Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфологические аспекты церебропротекторного эффекта кортексина при экспериментальном стрессе

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Морфологические аспекты церебропротекторного эффекта кортексина при экспериментальном стрессе"

/

На правах рукописи

004601496

ГУНЬКИН ИВАН ВЛАДИМИРОВИЧ

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ЦЕРЕБРОПРОТЕКТОРНОГО ЭФФЕКТА КОРТЕКСИНАПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ СТРЕССЕ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 9 ДПР 201и

Саранск-2010

004601496

Работа выполнена на кафедре цитологии, гистологии и эмбриологии ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П.Огарёва»

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор

Балашов Владимир Павлович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Кругляков Павел Павлович

доктор медицинских наук, профессор Дубовая Татьяна Клеониковна

Ведущее учреждение: ГОУ ВПО "Нижегородская государст-

венная медицинская академия"

Защита диссертации состоится/¿^^ЙО10 г. в часов на заседании диссертационного совета Д. 212.117.01 при ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева» по адресу: 430005, г. Саранск, ул. Большевистская, 68.

Автореферат диссертации опубликован на официальном сайте ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева» www.mrsu.ru E-mail: dsovet@mrsu.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева»

Автореферат разослан .» ^^ 20Югода.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

Тельцов Л.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Исследование морфофункциональных закономерностей адаптации клеток и тканей к изменяющимся условиям внешней среды является фундаментальной проблемой морфологии (Бороднж Н.Р., 1998; Постановление президиума РАН..., 2003). В частности среди таких факторов особый интерес для изучения в XXI веке представляют собой фармакологические средства (Сапин М.Р., 2000). Учитывая широкую распространенность церебральных поражений различного генеза (в том числе сгрессорного) изучение изменений нервной ткани при действии стрессоров и нейротропкых средств является, несомненно, актуальным направлением современной морфологии, неврологии и фармакологии.

В настоящее время для терапии больных с патологическими состояниями головного мозга различного генеза используется большой арсенал лекарственных средств (Машковский М.Д., 2005). Одной из наиболее востребованных фармакологических групп при патологии головного мозга являются препараты с ноотропным и нейротрофическим эффектом (Громова O.A., 2000), в том числе пептидные биорегуляторы (Рыбников В.Ю. и Закуцкий Н.Г., 2000). Отечественным препаратом нового поколения, успешно применяемым в терапии острого нарушения мозгового кровообращения, черепно-мозговых и послеродовых травм, в восстановительно-реабилитационный период после нейрохирургических вмешательств является кортексин (Емельянов А.Ю., 2004, 2006; Скоромец A.A. и др., 2007; Скороходов А.П. и др., 2007; Бурцева М.С. и Должич Г.И., 2007; Громада Н.Е., 2007).

Препарат создан в Санкт-Петербургской Военно-медицинской академии и внедрен в практику здравоохранения усилиями ученых Санкт-Петербургского Института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН и специалистами отечественной фармакологической компании «ГЕРОФАРМ» (Гусев Е.И. и Скоромец A.A., 2006). Пептидные биорегуляторы, к которым относится и кортексин, участвуют в поддержании структурного и функционального гомеостаза клеток нервной ткани, контролируют экспрессию генов и синтез белка, в обобщенном плане — они нормализуют метаболизм клеточных структур (Головкин В.И. и др., 2000). Имеются данные о способности кортексина уменьшать число нейронов гибнущих апоптозом в участке нервной ткани, окружающем очаг деструкции при ишемическом или геморрагическом инсульте (Гранстрем O.K. и др., 2008)

Учитывая эффективность кортексина при некоторых заболеваниях ги-поксического генеза (НикероваТ.В. и др., 2003, Левин О.С. и др., 2006) представляет интерес исследование реактивности нервной ткани в условиях экспериментального хронического стресса. Стресс, или общий адаптационный синдром, является одной из наиболее распространенных реакций организма на неблагоприятные или новые условия существования. Практически все системы и органы вовлекаются в ответную реакцию, где нервная система, наряду с эндокринной и иммунной, имеет определяющее значение, как в течении, так и в результирующем эффекте стрессового воздействия (Сапин М.Р. и Никитюк Д.Б., 2000; Капитонова М.Ю. и др., 2008, Подсеваткин В.Г. и

др., 2008). Стресс, особенно хронический, может приводить к значительным нарушениям в ЦНС, что ярко проявляется как в изменении поведенческих реакций, так и в структурных изменениях различных отделов головного мозга (Ховряков A.B. и др., 2009; McEwen, 2000). Хронический стресс, результатом которого является церебральная гипоксия, является одной из наиболее распространенных причин развития неврозов (Подсеваткин В.Г. и др., 2008, 2009).

В литературе, имеется подробное описание успешного использования кортексина при неврологических заболеваниях, однако практически отсутствуют данные о влиянии кортексина на структуры головного мозга, ответственные за формирование двигательных и поведенческих актов. В связи с тем, что эффективность кортексина в основном исследована при органических повреждениях ЦНС, представляет несомненный интерес оценка морфофунк-циональных аспектов действия данного пептидного биорегулятора в условиях экспериментального хронического иммобилизационного стресса.

Цель работы: изучить структурно-функциональные изменения нео- и папеокортекса у белых мышей при применении кортексина в условиях хронического иммобилизационного стресса.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Исследовать влияние хронического иммобилизационного стресса на поведение белых мышей в тесте «Открытое поле» и Т-образном лабиринте.

2. Провести анализ морфологических изменений нейроцитов моторной зоны коры больших полушарий и САЗ зоны гиппокампа белых мышей при хроническом стрессе.

3. Оценить влияние кортексина на стрессопосредованные изменения высшей нервной деятельности и структуры нейроцитов и глиоцитов нео- и папеокортекса белых мышей в сравнении с эффектом пирацетама.

Научная новизна исследования. Показано, что кортексин обладает заметным стресспротекторным эффектом. Выявлена способность препарата коррегировать стрессопосредованные нарушения условно-рефлекторной деятельности животных в Т-образном лабиринте и изменения поведенческих реакций в тесте «Открытое поле».

Новыми являются результаты о способности исследуемого препарата в условиях хронического стресса поддерживать нормальную ультраструктуру нейроцитов и глиоцитов моторной зоны коры больших полушарий и гиппо-кампальной извилины, а также уменьшать отек нейропиля и деструкцию си-наптических контактов.

Научно-практическая значимость работы состоит в том, что полученные результаты углубляют знания о фармакологии кортексина, подтверждают целесообразность использования данного препарата при органической патологии головного мозга, и являются экспериментальным обоснованием возможности использования кортексина при стрессопосредованных нарушениях ЦНС. Полученные результаты о повреждении нейронов гиппокампа и новой коры при хроническом иммобилизационном стрессе и их коррекции

кортексином должны учитываться как в клинике стрессорных расстройств памяти и других форм высшей нервной деятельности, так и при анализе мо-лекулярно-генетических основ патологии нейрона в эксперименте.

Результаты исследования внедрены в научно-исследовательскую работу и учебный процесс кафедры цитологии, гистологии и эмбриологии с курсом медицинской биологии и кафедры нервных болезней и психиатрии с курсом нейрохирургии ГОУ ВПО "Мордовский государственный университет".

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Стресспротекторные свойства кортексина проявляются как в коррекции расстройств поведения экспериментальных животных, так и в поддержании ультраструктуры нейроцитов прецентральной извилины коры больших полушарий и САЗ зоны гипиокампа.

2. Кортексин способствует снижению числа темных нейроцитов в моторной коре больших полушарий и в САЗ зоне гиппокампа, уменьшает стресс-опосредованную деструкцию ядерного аппарата, мембранных и немембранных органелл нейроцитов и глиоцитов, снижает содержание гранул липофусцина и миелиноподобных телец, отек нейропиля, поддерживает структуру синаптических контактов.

3. Стресспротекторная активность кортексина в условиях данной экспериментальной патологии не уступает эффективности пирацетама.

Апробация работы. Материалы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на VIII международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2007); международной научной конференции «Биология: теория, практика, эксперимент» (Саранск, 2008); VII Поленов-ских чтениях (Санкт-Петербург, 2008); научно-практической конференции «Актуальные проблемы повреждений и заболеваний нервной системы» (Саранск, 2008); IV съезде нейрохиругов Украины (Днепропетровск, 2008); Российской конференции, посвящённой 75-летию профессора И.А. Студенцовой (Казань, 2008); VI всероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Саратов, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, 3 из которых в изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста, документирована 5 таблицами и иллюстрирована 66 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), изложения собственных результатов (главы 3, 4 и 5), обсуждения результатов (глава 6), выводов и библиографического указателя, включающего 136 источников, в том числе 111 отечественных и 25 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования.

Характеристика лекарственных средств.

КОРТЕКСИН — это комплекс Ь-аминокислот и полипептидов с молекулярной массой от 1 до 10 Кда, выделенных из коры головного мозга телят в возрасте, не превышающем 12 месяцев. Также в составе препарата имеются витамины и минералы. Стабилизатором препарата выбран глицин (стандартный флакон содержит 10 мг кортексина и 12 мг глицина). В экспериментах использовали официнальную лекарственную форму в виде флакона содержащего 10 мг кортексина. Доза кортексина составляла 0,5 мг/кг 1 раз в сутки. Препарат вводили животным внутрибрюшинно.

В качестве препарата сравнения использовали пирацетам. В работе применяли официнальную жидкую лекарственную форму в виде 20% раствора пирацетама в ампулах по 5 мл. Доза пирацетама составляла 50 мг/кг 2 раза в сутки. Препарат вводили животным внутрибрюшинно.

Характеристика подопытных животных. Работа выполнена на 62 нелинейных белых мышах обоего пола массой 19-26 г. Распределение подопытных животных по группам и их количественная характеристика представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Объем выполненных экспериментальных исследований

№ п/п Условия опыта Цель исследований Количество животных

1.1 Иммобилизация 5 суток по 10 часов +изотонический раствор хлорида натрия (контроль) Поведение в «Открытом поле» и электронная микроскопия 10

1.2 Иммобилизация 5 суток по 10 часов + пирацетам Поведение в «Открытом поле» и электронная микроскопия 12

1.3 Иммобилизация 5 суток по 10 часов + кортесин Поведение в «Открытом поле» и электронная микроскопия 10

2.4 Иммобилизация 5 суток по 10 часов +изотонический раствор хлорида натрия (контроль) Поведение в Т-образном лабиринте и световая микроскопия 10

2.5 Иммобилизация 5 суток по 10 часов + пирацетам Поведение в Т-образном лабиринте и световая микроскопия 10

2.6 Иммобилизация 5 суток по 10 часов + кортесин Поведение в Т-образном лабиринте и световая микроскопия 10

ИТОГО: 62;

Методы экспериментальных исследований. Стресс моделировали по методу Коломейцевой И.А., (1988) и Hecht et al., (1971). Животных помещали в тесные пеналы, объем которых составил 43 см3. Режим иммобилизации: один раз в сутки по 10 часов в течение 5 суток.

Двигательную активность белых мышей оценивали в тесте "Открытое поле" (Калуев A.B., 1998). Регистрировали количество пересеченных квадратов (горизонтальная активность), количество выполненных стоек (вертикальная активность), количество заглядываний в норки (исследовательская активность) и продолжительность актов груминга. Тестирование проводили до стресса, и после истечения 1-х и 5-х суток стресса. Продолжительность тестов составляла 5 минут.

Условно-рефлекторную деятельность изучали в Т-образном лабиринте при положительном питьевом подкреплении (Воронина Т.А., Островская Р.У., 1998). Предварительно подопытных животных подвергали водной де-привации в течение 48 часов. Затем у каждой группы мышей (серии опытов 2.4 - 2.6, табл. 1) в течение 4 суток (2 раза/сутки) вырабатывали положительный питьевой рефлекс на открывание шторки стартовой камеры. Рефлекс считали выработанным, если его время в последних 2 попытках было не менее чем в 2 раза короче времени рефлекса в первой "тренировочной" попытке. После выработки рефлекса мышей подвергали стрессу с параллельным внутрибрюшинным введением плацебо (в контроле) или фармакологическим воздействием (кортексин или пирацетам). Первые трое суток стресса животные неограниченно получали воду. На четвертые и пятые сутки животных вновь подвергали водной депривации. По истечению 5 суток стресса тестирование животных в Т-образном лабиринте повторяли.

С целью изучения морфологических изменений головного мозга животных умерщвляли ингаляционным фторотановым наркозом. Головной мозг извлекали из полости черепа и фиксировали в 10% нейтральном формалине. Прошедший фиксацию головной мозг промывали и проводили по спиртам возрастающей концентрации и заливали в парафин. Готовили серии фронтальных срезов мозга толщиной 5 мкм, которые окрашивали крезиловым фиолетовым. Полученные окрашенные срезы изучали на световом микроскопе Jenaval (Австрия). Выявляли и считали количество жизнеспособных («светлых») и «погибших» («темных») клеток в поле зрения при помощи программы Видеотест - Мастер Морфология. Фотосъёмку препаратов производили цифровой камерой САМ V 200 (Vision, Австрия) с последующей обработкой изображения в Adobe Photoshop 7,0.

Ультраструктурные изменения нейроглиальных элементов головного мозга у животных определяли с помощью электронной микроскопии. Извлечение головного мозга осуществляли под ингаляционным наркозом после внутривенного введения 3% глутарового альдегида с гепарином. Заливку материала осуществляли в смесь эпоксидных смол эпон - аралдит с последующей полимеризацией в течение 2 суток при 60°С. Ультратонкие срезы изготавливали на ультратоме Ultracut, монтировали их на сетки и контрастирова-

ли уранилацетатом и цитратом свинца. Срезы изучали на электронном микроскопе ЭМ-125.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью t-критерия Стьюдента на персональном компьютере Pentium IV.

Результаты исследований

На первом этапе работы, мы оценили стресспротекторный эффект кор-тексина и препарата сравнения - пирацетама в тесте поведения животных в «Открытом поле» (таблица 1).

Животные не подвергнутые действию стресса были достаточно подвижны. В среднем за пять минут регистрации они пересекали в 1-й серии экспериментов 144,00±14,61 квадрата, во 2-й - 111,50±15,39, в 3-й -120,10+18,13 соответственно; выполняли в 1-й серии 20,14±2,74, во 2-й -14,00±3,20, в 3-й -19,90±2,75 вертикальных стоек. Исследовательская активность была достаточно выражена, поскольку норковый рефлекс соответствовал в 1-й серии 13,57±1,18, во 2-й - 12,63±1,46, в 3-й - 12,30±2,40 попыткам. Общее время актов груминга было не большим, что свидетельствует о низком уровне тревожности интактных животных. Данные показатели были использованы нами в качестве исходных, с которыми сравнивали поведение мышей, подвергнутых действию стресса и фармакологических средств.

Иммобилизационный стресс сопровождался изменением поведенческих реакций белых мышей. У животных отмечалось снижение локомоторной активности - число пересеченных квадратов уменьшалось на 1 сутки стресса до 24%, на 5 сутки - до 17% (р<0,05), а количество выполненных стоек до 57% и 48% (р<0,05) соответственно. Продолжительность актов груминга возрастала на 1 сутки стресса в 15 раз, на 5 сутки в 18 раз (р<0,05), что свидетельствует о повышении уровня тревожности мышей (Калуев A.B., 1998). Исследовательская активность на 1 сутки стресса снижалась до 77%, а к 5-м суткам отмечалось резкое уменьшение до 11% (р<0,05). Общая летальность в 1 серии опытов составила 30%.

Кортексин коррегировал стрессопосредованную депрессию двигательной активности животных. В первые сутки после действия стресса у мышей на фоне применения кортексина число пересеченных квадратов (45%) было выше соответствующего уровня в контроле (24%). На 5 сутки наблюдения положительное влияние кортексина на показателиь горизонтальной активности сохранялось (р<0,05). Препарат не изменял отрицательную стресс-опосредованную динамику вертикальной двигательной активности. На 5 сутки эксперимента кортексин, заметно поддерживал исследовательскую активность животных (65% против 11% в контрольной серии). Судя по продолжительности актов груминга, кортексин не проявлял противотревожного действия в рамках выбранной экспериментальной модели. Общая летальность при лечении препаратом составила 20%, что несколько ниже, чем в контроле.

Препарат сравнения пирацетам также способствовал сохранению локомоторной (горизонтальной) и исследовательской активности у животных,

хотя продолжительность актов груминга на фоне его применения оставалась высокой. Выраженность указанных эффектов пирацетама примерно соответствовала эффекту кортексина. Общая летальность составляла 20%.

Таблица 1

Динамика поведенческих реакций белых мышей в тесте «Открытое поле».

1 серия 2 серия 3 серия

Исследуемые по- Сроки, Стресс, 0,9% рас- Стресс, кортексин Стресс, пирацетам

казатели сутки вор хлорида натри (контроль)

Исход 144,00+14,61 111,50±15,39 120,10+18,13

(100%) (100%) (100%)

Горизонтальная активность 1 34,57±5,36А (24%) 50,50±6,65а* (45%) 57,80±9,63а* (48%)

5 24,43±2,91А 50,13±9,50а* 52,90±9,80а*

(17%) (45%) (44%)

Исход 20,14+2,74 14,00±3,20 19,90±2,75

100% (100%) (100%)

Вертикальная активность 1 11,43±1,94А (57%) 10,38±2,31 (74%) 15,00±2,10 (75%)

5 9,57±0,94д 7,25±1,86 11,30±2,11А

(48%) (52%) (57%)

Исход 11,43±1,22 9,38±1,28 9,70±1,47

(100%) (100%) (100%)

Продолжительность 1 171,14+8, 51а 126,50±15,01а 128,50±8,38А

груминга, сек (1497%) (1349%) (1325%)

5 207,86±)3,83А 160,25±11,55А 158,80±7,47А

(1819%) (1708%) (1637%)

Исход 13,57±1,18 12,63±1,4б 12,30+2,40

(100%) (100%) (100%)

Количество загля- 1 10,43±1,13 9,5011,18 9,30±1,53

дыпанийв норки (77%) (75%) (76%)

5 1,43±0,40А 8,00±1,59* 7,10±1,29*

(11%) (63%) (58%)

Примечания: А - отличия от исходных значений достоверны при р<0,05; * - отличия от соответствующих показателей в контрольной серии достоверны при р<0,05.

На следующем этапе работы мы оценили влияние кортексина в сравнении с пирацетамом на обучаемость животных в методике выработки условного рефлекса с положительным питьевым подкреплением (таблица 2).

В контрольной серии опытов перед началом создания стрессовой ситуации условный рефлекс удалось выработать у б подопытных животных - время добегания до поилки с 25,93±4,57 секунд в исходе уменьшилось до 10,05±1,91 секунд в 8-й попытке. После хронического стрессорного воздействия в течение пяти суток у животных контрольной группы рефлекс не вое-

производился ни у одного из животных - время добегания до поилки составило 24,5213,82 секунд, что свидетельствует о нарушении мнестических процессов. На фоне лечения кортексином и пирацетамом, не смотря на действие стресса, отмечалась сохранность рефлекса у всех животных - время добегания до поилки составило 9,49+1,58 и 9,87+2,70 секунд соответственно.

Таблица 2.

Динамика условно-рефлекторной деятельности белых мышей в Т-образном лабиринте.

Условия опыта Время добегания до поилки, сек

1-я попытка 25,93±4,57

8-я попытка 10,05±1,91А

Стресс, 0,9% раствор натрия хлорида (контроль) 24,52±3,82в

1-я попытка 27,36±2,50

8-я попытка 8,93±1,15а

Стресс, кортексин 9,49±1,58а*

1-я попытка 23,30+4,26

8-я попытка 10,90±2,86а

Стресс, пирацетам 9,87+2,70а*

Примечания: А - отличия от исходных значений (1 сутки) достоверны при р<0,05; В - отличия от 4 суток (8 попытка) выработки рефлекса в соответствующей серии достоверны при р<0,05; * - отличия от 5 суток после стресса в контрольной серии достоверны при р<0,05.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что хронический иммобилизационный стресс вызывает выраженное угнетение всех форм поведения. Использование кортексина и пирацетама способствовало нормализации поведенческих реакций при тестировании в «Открытом поле» и условного рефлекса в Т-образном лабиринте. Мы убедились, что исследуемый препарат - кортексин, наряду с препаратом сравнения имеет сресспротекторную активность.

В литературе имеются убедительные свидетельства (Смирнов A.B. и др., 2005; Капитонова М.Ю. и др., 2008) что влияние стресса реализуется на клеточном и субклеточном уровнях и приводит к повреждению и гибели клеток мозга и нарушению афферентных и эфферентных межнейрональных связей. В связи с этим в следующем разделе исследования мы оценили повреждающее действие стресса и цитопротекторные свойства обоих препаратов на клеточном уровне. Для решения поставленной задачи была выбрана методика окрашивания тканей крезиловым фиолетовым (таблица 3).

Окрашивание крезиловым фиолетовым САЗ зоны гиппокампа и моторной зоны коры большого мозга интактных животных выявило относительно незначительное количество гиперхромных клеток, причем основная их доля являлась глиоцитами.

Таблица 3.

Результаты морфометрического анализа «темных» нейронов

в гиппокампе и коре большого мозга.

Отдел ЦНС интактные стресс стресс + пирацетам стресс + кортексин

гиппокамп 0,83%±0,66 46,5%±18,3 А 13,8%±4,2 5,3%±1,3 *

Кора большого мозга 3,76%±1,9 39,1 %±8,4 А 3,6%±1,8 * 17,6%±5,9 *

Примечания: А - отличия от соответствующего значения у интактных животных достоверны при Р < 0,05; * - отличия от соответствующего значения у животных группы стресс - контроля достоверны при Р < 0,05.

Иммобилизационный стресс способствовал появлению значительного количества гиперхромных дегенерирующих клеток в САЗ зоне гиппокампа. Среди них выявлялись как нейроны, так и глиоциты. В коре большого мозга также происходило увеличение количества таких клеток, хотя их распределение в разных участках моторной коры сильно варьировало. Наряду с зонами, содержащими небольшое число интенсивно окрашенных клеток, мы наблюдали и участки с высокой плотностью расположения гиперхромных нейронов. В гиппокампе встречаемость «темных» нейронов значительно варьировала. Мы наблюдали участки, не содержащие интенсивно окрашенных клеток, но рядом с ними могли располагаться участки с единичными «темными» клетками. В других частях зоны САЗ наоборот «светлые» клетки были немногочисленны. Можно отметить, что хронический стресс, кроме нервных элементов, затрагивает и клетки стенок сосудов микроциркуляции. В обеих исследуемых областях мозга мы выявляли «темные» эндотелиоциты в стенках мелких сосудов.

Введение кортексина и пирацетама животным, подвергавшимся хроническому стрессорному воздействию, улучшало морфологическую картину, наблюдаемую в коре и гиппокампе. Ноотропные препараты уменьшали количество гиперхромных клеток. В гиппокампе использование ноотропов привело к уменьшению количества участков, содержащих гиперхромные клетки, и сократило протяженность таких участков. В поле зрения микроскопа стали преобладать клетки с окрашенной цитоплазмой и светлым ядром. В моторной коре также снижалось количество гиперхромных клеток, но плотность их расположения значительно варьировала в соседних участках коры. В зонах с небольшим количеством окрашенных клеток, они располагались диффузно. В сосудистом русле коры большого мозга и гиппокампа при введении препаратов несколько уменьшалось количество «темных» эндотелио-цитов.

Для детального изучения изменений, наблюдающихся в нейроцитах коры головного мозга и гиппокампапьной извилины при хроническом иммоби-

лизационном стрессе и оценки эффективности терапии кортексином, мы использовали электронно-микроскопический метод исследования.

При электронно-микроскопическом исследовании сенсорно-моторной зоны коры головного мозга и САЗ зоны гиппокампа интактных мышей нейроны и нейроглиапьные элементы не имели явных дегенеративных изменений ультраструктуры. Как в коре головного мозга, так и в САЗ зоне гиппокампа нейроны различались по своей форме и размерам, в зависимости от их местоположения в данных структурах. Преобладающей группой нейронов являлись «светлые» нейроны с хорошо развитой гранулярной эндоплазмати-ческой сетью. В них определялось крупное светлое, богатое эухроматином ядро, располагающееся в центральной части перикариона и имеющее ровные контуры поверхности. Ядерная оболочка имела обычное строение и была представлена двумя ядерными мембранами, разделенными узким перинукле-арным пространством. Нейропиль коры больших полушарий и гиппокампа характеризовался наличием безмиелиновых мелких и средних нервных волокон, часто с неполной глиальной оболочкой. Миелиновые волокна наблюдали сравнительно редко. Обычно это были мелкие проводники. Между без-миелиновыми волокнами часто наблюдали синаптические контакты, имеющие типичное строение.

При электронно-микроскопическом исследовании сенсорно-моторной зоны коры головного мозга, а также САЗ зоны гиппокампа у стрессирован-ных животных обнаруживались изменения ультрастуктуры как тел, так и отростков нейронов. Их выраженность значительно варьировалась и в разных нейронах и в разных участках коры и гиппокампа. Мы наблюдали и клетки с типичным строением, и с явно дегенеративными перестройками.

Хроническое стрессовое воздействие приводило к изменению формы и структуры ядер нейронов коры и гиппокампа. Наряду с округлыми ядрами типичной структуры наблюдались и ядра с различной степенью инвагинации оболочки. Ядра нейроцитов содержали уменьшенные в размерах ядрышки. Однако встречались клетки и с крупными ядрышками. Хронический стресс вызывал повреждения цитоплазматических структур. В первую очередь следует отметить нарушения в структуре гранулярной ЭПС. Мы наблюдали расширение канальцев, уменьшение количества рибосом на их мембранах. Возможно, канальца подвергались фрагментации, так как, в «темных» нейронах обычно отмечались более короткие канальца гЭПС. Однако следует учитывать, что более развитый эндоплазматический ретикулум характерен для более крупных нервных клеток. Комплекс Гольджи также претерпевал изменения структуры. При хроническом стрессорном воздействии значительная часть нейронов содержала диктиосомы имеющие вид стопки близко лежащих параллельных мембран с единичными везикулами около них. В нейронах коры и гиппокампа отмечалось увеличение размеров органоида и появление гигантских митохондрий. Следует отметить, что такие гигантские измененные митохондрии наблюдались не только в перикарионе, но и в крупных миели-низированных и немиелинизированных отростках нейронов, особенно в гип-покампе.

При воздействии хронического стресса значительные изменения ультраструктуры наблюдались й в отростках нервных клеток. В крупных волокнах нейроплазма обычно была просветленной, в ней появлялись вакуоли. Миелиновая оболочка также нередко выглядела поврежденной. В ней наблюдали участки набухания или истончения, разрыхление мембран миелина. В нейропиле гиппокампа среди миелиновых волокон встречались миелино-подобные тельца, представляющие собой спиральные структуры.

Синаптические окончания коры мозга и гиппокампа на фоне хронического стресса подвергаются деструктивным изменениям. Мы наблюдали синапсы со структурными перестройками в виде скопления синаптических пузырьков различной плотности, расширения, отека и просветвление нервных терминален (светлая дегенерация). В подавляющем большинстве обнаруженных синапсов разрушались активные зоны. Пресинапсы таких контактов были переполнены синаптическими везикулами. Кроме того, аксо-соматические синапсы, часто наблюдаемые у интактных животных, практически отсутствовали у мышей группы стресс-контроля. Данное обстоятельство, по видимому и приводит к ослаблению пространственной памяти и нарушению познавательной функции у невротизированных животных.

Хронический стресс влиял и на сосуды микроциркуляторного русла. В коре головного мозга и в гиппокампе наряду с выраженным периваскуляр-ным отеком наблюдались изменения строения эндотелия капилляров. Ядро эндотелиоцитов часто имело высокую электронную плотность. В нем с трудом определялись участки эухроматина. В цитоплазме таких эндотелиоцитов эндоцитозные везикулы были редки и не многочисленны.

Введение ноотропов на фоне хронического стресса оказывает некоторое коррелирующее влияние на ультраструктуру нервных клеток, как в коре головного мозга, так и в гиппокампе. В коре головного мозга и гиппокампе были представлены нейроны с широким спектром изменений тонкого строения. Как и у стрессированных животных в "популяции" нервных клеток имелись «светлые» клетки и клетки с разной степенью осмиофильности ядра и цитоплазмы. В целом действие ноотропов выражалось в уменьшении количества «темных» нервных клеток, имеющих признаки дегенеративно — некротических изменений и увеличении числа «промежуточных» по осмиофильности цитоплазмы форм нейронов с адаптивно - компенсаторными перестройками ультраструктуры.

Отростки нейронов на фоне введения лекарственных препаратов выглядели менее поврежденными. В них, как и при хроническом стрессе, наблюдали просветление нейроплазмы, появление крупных митохондрий. Однако, как и в перикарионах, доля разрушающихся отростков была значительно меньшей, чем при стрессе, а в отростках с перестройками ультраструктуры их количество и выраженность также уменьшались. В некоторых миелиновых волокнах наблюдали разволокнение миелиновой оболочки, иногда с образованием миелиноподобных телец, но частота и степень повреждения оболочки снижались. Количество выявляемых синаптических контактов в этой экспериментальной группе животных было выше, чем при стрессе.

Большая часть синапсов имела типичное строение. В некоторых синапсах сохранялись ферментоактивные зоны, но отсутствовали синаптические везикулы, другие сохраняли активные зоны, но пресинапс был переполнен пузырьками с медиатором.

Строение стенки капилляров незначительно отличалось от наблюдаемого при хроническом стрессе. В значительной части сосудов эндотелий отличался высокой осмиофильностью. В его цитоплазме не определялись орга-неллы, эндоцитозные везикулы были единичны, появлялись миелиноподоб-ные структуры. Ядро таких клеток было очень темным, некротически измененным, Однако на фоне применения кортексина, чаще выявлялись компоненты микроциркуляторного русла

При сравнении действия пирацетама и кортексина выявлено, что оба препарата обладают сопоставимой цитопротекторной активностью в отношении нейронов коры большого мозга, но кортексин оказался более эффективным в САЗ зоне гиппокампа. Кроме того, на наш взгляд, использование кортексина позволяет несколько снизить количество дегенерирующих нейронов при увеличении количества поврежденных глиальных клеток.

ВЫВОДЫ

1. Хронический иммобилизационный стресс у белых мышей приводит к увеличению доли гиперхромных нейроцитов и глиоцитов САЗ зоны гиппокампа и моторной коры и нарушению их ультраструктуры: повышению осьмиофильности цитоплазмы, инвагинации ядерной оболочки, увеличению доли гетерохроматина в ядре, просветлению или уплотнению матрикса митохондрий, расширению канальцев эндоплазматического ретикулума, увеличению содержания липофусцина. Нейропиль животных содержал отростки нейронов с просветленной цитоплазмой, миелиновые оболочки имели участки разволокнения, уменьшалось число синаптических контактов, имел место интерстициальный отек.

2. Иммобилизационный стресс приводит к срыву высшей нервной деятельности, что проявляется снижением общей двигательной и исследовательской активности, увеличением степени тревожности, угнетением условно-рефлекторной деятельности.

3. Кортексин коррегирует стрессопосредованную депрессию двигательной, исследовательской и условно-рефлекторной активности мышей, но не нормализует высокие значения груминга животных.

4. Введение кортексина животным, подвергавшимся хроническому стрессорному воздействию, способствует уменьшению числа гиперхромных нейронов в моторной зоне коры и в САЗ зоне гиппокампа. Препарат сравнения - пирацетам проявляет нейропротекторные свойства лишь в прецен-тральной извилине коры большого мозга.

5. Кортексин уменьшает тяжесть стрессобусловленных нарушений ультраструктуры нейроцитов и глиоцитов в изученных зонах нео- и палео-кортекса, а также способствует уменьшению интерстициального отека.

6. При сравнении действия пирацетама и кортексина выявлено, что оба препарата обладают сопоставимым нейропротекторным свойством в отношении нейронов коры большого мозга, но кортексин является более эффективным в САЗ зоне гиппокампа.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Балашов В.П. Влияние ноотропов на условно-рефлекторную деятельность белых мышей при хроническом стрессе / В.П. Балашов, A.B. Ховряков, И.В. Гунькин, М.И. Альмяшева // Научные труды VIII международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации». Москва, 2007. - С. 125-126.

2. Балашов В.П. Функциональные изменения центральной нервной системы белых крыс при экспериментальном неврозе / В.П. Балашов, A.B. Ховряков, И.В. Гунькин, М.И. Альмяшева // Материалы международной научной конференции: в 2-х кн. Кн. 2. Биология: теория, практика, эксперимент. Саранск, 2008. - С. 155-156.

3. Балашов В.П. Стресспротекция кортексином, пирацетамом и субстанцией 3635 хронического стресса / В.П. Балашов, A.B. Ховряков, Й.В. Гунькин, М.И. Альмяшева // VII Поленовские чтения. Тезисы всероссийской научно-практической конференции. Санкт-Петербург, 2008. -С. 394.

4. Гунькин И.В. Изменения гематоэнцефалического барьера при экспериментальном неврозе И Материалы научно-практической конференции «Актуальные проблемы повреждений и заболеваний нервной системы». - Саранск, 2008. - С. 163 - 164.

5. Гунькин И.В. Морфологические изменения клеток прецентральной извилины мышей при стрессе и протекции ноотропами / И.В. Гунькин, A.B. Балашов, A.B. Ховряков, В.Н. Абрамов, М.И Альмяшева // Материалы IV съезда нейрохирургов Украины. Днепропетровск, 2008. - С. 207.

6. Гунькин И.В. Морфология клеток двигательной коры мышей при стрессе и протекции ноотропами / И.В. Гунькин, A.B. Балашов, В.Н. Абрамов, Н.В. Семибратова, М.И Альмяшева, A.B. Ховряков // «Морфология», 2008, №4, С. 64.

7. Гунькин И.В. Ультраструктура гиппокампа мышей при стрессе и терапии веществами с ноотропными свойствами / И.В. Гунькин, A.B. Балашов, М.И. Альмяшева// Применение цитопротекторов метаболического действия в лечении соматических заболеваний. Сборник научных работ. - Саранск, 2008. - С. 53 - 55.

8. Балашов В.П. Ультраструктурные изменения гиппокампа мышей при стрессе и действии веществ с ноотропными свойствами / В.П. Балашов, В.Н. Абрамов, A.B. Ховряков, М.И. Альмяшева, Н.В. Гунькин, A.B. Балашов // «Морфологические ведомости», 2008, №3-4, С. 4-7.

9. Балашов В.П. Стресс-протекторные свойства производных фосфори-луксусной кислоты / В.П. Балашов, A.A. Литюшкина, М.И. Альмяшева, Н.П. Шиханов, И.В. Гунькин, A.B. Балашов // Фармакология и токсикология фосфорорганических соединений и других биологически активных веществ. Материалы Российской конф., посвященной 75-летию профессора И.А. Студенцовой. - Казань. - 2008. - Выпуск 4. - С.15.

Ш.Балашов 15.11. Анализ морфофушсциональных аспектов адаптации органов н тканей белых мышей при хроническом стрессе / В.П. Балатон, М.И. Альмяшева, A.B. Балашов, PI.В. Гунькнн, A.A. Ли-тюшкнпл, JI.B. Ванькова, Е.В. Блинова // «Морфология». - 2009. -Т.1.36. - №4. - С.11.

Бумага офсетная. Формат 60x84 1/16. Гарнитура Тайме. Печать способом ризографии. Усл. печ. л. 1,08. Уч.- изд. л. 1,33. Тираж 100 экз. Заказ № 25.

Отпечатано с оригинала-макета заказчика в ООО «Референт»

430000, г. Саранск, пр. Ленина, 21.

тел. (8342)48-25-33