Клиническая и морфофункциональная характеристика репарации тканей гнойных ран в аспекте нейроэндокринной регуляции при лечении милиацилом

Прудников, Александр Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Клиническая и морфофункциональная характеристика репарации тканей гнойных ран в аспекте нейроэндокринной регуляции при лечении милиацилом
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Клиническая и морфофункциональная характеристика репарации тканей гнойных ран в аспекте нейроэндокринной регуляции при лечении милиацилом"

На правах рукописи

ПРУДНИКОВ Александр Владимирович

КЛИНИЧЕСКАЯ И МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕПАРАЦИИ ТКАНЕЙ ГНОЙНЫХ РАН В АСПЕКТЕ НЕЙРОЭНДОКРИННОЙ РЕГУЛЯЦИИ ПРИ ЛЕЧЕНИИ МИЛИАЦИЛОМ

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология 14.01.17-Хирургия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

005542172

5 ДЕК 20)3

Оренбург -2013

005542172

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители: заслуженный деятель науки РФ,

доктор биологических наук, профессор Стадников Александр Абрамович

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

.СО

Защита состоится «*2^> декабря 2013 года в часов на заседании диссертационного совета Д. 208.066.04 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6, зал заседаний диссертационного совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО ОрГМА Минздрава России.

Автореферат разослан «22.» ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук.

доктор медицинских наук, доцент Нузова Ольга Борисовна

Официальные оппоненты: заслуженный врач РФ,

доктор медицинских наук, профессор кафедры общей хирургии ГБОУ ВПО ОрГМА Минздрава России Абрамзон Олег Моисеевич

доктор медицинских наук, профессор, врач-патологоанатом патологоанатомического отделения ГАУЗ ООКБ № 2 Корнеев Геннадий Иосифович

профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Лечение гнойно-воспалительных процессов мягких тканей является одной из важнейших проблем хирургии (Кузин М.И. с соавт., 1991; Глянцев С.П., Павлов В.В., 1998; Белоконев В.И., Измайлов Е.П., 2009; Оболенский В.Н., 2013). Постоянное внимание к этой проблеме объясняется увеличением гнойно-воспалительных заболеваний, тяжестью их течения, прогрессирующим - возрастанием антибиотикоустойчивых и антибиотикозависимых штаммов микроорганизмов (Стручков В.И., 1987; Бубнова H.A. с соавт., 1989; Светухин A.M. с соавт., 2004; Митиш В.А. с соавт., 2012; Нузов Б.Г. с соавт., 2012; Keztesz I. et al., 1983; Koseoglu H., 2006). Среди всех хирургических больных раневая инфекция встречается у 35 - 45% (Блатун Л.А., 2011).

Успех лечения больных с гнойной хирургической инфекцией во многом зависит от местного лечения (Егоров В.А., 2001; Бордуновский В.Н. с соавт., 2004; Ефименко H.A. с соавт., 2004; Conley J., 2003). Применяемый в настоящее время большой арсенал методов и средств не всегда обеспечивает желаемый результат. Поэтому важен поиск новых методов и средств местного лечения, обладающих разносторонним воздействием, обеспечивающим антимикробный, противовоспалительный и репаративный эффект.

Таким требованиям обладает разработанный в ГБОУ ВПО «Оренбургская • государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации препарат милиацил - просяное масло (Miliacylum).

Решением номенклатурной комиссии ФГК МЗ и МП от 19 июля 1995 г. препарату утверждено название милиацил. Приказом Министерства здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации № 292 от 27 октября 1995 г. данный лекарственный препарат разрешен для медицинского применения и промышленного выпуска. Милиацил внесен в реестр зарегистрированных лекарственных средств - номер регистрационного удостоверения 95/292/7 от 27.10.1995 г.

Работами Л.Е. Олифсона с соавт. (1989), Б.Г. Нузова (1991), Б.Г. Нузова, А.А. Стадникова (1994) установлено, что лечебный эффект милиацила обусловлен наличием в нем ряда биологически активных соединений.

Однако не до конца изучены изменения в тканях гнойных ран при использовании милиацила в аспектах ультраструктурного и молекулярно-генетического анализа (апоптоз).

Одной из причин неблагоприятного течения инфекционных заболеваний считается инфицирование возбудителем, способным секретировать биологически активные вещества, инактивирующие защитные механизмы хозяина и оцениваемые, как факторы бактериальной персистенции (Бухарин О.В., 1999; Курлаев П.П., 2001). Антилактоферриновая активность микроорганизмов является фактором персистенции бактерий, способствующим выживанию в организме хозяина (Валышева И.В., 2005). Многие патогенные бактерии обладают механизмами, направленными на управление клеточной гибелью, что позволяет им поддерживать оптимальные условия развития инфекции (Зигангирова Н. А. с соавт., 2004).

В последние годы значительно повысился интерес исследователей к изучению роли и значения нонапептидов супраоптических и паравентрикулярных ядер гипоталамуса в обеспечении процессов адаптации и компенсации нарушенных функций организма.

Динамика изменения состояния нервных клеток демонстрирует связь со стадиями раневого процесса и его длительностью (Алексеева Н.Т. с соавт., 2011). Установлено, что рассинхронизация фаз секреторного цикла клеточных элементов крупноклеточных ядер гипоталамуса у экспериментальных животных, подвергнутых воздействию дестабилизирующих факторов, включая ситуации с неблагоприятным течением раневых процессов, приводит к ограничению защитно-приспособительных реакций и лимитированию репаративных процессов тканей различного генеза. И если альтеративный аспект данной проблемы (в частности, патоморфология инфекционного процесса) хорошо изучен, то

вопросы регенераторно-пластических изменений, происходящих в тканевых структурах эукариот при их взаимодействиях с прокариотами, в должной мере не обозначен. Особенно это касается исследований роли и адаптивного значения нонапептидергической гипоталамо-гипофизарной

нейросекреторной системы в регуляции этих взаимоотношений (Стадников A.A., Бухарин О.В., 2012). Все выше указанное и предопределило выбор темы и конкретных объектов настоящего диссертационного исследования, а также методические подходы к его осуществлению.

Цель исследования

Цель исследования - экспериментально-морфологически обосновать клиническую эффективность местного применения милиацила в лечении гнойных ран, инфицированных бактериальными патогенами с различными персистентыми свойствами с учетом адаптивной роли гипотапамической нонапептидергической нейросекреции в репаративных гистогенезах в экспериментальных условиях.

Задачи исследования

1. Сравнить влияние различных методов консервативного местного лечения (милиацил, 1% раствор диоксидина и облепиховое масло) на заживление гнойных ран, инфицированных штаммами золотистого стафилококка (S.aureusj, как обладающих антилактоферриновой активностью (АЛфА+), так и без таковой (АЛфА~), в экспериментальных условиях.

2. Изучить особенности динамики гистологических изменений в тканях гнойных ран под влиянием указанных методов лечения в зависимости от персистентных свойств штаммов S. aureus с антилактоферриновой активностью (АЛфА+) и без таковой (АЛфА~).

3.Установить на экспериментальном материале иммуноцитохимическую идентификацию экспрессии проапоптотических белков р53, caspase-3, антиапоптотического белка bel—2, а также белка Ki—67 — маркера пролиферации, для оценки характера и выраженности репаративных гистогенезов.

4. Определить антилактоферриновую активность штаммов S.aureus для оценки течения раневого процесса.

5. Изучить морфофункциональные изменения в гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системе (супраоптические и паравентрикулярные ядра) при различных способах местного лечения гнойных ран, инфицированных штаммами S.aureus с различными персистентными свойствами в экспериментальных условиях.

Научная новизна полученных результатов Впервые проведена на экспериментальном материале иммуноцитохимическая идентификация экспрессии проапоптотических белков р53, caspase-З, антиапоптотического белка bcl-2 и белка Ki-67 для установления характера течения и прогнозирования репаративных процессов в гнойных ранах.

На основе определения антилактоферриновой активности S. aureus дана оценка течения раневого процесса.

Установлено, что местное применение милиацила оптимизирует фазы репаративных гистогенезов, оказывает выраженное противоапоптозное действие, приводит к быстрой элиминации патогенной микрофлоры, предотвращает повторное инфицирование ран.

Было изучено морфофункциональное состояние

гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы при различных способах местного лечении гнойных ран, вызванных штаммами S. aureus с различными персистентыми свойствами, и показано влияние гипоталамических нонапептидов на репаративные гистогенезы.

Научно-практическая значимость работы Полученные научные данные расширяют представления о позитивном влиянии милиацила на репаративные гистогенезы гнойных ран, которые могут быть использованы в качестве фундаментальной основы при разработке новых подходов к комплексному лечению пациентов с гнойно-воспалительными процессами.

Разработанный способ прогнозирования течения гнойно-

воспалительных процессов мягких тканей на основе иммуноцитохимической идентификации экспрессии проапоптотических белков р53, caspase-3,

антиапоптотического белка bcl-2, а также белка Ki-67 открывает новые перспективы в хирургической практике.

Определение антилактоферриновой активности S. aureus дает возможность оценить течение раневого процесса.

Полученные научные данные расширяют представления о механизмах гипоталамической нейроэндокринной регуляции репаративных гистогенезов гнойных ран.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Местное лечение гнойных ран милиацилом оптимизирует фазы репаративных гистогенезов, оказывает выраженное противоапоптозное действие, приводит к быстрой элиминации патогенной микрофлоры, и предотвращает повторное инфицирование ран.

2. Обоснован способ прогнозирования репаративных процессов в гнойных ранах на основе иммуноцитохимической идентификации экспрессии синтеза про- и антиапоптотических протеинов.

3. На основе определения антилактоферриновой активности микроорганизмов можно оценить течение раневого процесса.

4. Определено участие гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы как регулятора репаративных гистогенезов и выявлены изменения в ней при различных способах лечения гнойных ран, инфицированных S.aureus с различными персистентыми свойствами.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования используются в учебном процессе на кафедрах факультетской хирургии, гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Разработанный способ прогнозирования течения гнойно-воспалительных процессов мягких тканей на основе иммуноцитохимической идентификации экспрессии проапоптотических белков р53, caspase -3, антиапоптотического белка bcl-2, а также белка Ki-67 может быт использован в хирургической практике. Для оценки течения раневого процесса можно использовать определение антилактоферриновой активности штаммов S.aureus.

Апробация работы

Основные результаты исследований доложены и обсуждены на II Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Пироговские чтения» (Челябинск, 2012, работа отмечена дипломом); на ежегодной областной молодежной научно-практической конференции в секции «Медицина» (Оренбург, 2012, работа отмечена дипломом); на II региональном молодежном инновационном конвенте (Оренбург, 2012, работа отмечена дипломом); на VIII Международной (XVII Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2013); на II Всероссийской конференции студентов и молодых ученых в рамках «Дней молодежной медицинской науки ОрГМА», посвященной памяти чл. - корр. АМН СССР, профессора Ф.М. Лазаренко (Оренбург, 2013); на Всероссийской конференции с международным участием «Доклинические исследования в инновационной медицине и биотехнологиях» (Самара, 2013).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 5в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения и четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования и двух глав собственных исследований), обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающий 215 источников, в том числе 165 работ отечественных и 50 - иностранных авторов. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 27 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Экспериментальные исследования проведены на 72 лабораторных беспородных крысах - самцах массой 230-280 г на кафедре гистологии,

цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО ОрГМА Минздрава России (зав. кафедрой - з.д.н. РФ, д.б.н., проф. Стадников A.A.) с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» согласно приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 года, Федеральному закону РФ «О защите животных от жестокого обращения» от 01.12.1999, «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей» (Страсбург,1985).

Микробиологические исследования выполнены в лаборатории по изучению механизмов и регуляции персистенции бактерий Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (директор - д.м.н., доц. Черкасов C.B., заведующая лабораторией - д.б.н., проф. Карташова O.JL).

У крыс моделировали раневой процесс задних конечностей. Подопытным крысам после удаления волосяного покрова и обработки кожи настойкой йода и спиртом в стерильных условиях в область бедра внутримышечно вводился 1 мл взвеси суточной культуры S.aureus (2 млрд. микробных тел) и 0,25 мл 25% сульфата магния. 36 животным инфицирование проводили введение S. aureus с антилактоферриновой активностью (АЛфА+) и 36 животным - штаммом S. aureus без антилактоферриновой активности (АЛфА"). Через 5-7 дней у подопытных животных возникал гнойный очаг. После получения экспериментальной модели гнойно-воспалительного очага производили его хирургическую обработку в объеме, обеспечивающем удаление нежизнеспособных тканей.

Крысы были разделены на три группы: основную, первую контрольную и вторую контрольную. В каждой группе было по 24 крысы (из них 12 крыс инфицированы S.aureus АЛфА+ и 12 крыс S. aureus АЛфА-).

У крыс основной группы в местном лечении ран использовали милиацил по 0,3 мл ежедневно, затем накладывали марлевую повязку. В первой контрольной группе животных был исследован характер течения гнойно-воспалительного процесса без лечебной коррекции. Во второй контрольной группе применяли повязки с 1% раствором диоксидина в течение 8-10 дней для очищения ран от гнойно-некротических масс, а затем наносили по 0,3 мл облепихового масла.

Динамику течения патологического процесса оценивали по клиническим признакам. Измерение площади ран (планиметрия) проводили, используя метод JI.H. Поповой, 1942 (Кузин М.И, Костюченок Б.М., 1981).

У животных основной и контрольных групп выполнены исследования состава микрофлоры гнойных ран по общепринятой методике перед началом лечения, на седьмой день и по окончании лечения. Идентификацию стафилококков, стрептококков, кишечных палочек проводили с использованием тест-систем «STAPHYtest 24», «STEPTOtest 16», «ENTEROtest 24» (Lachema, Чехия). Бациллы идентифицировали до рода. Антилактоферриновую активность определяли по методике О.В.Бухарина с соавт. (2005).

У подопытных животных в динамике течения раневого процесса выполняли гистологические и гистохимические исследования тканей из края раны на 3-й, 7-й, 14-й и 21-й день лечения после эвтаназии крыс.

Также были изучены морфофункциональные изменения в гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системе (ГГНС) у крыс всех трех групп. В указанные сроки, в которые забивали по шесть крыс каждой группы (по три крысы, инфицированные S.aureus АЛфА+ и три крысы - S. aureus АЛфА") для выполнения морфологических исследований. Животные выводились из опыта путем ингаляции летальной дозы эфира.

Объекты исследованы на светооптическом и электронно-микроскопическом уровнях. Гистосрезы толщиной 6-8 мкм, изготовленные на ротационном микротоме, после депарафинирования окрашивали гематоксилином Майера и эозином, пикрофуксином по Ван Гизон, метиленовым зеленым и пиронином по Браше, перйодатом К и реактивом Шиффа по Мак Манусу. Гистохимические реакции сопровождались энзиматическими контролями (Пирс Э., 1962).

Для электронной микроскопии часть материала фиксировали в

охлажденном 2,5 % растворе глутарового альдегида на S - коллединовом

буфере (рН - 7,3). Постфиксацию проводили в четырехоксиде осмия

(Millonig G.,1961). Объекты дегидратировали в ацетоне с возрастающей

концентрацией и заключали в смолу ЭПОН - 812. Ультратонкие срезы,

изготовленные на ультратоме LKB - 5 (Sweden, Bromma), подвергали двойному контрастированию в 5 % спиртовом растворе уранил-ацетата и цитрате свинца (Reynolds E.S., 1963). В последующем срезы изучали и фотографировали в электронном микроскопе ЭВМ 100 АК при увеличениях от х 12000 до 50000.

Морфометрические исследования проводили при помощи винтового окуляр-микрометра МОВ-1-15хУ4.2 и окулярной вставки Г.Г.Автандилова (1990) с последующей статистической обработкой количественных параметров.

Для идентификации клеток с признаками апоптоза (программированной гибели клеток) в регенерате гнойных ран использовали иммуноцитохимические реакции. Для определения экспрессии проапоптотического белка р53, антиапоптотического белка bcl-2, а также белка Ki-67, серийные гистосрезы (толщиной 5-6 мкм) инкубировали с соответствующими моноклональными антителами (фирма «Dako», Дания) в рабочем разведении 1:50. Для определения экспрессии проапоптотического белка caspase-3 («Sigma-Aldrich», США) использовали рабочее разведение 1:100. Для визуализации структур использовали стрептавидин-биотиновый пероксидазный метод (Dako LSAB-kit, Дания) с дополнительным окрашиванием ядер клеток гематоксилином Майера. Для определения внутрифазной фрагментации ДНК использовали набор реактивов «Apoptag Plus Peroxidaze in Situ Apoptosis Detection Kit» (фирма «Intergen», Канада).

Полученные данные были обработаны на ЭВМ с помощью программы «Статистика 6.1». Количественные признаки были подвергнуты статистической обработке путём подсчёта основных статистических характеристик: выборочного среднего, ошибки среднего (стандартной ошибки). Данные, полученные в результате исследования, анализировались с применением непараметрических и параметрических методов статистики согласно рекомендациям (Гублер Е.В., Генкин А.А.,1973; Лакин Г.Ф., 1990; Боровиков В.П., 2003). В качестве непараметрических критериев применялись: критерий Вилкоксона (в случае зависимых выборок) и

критерий Манна-Уитни (в случае независимых выборок). В качестве параметрического критерия использовался ^критерий Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты экспериментальных исследований свидетельствует о том, что более эффективным оказалось использование милиацила при местном лечении гнойных ран, чем применение 1% раствора диоксидина и облепихового масла (табл.1).

При лечении милиацилом гнойных ран крыс основной группы на четвертые сутки выявлялось очищение их от гнойно-некротических масс, появление розовых грануляций. На седьмые сутки лечения содержимое ран было скудным, серозного характера. Дно и стенки ран покрывались сочными грануляциями, наблюдалось появление краевой эпителизации. К десятым суткам лечения раны животных заживали.

У крыс первой контрольной группы лечение ран не проводилось, на третьи сутки они были покрыты гнойно-некротическим содержимым. Появление грануляций наблюдалось на седьмые сутки, очищение ран у животных данной группе происходило на девятые сутки, начало эпителизации на десятые сутки. Заживление ран у крыс первой контрольной группе не происходило к 21 суткам.

У животных второй контрольной группы на третьи сутки, леченных местно 1% диоксидином наблюдалось сохранение гнойно-некротических масс, грануляции не выявлялись. На седьмой день лечения происходило снижение воспалительного процесса, раны были заполнены зернистыми грануляциями. На 14 сутки лечения хорошо видна краевая эпителизация, раны значительно уменьшались в размерах. Длительность заживления ран у крыс данной группы составила 16 дней. О наиболее значительном воздействии милиацила на процессы заживления ран свидетельствуют и данные уменьшения в процессе лечения площади ран.

Данные клинических исследований полностью коррелируют с результатами, полученными при микробиологических исследованиях. При вскрытии очага инфекции до лечения у всех подопытных животных

микрофлора была представлена S. aureus. У высеянных штаммов S. aureus определяли антилактоферриновую активность, которая составила 1176± 110 нг/мл.

Таблица 1

Результаты лечения гнойных ран крыс в зависимости от характера местного воздействия и свойств стафилококков

Группы крыс М±ш Сроки (в днях)

Стафилококк очищение ран появление грануляций начало эпителизации заживление

Первая контрольная группа (без лечения) АЛфА+ 9,3 ±0,3**** (п=6) 8,3 ±0,3**** (п=6) 10,7 ±0,4*** (п=6) На 21 сутки не происходило заживления ран (п=6)

АЛфА" 7,5± 0,3*** (п=6) 6,2 ±0,2*** (п=9) 9,0 ±0,3*** (п=6)

Вторая контрольная группа (диоксидин и облепиховое масло) АЛфА+ 6,9 ±0,3*** (п=9) 5,8 ±0,3** (п=9) 8,5 ±0,2** (п=6) 17,3±0,3** (п=3)

АЛфА" 6,4 ± 0,2*** (п=9) 5,6± 0,2*** (п=9) 8,2 ±0,2*** (п=6) 15,7 ±0,3* (п=3)

Основная группа (милиацил ) АЛфА+ 4,6 ±0,2 (п=9) 4,1 ±0,2 (п=9) 7,2 ± 0,2 (п=6) 10,8 ±0,3* (п=6)

АЛфА" 4,3 ±0,2 (п-9) 3,9±0,2 (п=9) 6,6 ±0,2 (п=9) 9,2± 0,3 (п=6)

Примечание:

* -достоверность различий показателей от таковых основной группы (р<0.05) ** -достоверность различий показателей от таковых основной группы (р<0.01) *** -достоверность различий показателей от таковых основной группы (р<0.001)

* - достоверность различий показателей в зависимости от штамма стафилококка (р<0.05) ** - достоверность различий показателей в зависимости от штамма стафилококка (р<0.01)

Через семь дней у 13 (72,2 %) из 18 крыс, леченных милиацилом, рост микрофлоры в посевах из ран не обнаружен (рис. 1). У 5 (27,8%) из 18 животных микрофлора определялась, причем у 4 выделили S. aureus в монокультуре, в 1 наблюдении определили микробную ассоциацию. В конце лечения у 11 (91,7 %) из 12 крыс этой группы микрофлора в посевах из ран не высеяна, только в одном наблюдении выделен S.aureus в монокультуре. В процессе лечения антилактоферриновая активность S.aureus снизилась в 6,1 раза и составила 194±16 нг/мл.

Через семь дней у 4 (22,2%) из 18 крыс 2 контрольной группы, леченных диоксидином и облепиховым маслом, рост микрофлоры в посевах из ран не установлен. У 14 (77,8%) из 18 крыс этой контрольной группы через 7 дней в посевах из ран выделяли микроорганизмы (из них: у 8 животных - S. aureus в

монокультуре, у 6 - ассоциации 5. aureus с другими микроорганизмами). По окончании лечения лишь у 3 (50%) из 6 крыс рост микрофлоры в посевах из ран не выявлен, микробные ассоциации определили в 2 наблюдениях, в 1 случае - высеян S. aureus в монокультуре. . В процессе лечения антилактоферриновая активность S. aureus в этой группе снизилась в 2,2 раза и составила 540±50 нг/мл.

Через 7 дней у 18 крыс первой контрольной группы, лечение которым не проводилось, в посевах из ран высевались микроорганизмы (из них: в 9 наблюдениях S. aureus в монокультуре, в 9 наблюдениях выявили микробные ассоциации). На 21 сутки в 1 случае (16,7%) из 6 рост микрофлоры не выявлен. У 4 из 6 крыс данной группы выявлены микробные ассоциации, в 1 наблюдении из 6 высеян S. aureus в монокультуре.

Анализ исследованных объектов у животных, которые не подвергались лечебной коррекции, показал, что в целом морфологические изменения в раневой области полностью укладывались в картину общеизвестного течения раневого процесса (альтерация тканевых структур, экссудация, пролиферация малодифференцированных клеток). Цитологические и гистологические характеристики раневого процесса у экспериментальных животных, инфицированных S.aureus с антилактофериновой активностью (АЛфА+) и без антилактофериновой активности (АЛфА~) показаны в таблицах 2, 3.

Экспериментальный гнойный процесс, вызванный S. aureus с антилактоферриновой активностью (АЛфА+) носил более затяжной характер и характеризовался появлением значительных участков некротизированных тканей кожи и прилежащих мышц, наличием большого числа гранулоцитов, находящихся в состоянии дегенерации (кариопикноз, кариолизис) и цитолиза, по сравнению с раневым процессом крыс, вызванных S. aureus без антилактоферриновой активности (АЛфА").

Рис. 1. Отсутствие выделения микрофлоры из гнойных ран в процессе лечения различными способами.

Таблица 2

Гистологическая и цитологическая характеристика раневого процесса у экспериментальных животных, инфицированных &аиге«м без антилактоферриновой активности (АЛфА )

100,00% 90,00% 80,00% 70,00% 60,00% 50,00% 40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00%

■ на 7 день

■ перед окончанием лечения

Милиацил Диоксидин и Без лечения облепиховое масло

Показатель,0/» М±т 3 сут М±т 7 сут

без лечения (п=3) диоксидин и облепиховое масло (п=3) милиацил (п=3) без лечения (п=3) диоксидин и облепиховое масло (п=3) милиацил (п=3)

Число лейкоцитов (абс.)в усл. полях зрения 96,8 ±4,1*** 58,2 ± 1,8 62,2 ±2,2 56,3 ± 1,2*** 41,6±3,1 45,1 ± 1,8

Деструкция лейкоцитов. % 95,3 ± 1,3*** 68,6 ± 1,2*** 57,6 ± 1,2 69,6 ±4,6*** 50,4 ±1,1*** 40,8 ± 1,2

Кариопик-ноз эндоте-лиоцитов, % 34,8± 0,2** 33,2 ±2,1 29,4 ± 1,8 31,8 ±1,2* 29,2 ± 1,1 27,4± 1,1

Макро-фаги, % 2,4 ±0,03*** 2,6 ±0,14" 3,2 ±0,11 2,9 ± 0,04*** 3,4 ±0,12** 4,2 ±0,18

Фиброб-ласты, % - - - 0,9 ±0,02*" 1,6 ±0,02*** 2,5 ± 0,03

Плазматические клетки, % - - - - - -

Эпите-лиоциты % единичные клетки единичные клетки единичные клетки единичные клетки единичные клетки единичные клетки

* - окулярная вставка 25 мм2: микроскоп МБИ -15,об. 90, ок. 10.

Примечание: * - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001 - степень статистической достоверности различий показателей по сравнению с таковыми основной группы (милиацил).

Таблица З

Гистологическая и цитологическая характеристика раневого процесса у экспериментальных животных, инфицированных £.янга« с антилактоферриновой активностью (АЛфА+)

Показательно М±т 3 сут. М±т 7 сут.

без лечения (п=3) диоксидин и облепиховое масло (п=3) милиацил (п=3) без лечения (п=3) ДИОКСИДИН и облепиховое масло (П=3) милиацил (п=3)

Число лейкоцитов (абс.) в усл.полях Ф зрения 98,8 ± 1,1*" 89,4 ± 1,2" 83,6 ± 1,2 86,4 ± 1,2"' 78,2± 1,7' 72,4 ± 1,3

Деструкция лейкоцитов, % 100 ±1,3"' 87,6 ± 1,4" 81,2 ± 1,4 82,1 ± 1,6'" 68,2 ± 1,2 65,2 ± 1,2

Кариопикноз эндотелио- ЦИТОВ, % 100 ±1,4'" 64,2 ± 1,3" 58,2 ± 1,1 91,1 ± 1,1'" 60,2 ± 1,4' 55,1 ± 1,2

Макрофаги, % 4,1 ±0,12'" 4,4 ±0,12"' 5,8 ±0,14 5,6± 0,21'" 6,0 ± 0,24' 6,8 ±0,14

Фибро-бласты,% - - - 1,3 ±0,03"* 2,9± 0,04

Плазматические клетки,% - - - - -

Эпителио-циты,% - - единичные клетки единичные клетки единичные клетки единичные клетки

* - окулярная вставка 25 мм2: микроскоп МБИ-15,об. 90, ок. 10.

Во второй контрольной группе в области ран через 7 дней лечения отмечалось наличие участков десквамированного эпидермиса, выполненного детритом. Часто определялись в толще дермы очаги некроза разной величины, окруженные обильной лейкоцитарной инфильтрацией. Очищение ран было замедлено, слабо выражена мобилизация макрофагов. В области раневого дефекта через 14 дней лечения хорошо выявлялся покровный эпителий, местами с выраженными явлениями пролиферации и образования сосочков. В глубине дермы были выражены склеротические явления, здесь определялись различные изменения в виде организующихся очагов некроза, воспалительные инфильтраты с преобладанием эозинофилии или

инфильтраты, представленные малыми лимфоцитами. В дерме в эти сроки полной репарации не происходило при наличии различных клеточных реакций.

Светооптическими и электронно-микроскопическими исследованиями было показано, что применение милиацила, по сравнению с использованием диоксидина и облепихового масла, обеспечивало оптимизацию фаз репаративных гистогенезов в раневой зоне, инфицированной штаммами S. aureus, в том числе обладающих антилактоферриновой активностью (АЛфА+). Использование милиацила достоверно уменьшало некротические и некробиотические процессы в тканях. На стадиях альтерации и экссудации воспалительного процесса было выявлено усиление лейкоцитарной инфильтрации и макрофагальной реакции, ускорялось купирования воспалительного процесса и отделение некротических масс. Существенно снижалась квота деструктивно измененных лейкоцитов, пикнотизированных эндотелиоцитов, достоверно возрастала активность макрофагов. Более активным (в том числе при инфицировании S. aureus с антилактоферриновой активностью (АЛфА+) оказалось формирование грануляционной (малодифференцированной соединительной) ткани за счет интенсификации васкулогенеза, мобилизации адвентициальных клеток и фибробластов. При этом интенсивное образование грануляционной ткани сопровождалось ускорением эпителизации поверхности раневого дефекта (рис. 2). Новообразованные эпителиальные пласты носили органотипический характер с последующим формированием дериватов кожи. В прилегающих участках раны регистрировались процессы репаративного миогенеза поперечнополосатых миосимпластов (рис 3).

Благоприятное воздействии милиацила на заживление гнойных ран подтверждалось иммуноцитохимическими исследованиями (табл. 4, 5).

Количество bcl-2 положительных эпителиоцитов у крыс основной группы, инфицированных S. aureus с антилактоферриновой активностью (АЛфА+), увеличивалось на 3 сутки лечения по сравнению с таковым

показателем у животных второй контрольной группы в 1,6 раза, на 7 сутки соответственно в 4,7 раза.

Рис. 2. Участок эпителиального пролиферата Рис. 3. Фрагмент регенирирующих через 7 суток использования милиацила у миосимпластов раневого дефекта крысы, крысы, инфицированной S. aureus с инфицированной S. aureus с

антилактоферриновой активностью (АЛфА+). антилактоферриновой активностью (АЛфА+) Фиксация: 10% раствор нейтрального при лечении милиацилом. формалина Фиксация: 10% раствор нейтрального

Окраска: перйодат-Шифф-реакция. формалина.

Ув. :х об. 20, ок. 10. Окраска: пикрофуксин по Ван-Гизон

Ув.:х об.40, ок. 10

Количество bcl-2 положительных клеток фибробластов у крыс основной группы, инфицированных S. aureus с антилактоферриновой активностью (АЛфА+), увеличилось на 3 сутки лечения в 2,4 раза, по сравнению с аналогичным показателем у животных второй контрольной группы, а на 7 сутки соответственно в 1,8 раза. У крьТс первой контрольной группы bcl-2 положительные эпителиоциты, фибробласты обнаружены не были на 3 и 7 сутки. У животных основной группы, инфицированных S. aureus без антилактоферриновой активности (АЛфА~), увеличилось количество bcl-2 положительных эпителиоцитов на 3 сутки лечения в сравнении с таковым показателем у крыс первой и второй контрольных групп в 3,7 и 1,1 раза, на 7

сутки соответственно в 3,8 раза по сравнению с аналогичным показателем у животных второй контрольной группой.

Таблица 4

Морфометрические данные по анализу некротических процессов и содержание иммунопозитивных клеток (%) в ране экспериментальных животных, инфицированных З.аигет с антилактоферриновой активностью (АЛфА*) в зависимости от способа их лечения (подсчет проведен с помощью сетки Г.Г. Автандилова, об. 40, ок. 10)

Количество иммунопозитивных клеток, % М±ш 3 сут. М±т 7 сут.

без лечения (п=3) диоксидин и облепиховое масло(п=3) милиацил (п=3) без лечения (п=3) диоксидин и облепиховое масло (П=3) милиацил (п=3)

эпигелиоциты Р53 4,2±0,03» 2,9±0,04» 1,8±0,01 5,5±0.03* 3,1±0,05* 1,2±0.01

сазрава-З 5,0±0,01* 3,3±0,07* 1,9±0,01 6,9±0,01* 3,9±0,04* 1,7±0,02

Ьс1-2 _ 1,9±0,01* 3,1 ±0,03 - 0,7±0,01* 3,3±0,01

Кл-67 - 1,7±0,01» 2,7±0,04 - 1,1±0,01* 3,9±0,03

фибробласты Р53 4,9±0,01» 3,1 ±0,06* 2,4±0,03 4,7±0,02* 2,9±0,08* 1,6±0,01

сазраэа-З 6,2±0,03* 5,2±0,08* 3,3±0,02 7,0±0,02* 4,8±0,09» 2,9 ±0,01

Ьс1-2 _ 1,6±0,01» 3,9±0,04 - 2,5±0,01* 4,4±0,0б

Кл-67 - 1,9±0,02» 3,5±0,01 - 2,4±0,09* 4,0±0,03

Примечание: * - р<0,001 степень статистической достоверности различий показателей по сравнению с таковыми основной группы (милиацил).

Таблица 5

Морфометрические данные по анализу некротических процессов и содержание иммунопозитивных клеток (%) в ране экспериментальных животных, инфицированных без антилактоферриновой

активности (АЛфА~) в зависимости от способа их лечения (подсчет проведен с помощью сетки Г.Г. Автандилова, об. 40, ок. 10)

Количество иммунопозитивных клеток, % М±гп 3 сут. М±т 7 сут.

без лечения (л=3) диоксидин и облепиховое масло (п=3) милиацил (п=3) без лечения (п=3) диоксидин и облепиховое масло (п=3) милиацил (п=3)

эшггелиоциты р53 2,8±0,02* 2,6±0,04* 1,9±0,02 1,9±0,01» 2,1±0,03* 1,7±0.01

саэраза-З ^,0±0,01* 2,9±0,02* 2,2±0,01 3,7±0,01* 3,1±0,04* 1,9±0,02

Ьс1-2 0,9±0,01» 2,7±0,01» 3,0±0,01 - 0,9±0,01* 3,4±0,03

К1-67 _ 0,9±0,01* 2,9±0,01 - 1,9±0,01» 4,1±0,01

фиоробласты р53 3,3±0,04* 3,0±0,01* 2,1 ±0,01 2,0±0,04* 3,1±0,09* 1,5±0,02

сазраэа-З 5,1±0,07» 4,9±0,06* 3,0±0,04 3,7±0,01* 4,9±0,01* 3,1±0,03

Ъс\~2 0,8±0,01» 1,5±0,01* 4,4±0,09 - 2,9±0,03* 4,9±0,03

К1-67 - 2,9±0,01* 3,7±0,03 - 2,8±0,02* 3,9±0,01

Примечание: * - р< 0,001 степень статистической достоверности различий показателей по сравнению с таковыми основной группы (милиацил).

У животных первой контрольной группы bcl-2 положительные эпителиоциты определены не были. Количество bcl—2 положительных фибробластов у крыс основной группы, инфицированных S. aureus без антилактоферриновой активности (АЛфА~), было больше, чем аналогичный показатель у крыс первой и второй контрольных групп в 5,5 и 2,9 раза на 3 сутки, на 7 сутки в 1,7 раза в сравнении с данным показателем у животных второй контрольной группы, bcl-2 положительные фибробласты не выявлялись у крыс первой контрольной группы.

В этой связи полученные нами данные по активизации экспрессии гена bcl-2 в клетках на поле воспаления при различных способах лечения свидетельствуют о том, что данный протеин может рассматриваться как внутриклеточный супрессор апоптоза, способствующий выживаемости эпителиоцитов и клеток фибробластического ряда. С позиций концепции о программированной клеточной гибели (Новиков B.C.,1996), белок р53 является транскрипционным фактором, регулирующим прохождение клеточного цикла через G1 фазу (образно говоря, осуществляется «арест» жизненного цикла клетки). Экспрессия же синтеза протеина bcl-2 ингибирует образование в клетках протеина р53, а следовательно вступление их в апоптоз.

Количество р53 положительных эпителиоцитов у крыс основной группы инфицированных S. aureus с антилактоферриновой активностью (АЛфА+), уменьшалось на 3 сутки лечения по сравнению с таковым показателем у животных первой и второй контрольных групп в 2,3 и 1,6 раза, на 7 сутки соответственно в 4,6 и 2,6 раза. Уменьшалось количество р53 положительных фибробластов на 3 сутки у крыс основной группы инфицированных S. aureus с антилактоферриновой активностью (АЛфА+), по сравнению с аналогичным показателем у животных первой и второй контрольных групп в 2 и 1,3 раза, на 7 сутки соответственно в 2,9 и 1,8 раза. У животных основной группы, инфицированных S. aureus без антилактоферриновой активности (АЛфА~), на 3 сутки лечения также уменьшалось количество р53 положительных

эпителиоцитов в сравнении с таковым показателем у животных первой и второй контрольных групп в 1,5 и 1,4 раза, на 7 сутки соответственно в 1,1 и 1,2 раза. Уменьшилось количество р53 положительных фибробластов на 3 сутки у животных основной группы по сравнению с аналогичным показателем у животных первой и второй контрольных групп в 1,6 и 1,4 раза, на 7 сутки соответственно в 1,3 и 2,1раза.

Изучение экспрессии caspase-З позволило получить дополнительный фактический материал, свидетельствующий об усугублении процессов повреждения мягких тканей под воздействием S. aureus, обладающего антилактоферриновой активностью (АЛфА+). На 3 сутки лечения милиацилом крыс, инфицированных S. aureus с антилактоферриновой активностью (АЛфА+), уменьшилось количество caspasa3 положительных эпителиоцитов в сравнении с таковым показателем у животных первой и второй контрольных групп в 2,6 и 1,7 раза, на 7сутки соответственно в 4 и 2,3 раза. Уменьшилось количество caspase-З положительных фибробластов у крыс основной группы в сравнении с таковым показателем у животных первой и второй контрольных групп в 1,9 и 1,6 раза, на 7 сутки соответственно в 2,4 и 1,7 раза.

У животных, инфицированных S. aureus без антилактоферриновой активности (АЛфА~), на 3 сутки лечения милиацилом также уменьшалось количество caspase-З положительных эпителиоцитов в сравнении с таковым показателем у животных первой и второй контрольных групп в 1,8 и 1,3 раза, на 7 сутки соответственно в 1,9 и 1,6 раза. Уменьшалось количество caspase-З положительных фибробластов у крыс основной группы по сравнению с данным показателем у животных первой и второй контрольных групп в 1,7 и 1,6 раза, на 7 сутки соответственно в 1,2 и 1,6раза. Эти данные свидетельствуют о том, что милиацил вполне вероятно тормозит провоцирование протеолитического прессинга апоптоза.

Сопоставляя данные с ультраструктурными сведениями, можно было заключить, что усиление экспрессии синтеза caspase-З связано с

повреждениями кариолеммы, разрушением цитоскелета и мембранных компартментов клеток (рис. 4).

На 3 сутки лечения у крыс основной группы, инфицированных aureus с антилактоферриновой активностью (АЛфА+), увеличилось количество Ki-67 положительных эпителиоцитов по сравнению с аналогичным показателем у животных второй контрольной группы в 1,6 раза, на 7 сутки соответственно в 3,5 раза. Увеличилось количество Ki-67 положительных фибробластов на 3 сутки лечения у крыс основной группы по сравнению с аналогичным показателем у животных второй контрольной группы в 1,8 раза, на 7 сутки соответственно в 1,7 раза. У крыс, которым лечение не проводилось, Ki-67 положительные эпителиоциты, фибробласты обнаружены не были на 3 и 7 сутки.

Рис. 4. Формирование дискретных апоптозных

телец в зоне раневого дефекта у крысы,

инфицированной S. aureus с антилактоферриновой

активностью на 7 сутки. Стрелкой показаны

стафилококки

Электронограмма.

Ув.:х 22500

У животных основной группы, инфицированных золотистым S. aureus без антилактоферриновой активности (АЛфА~), на 3 сутки лечения также увеличилось количество Ki-67 положительных эпителиоцитов в сравнении с таковым показателем у животных второй контрольной группы в 3,2 раза, на 7

сутки соответственно в 2,2 раза. Также увеличилось количество Ki-67 положительных фибробластов у крыс основной группы на 3 сутки в сравнении с аналогичным показателем у животных второй контрольной группы в 1,3 раза, на 7 сутки соответственно в 1,4 раза. У крыс, которым лечение не проводилось, Ki-67 положительные эпителиоциты, фибробласты обнаружены не были на 3 и 7 сутки.

В этой связи полагаем, что фракция пролиферации, устанавливаемая по маркировке Ki—67, определяющая вступление клеток в митотическую фазу клеточного цикла может иметь существенное прогностическое значение и будет полезна в диагностическом плане при оценке процессов репарации гнойно-некротических дефектов мягких тканей.

Таким образом, милиацил стимулирует пролиферативную активность клеток раневой области и приводит к лимитированию апоптотической доминанты (противоапоптозное действие). При этом при применении 1 % раствора диоксидина и облепихового масла проведенными исследованиями обнаружено, что пролиферативная активность клеток была существенно снижена на фоне интенсивной экспрессии белков р53, caspase-З и подавления экспрессии белков bcl-2, Ki-67.

Приводятся далее сведения о структурно-функциональных изменениях в гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системе с параллельной оценкой репаративных процессов в области раневых дефектов крыс, инфицированных штаммами S. aureus с антилактоферриновой активностью (АЛфА+) и без таковой (АЛфА~) при различных способах местного лечения.

У крыс первой контрольной группы (наблюдались животные без лечебной коррекции) в супраоптических ядрах преобладали нейросекреторные клетки в состоянии «повышенной активности», а в паравентрикулярных ядрах - «умеренной активности». При инфицировании ран животных S. aureus с антилактоферриновой активностью (АЛфА+) до 70% нейросекреторных клеток находились (в поздние сроки наблюдений) в состоянии «депонирования» нейросекрета с признаками дегенерации

ультраструктурных компартментов. Следует особо подчеркнуть то обстоятельство, что при этом в гипоталамо-гипофизарном нейросекреторном комплексе формировались значительных размеров терминали аксонов нейросекреторных клеток исследованных гипоталамических ядер, в том числе тельца Герринга, расположенные выше аксовазальных контактов на уровне нейрогипофиза (рис. 5).

Рис. 5. Терминали аксонов нейро-секреторных • клеток срединного возвышения гипоталамуса крысы, инфицированной S. aureus с ' антилактоферриной активностью, на 7 сутки лечения 1% раствором диоксидина, затем облепиховым маслом, а - секреторные гранулы б - лизосома в - ламеллярные тельца г - хлопковидный матрикс. Электронограмма Ув.:х 28000

При инфицировании ран штаммами S. aureus с антилактоферриновой активностью (АЛфА+) среди нейросекреторных клеток регистрировались клетки с признаками апоптоза, что не наблюдалось у крыс при инфицировании ран штаммами S. aureus без антилактоферриновой активности (АЛфА~).

Подобные изменения нейросекреторных клеток крупноклеточных ядер гипоталамуса были отмечены и во второй контрольной группе, где мы с лечебной целью использовали диоксидин и облепиховое масло.

У крыс основной группы, где в качестве лечебного средства мы

применяли милиацил, были получены иные морфофункциональные

сведения, касающиеся крупноклеточных ядер гипоталамуса (по срокам наблюдений). Так терминалы аксонов НСК, сосредоточенные в контактных областях имели конусообразную форму без задержки экструзии секреторных гранул в гемоциркуляцию). В нейроплазме подобных терминалей содержалась хорошо развитая агранулярная эндоплазматическая сеть, митохондрии, нейротрубочки, нейронити и «синаптические» пузырьки. Использование милиацила приводило к достоверному возрастанию объемов ядер и ядрышек нейросекреторных клеток, снижению числа пикноморфных нейросекреторных клеток на фоне возрастания функционально активных клеток в составе супраоптических и паравентрикулярных ядер гипоталамуса. Подобных изменений не было отмечено в контрольных группах.

Таким образом, положительное действие милиацила в лечении гнойно-некротического процесса коррелирует с нормализацией гипоталамической нонапептидергической нейросекреции, существенно нарушенной в условиях инфицирования раневых дефектов персистентными штаммами S. aureus.

В целом результаты исследований свидетельствуют о существовании определенных параллелей между уровнем и характером секреции гипоталамических нонапептидов и репаративными процессами в раневых дефектах, инфицированных бактериальными патогенами с различными персистентыми свойствами.

ВЫВОДЫ

1. Комплексными исследованиями доказано, что милиацил эффективнее 1% раствора диоксидина и облепихового масла при лечении гнойных ран благодаря оптимизации фаз репаративных гистогенезов и выраженному противовоапоптозному действию.

2. Местное применение милиацила уменьшает у эпителиоцитов и фибробластов экспрессию синтеза проапоптотических белков р53, caspase-3, увеличивает экспрессию синтеза антиапоптотического белка bcl-2, а также маркера пролиферации белка Ki-67.

3. Обоснован способ прогнозирования репаративных процессов в гнойных ранах на основе иммуноцитохимической идентификации

экспрессии проапоптотических белков р53, caspase-З, антиапоптотического белка bcl-2, а также белка Ki-67.

4. В экспериментальных условиях при различных способах местного лечения раневых дефектов показано, что при инфицировании крыс штаммами S. aureus с антилактоферриновой активностью (АЛфА+), более выражены деструктивные изменения, снижены репаративные процессы в тканях гнойных ран, чем при инфицировании животных стафилококком S. aureus без антилактофериновой активности (АЛфА~).

5. Милиацил оказывает выраженное антимикробное действие, приводит к быстрой элиминации патогенной микрофлоры, значительному снижению антилактоферриновой активности микроорганизмов.

6. По снижению уровня антилактоферриновой активности S. aureus в процессе лечения можно оценить течение раневого процесса.

7. Благоприятное действие милиацила в лечении гнойных ран коррелирует с нормализацией гипоталамической нонапептидергической нейросекреции, нарушенной в условиях инфицирования раневых дефектов персистентными штаммами S. aureus, что подтверждалось активизацией экструзии нейросекреторных гранул из терминалей аксонов нейросекреторных клеток на уровне нейрогипофиза, возрастанием функционально активных клеток в составе супраоптических и паравентрикулярных ядер гипоталамуса.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При лечении гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей представляется рациональным и полезным определение антилактоферриновой активности S. aureus в отделяемом ран для оценки течения раневого процесса.

2. На основе иммуноцитохимической идентификации экспрессии проапоптотических белков р53, caspase-З, антиапоптотического белка bcl-2, а также белка Ki-67- маркера пролиферации в процессе лечения можно прогнозировать течение раневого процесса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Магомедов А.Р. Новый способ лечения гнойных ран / А.Р. Магомедов, A.A. Стадников, О.Б. Нузова, A.B. Прудников // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра. - 2012. - № 4 часть 1. - С. 205-209.

2. Прудников A.B. Клиническая и морфофункциональная характеристика репарации гнойных ран при использовании милиацила / A.B. Прудников, A.A. Стадников, О.Б. Нузова, А.Р. Магомедов // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра. - 2012. - №4 часть 2. - С. 190-192.

3. Прудников А. В. Оценка течения раневого процесса у крыс при различных способах местного лечения гнойных ран в аспекте нейроэндокринной регуляции / А. В. Прудников, А. А. Стадников, О. Б. Нузова // Журнал анатомии и гистопатологии. — 2012. - Т. 1, № 4. - С. 44-48.

4. Прудников A.B. Характеристика репарации гнойных ран при различных способах местного лечения / A.B. Прудников, О.Л. Карташова, Т.М. Уткина // Материалы VII международной научной конференции молодых ученых-медиков. - Курск, 2012. - С. 44-48.

5. Прудников A.B. Применение милиацила для лечения гнойных ран / A.B. Прудников // Вестник РГМУ. Журнал Российского национального исследовательского медицинского университета имени Н.И.Пирогова. - 2013. - Специальный выпуск №1. - С. 348-349.

6. Нузова О.Б. Эффективность использования милиацила при лечении гнойных ран / О.Б. Нузова, A.B. Прудников, А.Р. Магомедов // Материалы ежегодной областной молодежной научно-практическая конференции. -Оренбург, 2012.-С. 131.

7. Прудников A.B. Регенерационный гистогенез гнойных ран под влиянием различных способов местного лечения / A.B. Прудников // Пироговские чтения: сборник научных работ II Международной

научно-практичекой конференции студентов и молодых ученых. -Челябинск, 2012. - С. 198-200.

8. Прудников A.B. Изменения в нейроэндокринной системе крыс при различных способах лечения ран / A.B. Прудников // Сборник материалов II Всероссийской конференции с международным участием студентов и молодых ученых в рамках празднования «Дней молодежной медицинской науки ОрГМА», посвященной 125-летию со дня рождения чл.-корр. АМН СССР профессора Ф.М. Лазаренко. - Оренбург, 2013. - С. 203-204.

9. Прудников A.B. Характеристика репарации тканей гнойных ран на основе иммуноцитохимической идентификации экспрессии синтеза про- и антиапоптотических генов / A.B. Прудников, A.A. Стадников, О.Б. Нузова, ОЛ. Карташова, А.Р. Магомедов // Морфологические ведомости. - 2013. - № 3. - С. 89-91.

10. Нузова О.Б. Сравнительное исследование влияния различных методов лечения на заживление гнойных ран / О.Б. Нузова, A.A. Стадников, A.B. Прудников // Альманах молодой науки. - Оренбург, 2013 - № 1. — С. 17-20.

11. Прудников A.B. Морфологическое обоснование путей улучшения результатов лечения гнойных ран / A.B. Прудников, О.Б. Нузова // Морфология. - 2013. - Т. 144, № 5 - С.107-108.

ПРУДНИКОВ Александр Владимирович

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 20.11.2013 г. Отпечатано в типографии «ОренПечать» О.Г.Р.Н. 312565810300101 Формат 60x84 1/16. Бумага офисная. Усл. печ. л. 1.8 Тираж 150 экз. Заказ 119 г. Оренбург, ул. Советская, 27, офис 214

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Прудников, Александр Владимирович, Оренбург

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ОРЕНБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

04201453996

Прудников Александр Владимирович

КЛИНИЧЕСКАЯ И МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

РЕПАРАЦИИ ТКАНЕЙ ГНОЙНЫХ РАН В АСПЕКТЕ НЕЙРОЭНДОКРИННОЙ РЕГУЛЯЦИИ ПРИ ЛЕЧЕНИИ МИЛИАЦИЛОМ

03.03.04. — Клеточная биология, цитология, гистология 14.01.17-Хирургия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители:

заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор A.A. Стадников

доктор медицинских наук, доцент О.Б.Нузова

Оренбург- 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ............................................................................ 3

ГЛАВА 1.СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ ЛЕЧЕНИЯ ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ МЯГКИХ ТКАНЕЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)............................................................ 10

1.1. Лечение гнойных ран.............................................................................. 10

1.2. Регуляция регенерации тканей гнойных ран........................................ 24

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..................... 31

ГЛАВА 3. РЕГЕНЕРАЦИЯ ГНОЙНЫХ РАН ПРИ РАЗЛИЧНЫХ СПОСОБАХ ЛЕЧЕНИЯ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ... 37

3.1. Сравнительная морфофункциональная оценка регенерации гнойных ран под влиянием различных способов местного лечения............................................................................................................ 37

3.2.Иммуноцитохимическая идентификация экспрессии проапоптотических белков р53, саБраБе-З, антиапоптотического белка Ьс1-2, а также белка К1-67 - маркера пролиферации у клеток на поле воспаления, как критерий оценки характера течения и прогнозирования репаративных процессов в гнойных ран............... 63

3.3. Сопоставительный анализ лечебного воздействия милиацила на

заживление гнойных ран............................................................................... 74

ГЛАВА 4. ОЦЕНКА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ НОНАПЕПТИДЕРГИЧЕСКОЙ ГИПОТАЛАМО-ГИПОФИЗАРНОЙ НЕЙРОСЕКРЕТОРНОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ГНОЙНЫХ РАНАХ, ВЫЗВАННЫХ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ БАКТЕРИАЛЬНЫМИ ПАТОГЕНАМИ С РАЗЛИЧНЫМИ ПЕРСИСТЕНТНЫМИ

СВОЙСТВАМИ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ СПОСОБАХ ЛЕЧЕНИЯ................ 76

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.................................... 88

ВЫВОДЫ........................................................................................................ 97

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ........................................................ 99

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................... 100

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Лечение гнойно-воспалительных процессов мягких тканей является одной из важнейших проблем хирургии (Кузин М.И., Костюченок Б.М., 1981; Глянцев С.П., Павлов В.В., 1998; Белоконев В.И., Измайлов Е.П., 2009; Оболенский В.Н., 2013). Постоянное внимание к этой проблеме объясняется увеличением гнойно-воспалительных заболеваний, тяжестью их течения, прогрессирующим возрастанием антибиотикоустойчивых и антибиотикозависимых штаммов микроорганизмов (Стручков В.И., 1987; Бубнова H.A. с соавт., 1989; Светухин A.M. с соавт., 2003; Митиш В.А. с соавт., 2012; Нузов Б.Г. с соавт., 2012; KezteszI. et al., 1983; Koseoglu H., 2006). Среди всех хирургических больных раневая инфекция встречается у 35 - 45% (Блатун Л.А., 2011).

Таким требованиям обладает разработанный в ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации препарат милиацил - просяное масло (Miliacylum).

№ 292 от 27 октября 1995 г. данный лекарственный препарат разрешен для медицинского применения и промышленного выпуска. Милиацил внесен в реестр зарегистрированных лекарственных средств - номер регистрационного удостоверения 95/292/7 от 27.10.1995 г.

Работами JI.E. Олифсона с соавт. (1989), Б.Г. Нузова (1991), Б.Г. Нузова, A.A. Стадникова (1994) установлено, что лечебный эффект милиацила обусловлен наличием в нем ряда биологически активных соединений.

Одной из причин неблагоприятного течения инфекционных заболеваний считается инфицирование возбудителем, способным секретировать биологически активные вещества, инактивирующие защитные механизмы хозяина и оцениваемые, как факторы бактериальной персистенции (Бухарин О.В., 1999; Курлаев П.П., :2001). Антилактоферриновая активность микроорганизмов является фактором персистенции бактерий, способствующим выживанию в организме хозяина (Валышева И.В., 2005). Многие патогенные бактерии обладают механизмами, направленными на управление клеточной гибелью, что позволяет им поддерживать оптимальные условия развития инфекции (Зигангирова Н. А. с соавт., 2004).

экспериментальных животных, подвергнутых воздействию дестабилизирующих факторов, включая ситуации с неблагоприятным течением раневых процессов, приводит к ограничению защитно-приспособительных реакций и лимитированию репаративных процессов тканей различного генеза. И если альтеративный аспект данной проблемы (в частности, патоморфология инфекционного процесса) хорошо изучен, то вопросы регенераторно-пластических изменений, происходящих в тканевых структурах эукариот при их взаимодействиях с прокариотами, в должной мере не обозначен. Особенно это касается исследований роли и адаптивного значения нонапептидергической гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы в регуляции этих взаимоотношений (Стадников A.A., Бухарин О.В., 2012). Все выше указанное и предопределило выбор темы и конкретных объектов настоящего диссертационного исследования, а также методические подходы к его осуществлению.

Цель исследования

Цель исследования - экспериментально-морфологически обосновать клиническую эффективность местного применения милиацила в лечении гнойных ран, инфицированных бактериальными патогенами с различными персистентыми свойствами с учетом адаптивной роли гипоталамической нонапептидергической нейросекреции в репаративных гистогенезах в экспериментальных условиях.

Задачи исследования

стафилококка (S. aureus), как обладающих антилактоферриновой активностью (АЛфА+), так и без таковой (АЛфА~), в экспериментальных условиях.

3.Установить на экспериментальном материале иммуноцитохимическую идентификацию экспрессии проапоптотических белков р53, caspase-З, антиапоптотического белка bcl-2, а также белка Ki-67 - маркера пролиферации, для оценки характера и выраженности репаративных гистогенезов.

4. Определить антилактоферриновую активность штаммов S.aureus для оценки течения раневого процесса.

Научная новизна полученных результатов

Впервые проведена на экспериментальном материале иммуноцитохимическая идентификация экспрессии проапоптотических белков р53, caspase-З, антиапоптотического белка bcl-2 и белка Ki-67 для установления характера течения и прогнозирования репаративных процессов в гнойных ранах.

На основе определения антилактоферриновой активности S.aureus дана оценка течения раневого процесса.

Установлено, что местное применение милиацила оптимизирует фазы репаративных гистогенезов, оказывает выраженное противоапоптозное

действие, приводит к быстрой элиминации патогенной микрофлоры, предотвращает повторное инфицирование ран.

Было изучено морфофункциональное состояние

Научно-практическая значимость работы

Полученные научные данные расширяют представления о позитивном влиянии милиацила на репаративные гистогенезы гнойных ран, которые могут быть использованы в качестве фундаментальной основы при разработке новых подходов к комплексному лечению пациентов с гнойно-воспалительными процессами.

Разработанный способ прогнозирования течения гнойно-воспалительных процессов мягких тканей на основе иммуноцитохимической идентификации экспрессии проапоптотических белков р53, caspase-З, антиапоптотического белка bcl-2, а также белка Ki-67 открывает новые перспективы в хирургической практике.

Определение антилактоферриновой активности S. aureus дает возможность оценить течение раневого процесса.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Местное лечение гнойных ран милиацилом оптимизирует фазы репаративных гистогенезов, оказывает выраженное противоапоптозное действие, приводит к быстрой элиминации патогенной микрофлоры и предотвращает повторное инфицирование ран.

2. Обоснован способ прогнозирования репаративных процессов в гнойных ранах на основе иммуноцитохимической идентификации экспрессии проапоптотических белков р53, caspase-3, антиапоптотического белка bcl-2, а также маркера пролиферации белка Ki-67.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования используются в учебном процессе на кафедрах факультетской хирургии, гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Разработанный способ прогнозирования течения гнойно-воспалительных процессов мягких тканей на основе иммуноцитохимической идентификации экспрессии проапоптотических белков р53, caspase-3, антиапоптотического белка bcl-2, а также белка Ki-67 может быт использован в хирургической практике. Для оценки течения раневого процесса можно использовать определение антилактоферриновой активности штаммов S.aureus.

Апробация работы

конференции в секции «Медицина» (Оренбург, 2012, работа отмечена дипломом); на II региональном молодежном инновационном конвенте (Оренбург, 2012, работа отмечена дипломом); на VIII Международной (XVII Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2013); на II Всероссийской конференции студентов и молодых ученых в рамках «Дней молодежной медицинской науки ОрГМА», посвященной памяти чл.-корр. АМН СССР, профессора Ф.М. Лазаренко (Оренбург, 2013); на Всероссийской конференции с международным участием «Доклинические исследования в инновационной медицине и биотехнологиях» (Самара, 2013).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 5- в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения и четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования и двух глав собственных исследований), обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающим 215 источников, в том числе 165 работ отечественных и 50 - иностранных авторов. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 27 рисунками.

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ ЛЕЧЕНИЯ ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ МЯГКИХ ТКАНЕЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Лечение гнойных ран

Хирургия тесно связана с такими понятиями как раны и раневая инфекция (Адамян A.A. с соавт., 1998; Гостшцев В.К. с соавт., 1999; Блатун JI.A., 2002; Ищук A.B., 2007). Лечение больных с гнойной хирургической инфекцией представляет собой сложную, трудную и актуальную задачу (Стручков В.И., 1987; Глянце С.П. с соавт., 1998; Светухин A.M. с соавт., 2003; Нузов Б.Г., 2005; Митиш В.А. с соавт., 2012; KezteszI. et al., 1983). Этой проблеме посвящены многочисленные исследования (Яковлев Л.В., 2001; Логинов В.И. с соавт., 2003; Канцалиев Л.Б. с соавт., 2008; Привольнев В.В., Каракулина Е.В., 2011; Нузов Б.Г. с соавт., 2012; Bjordal J.M., 2003).

Общепризнанным методом лечения гнойно-воспалительных процессов мягких тканей является оперативное раскрытие гнойного очага с дренированием полостей и создание условий для оттока раневого отделяемого (Кузин М.И., Костюченок Б.М., 1981; Батанов А.Н., 1998; Баулин A.A. с соавт., 2012).

Для местного медикаментозного лечения гнойных ран предложено множество лекарственных препаратов из различных групп действия (антибиотики, антисептики, протеолитические ферменты, коллагеновые препараты, растительные средства и др.).

Ряд работ посвящен изучению эффективности антибиотиков, применяемых местно в лечении гнойных ран (Борисов М.А., 1998; Бесчастнов В.В., 2009; Будашеев В.П., 2011).

Для проведения эффективной антибактериальной терапии необходим постоянный мониторинг этиологических факторов инфекции (Богданов М.Б., Черненькая Т.В., 2004; Ефименко Н. А., Гучев И. А., 2004; Божкова С.А. с соавт., 2009).

Часто микроорганизмы образуют в ранах биопленки. Исследования показали, что наиболее низкие концентрации, требуемые для уничтожения или удаления бактериальной биопленки, для большинства антибиотиков фактически превышают максимальные прописываемые врачами дозы. Таким образом, стандартные дозировки для тех антибиотиков, которые эффективно уничтожают обычно чувствительные

планктоно-выращиваемые в клинической лаборатории бактерии, могут иметь слабое антимикробное действие или могут быть вовсе неэффективными в отношении того же типа бактерий в биопленках ран пациентов (Conley J., 2003; Koseoglu Н., 2006).

Перспективность местного введения антибактериальных средств непосредственно в рану связана непосредственно с целенаправленностью действия лекарственных средств. Местное применение антибиотиков в терапевтических дозах не нарушает процессы регенерации, снижает выраженность воспалительных реакций, стимулирует активацию фибробластов, созревание рубцовой ткани, процессы клеточного деления. (Воленко A.B., 1992; Ashe G., Kleem К., 1978).

Но на современном этапе эффективность использования антибиотиков в лечении гнойных ран, особенно при их местном применении все более уменьшается. Проблема выбора антибиотиков для лечения гнойно-септических больных приобрела большое значение на фоне распространенной резистентности возбудителей заболеваний (Хлебников Е.П. с соавт., 1987; Васютков В.Я., 1999; Савельев B.C. с соавт., 2012).

Решение проблемы лечения в стационаре инфекций, вызванных полирезистентными бактериями, связано в основном не с ожиданием рождения новых антимикробных препаратов, а с разработкой и внедрением решительных и адекватных мер по сдерживанию антибиотикорезистен

Информация о работе

Прудников, Александр Владимирович
кандидата медицинских наук
Оренбург, 2013
ВАК 03.03.04

Диссертация

Клиническая и морфофункциональная характеристика репарации тканей гнойных ран в аспекте нейроэндокринной регуляции при лечении милиацилом - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы