделе головного мозга при стрессе часто наблюдались «темные» эндотелиоциты в стенках мелких кровеносных сосудов.

интактные стресс ХС 3635

Рис. 1. Число гиперхромных нейронов (в % к общему числу нейронов) у мышей различных экспериментальных групп

У животных, получавших на фоне стресса коррекцию веществом ХС 3635, наблюдалась некоторое улучшение морфологических характеристик в исследуемой зоне гиппокампа. При использовании ХС 3635 значительно уменьшалось количество гиперхромных клеток, содержащих краситель. В зонах с окрашенными клетками наблюдалось значительно меньше «темных» дегенерирующих клеток. В таких зонах стали преобладать клетки с окрашенной цитоплазмой и светлым ядром. В сосудистом русле коры большого мозга и гиппокампа при введении препаратов визуально несколько уменьшалось количество «темных» эндотелиоцитов. Тем не менее, капилляры с «темным» эпителием отмечались достаточно часто.

Наши данные хорошо согласуются с ранее полученными результатами о зависимости между морфофункциональным состоянием нейронов СА3 зоны гиппокампа мышей и моторной и исследовательской активностью ин-тактных мышей при стрессе и действии ХС 3635 (Балашов В.П. с соавт., 2005; Балашова Г.В., 2009). В этом плане можно отметить, что стрессорное

воздействие существенно нарушает двигательную и исследовательскую активность животных в "открытом поле", а также разрушает условнорефлек-торную деятельность мышей в Т-образном лабиринте. Исследуемое нами соединение заметно устраняет негативное действие стресса.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что иммобилизацион-ный стресс способствует увеличению в зоне СА3 гиппокампа числа нейронов с измененным морфофункциональным состоянием, тогда как вещество ХС 3635 заметно предупреждает такой рост. Однако полученные данные не позволяют судить о степени функциональных изменений в "темных" нейронах. Не ясно, обратимы такие нарушения или нет. Для уточнения степени нарушений морфофункциональных изменений нейроцитов гиппокампа при стрессе мы использовали метод изучения интенсивности иммуногистохимической реакции нейронов зоны СА3 гиппокампа у крыс к антиапоптозному белку Ьс1-х1.

Полученные данные свидетельствуют, что у интактных животных нейроциты СА3 зоны гиппокампа давали слабую иммуноположительную реакцию при взаимодействии с антителами к Ьс1-х1. Интенсивность этой иммуногистохимической реакции заметно увеличивалась у животных, подвергавшихся хроническому стрессу. Мы предположили, что у крыс, находящихся в состоянии обычного эмоционального и физического состояния, ан-тиапоптотические белки синтезируются весьма умерено, тогда как стресс способствует усилению экспрессии антиапоптозных факторов. Максимальную интенсивность иммуногистохимической реакции с антителами к Ьс1-х1 в СА, зоне гиппокампа наблюдали у животных третьей экспериментальной группы. На основании полученных данных мы предположили, что своё цито-и нейропротекторное действие при стрессе тестируемое соединение во многом осуществляет за счет вероятного снижения апоптоза нейронов исследуемой зоны гиппокампа.

Для оценки характера структурных изменений, наблюдающихся в нейроцитах и глиоцитах гиппокампальной извилины при хроническом иммо-билизационном стрессе и действии ХС 3635, был применен электронно-микроскопический метод исследования.

Данные, полученные при ультраструктурном исследовании, хорошо согласуются с представленными выше результатами. У интактных мышей нейроциты и глиоциты не имели выраженных дегенеративных изменений ультраструктуры. Нейроны несколько варьировали по размерам и степени осмиофильности цитоплазмы, но преобладающей их группой являлись «светлые» нейроны с хорошо развитой гранулярной эндоплазматической сетью. В таких нейронах визуализировалось округлое светлое ядро, располагающееся обычно в центральной части перикариона. Контуры ядра, как правило, были ровными, крупные инвагинации или выросты отсутствовали. Ядерная оболочка имела типичное строение, была представлена двумя ядерными мембранами, разделенными узким перинуклеарным пространством. В нейро-пиле было обычным переплетение безмиелиновых мелких и средних нервных волокон, часто с неполной глиальной оболочкой. Миелиновые волокна

встречались реже. Обычно это были мелкие проводники. Характерной особенностью нейропиля животных интактной группы было обилие синаптиче-ских контактов, в которых четко выявлялись везикулы в пресинаптическоих терминалях и четкие ферментоактивные зоны

Для животных группы стресс-контроля были характерны изменения ультраструктуры перикарионов и их отростков. Выраженность таких изменений значительно варьировала в разных нейронах и в разных участках зоны САэ гиппокампа. При электронномикроскопическом исследовании мы наблюдали клетки и с типичным строением и с признаками дегенеративных изменений. Такие нейроны были осмиофильны. Следует отметить, что встречаемость нейронов с признаками нейродегенеративных перестроек примерно соответствовала частоте выявления "темных" нейроцитов при светомикро-скопйческом исследовании парафиновых срезов, окрашенных крезиловым фиолетовым.

Хроническое стрессовое воздействие приводило к изменению формы и структуры ядер большой части нейронов. Наряду с округлыми ядрами типичной структуры можно было наблюдать ядра с различными выростами и инвагинациями оболочки. В таких ядрах часто изменялись размеры ядрышек. Для животных группы стресс-контроля были характерны повреждения цито-плазматических структур нейронов. Часто выявлялись нарушения в структуре гранулярной ЭПС. Типичными среди них были расширение канальцев ЭПС, уменьшение количества рибосом на их мембранах. Возможно, канальца подвергались фрагментации, так как, в «темных» нейронах обычно отмечались более короткие канальца гЭПС. Характерным было увеличение размеров органелл, в частности - появление гигантских митохондрий. Причем, гигантские митохондрии мы наблюдали не только в перикарионе, но и в крупных миелинизированных и немиелинизированных отростках нейронов. Комплекс Гольджи претерпевал менее значительные изменения структуры. Часть нейронов содержала диктиосомы, имеющие вид стопки близко лежащих параллельных мембран с единичными везикулами около них.

Важнейшей особенностью, которую мы выявили при электронномикроскопическом исследовании зоны САЗ гиппокампа мышей группы стресс-контроля, было уменьшение выявляемое™ синапсов в нейропиле. Видимо данный факт объясняется повреждением нейролемм нервных отростков и развитием обширных зон отека. Можно предположить, что деструкция синапсов при стрессе приводит к «деафферентации» нейронов гиппокампа, и, соответственно, к нарушению их ответной реакции на сигналы внешней среды, что, в конечном итоге, может служить объяснением фактов нарушения условно-рефлекторной и мнестической активности животных (Ховряков А.В, 2002).

У животных второй экспериментальной группы также наблюдали перестройку нейроглиальных элементов. В астроцитах, особенно в «сосудистых» ножках астроцитов, часто выявлялся выраженный отек цитоплазмы, иногда приводящий к ухудшению гемодинамических свойств сосудов головного мозга. Обычно эти изменения наблюдались в астроцитах, окружающих «темные» осмиофильные нейроны гиппокампа. Деструктивные изменения в телах

астроцитов, проявлялись также просветлением матрикса цитоплазмы, уменьшением количества внутриклеточных органелл, появлением вакуолей и многочисленных гранул липофусцина.

Хронический стресс заметно изменял ультраструктуру компонентов стенки сосудов микроциркуляторного русла. В гиппокампе животных группы стресс-контроля мы наблюдали наряду с выраженным периваскулярным отеком изменения строения эндотелия капилляров. Ядра эндотелиоцитов часто имели высокую электронную плотность. В них с трудом определялись участки эухроматина.

ХС 3635 оказывает заметное коррегирующее действие на ультраструктуру нервных клеток, глиоцитов, компонентов нейропиля и сосуды микроциркуляторного русла в гиппокампе. У животных 3-й группы мы наблюдали заметный полиморфизм ультраструктуры нейронов. Как и у мышей группы стресс-контроля среди нейроцитов встречались и "светлые" и "темные" клетки. Причем большинство составляли светлые нейроны с типичным строением. Встречаемость нейронов с высокой осмиофильностью ядра и цитоплазмы была значительно меньшей. Можно отметить появление значительной доли промежуточных по осмиофильности цитоплазмы нейронов - с адаптивно -компенсаторными перестройками их ультраструктуры.

Отростки таких нейронов выглядели менее поврежденными. В них, как и при хроническом стрессе, наблюдали просветление нейроплазмы, образование миелиноподобных телец, появление крупных митохондрий. Однако доля разрушающихся отростков у нейронов была значительно меньше, чем при стрессе. В отростках выраженность перестроек ультраструктурных компонентов также уменьшались. В некоторых миелиновых волокнах наблюдалось разволокнение миелиновой оболочки, иногда с образованием миелиноподобных телец. Однако это обнаруживалось достаточно редко.

Наиболее важным фактом по нашему мнению является увеличение (по сравнению с группой стресс-контроля) выявляемое™ синаптических контактов в нейропиле. Хотя следует отметить, что часть синапсов имела нетипичное строение. В некоторых синапсах сохранялись активные зоны, но отсутствовали синаптические везикулы. В других - при сохранности активных зон пресинапс был переполнен пузырьками с медиатором. В целом, на наш взгляд, межнейронные связи при действии ХС 3635 были заметно компенсированы, по сравнению с негативным действием стресса.

Другим положительным эффектом ХС 3635 было поддержание ультра структуры сосудов микроциркуляции. По нашим данным большая часть таких сосудов имела морфологию близкую к норме. Интерстициальный отек при действии ХС 3635 выявлялся редко и обычно носил очаговый характер. Вследствие меньшей степени периваскулярного отека значительная часть сосудов имела нормальный просвет и ультраструктура компонентов их стенки была близка к типичной, что наблюдалось у животных интактной группы

Небольшая часть сосудов микроциркуляции по своей морфологии соответствовала капиллярам животных группы стресс-контроля. По нашему мнению, данный факт корреллирует со степенью деструкции компонентов

нейропиля, что, видимо, и приводит к развитию интерстициального и пери-васкулярного отека. Отек уменьшал просвет сосуда и, очевидно, вызывал деформацию эндотелиоцитов, что визуализировалось повышением осмиофиль-ности их цитоплазмы и, в меньшей степени, ядра. У сосудов с такими особенностями ультраструктуры стенки иногда выявлялась гипертрофия базаль-ной мембраны эндотелия.

В целом, можно отметить, что уменьшение степени деструкции сосудов микроциркуляторного русла под влиянием ХС 3635 способствовало поддержанию их дренажной и трофической функции и приводило к заметному цитопротекторному эффекту как в отношении нейроцитов зоны САз гиппо-кампа, так и в отношении глиальных элементов зоны.

Является интересным сравнение полученных нами данных с ранее выполненными исследованиями И.В. Гунькина (2010). В своей работе автор сравнивает нейропротекторные свойства пирацетама и кортексина на модели стрессорного повреждения, использованной и в нашем исследовании. Сравнив данные работ, мы можем сделать вывод, что ХС 3635 по своим нейро-протекторным свойствам заметно превосходит такие неротрофики и нейро-протекторы, как пирацетам и кортексин.

В заключение мы предприняли попытку выявить некоторые вероятные механизмы стресспротекторного действия ХС 3635. Опираясь на работы ученых, изучавших фармакологические свойства представителей данной группы соединений (Семина И.И. с соавт., 1999; 2001; 2002) и, в частности ХС 3635 (Курмышева Т.В., 2005), мы предположили, что исследуемое вещество способно проявлять антигипоксические свойства. Данное предположение мы подтвердили в опытах на модели гиперкапнической гипоксии (рис. 2) .

Мин. 35 30 25 20 15 10 5 0

Рис. 2. Влияние величины латентного периода после введения ХС 3635 (4,3 мг/кг, внутрибрюшинно) на время "положения мышей на бок" на модели гиперкапнической гипоксии. * - отличия от контроля достоверны при р<0,05.

При этом эффект соединения существенно зависел от латентного периода введения вещества. При введении ХС 3635 за 20 минут до прекращения поступления воздуха в герметически замкнутый сосуд мы выявили увеличение времени "положения "животных на бок, тогда как при уменьшении вре-

контролль за 1 мин за 20 мин

мени латентного периода антигипоксическое действие вещества не проявлялось.

В опытах in vitro с использованием метода лазерного комбинационного рассеивания (табл. 1) мы продемонстрировали, что антигипоксический эффект ХС 3635 может быть в некоторой части объяснён способностью дезок-сигемоглобина более активно присоединять кислород. В частности, в контрольных опытах эта характеристика гемоглобина составила 0,996±0,0076, а под влиянием ХС 3635 она увеличилась до 1,(ПСЫ),0022 (р<0,05).

Таблица 1.

Соотношение интенсивностей полос спектра комбинационного рассеяния при анализе эритроцитов доноров при действии ХС 3635 в различных концентрациях.

ХС 3635 (мкг/мл) Il375/(Il355 + Il375) относительное количество оксигемоглобина I1355/I1550 способность дезоксигемоглобина связывать кислород I1375/I1580 способность оксигемоглобина освобождать кислород

Контроль 0,6130±0,0032 0,9960±0,0076 0,6500±0,0095

5 0,6220±0,0050 1,0700±0,0022* 0,5920±0,0017*

50 0,5900±0,0046* 1,0600±0,0086 0,5790±0,0024*

500 0,5820±0,0016* 1,0110±0,0028 0,6030±0,0013*

Примечание: *- отличия от контроля достоверны при р<0,05.

Изучение электрофизиологических свойств ХС 3635 в опытах на калиевых каналах задержанного выпрямления в нейронах окологлоточного кольца большого прудовика позволило нам исключить из механизма действия тестируемого соединения гипотезу о его способности непосредственно модулировать электрофизиологические свойства нейролеммы.

Таким образом, комплекс проведенных нами исследований свидетельствует о способности ХС 3635 существенно уменьшать количественные и качественные характеристики негативного действия стресса на структурные компоненты зоны САЗ гиппокампа лабораторных грызунов. Одним из механизмов стресспротекторного действия вещества, по-видимому, является его антигипоксическая активность.

выводы

1. У белых мышей, подвергнутых хроническому иммобилизацион-ному стрессу, в зоне САз гиппокампа при действии ХС 3635 (4,3 мг/кг) наблюдается снижение количества гиперхромных нейронов.

2. Стресс-индуцированная экспрессия антиапоптотического белка bcl-xl в нейроцитах и глиоцитах САз-зоны гиппокампа крыс усиливается под влиянием ХС 3635.

3. В условиях стресса у мышей и применения ХС 3635 наблюдается коррекция нарушений ультраструктуры нейронов и глиоцитов САз-зоны гиппокампа, а также нормализация структуры и увеличение количества си-наптических контактов.

4. Деструктивные изменения компонентов стенки сосудов микро-циркуляторного русла и периваскулярный отек, у животных, получавших в качестве стресс протектора ХС 3635, наблюдаются реже.

5. Механизм цитопротекторного действия ХС 3635 реализуется через его антигипоксические свойства и повышение сродства дезоксигемогло-бина к кислороду и не опосредован блокадой потенциал-зависимых калиевых каналов задержанного выпрямления.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Изучаемое вещество - ХС 3635, может представлять интерес для создания на его основе перспективного отечественного стресспротекторного и нейропротекторного средства.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гунькин И.В., Ховряков А.В, Абрамов В.Н, Балашов A.B., Аль-мяшева М.И. Морфологические изменения клеток прецентральной извилины мышей при стрессе и протекции ноотропами // IV Съезд нейрохирургов Украины. Материалы съезда. Днепропетровск, 2008. - С.207.

2. Балашов В.П., Абрамов В.Н., Ховряков A.B., Балашов A.B., Альмяшева М.И., Гунькин И.В. Ультраструктурные изменения гиппокампа мышей при стрессе и действии веществ с ноотропными свойствами // Морфологические ведомости. 2008, № 3-4. - С.4-7.

3. Литюшкина A.A., Альмяшева М.И., Шиханов П.П., Гунькин И.В., Балашов A.B. Стресспротекторные свойства производных фосфорилуксусной кислоты. // Фармакология и токсикология фосфорорганических соединений и других биологически активных веществ. Вып. 4. Материалы Российской конференции. Казань, 2008. - С.15.

4. Альмяшева М.И., Балашов В.П., Гунькин И.В., Литюшкина A.A. Ванькова JI.B., Балашов A.B. Анализ морфофункциональных аспектов адаптации органов и тканей белых мышей при хроническом стрессе // Морфология, 2009. Т.136. -№4. - С.17.

5. Балашов В.П., Балашов A.B., Кругляков П.П., Зорькина A.B. Морфология нейронов двигательной коры и гиппокампа мышей при стрессе// Морфология. 2012. - №3. - С. 19-20.

6. Балашов В.П., Исаева И.А., Кузьмичева JI.B., Кабаева Г.Н., Балашов A.B., Чистяков С.И., Курмышева Т.В. Исследование антигипо-ксических свойств производных фосфорилуксусной кислоты// Современные проблемы науки и образования, 2013. - №1. URL: www.science-cducation.ru/107-8259.

7. Исаева И.А., Балашов A.B., Кабаева Г.Н., Балашов В.П., Кузьмичева JI.B., Чистяков С.И., Курмышева Т.В. Исследование антигипоксических свойств производных фосфорилуксусной кислоты// Здравоохранение XXI века: проблемы и пути решения: материалы молодежной научной конференции с элементами научной школы - Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2012. -С. 71-75.

Подписано в печать 11.04.13. Объем 1,0 п. л. Тираж 100 экз. Заказ № 565. Типография Издательства Мордовского университета 430005, г. Саранск, ул. Советская, 24

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Балашов, Алексей Владимирович, Саранск

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «МОРДОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

им. Н.П.ОГАРЕВА»

04201357265 На правах рукописи

БАЛАШОВ Алексей Владимирович

СТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ГИППОКАМПА У БЕЛЫХ МЫШЕЙ ПРИ СТРЕССЕ И ДЕЙСТВИИ ПРОИЗВОДНОГО ФОСФОРИЛУКСУСНОЙ

кислоты

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор А.В. Зорькина

Саранск 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

Введение 3

ГЛАВА 1. (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 8

1.1. Современные представления о структурной организации 8 нервной ткани

1.2. Морфология гиппокампа 23

1.3. Стресс и его роль в этиопатогенезе повреждений головного 28 мозга

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 37

2.1. Характеристика подопытных животных 3 7

2.2 Моделирование стресса и взятие материала 38

2.3 Метод световой микроскопии 38

2.4 Иммуногистохимические методы исследования 39

2.5 Метод электронной микроскопии 40

2.6 Исследование антигипоксической активности 40

2.7 Метод спектроскопии комбинационного рассеивания 41

2.8 Методы изучения калиевой проводимости на нейронах боль- 42 шого прудовика

2.9 Статистическая обработка 43

2.10 Характеристика исследуемых соединений 43 ГЛАВА 3. Количественный анализ повреждения нейроцитов зо- 45 ны Са3 гиппокампа в условиях стресса и протекции ХС 3635 ГЛАВА 4. Ультраструктурные аспекты нейропротекторного дей- 55 ствия ХС 3635 при стрессе

ГЛАВА 5. Исследование некоторых свойств производного фос- у форилуксусной кислоты (ХС 3635)

5.1 Антигипоксические свойства вещества 79

5.2. Влияние ХС 3635 на калиевый ток задержанного выпрямле- 83 ния нейронов ганглиев окологлоточного кольца большого прудовика

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 87

ВЫВОДЫ 96

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 97

ЛИТЕРАТУРА 98

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Морфофункциональные закономерности стрессорного повреждения организма и его структур представляют значительный интерес для анатомов, гистологов, физиологов и клиницистов (Меерсон Ф.З., 1986; Пшенникова М.Г., 2000; Батышева Т.Т., 2007; Путилина М.В., 2011; Румянцева С.А., 2007). На сегодняшний день можно утверждать, что, не смотря на несомненные достижения в изучении данной проблемы, она все-таки очень далека от своего окончательного разрешения, особенно в плане изучения адаптации к стрессу нервной системы и её структурных компонентов.

В индустриально развитых странах человек постоянно подвергается воздействию различных стрессорных факторов разнообразной природы. В сочетании с другими этиопатогенетическими факторами это приводит к усугублению течения патологии центральной нервной системы (Бобровицкий И.П., Ушаков И.Б., 1998; Бурчинский С.Г., 2008; Гурович И.Я. с соавт., 2000; Гуро-вич И .Я., 2001; Дмитриева Т.Б., 2001; Акарачкова Е.С., 2006). В частности, по данным статистики, в течение последних десятилетий, среди ведущих медицинских и социальных проблем на первые позиции выходят цереброваскуляр-ные заболевания (Батышева Т.Т 2007; Гусев Е.И с соавт 2010; Суслина З.В., 2008; Шахпаронова Н.В., 2008; Шальнова С.А. с соавт., 2011; Путилина М.В., 2011; Камчатнов П.Р., 2011; Kwon D.Y. et al. 2008; Chen C.F. et al., 2011), в том числе и в республике Мордовия (Блинов Д.С., с соавт., 2011).

В рамках анализа указанной проблемы, следует отметить, что патогенез цереброваскулярных заболеваний и стрессорных расстройств, несмотря на ряд особенностей, имеет многие общие звенья. В частности, сложный многокомпонентный характер повреждения, напряжение симпатоадреналовых механизмов ауторегуляции, чрезмерная активация процесса перекисного окисления липидов, что приводит к церебральной гипоксии, апоптозу и некрозу нейроци-

тов (Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г., 1988, 1989; Гельфанд Б.Р. с соавт., 2007).

Важная роль стресс-реализующих систем и гипоксии в патогенезе цереб-роваскулярных расстройств подтверждается многочисленными данными литературы об эффективности антигипоксантов и стресспротекторов в экспериментальных условиях и в комплексной терапии данной патологии (Зорькина A.B., 1997; Блинов Д.С. с соавт., 2010; 2012). Перспективным направлением поиска эффективных нейропротекторов является изучение синтетических ан-тиоксидантов из группы фосфорорганических неантихолинэстеразных средств. Ранее рядом авторов (Хафизьянова Р.Х., 1991; Цыбулькина В.Н., 1999) продемонстрирован нейропротекторный эффект димефосфона в эксперименте и у больных с цереброваскулярной патологией. Особое внимание привлекают к себе производные фосфорилуксусной кислоты, обладающие ан-ксиолитическим, антидепрессивным и ноотропным эффектами (Семина И.И., 1988; 1999; 2002; Хафизьянова Р.Х., 1991; Ржевская Г.Ф. и соавт., 1996). Анализ литературы, посвященной данной группе веществ, свидетельствует, что механизмы их фармакологических эффектов основаны на антигипоксических (Курмышева Т.В., 2005), антиоксидантных (Семина И.И. с соавт., 2002; Кур-мышева Т.В., 2005), мембраностабилизирующих (Семина И.Г. с соавт., 2001) и стресспротекторных свойствах (Балашова Г.В., 2009).

Среди ряда изученных соединений наибольшую стресспротекторную и кардиопротекторную активность (Кулькова Н.П., 2007; Альмяшева М.И. с соавт., 2006; Балашов В.П. с соавт., 2007; 2008) проявила трифторуксуснокислая соль 4 - диметиламинофенил - 2 - хлорэтоксифосфорилацетилгидразида (лабораторный шифр соединения - ХС-3635). Однако, влияние данного вещества на структурные изменения нейронов в отделах центральной нервной системы, ответственных за поведенческие и двигательные реакции млекопитающих животных, при стрессе ранее не изучались, что и предопределило цель нашего исследования.

Цель работы: изучить морфологические изменения зоны СА3 гиппокампа в условиях хронического стресса и действия трифторуксуснокислой соли 4 -диметиламинофенил - 2 - хлорэтоксифосфорилацетилгидразида (ХС 3635).

Задачи исследования:

1. Провести анализ структурных изменений нейроцитов зоны САз гиппокампа лабораторных грызунов на светооптическом уровне при действии стресса в сочетании с ХС 3635.

2. Изучить особенности ультраструктуры нейроцитов, глиоцитов и компонентов сосудистой стенки в зоне СА3 гиппокампа мышей при комбинированном действии стресса и ХС 3635.

3. Оценить некоторые механизмы нейропротекторных свойств ХС 3635.

Научная новизна. В тесте окраски зоны СА3 гиппокампа мышей кре-зиловым фиолетовым показана способность ХС 3635 уменьшать долю нейроцитов, находящихся в состоянии стресс-опосредованной деструкции. При иммуногистологическом исследовании показано усиление синтеза анти-апоптотического белка Ьс1-х1 в клетках зоны СА3 гиппокампа крыс в условиях стресса на фоне действия ХС 3635.

При ультраструктурном исследовании выявлено цитопротекторное действие вещества ХС 3635, проявляющееся в поддержании типичного строения нейроцитов и глиоцитов зоны СА3 гиппокампа мышей, подвергнутых хроническому стрессу. Число нейроцитов с признаками дегенеративных изменений ультраструктуры ядра и цитоплазмы было относительно невелико. Преобладающей группой нейронов являлись «светлые» нейроны с хорошо развитой гранулярной эндоплазматической сетью. В них определялось крупное, богатое эухроматином ядро, имеющее ровные контуры поверхности. В нейропиле сохранялись многочисленные синаптические контакты, реже наблюдались нарушения ультраструктуры компонентов стенки сосудов микроциркуляторного русла, зоны периваскулярного отека были существенно уменьшены.

О протекторном действии ХС3635 свидетельствует повышение выживаемости мышей в тесте гиперкапнической гипоксии (при введении за 20 минут до прекращения доступа кислорода). Вещество увеличивает способность дезокси-

гемоглобина присоединять кислород. Эффекты ХС3635 не могут быть объяснены блокадой реполяризующего калиевого тока нейронов.

Практическая ценность работы. Результаты проведенных исследований расширяют знания о закономерностях стрессорного повреждения нервной ткани в условиях применения потенциальных нейропротекторов. Данные, полученные о закономерностях и характере повреждения нейронов зоны СА3 гиппокампа, а также выявленные гистофармакологические эффекты ХС-3635 дополняют современные представления о молекулярно-генетических основах патологии нейрона и могут служить предпосылкой для разработки нового лекарственного средства.

Результаты исследования внедрены в научно-исследовательскую работу и учебный процесс кафедры цитологии, гистологии и эмбриологии с курсом медицинской биологии и кафедры фармакологии ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П.Огарева».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Стресс-опосредованное увеличение доли гиперхромных нейро-цитов в зоне СА3 гиппокампа уменьшается при действии ХС 3635, при этом активизируется синтез антиапоптотического белка Ьс1-х1.

2. Нарушения ультраструктуры компонентов нервной ткани в зоне СА3 гиппокампа, вызванные хроническим стрессом, коррегируются ХС 3635.

3. Цитопротекторное действие производного фосфорилуксусной кислоты основано на его антигипоксических свойствах.

Апробация работы. Материалы, представленные в диссертации, докладывались и обсуждались на: ежегодных Огаревских чтениях и конференциях молодых ученых Мордовского государственного университета (Саранск 2006-2012); Российской конференции «Фармакология и токсикология фосфо-роорганических соединений и других биологически активных веществ» (Казань, 2008); IV съезде нейрохирургов Украины (Днепропетровск, 2008); научно практической конференции «Молодежь и наука: модернизация и инновационное развитие страны (Пенза, 2011), Молодежной научной конферен-

ции "Здравоохранение XXI века: проблемы и пути решения"; XI конгрессе международной ассоциации морфологов (Самара, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, 4 из которых - в изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста, документирована 4 таблицами и иллюстрирована 30 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), изложения собственных результатов (глава 3, 4 и 5), заключения (глава 6), выводов и библиографического указателя, включающего 193 источника.

ГЛАВА 1. (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Современные представления о структурной организации

нервной ткани

Структурная и функциональная организация нервной ткани сегодня остается предметом глубоких и многочисленных исследований морфологов различных стран. Несмотря на определенные успехи в этом направлении, наши знания остаются, достаточно, поверхностными, и не отвечают в полной мере требованиям клиницистов и представителей смежных фундаментальных научных специальностей.

Сегодня хорошо известно, что клетки, образующие нервную ткань, подразделяют на две группы: нейроциты и нейроглию. Нейроциты являются ведущим клеточным типом, поскольку все основные функции ткани основаны на свойстве нейроцитов - генерировать и (или) передавать возбуждение на соседние нейроны и на эффекторные клетки. Среди глиальных элементов различают клетки макро- и микроглии. Первая группа клеток наиболее широко представлена и к ней относят астроциты, олигодендроциты и эпендимо-циты. Микроглиоциты представлены одним типом клеток. При этом, если макроглиальные элементы формируются из дорсальной эктодермы, то микроглиоциты гистогенетически являются моноцитарными производными (Питере А. и др., 1972, Артюхина Н.И., 1979; Бабминдра В.П., 1987; Сосунов A.A., Чучков В.М, 1995). Нейроглиальные клетки, согласно классическим представлениям, являются вспомогательными и помогают нейронам реали-зовывать их специфические функции (Бабминдра В.П., 1982).

Сегодня неопровержимо установлено, что в нервной ткани находится еще один тип нейроглиальных клеток, так называемые КС2-клетки. По данным Подрезовой Е.П. и соавторов (2008), эти клетки могут проявлять свойства стволовых нейральных клеток дефинитивного организма.

Нейроциты и глиоциты располагаются во внеклеточном матриксе, образованном смесью гликозаминогликанов, протеогликанов и гликопротеи-нов. Эти сложные химические компоненты располагаются между клетками нервной ткани и сосудами микроциркуляции, и в ходе нейрогенеза способствуют возникновению различных контактов между нейроцитами и глиоцита-ми (Dityatev A. Et all, 2004; Golgi С., 2006; Loers G. and Schachner M., 2007). В сформировавшейся ткани внеклеточный матрикс является средой для реализации пластических процессов (Benson D.L. et all, 2000; Bernard-Trifilo J.A. et all, 2005).

Нейроциты или нейроны в разных отделах центральной и периферической нервной системы имеют различную форму. Чаще от тела нейрона (пе-рикариона) отходит множество отростков, которые многократно ветвятся. У большинства нейронов выделяют много дендритов, по которым возбуждение направлятся к перикариону и один аксон, отличающийся значительной длиной и, по которому потенциал действия движется от перикариона. Дендриты, обычно сильно ветвятся недалеко от тела нейрона, а разветвления аксона обычны в его терминальных участках.

Уникальные функции нейроцитов в первую очередь обеспечиваются строением их плазматической мембраны. В неё интегрировано огромное число потенциал- и лиганд- зависимых ионных каналов, способных избирательно транспортировать ионы натрия, калия, кальция, хлора. В терминалях аксонов через нейролемму выделяются разнообразные нейромедиаторы, что обеспечивает разнообразие межнейронных сигналов и возможность сложного управления функциями эффекторных органов.

Хорошо известно, что в эмбриогенезе нервная ткань формируется из участка дорсальной эктодермы, расположенной над хордой. У позвоночных нейроэктодерма последовательно формирует нервную пластинку, нервный желобок с нервными валиками и нервную трубку с нервным гребнем. Во время формирования нервной трубки из её краниального отдела формируется головной мозг, а остальная её часть дает начало спинному мозгу. Часть кле-

ток нервного гребня является источником развития элементов периферической, в том числе и вегетативной, нервной системы. В образовании некоторых ганглиев головы, видимо, участвуют нейральные плакоды - утолщения эктодермы по бокам головы зародыша.

В процессе развития вышеперечисленных эмбриональных органов (нервной трубки, нервных гребней, нейральных плакод) в них образуются два типа бластных, т. е. активно делящихся клеток: нейро- и глиобласты.

I. Нейробласты дают начало огромному количеству нейронов (1012), но вскоре после рождения теряют способность к делению.

II. Глиобласты, долго сохраняя пролиферативную активность, дифференцируются в глиоциты (некоторые из которых тоже способны к делению).

Известно, что в эмбриональном периоде, значительная часть (по некоторым оценкам до 40-80%) образующихся нервных клеток погибает путем апоптоза. Считают, что это, во-первых, клетки с серьезными повреждениями хромосом (в т. ч. хромосомной ДНК) и, во-вторых, клетки, отростки которых не смогли установить связь с соответствующими структурами (клетками-мишенями, органами чувств и т. д.).

В нервных клетках традиционно выделяют три отдела: тело (перикари-он), дендриты и аксон. Каждый из этих отделов имеет свои особенности строения. В частности, аксоны нейронов имеют ветвления в своей терминальной части и часто очень большую длину, тогда как дендриты обычно короче и могут начинать ветвиться уже недалеко от перикариона. В нейроплаз-ме находится много специфических молекул. Они имеют полипептидную и небелковую природу. Среди этих веществ обычны нейромедиаторы, нейро-модуляторы и нейропептиды.

Учитывая большое разнообразие нервных клеток используют различные критерии для их классификации. Один из них - это форма тела. Согласно этому критерию, различают пирамидные, веретеновидные, нейроны с аксо-нальной кисточкой, грушевидные, округлые, звездчатые и другие виды клеток. Второй критерий учитывает число отростков нейронов. В связи с этим

традиционно выделяют униполярные, псевдоуниполярные, биполярные и мультиполярные нейроны. Другой критерий учитывает функциональное значение нейрона. В данной классификации выделяют афферентные (чувствительные), ассоциативные (вставочные) и эфферентные (двигательные и секреторные) нейроны. В нейрофизиологии особенно популярна классификация нейронов по содержанию нейромедиаторов. Согласно данному принципу выделяют адренергические, холинергические, ГАМК-ергические, пептидэр-гические, глицинергические и другие (Жвания М.Г. и др., 2005).

Следует остановиться на характеристике и некоторых особых форм нервных клеток. Некоторые нейроны центральной нервной системы не генерируют потенциалы действия, их называют бесспайковыми. Другие клетки -являются спонтанно-возбудимыми - это так называемые осцилляторные клетки. Важную группу представляют нейрос�