Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Принципы организации и функционирования полигенной системы ACHAETE-SCUTE Y DROSOPHILA MELANOGASTER

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Принципы организации и функционирования полигенной системы ACHAETE-SCUTE Y DROSOPHILA MELANOGASTER"

Р Г Б Ом

1 5 ЛЕН 1зьь

На правах рукописи УДК 575:595-773.4

.. ФУРМАН Дагмара Павловна

ПРИНЦИПЫ ОРГАНИЗАЦИИ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ПОЛМГЕННОИ СИСТЕМЫ АСНАЕЕЕ-БСШЕ У Ш030РН1ЬА ШШШООАЗТЕН

03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Новосибирск, 1996

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Кайданов Л.З.,

Санкт-Петербургский Государственный университет, г.Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор Стегний В.Н.,

Институт биологии и биофизики Томского Государственного университета, г.Томск

доктор биологических наук Чадов Б.Ф., •

Институт цитологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск

Ведущее учреждение - Институт биологии развития

игл.Н.К.Кольцова РАН, Москва

»'СО I-

1996г. на

з совета по защите диссертаций на

Защита состоится заседании диссертационного" совета по защите диссертаций соискание ученой степени доктора наук Д-002.11.01 при Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу:

630090, Новосибирск-90, пр. акад. Лаврентьева ю.

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан ^^

1996г.

Ученый секретарь диссертационного созэта доктор биологических наук ' А.Д.Груздев

Актуальность теш. Основной функцией генного комплекса aohaete-scute (AS-C) является контроль формирования сенсорных органов периферической нервной системы личинок и имаго. Гены aohaete-soute, в частности, определяют развитие щетиночного узора на голове и теле дрозофилы, который характеризуется двумя основными свойствами - постоянством числа и позиций 20 составляющих его щетинок. Мутации этих генов проявляются в утрате некоторых или большинства щетинок набора и имеют неполную пенетрантность.

Сенсационные результаты А.С.Серебровского, Н.П.Дубинина и их коллег, полученные при изучении свойств аллелей aohaete-eoute, в тридцатые года произвели переворот в генетическом мировоззрении, заставив пересмотреть представления о гене как единице мутации, рекомбинации и функции. Руководствуясь сформулированной ими концепцией ступенчатого аллэломорфизма и базируясь на бинарной градации при оценке признака (пенетрант-ности по редукции щетинок), авторы путем сопоставления фенотипов гомозигот и компаундов получили некий линейный порядок индексов щетинок, которые редуцировались у носителей соответствующих мутантных генотипов. Этот порядок интерпретировался как проекция внутренней структуры локуса, т.е. как его генетическая карта (Серебровский,1928; Дубинин,1932; 1933; 1966).

Однако очевидная произвольность выбора порога для перехода от количественной оценки фенотипа (пенетрантности) к качественной бинарной (редукция-отсутствие редукции), равно как и зависимость самих фенотшических проявлений от привходящих факторов - температуры, дозы гена soute, генетического фона и др., - приводили к неоднозначности результатов картирования. В свою очередь, неустойчивость получаемого порядка индексов подрывала логическую основу его трактовки в рамках развиваемой концепции. Был выдвинут целый ряд аргументированных альтернативных вариантов интерпретации сделанных построений (Ро-кицкий, 1931; Sturtevant, Schultz, 1931; Muller et al., 1935). В результате вопрос, являются ли карты локуса Серебро-вского-Дубинина истинными генетическими картами или отражают некие иные свойства системы, остался открытым.

Предлагаемый подход к решению принципиального вопроса о возможности исследования генетической организации локуса

soute по картам феноишических проявлений мутаций ориентирован на использование строгих методов картирования и основан на простой логической посылке: если карты отражают организацию локуса, то в их. структуре должны найтись элементы, устойчивые к факторам, модифицирующим фенотип, поскольку характер дефектов в локусе остается при этом неизменным. В качестве таких факторов рассмотрены температура культивирования мутантов, доза гена soute и направление скрещиваний.

До сегодняшнего дня в полной мере не исследованы и механизмы генетического контроля над числом щетинок. Еще в шестидесятые годы по результатам селекционных экспериментов система aohaete-soute была квалифицирована как полигенная - с олиго-геном aohaete-soute и набором генов-модификаторов (Muller, Fraser, 1968; Rendel, 1976). Однако продвинуться далее констатации этого факта и дать описание системы, включающее информацию о числе и локализации составляющих ее полигенов, не удалось. Подобная ситуация являлась достаточно типичной для самых разных полигенных систем и отражала общее состояние проблемы генетической детерминации количественных признаков, когда возможности традиционных методов ее изучения были исчерпаны, а новые подходы еще не разработаны. С открытием мобильных элементов генома появилась принципиальная возможность локализации полигенов, основанная на использовании маркерных свойств мобильных элементов.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в комплексном исследовании системы aohaete-soute как модельной полигенной системы контроля реализации количественного признака, включающем изучение генетической топографии локуса soùte и картирование входящих з систему полигенов. Сформулированная цель работы и предлагаэмые экспериментальные подхода подразумевали решение следующих задач:

1. Проанализировать фенотипические проявления аллелей Boute в гомозиготах и компаундах при разных температурах.

2. Построить по этим данным карты мутационных проявлений, используя адекватные методы классификации генотипов.

3. Провести сравнение карт, исследовать их устойчивость к изменению температуры, дозы гена, направлению скрещиваний. Выделить в структуре карт инвариантные к изменению перечис-

ленных факторов компоненты, если таковые окажутся.

4. Получить серию новых линий мутантов, сочетающих утрату небольшого числа щетинок с широким диапазоном пэнетрантности.

5. Выяснить закономерности совокупного распределения мобильных элементов шести семейств в геномах этих линий..

ь. На основе сравнительного анализа полученных распределений установить зависимость между уровнем редукции и локализацией мобильных элементов.

7. Исследовать источники гетерогенности по локализации мобильных элементов з ряду изогенных линий. Оценить спектр и частоты происходящих при изогениаации транспозиций мобильных элементов.

о. Базируясь на полученных результатах я учитывая литературные данные, дать описание исследуемой системы. Научная новизна. Впервые исследовано влияние температуры, дозы гена, направления скрещиваний на фенотипические характеристики мутаций и на построенные на их основе карты мутационных проявлений гена soute. Продемонстрировано наличие в линейной структуре карт блоков индексов мутантов и отвечающих год блоков индексов щетинок, инвариантных к изменению перечисленных факторов. Устойчивость выявленных блоков позволяет однозначно интерпретировать их последовательность как истинную генетическую карту локуса. Существенно позднее полученные данные молекулярного клонирования района (Oarrranolino et al., 1982; Gomez-Skanneta et al., 1995) полностью подтвердили предложенную интерпретацию, что свидетельствует об адекватности и высокой эффективности примененного нами метода генетического анализа топографии локуса.

В системе дисгенных скрещиваний получена серия новых аллелей soute, не имеющих аналогов среди "классических" мутаций. Сравнительный анализ мутантов в гомозиготах и компаундах при разных температурах культивирования линий позволил разбить их на шесть комплементационных груш. Мутанты первых пяти групп различаются качественно - наборами редуцированных щетинок, тогда как мутанты шестой группы различаются лишь пенетрантно-стью по редукции единственной пары гумеральных щетинок. Выявленные особенности проявлений' дают основание предполагать не только генетические изменения в структуре олигогена soute, но

и модулирующее влияние полигенных составляющих системы детерминации щетиночного узора.

Для локализации полигенов впервые использован принципиально новый подход, заключающийся в сравнительном анализе совместного распределения мобильных элементов шести семейств. Сопоставление рисунков совокупных распределений Р, oopia, gyp-ву, В104, Ш412, мдг1 в сериях изогенных линий с различной пенетрантностыо позволило указать корреляцию мезду уровнем редукции и локализацией мобильных элементов. Специфичные для разных уровней пенетрантности наборы сайтов локализации мобильных элементов не связаны с происхождением изогенных линий, что определенно указывает на эти сайты как на позиции гипотетических полигенов, связанных с установлением уровня пенетрантности. Таким образом, впервые картированы некоторые полигены, входящие в систему контроля детерминации количественного признака.

Впервые оценено влияние изогенизирукшх скрещиваний на рисунок мобильных элементов в дочерних линиях. В результате исследования спектра распределений мобильных элементов шести семейств в нисходящем ряду изогенных линий выявлен полиморфизм по сайтам инсерций. Показано, что позиционное разнообразие обеспечивается спонтанными транспозициями элементов в родительских линиях, а также рекомбинациями с балансерными хромосомами и перемещениями элементов в процессе изогенизации, частота которых при этом значительно возрастает. Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты работы дают качественно новую информацию о системе реализации конкретного количественного признака. В то же время сходство систем полигенного контроля детерминации для многих количественных признаков в отношении их организации и функционирования, которые обеспечиваются сходством составляющих их единиц и универсальностью механизмов сегрегации, рекомбинации, экспрессии, мутирования входящих в них генов, позволяют предполагать, что закономерности, выявленные для системы, achaete-eoute, носят общий характер и могут быть экстраполированы на другие системы и объекты, расширяя тем самым представление об общих закономерностях их организации и функционирования.

Факт доказанной активации перемещений мобильных элементов

и наличия "рекомбинаций o хромосомами-балансерами в процессе

изогенизирующих скрещиваний позволяет дать практические рекомендации проводить паспортизацию всех линий, участвующее з таких скрещиваниях, на предает распределения мобильных элементов» чтобы избежать смещения оценок степени полиморфизма в исходных линиях и ошибок при расчете частот перемещений в мвнаашейных скрещиваниях подобного типа.

При идентификации полигенных локусов с помощью мобильных элементов следует использовать сравнительный анализ совокупен; распределений нескольких мобильных элементов, что повышает разрешающую способность эксперимента и прогностическую ценность результатов.

Результаты работы используются при чтении курсов лекций в Новосибирском Государственном университете. Апробация работы. Материалы диссертации докладывались или представлялись на II, III, IV и VI Всесоюзных съездах ВОГиС (Москва, 1972; Ленинград, 1977; Кишенев, 1982; Москва, 1987), II Школе ВОГиС по генетике дрозофилы (Канев, 1977), XIV Международном генетическом конгрессе (Москва, 1978), У, VI и VII Всесоюзных Симпозиумах "Молекулярное мохзпипми генетических процессов" (Москва, 1983, 1937, 1990), vi Всесоюзном совещании но проблемам генетики и биологии дрозофилы (Одесса, 1989), Международной конференции "Modelling and computer methods in molecular biology and genctics" »'Novosibirsk, 1990), на oiчетных сессиях ИЦиГ 1990 и 1996г.г.

Материалы диссертации представлены б 34 публикациях. Работа выполнялась в лабораториях популяционной генетики и молекулярной эволюции ИЦиГ СО РАН при частичной финансовой поддержке ГНГПР "Приоритетные направления генетики".

Результаты получены автором лично шн в совместных исследованиях с .ПШТПЖЩэо], В.А.Ратнером, С.Н.Родиным, Т.А.Бухариной (Кожемякиной), С.А.Забановым, Ю.Н.Ивановым, участие которых отражено в цитированных публикациях. Всем названным коллегам автор искренне признателен. Особую благодарность автор выражает В.А.Ратнеру - инициатору исследования генетический топографии локуса soute -, под чьим руководством была выполнена кандидатская диссертация, материалы которой частично использованы при написании первой главы.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 266 страницах машинописного текста (без списка литературы), состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и приложения. Текст иллюстрирован 47 таблицами, 2 схемами и 7 рисунками. Библиография - 384 работы, в том числе 94 на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ИНВАРИАНТЫ КАРТ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ ПРОЯВЛЕНИЙ МУТАЦИЙ SCUTE КАК ОТРАЖЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТОПОГРАФИИ ЛОКУСА

Примененный нами метод исследования генетической организа-' ции локуса Boute основан на поиске элементов карт фенотипиче-ских проявлений мутаций, устойчивых по отношению к факторам, модифицирующим фенотип.

Эксперимент выполнен на 12 "классических" мутантных линиях soute из коллекции Баулинг-Грин (Огайо, США). Подсчитывались проценты редукции каждой из 20 пар щетинок головы, торакса и скутел-люма (Рис.1) у гомозигот (отдельно для самцов и самок) и компаундов от прямых и реципрокных скрещиваний. В сумме это составило 156 вариантов генотипа по локусу soute. Фенотип каждого из вариантов исследовался при 14°, 22°, 30°с. Полученный массив данных охватывает результаты анализа ~120 тыс. особей и представлен в виде таблиц "генотипы » щетинки".

Карты фенотипических проявлений гомозигот и компаундов представляют собой упорядоченную последовательность мутаций, кавдой из которых приписаны соответствующие фенотипические проявления -совокупности щетинок, редуцированных у носителей данной мутации. Построение карт фенотипических проявлений включает поэ-

рис. 1. Иетиночный узор D. melanoeaster ос - оцеллярные. pv -поствертикальные, ог -орбитальные, de - дор-зодентральные, se -скутеллярные, h - гу-неральные.п - ното-плевральные,Ps - пре-сутуральные, sa - су-пра-алярные, ра -пост-алярные.

тому две независимых процедуры упорядочения - индексов мутаций и индексов отвечающих им щетинок.

Упорядочение индексов мутантов основано на вычислении различий между линиями разных генотипов по интегральной редукции

всэх затронутых щетинок. Существенно, что при этом проценты редукции используются как таковые, Саз замены их качественной оценкой "есть-нет", что обеспечивает максимально полное использование информации и снимает вопросы, связанные с произвольными преобразованиями исходных данных. Мерой различия между лнниали служили накопленные разницы процентов редукции по всем затронутым щетинкам. Результаты сводились в матрицы функ

^Í^AA-UV^íüaX рсЗммГчиП i.ij TCiüTOíi (тзСл. i } • iiO^w CÍ'JUOBI^OA

индексов мутантов добивалась монотонного возрастания мер различия в сторону от диагонали матрицы. Если такого результата удается достичь, полученный порядок индексов интерпретируется как генетическая карта. Интерпретация основана на естественном соображении о том, что близость фенотипических проявлений мутантов обусловлена структурной близостью внутрилокусных дефектов, которые эти мутации вызывают. В структуре матриц сходства гомозигот псзмопно выделение блоков иттдптссоп мутантов. Границы блоков проводились так, чтобк максимальное расстояние внутри блоков было меньше наименьшего расстояния за их предо-лаг®, а в блоки попало наибольшее число мутантов. Этот критерий позволяет выделить два блока мутантов, в которые, однако, но попадают мутанты веб и возв. Использоваше болое мягкого критерия (среднее расстояние внутри блока меньше среднего расстояния между блоками) позволяет считать их двумя одноэлементными блоками. Действительно, по ряду свойств обе мутации отличны как от мутантов других олоков, так и друг от друга.

Использование для сравнения генотипов другой моры сходства - вероятности . оиибочной классификации при индивидуальном сравнении особей из разных мутантных линий - дает качественно тот же результат выделения четырех блоков мутаций. При этом границы между блокаж становятся контрастнее, тогда как связь между блоками выражается слабее. Аналогичная тенденция выявляется и при оценке сходства генотипов.через евклидово расстояние. Таким образом, структура матрицы устойчива к применяемой мере оценки различий генотипов. Это означает, во-

Таблицам Упорядоченная натрнца функциональных различий нутантов scute. Выделены блоки близких нутантов.

sc9 scl SC7 SCD2 SCD1 SC3B 9C6 SC260 SC28 sc5 SC8 SCV2

SC9 0 2029 2172 3168 3310 6114 6792 10634 11506 1 1782 12536 14205

SC1 2029 0 1555 2955 2743 5615 6281 10377 10887 11457 11529 13836

SCT 2172 1555 0 2248 1556 4470 6836 9222 9766 10270 10900 1 3016

scDH 3168 2955 2248 0 2070 4234 6384 9146 8942 8910 10144 11341

scDl 3310 2743 1556 2070 0 3304 7598 7984 8448 8984 9494 11275

SC6 6114 5615 4470 4234 3304 0 9502 5196 5508 5888 6874 8315

SC3B 6792 6281 6836 6384 7598 9502 0 144.18 13562 13022 13696 11053

SC260 10634 10377 9222 9146 7984 5196 14418 0 1064 14S0 2494 3813

SC28 11506 10887 9766 8942 8448 5508 13562 1064 0 1132 1630 3033

SC5 11762 11457 10270 8910 8984 5888 13022 1430 1132 0 2702 2635

зсо 12536 11529 10900 10144 9494 6874 13696 2494 1630 2702 0 3351

SCV2 14205 13836 13046 11341 11275 8315 11053 3813 3083 2635 3351 0

Таблица 2. Карта функциональных проявлений локуса scute (гомозигота). Показана границы нехду блскани индексов шетинок.

pa 1 П 1 ОС or 2 PV 1 or 1 SC 3-4 SC 1-2

1 Г 1 г 1 Г I Г 1 rl 1 r 1 Г 1 Г

sc9 42 43 93 99 99 100 84 87 100 1001 99 97 100 100 99 99

scl 2 1 100 100 91 92 96 95 100 100 99 99 99 100 96 98

SC7 100 100 71 70 74 72 100 991 99 100 100 100 96 98

SCD2 92 91 06 85 39 35 100 100' 96 99 92 94 72 70

SCD1 1 1 97 97 49 49 43 43 97 961 93 95 99 99 97 97

SC6 77 74 97 97 99 97 99 991 93 93 17 16 8 8

зсзв 17 17 36 37 92 89 97 97 99 99 86 91

SC260 1 1 1 1 1 100 100 100 100

SC28 1 1 1 1 1 11 1 2 80 79 79 79

SC5 1 l1 5 6 87 88 48 47

SC8 2 2 3 3 1 1 1 | 1 53 54 83 81

SCV2 1 1 1 1 1 8 9 11 11

Таблица з. Карта функциональных проявлений локуса scute (конпаунды. опорный аллель sc3B).

о 1 1 1 3-4 i-S

or- PV ОС or SC SC

1 rl 1 Г | I Г 1 г 1 г 1 r

SCD2 9 7 ' 65 67 99 99 100 too 20 16 14 14

SC7 21 221 47 431 98 98 100 100 24 28 40 32

SCD1 31 31 65 62' 99 99 100 100 37 36 42 43

scl 45 531 45 341 98 197 100 100 53 48 9 11

sc9 23 23 80 80 100 100 99 99 75 73 37 45

SC6 25 251 43 431 97 97 100 100 1

SC3B 13 12| 61 601 91 94 100 100 34 36 43 43

SC260 | 61 73 38 40

SC28 * 67 68 41 41

SCV2 11 2 2 1 1 8 7 3 7

SC8 1 l1 2 1 2 2 8 6

SC5 I 4 7 7 7

первых, что блоки не являются артефактом, а отражают наличие реальных субструктур локуса; и, во-вторых, что метод "процентов редукции" вполне адекватен для получения общего представления об организации рассматриваемого района.

- ?рудь —.

Вторая процедура - упорядочение индексов щетинок - проводилась так, чтобы в результате щетинки, затронутые у каждого мутанта, образовали неразрывные группы, а внутри этих групп проценты их редукции изменялись монотонно. В полученном упорядочении также можно выделить блота. Критерием их выделения было либо наличие резкого изменения процентов редукции одноименных щетинок у одаого-двух мутантов, либо менее резкие различия, но отмеченные у нескольких мутантов.

Отметим, что процедура упорядочения индексов щетинок явля-

• ется более строгим

A ¡H™1 v' t' #\ps п' Ыar'te \st и \ f W вариантом картирова-

dC t/t r /if rr „ _

ния СереСровского-Дубшшна. Сравнение карт (Рис.2) показывает, что различия связаны с двумя, но важными перестановками индексов щетинок: pv, входящими в карта (а) в один центр со скутелляр-ными; и ра, составля вдими общий центр с ог и со. В обоих случаях нарушается принцип топографической близости щетинок, согласно которому их индексы образуют блоки в карте (б).

Искомая карта функциональных проявлений получалась совмещением упорядоченных индексов мутаций и щетинок в одной таблице (табл.2), сравнение карт, построенных по фенотипическим проявленям гомозигот при трех температурах, позволяет сделать несколько заключений, существенных для интерпретации: 1) независимо найденные порядки и выделенные блоки индексов мутаций и щетинок взаимно соответствуют друг другу, выявляя полярную структуру карт. Блоку мутаций (soDi, во7, во1, soD2) отвечают ра1 щетинки; sc6 связан с п1 щетинками; зсЗВ -С группой (ос1-2, pv1-2, ог1-2); блоку (scV2, sc260-22, sc2S,

п< or'-2 ос'-* pv'rг L'-f

1

2 i///

\///Á «л//?

Рис.г. Последовательность центров я карте Серебровского-ДУбинина (1933) !А) и карта функциональных проявлений локуса scute (Б).

so8, so5) отвечает блок (во1-2, so3-4) щетинок. 2) Индексы щетинок формируют блоки по позиционной принадлежности отвечающих юл щетинок: грудь, голова, щиток (Рис.20). 3) Блоки сохраняют устойчивость при изменении температуры.

Обе процедуры - упорядочение индексов мутаций и щетинок -применялись и к грушам компаундов, имеющих общий - опорный -аллель. В этом случае результат картирования прямо зависит от принадлежности опорного аллеля к разным блокам карт гомозигот.

Если опорный аллель принадлежит первому блоку, карты мутационных проявлений компаундов практически идентичны картам гомозигот. В их структуре стабильно выявляются те же блоки индексов мутаций и щетинок.

Если опорными являются мутанты из одноэлементных блоков воб или воЗВ, то картина получается промежуточной - в картах можно указать лишь отдельные фрагменты (табл.з).

Если опорным служит мутант из последнего блока карт гомозигот, построение карт компаундов оказывается невозможным. В матрице различий мутантов блочная структура не просматривается, а в упорядочении щетинок выделяется лишь отвечающий этому блоку мутантов блок скутеллярных щетинок.

Резюмируя результаты, можно сказать, что факт наличия в структуре карт блоков говорит о наличии устойчивых групповых свойств входящих в блоки элементов. Полярность карт и зависимость результата картирования от групповой принадлежности опорного аллеля свидетельствует о цис-эффектах, связывающих разные блоки. Инвариантность числа и состава блоков по отношению к факторам, модифицирующим фенотип мутантных линий, свидетельствуют об их соответствии реальным субструктурам ло-куса, локально определяющим формирование щетинок в определенных областях головы и тела дрозофилы. Т.о., упорядоченная последовательность блоков и является истинной картой локуса.

Впоследствии эти данные и интерпретация были подтверждены результатами прямого молекулярного картирования района, (Carramolino et al., 1982). В структуре района выявлено несколько единиц транскрипции, две из которых связаны с экспрессией генов aohaete (Т5) и вoute (54), и выделен набор энхан-серов, направляющих их транскрипцию. Функционально активная единица, генетическим аналогом которой является soute, со-

стоит из транскрибируемого района и одного контролирующего элемента. Каждый контролирующий элемент ответственен за локальную экспрессию гена в строго определенной позиции. Расположение энхансеров, контролирующих транскрипцию Т4, совпадает с последовательностью индексов щетинок в построенных нами картах. Эффект мутаций состоит в разобщении регуляторного и транскрибируемого районов. Групповые свойства мутаций обусловлена их положением относительно района 54 и инактивацией соответствующих энхансерных элементов. Природа дефекта роли неиграет. У мутантов 1-го блока в результате инсерции (sd, езК"! " scD2, ) или перестроек (во7 и во9) блокирована большая часть энхансеров, тогда как во5 в результате делении дгеол лить "скутеллярных". Внутренняя делеция so6 привела к инактивации пира энхансеров, но сохранила "скутеллярные". Все эти свойства отражены в построенных нами картах функциональных проявлений.

Таким образом, полученные данные демонстрируют адекватность и высокую эффективность генетических методов для анализа структурной организации' сложных локусов эукариот.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОБИЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ ДЛЯ ЩЖКОЖШМ ПОЛИГЕНОВ В ПОЛИГЕННОЙ СИСТЕМЕ SOUTE

При исследовании любой полигвйной системы возникает проблема идентификации всех составляющих ее элементов. Практика подобных исследований показывает, что для решения этой задачи традиционные генетические методы, как правило, оказываются недостаточно эффективными в силу отсутствия у полигонов выраженных фенотипических проявлений, их дисперсного положения в геноме, малого влияния на признак отдельно взятого полигена, плейотропных эффектов и часто антагонистического влияния на признак разных полигенов. Не могут быть использованы для их идентификации и прямые молекулярно-генетические метода, поскольку продукты экспрессии полигенов до сих пор неизвестны. С открытием мобильных элементов генома возникла возможность сделать это, используя мобильные элементы в роли маркеров.

Задача при этом сводится к сопоставлению рисунков распределения мобильных элементов в линиях с разной пенетрантностью

и поиске зависимости между уровнем редукции щетинок в линии того или иного генотипа и характером распределения мобильных элементов в ее геноме.

•Имея ввиду свойства полигенов, представляется очевидным, что результативно влиять на признак могут лишь ансамбли полигенов однонаправленного действия, и в максимальной степени их эффект проявится на фоне мутации в олигогене. Поэтому желательно включение в эксперимент мутантных -линий, охватывающих широкий диапазон пенетрантности по признаку редукции щетинок, минимизация внутрилинейного полиморфизма по распределению мобильных элементов и расширение круга используемых мобильных элементов с целью поиска и интерпретации неких общих свойств их совокупного распределения в геномах линий.

Распределение мобильных элементов и пенетрантность в исходных линиях мутантов

Специально для выполнения данного этапа исследования в системе р-м гибридного диагенеза по стандартной схеме (Rubin et al., 1982) был получен ряд новых мутантов soute, 6 из которых выбрали для эксперимента. У всех мутантов с пенетрантностыо от 19.855 (во34Р) до 89.5% (во133Р) (Р>0.95) редуцировались гумеральные щетинки , а у во34Р - еще и поствертикальные (табл.4).

Таблица 4. Проценты редукции щетинок у самцов из линий S034P, во55Р, во59Р, во14бР, бо147Р, во13ЭР

— — • ; щетинки ' : "' ЛИНИИ. —-:-;-

h1 h2 среднее pv pv2 среднее

во34Р 22.5 17.0 19.8± 2.7 54.0 64.0 59.0+5.0

S055P 24.0 34.0 29.04 5.0 - - - •

во59Р 28.5 40.5 34.5± 6.0 - - -

ео146Р 52.5 50.5 51.54 1.0 - - -

SC147P 80.0 77.5 78.8+ 1.2 - - -

S0133P 90.0 89.0 89.5± 0.5 - - -

Каадая линия характеризовалась распределением мобильных

элементов шести семейств (Р, мдг1, ГЫ12, oopia, gypsy, ВЮ4) по данным гибридизации in situ на препаратах политешшх хромосом слюнных желез.

Анализ этих распределений позволяет сделать два

заключения:

1) Наблюдаемые межлинейные различия по пенетрантности могут быть обусловлены скорее не числом элементов, а качественным характером их распределения в геноме.

Это положение иллюстрируется табл.5, из которой видно, что среднее число инсертов на геном варьирует от 79.5 У во'34? до 94.1 у SC133P- Межлинейное разнообразие по насыщенности ясСйгьпшк ял9м9нт8ми создается в основной; за ù-iei 3104: ми--нимальное значение числа инсерций этого элемента составляй? 20.2 (so34P), максимальное - 34-8 (so55P). Содержанием других элементов линии различаются несущественно. Однозначной зависимости между насыщенностью генома мобильными элементами и уровнем пенетрантности по редукции щетинок в линии выявить не удается, независимо от того, рассматривается ли содержание

Таблица 5. Среднее число инсертов мкг1, Dm4l2, oopia, gypsy, В104, Р элемента на геном в мутантшх линиях

TSÏ линии

инсер- '

та so34P SC55P зс59Р wH¿? г;с147Р бс133Р

ГДДГ1 16.8±0.8 16.4±0.б 15-6±1 .1 17.4r.G-8 -¡¿.0;1.б 1?.4±2.8

Dni412 17.8+1.7 18.0+1.2 19.6±1,5 17-6±0.9 18.2+0.4 18.4±2.2

oopia 17.4+O.9 18.0+1.9 19-6±1.5 20.0+1.9 21.3+1.2 20.0+2.4

В104 20.2±0.8 34.3±2.3 28.8±1.6 30.2+2.9 33.7±2.6 32.2+1.7

gypsy 3.0+0.7 2.8+0.7 3.0±2.2 3.8+0.4 З.б±0.5 2.3±0.9

? 0.7±0.5 1.2±0.8 - 1.0±0 1.2±0.4 0.8+0.4

Итого 75.9 91.2 86.б 90.0 94.0 93.1

одного или совокупное содержание всех названных элементов.

2) Качественная характеристика (рисунок) распределения по геному отдельно взятого мобильного элемента недостаточно информативна, чтобы связать ее с уровнем пенетрантности в соответствующих линиях. Это заключение подтверждается данными

табл.6.

Таблица 6. Индексы сходства мутантов по рисунку ВЮ4 на 2Ь (выше диагонали) и мдм на Зй (ниже диагонали) хромосомах

линии бо34Р БС55Р во59Р Б01 46Р во147Р во1 ЗЗР

Б034Р - 0 0 0 0 о.з

бо55Р 0.3 - 0 0 0 0

бс59Р 0.7 0.5 - 0.1 0.2 0.1

бс146Р 0.6 0.5 0.7 - 0.2 0.5

вс147Р 0.6 0.5 0.7 0.9 - 0.3

вс1ЗЗР 0.4 0.5 0.8 0.6 0.6 -

В качестве объективного показателя близости объектов по рисунку распределения мобильных элементов здесь и далее использован индекс сходства Б = (Ие1 et а1., 1990), где

ы^ - число совпадающих сайтов мечения, а и л^ - числа

сайтов гибридизации у попарно сравниваемых объектов. осз^1: о - отсутствие общих сайтов; 1 - идентичность рисунка сайтов.

Ситуация улучшается при анализе совокупного распределения всех названных мобильных элементов. (Сайт считается занятым, если метится при гибридизации хотя бы с одним из элементов). В табл.7 представлены индексы сходства попарно сравниваемых

Таблица 7. Число общих сайтов в суммарных распределениях мобильных элементов шести семейств по геномам мутантных линий (ниже диагонали) и матрица индексов сходства, построенная по этим данным (выше диагонали)

Линии

во34Р во55Р 6059Р Б0146Р бо1 47Р Б0133Р

бо34Р 33 0.51 0.41 0.38 0.26 0.29

бо55Р 19 42 0.48 0.43 0.31 о.зо

во59Р 15 20 41 0.46 0.32 0.36

вс146Р 15 19 20 46 0.57 0.41

во1 47Р 9 12 12 23 35 0.40

Б0133Р 10 12 14 17 14 36

линий, предварительно упорядоченных по возрастанию пенетрант-

ности.Почти без исключений значения индексов убывают в сторону от диагонали»т.е. сходство между линиями по рисунку мобильных элементов тем меньше, чэм дальше они отстоят друг с? друп по уровню редукцгпт щетлпотс. Максимальной близостью га-

рактерчзуктся мутанты, зашагакщие ь л'.отряцо сме:сзде ггозэтшя (им соответствует первая цифра от диагонали). Т.о., уже при

гш-хйгз>.> «сходных лш-юй просматривается ТдНДОЯЦЯЯ к лоллч;го заилсшиатл ггезду данзхраашостьа и каюса-веяшаш ларакхзрис-'¡■,,:ка"./г ямсчшо суммарного р^иределенпя уобпзъннх о.тамгь^ов,

Ь -пиа виявился «юокиР уровень полиюрфп;*?.-, .к сайгзя инсерций элементов. Поскольку ставится задача выявления кор-

■па ттатттуж «яатитти тлтжгчгхлгпм йпниоич'по м пиии'тйи-рмшгтк,!. миннйннн-

мой, по определению, на некоторой совокупности особей мутакт-ного генотипа, точные данные можно получить только при условии унификации генетического фона у всех особей анализируемой выборки. Этому требованию отвечают изогенные линии мутантов.

Распределение мобильных элементов и пенетрантность в ряду изогешшх лшшй мутантов

Изогенизаияя преследовала две цо/ч: выявлен?..? гвиотитг^.э-окого разнообразия исходам:? линий и минимизация внутрилинейного иолш;орсгзки но распрздолсвигы ми^аллчу. •сл№1еатг'В.

Изорэиизадда выполнялась в два раунде ии стандартной пр-к помощи оалазсерных линия Вазс;СуЛ'тц>'«»: (х-? реуяч) л Су/Ря;Е/зь (и-й раунд), содеркадих видимые мерхэрн и «нввр-сии, блокирующие перекрест. В результате кърього-раунда получено 18 линий (изогенные 1-го порядка) (табл.8). Пенетрантность по признаку редукции ЩРТИПОГГ ТГОЛОбЛЭТСЯ В ЭТИХ ЛИНИЯХ ■ оч' 2.8;' до 52.Ой, существенно пропитая по диапазон/ значений соответствующие показатели для родительских исходных линий. При этом от линий с близкими значениями редукции получены производные линии, различающиеся по этому признаку, и напротив, линии, исходно различающиеся пенетрантностью, дали изо-генннэ с близкой пенетрантностью. В качестве примера укажем хотя Си тары лшшй зс55-9 - вс59-Ю й з?55-9 - во133-3-

.Две линии с контрастными значениям! пенетрантности - пс59-5 и во147-14 - изогенизировались повторно через 65 поколений

лабораторного разведения (в табл.8 обозначены звездочкой).

Таблица 8. Редукция щетинок у самцов из родительских (выделены жирным шрифтом) и изогенных линий 1-го (слева) и И-го порядка (справа)

тлтлттгг щетинки ТРТГТТГГТ щетинки

h1"2 pv1 -2 «/lilllfcliíl h1"2

вс34Р 19.8 59. 0 SC59P-5* 3.2

во34-1б 11.0 75. 5

S034-22 43.0 - sc59P-5-15 1 .0

SO34-10 47.2 50. 5 sc59P-5-6 2.3

Сред. изог. 33.7± 0.2 42. 0+14.1 so59P-5-8 3.7

sc55P 29.0 - sc59P-5-3 4-0

so55-9 24.8 - so59P-5-14 4.2

SC59P 34.5 - - В059Р-5-2 7.0

so59-5 2.8 - so59P-5-23 7-5

во59-8 15.2 - sc59P-5-1 11.0

6059-4 22.0 - sc59P-5-9 15.8

S05S-10 72.0 -

Сред. изог. 28.0± 3.8 Сред, изог-11 6.3±1.6

ес146Р 51.5

S0146-2 63.2 -

sol 46-8 70.8 - -

Сред. изог. 67.0+26.0 SC147P-14* 93.2

ес147Р 78.8 -

В0147-7 40.0 - sol 47Р-14-2 12.8

sol 47-14 92.0 - S0147P-14-9 25.5

Сред. изог. 66.0± 1.5 sol 47Р-14-5 38.3

БС133Р 89.5 - sol 47Р-14-19 39.7

В0133-Э 29.8 - S0147P-14-7 47.2

Б01ЭЗ-1 59.0 - sol 47Р-14-4 60.5

во1 ЭЗ-Ю 62.5 - sol 47Р-14-6 73.2

80133-11 72.8 - sol 47Р-14-13 73.5

В0133-16 73.5 - во147Р-14-16 97.7

S0133-18 79.5 -

Сред. изог. 62.8± 7.3 Сред. изог-II 52.0±8.9

В результате было получено еще 18 производных (изогенные и-го порядка) (табл.8), среди которых также оказались линии с близкими значениями редукции.

3 изогенных линиях внутрилинейного полиморфизма по распределению мобильных элементов выявлено не было, что свидетельствует о высокой степени изогенностк. Далее изогенные линии 1-го и и-го порядков анализировались совместно,

Бела гипотеза о наличии корреляции мзжду распределенном '„■.■¿»"оптов и уровнем редукции в линиях верна, то схо.ястро по пенетрантностн до~по солровоадаться сходство:! то рьшгродедэ-уп:г ж'лльн!?" элементов ;?нв зазиашоегк от ирскс£оадвния лао-линий.

Для цоовярй-и прс^х^-юлййия иолт.ргтз; ■ Л'ЧБНЧ™

по ^иокуч-ному рпгпргдоденш моОильных элементов, охватившему 211 сайтов. За вычетом общих сайтов (встретившихся во всех без исключения линиях) и уникальных сайтов (принадлежащих лишь одной из линий) число информативных сайтов составило 168. Построенная на основании попарного сравнения линий матрица индексов сходства по рисунку информативных сайтов приведена в табл.д (нижний треугольник).

Линии ранжированы то полотрантностя. Грделкдое свойства лилий становятся более наглядными после ■ ц&эбрааогшш матрицы в графическую форму, Для этого вычислил* средпемэтричков значение индекса (3=0,61) и зачернили позишш >ящексов, превышающих это значение (Р>0.99) (верхний треугольник табл.9). В матрице выделяется несколько блоков линий. Один из них образован производными ог единственной линии - зс34. Кроме него, видны, по крайней мере, еще два блока, в которые объединились линии разного происхождения и разного порядка изоген-ности. Первый насчитывает 16 линий (от во59-5-15 до эс133-3) - с покетрантностью от 1.0 до 30%; второй составлен 17 элементами и охватывает линии 50147-14-5 - зо 147-14-16, пенетран-■гность от 38% до 98%. Среднеблочные значения индексов сходства равны соответственно 79.0.0+3.2; 64.3±0.6 и 70.2+0.7, что косвенным образом свидетельствует о дискретности и неперекрываемости названных блоков. В пределах двух последних блоков можно указать подблоки.

Легко видеть, что во второй и третий блоки объединились

Таблица 9. Матрица индексов сходства изогенных линей по совокупному распределению мобильных элементов

! I I п п I ¡1 и и к г5 а г» » гг ( 5 29 I в л г я » я н в и « к м с к и н з>

100 и й

15 п I

51 Я Я

II 15 (!

55 5» 59

И К (5

(! I) О

И Ю Я

<5 <7 (Г

Я 51 52

50 55 5) И <6 м

|> а %

II ч и

51 51 51 19 И 55 15 15 II Я 57 56 И 15 I! 55 I? 51

51 15 51 50 51 51

5« К И

55 50 51

54 51 51 « 55 № 6! 50 5) (0 52 52 И 52 55 И И 5!

52 19 <9

55 55 И 19 19 55 55 5! 5! 55 50 55

И Я 1К

ш

а то ю ш

ПИП«

в о »к

а и а и и

И И 15 л и

71 5) 75 II ГО

59 55 57 57 50

7» 50 71 Я и

51 Ы 5} 62 » 69 55 71 62 Н И 50 Н 51 И

55 61 56 57 57

56 16 55 55 И « 57 (9 52 55

57 59 55 53 57 » I» 55 51 Я 57 5? 59 57 5? И « Й 5 II 19 51 51 15 55 Я 51 Я 51 50 И Я Я I) 51 И 50 55 13 50

52 57 55 52 54 51 17 Я I) И « Ы 51 I? 52

50 57 51 <9 52

51 Я Я 17 5?

52 Я 55 19 57

53 55 51 50 57 52 57 52 (8 В

И! Я 711 (15 Л К!

т и га й га в

т ГС 75 га

в т и я т и

Р в я т « т

К <5 7И <5 т

я я к т ¡з чявяя»

ч И 7Я

¡1 к ч

И И я к ч л »«¡¡8» 55 ТОО гк гн 7Я

69 Я ЮЗ Е* П

71 59 51 |Ы Р а ю 57 и 155

72 <2 77 7Г 5! Й 6} 67 59 65 67 65 76 57 71 16 62 7Т 72 71 55 69 Ю 5» 57 57 5« 51 57 57 61 65 51 55 56 61 6» 50 62 69 57 65

70 6) 50 5« К 67

71 61 71 Г7 (2 75 79 59 П Ю 59 19 59 П 63 65 63 67 70 73 52 70 61 72 79 65 77 92 55 83 76 6! П Т9 Я 91

70 51 15 69 Кч

15 55 Г) 15 16 75 79 К 97 75 92 Й

» 71 79 93 К?

9 2 > 19 20 I 21 22 2 3 21 25 25 29 5 27 ( 5 29 6 33 31 7 32 10 33 II 12 li.ll 15 !| 35 15 II 1!

линии разного происхождения именно по сходству пенетрантно-сти. Линии первого блока происходят от единственной линии бсЭ4, в которой, кроме гумеральных, отсутствующих и во всех других линиях, утрачена еще одна пара щетинок. Так что их специфика обусловлена, видимо, иным характером дефекта в ло-кусе и собственным набором полигенов. Таким образом, эта группа линий явилась внутренним критерием эффективности использованной процедуры классификации.

Основной вывод из представленных данных состоит в том, что, независимо от своего происхождения, изогенные линии с близкой пенетрантностью имеют сходные рисунки распределения мобильных элементов, т.е. проверяемая гипотеза о наличии кор-

реляции "пенетрантность-рисунок мобильных элементов" верна.

Теперь необходимо было выяснить, существуют ли специфические сайты инсерций, обеспечивающие структурированность матрицы __ индексов сходства, и соотнести с ними уровень пенетрант-ности по редукции гуморальных щетинок. №эличиё~ "таких ~ сайтов ~ " ----- -указало бы на положение искомых полигенов. Эта задача решалась методами кластерного анализа.

На первом этапе обработки данных множество из 33 линий с редукцией гуморальных щетинок, упорядоченных по возрастаний пенетрактности, было разбито на 4 группы: 1-я - линии зо59-5-

Тяблицч 1 о

Кластеризация сайтов ^ксгрцпй :«<5и."ькнх элементов «шин«* семыкпц. соответствующих кластерам изогенных линий с различным уровнем пенетрантности по редукции щетинок (самцы).

Линии Пенетран-

тность

-5-15 1. .0«

-5-6 2. 3%

59-5 2. 8%

-5-8 3. 7%

-5-3 4. 0%

-5-14 4. г%

-5-2 7. СО/

- 5- ! 1 . ; 1 О'О 0%

- И - 2 12. ь*

5У-С 15. 2 Ж

-5-9 15. 8%

50-Д 0'? 0%

о 24! 8%

■ 1 25. 5%

133-3 ?Э. В%

-14-5 38. 3%

-14-19 39. 7%

147-7 40. 0%

-14-7 47. 2%

133-1 59. 0%

-14-4 СО. 5%

133-1С 62. ^%

146-2 63. 2%

146-8 70. 8%

59-10 72. 0%

133-11 72. 8%

-14-6 73. 2%

-14-13 73. 5%

133-16 73. 5%

133-18 79. 5%

147-14 95. 0%

-14-16 97. 7%

Блоки сайтов (Каждой линии отвечает столбец)

Пнсертн

& V .;'*"

■!АВ 9Г-

зо;

В10-'. 8104 сои 1а Л г 1,

57Г '¡ОС 7 7 ЕС 850 90ПЕ О В 23С 37 В 47 А 8С 22В 43А

67 А 390

8Е 38А 390 53СЕ

68 С 210

аилг

[;п112

сор1а. 1.'П1412 ¡ли ¡2. соп:о Г. 104

В104. МЛГ1, 0''1-112 со|Ла, 1ж:4;2 сор! а Ы04

.адг!. 0ш412, сор 1а сор!а. В104 В101 0ш412 В104 В104

сор1п. 5104 В101 Б104 В104

МДГ1. В104 0111412. В104 сор1а. В104

15- 60133-3; 2-я - линии бо1 47-14-5 - 147-14-7; 3-я - линии ео133-1 - бо133-18; 4-я - линии во147-14 - во147-14-16. Критерием разбиения служила достоверность различий между максимальным значением редукции в линии предыдущей группы и минимальным значением редукции в линии последующей группы (Р>0.95) (табл.10).

Затем провели группировку 168 информативных сайтов методами кластерного анализа (Бпеа^, Бока!, 1973). В результате было выявлено 24 значимых сайта, которые по совокупности критериев оказались жестко привязанными к одной или нескольким грушам линий (табл.10). Из них 8 соответствуют линиям первого блока, 1 - линиям второго и 2 - линиям четвертого. Сайтов, специфичных для линий третьего блока, не выявлено. Остальные 13 сайтов входят более, чем в один блок. Представленность сайтов в разных блоках не зависит от числа линий в груше. Существенно, что ни один из элементов не перекрывает всех значимых сайтов. Это означает, что для идентификации полигенов информативным является именно обобщенное распределение нескольких элементов.

Таким образом, налицо связь уровня редукции в линиях с наличием определенных сайтов мечения. Именно в районах генома, меченных такими специфическими сайтами, видимо, и локализованы искомые полигены. Можно указать две группы полигенов с противоположным влиянием на признак - из первого и четвертого

Таблица 11. Зависимость пенетрантности в мутантных линиях от наличия инсертов в характеристических сайтах

Сайты 59-5 -5-9 147-14 -14-2

(3.2%) (15.8%) (93.2%) (12.8%)

14АВ + + _ —

77ВС + + - -

291"-ЗОА + - - -

43Р + - - +

44СБ - - - +

57Р + + - +

70С + + - +

85Б + + - +

9В _ _ + +

23С - + +

блоков. Наиболее демонстративно в этом плане сравнение изо-Г9ННЫХ и-го порядка, имеющих значения признака, экстремальные для своих групп, с их родительскими линиями (табл.11). В изогенной линии вс59Р-5-9 утрата двух сайтов из 1-го блока, "ослабителей" редукции и приобретение одного сайта-"усилителя" редукции скоррелировано с увеличением пенетрант-ности до 15.8% против Э.2Ж в родительской линии ео59Р-5. Напротив, в линии зо147Р-14-2 утрата сайта 230 одновременно с приобретением четырех сайтов-"ослабителей" сопровождается' уменьшением процента редукции до 12.8% против 93-2% в родительской линии во147Р-14.

Таким образом, полученные деннне свидетельствуют об эффективности использования мобильных элементов для локализации полигенов. Очевидно, что расширение набора привлекаемых для анализа элементов должно улучшить результаты локализации.

Следует отметить два принципиальных отличия выполненной работы от аналогичных исследований: во-первых, рассматривался обобщенный рисунок распределения нескольких мобильных элементов, что повысило разрешающую - способность эксперимента; и, во-Еторых, для выявления компонентов полигенной системы использовали разложение на составляющие генотипической изменчивости в линиях мутантов по количественному признаку с одновременной минимизацией полиморфизма по сайтам ¡лечения путем изогенизации. Эта процедура традиционно рассматривается как наиболее щадящий способ выявления генетического разнообразия в изогенизируемых линиях, поскольку считается, что при изогенизации геномы не подвергаются крупномасштабным первтасовкам, возникающим как следствие .при отборе, температурных или иных воздействиях. В связи с этим возникает вопрос о том, не вносит ли возмущений в характер распределения мобильных элементов процесс изогенизации, и, если вносит, то каков их характер и параметры. Ответить' на этот вопрос и количественно оценить вклад изогенизации в изменение рисунка мобильных элементов позволяют •результаты повторной изогенизации изогенных линий.

ИЗМЕНЕНИЕ РИСУНКА МОБИЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ КАК ИСТОЧНИК ГЕНОТИПИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ПРИ ИЗОГЕНИЗАЦИИ МУТАНТНЫХ ЛИНИЙ

Различив по локализации мобильных элементов между дочерними изогенными линиями обеспечивается гетерогенностью родительских линий и/или полиморфизмом, возникающим в процессе получения дочерних линий. Однако относительный вклад предсу-ществующего'и возникающего разнообразия в межлинейные различия по рисункам мобильных элементов, выявляемые через изоге-низацию, для изогенных линий разного порядка различен. Очевидно, что в изогенных 1-го порядка прежде всего отражается полиморфизм по распределениям мобильных элементов, присутствующий в гетерогенных исходных линиях. При изогенизации происходит стабилизация внутрилинейных распределений инсертов в производных линиях по отношению к родительским, сопровождаемая сокращением численности инсертов, что легко объяснимо в рамках эффекта основателя.

Повторная изогенизация линий с предварительно унифицированным генетическим фоном также выявляет их гетерогенность по численности и распределению элементов, которая в этом случае могла возникнуть только как результат их спонтанных перемещений при культивировании линий и/или индуцированных перемещений в процессе изогенизации.

Сопоставление результатов анализа изогенных 1-го порядка, прошедших 65 поколений лабораторного разведения, с данными их анализа на момент получения показывает, что имели место как спонтанные инсерции, так и эксцизии элементов (табл.12). Однако частота событий была невелика, а перемещения элементов не коснулись значимых сайтов, так что феноооблик линий фактически не изменился (табл.8).

Качественно иная картина выявляется при сопоставлении изогенных 1-го и и-го порядков друг с другом. В большинстве дочерних линий произошло увеличение численности элементов, сопровождаемое расширением репертуара занимаемых сайтов. Среднее число приобретенных и утраченных сайтов во всех изогенных И-го порядка было примерно одинаково, составляя на линию около 9.6 и з.о соответственно. Подавляющее большинство изменивших состояние сайтов были уникальными, т.е. ранее не

Таблица 12. Частоты спонтанных и происшедших в процессе изо генизации инсерций и эксцизий мобильных элементов мдач, 1)т412, оор1а, В104 В ЛИНИЯХ бо147Р-14 II 5о59Р-5

ЛИНИИ

элемент зо1 47Р-14 ЗС59Р-5 80147Р-14 во59Р-5

Спонтанные инсерции Спонтанные эксцизии

МДГ1 2.6*10~4 4.8x10-4 0 0

(1/3900) (2/4160)

йп412 э.эио-4 0 З.ЗхЮ-4 0

(1/2990) (1/2990)

еор1з 0 2,8*10""'* 0 0

(1/3510)

В104 1.9*10~4 0 0 2.0x10-4

(1/5200) (1/4810)

Индуцир. инсерции Индуцир. эксцизии

МДГ1 8.5*10~2 6.0x10 2 3.5*10~3 1.0x1 о-2

(48/567) (29/486) (2/567) (5/486)

Т5т412 7.2x10""2 5.8*10~2 2.1x10-2 2.1 х1 О-2

(45/621 ) (33/567) (13/621 ) (12/567)

сср!а 4.3*10~2 7.2 х 10~ 2 8.0x10""3 1.6x1 О-2

(27/621 ) (37/513) (5/621) (8/513)

В104 2.2x10-2 2 .0?-10-2 5,4х10"3 5.0x1 0~Э

(25/1107) (20/999) (6/1107) (5/999)

Частоту спонтанного события рассчитывали как отношение числа событий к произведению следующих величин: (число сайтов в исходной линии)*65(число поколений)«(число просмотренных препаратов).

Частоту индуцированного события рассчитывали как отношение числа событий, к произведению: (число сайтов в исходной линии)»3(число поколений)«9(число изогонных и-го порядка), (утраты) в родословной каждой из линий.

встречались (приобретения), либо, напротив", были облигатннми (утраты) в родословной каждой из линий.

Некоторая часть полиморфизма по локализации инсертов, выявляемого в изогенных п-го порядка, обусловлена рекомбинациями с хромосомами балансерной линии (Фурман, Бухарина, 1996), однако основной вклад в его создание принадлежит перемещениям элементов, индуцированным самим процессом, изогенизации. Факт транспозиций элементов при изогенизации отмечался и другими авторами (Пасюкова и др., 19В7; Ка1йапоу et а1., 1991; Квйда-нов и др., 1996), хотя параметры процесса оценены не были.

Оценка и сравнение частот спонтанных и индуцированных пе-ремещещй показывает, что частоты индуцированных перемещений превосходят соответствующие значения спонтанных событий на один-два порядка, причем инсерции происходят достоверно чаще эксцизий (критерий Стыодента-Фишера, Р>о.99) (табл.12). Поскольку учитывались лишь уникальные сайты, рассчитанные частоты являются даже несколько заниженными. Схема эксперимента и отсутствие заметных проявлений синдрома гибридного дисгене-за в потомстве скрещиваний, а также литературные данные об ограниченности воздействия систем дисгенеза на мобилизационную активность элементов их собственными детерминантами (Е£§1ев1;оп е1; а1., 1988; Нагайа et а1., 1990; Ким и др., 1991) позволяют в данном случае отрицать дисгенез как возможную причину повышения транспозиционной активности элементов.

Приведенные данные позволяют сделать, как минимум, два заключения. Во-первых, активацию перемещений элементов могут вызывать не только такие известные сильные воздействия, как тяжелый хит-шок или условия гибридного дисгенеза, но и рутинные межлинейные скрещивания, дающие сопоставимый или даже превосходящий эффект (Фурман, Бухарина, 1996; Ратнер, Васильева, 1996).

И, во-вторых, процесс, видимо, отражает наличие оптимума по насыщенности генома мобильными элементами, что может быть связано с активной ролью, которую они играют в организации и функционировании генома. Численность отдельных элементов и их общая численность ограничиваются не только сверху, но и снизу. При отклонении от оптимума запускаются механизмы, в результате действия которых число элементов возвращается к оптимальному. Природа механизмов, вызывающих активацию перемещений элементов при изогенизации, пока неясна. В этой связи

рассматриваются роль нарушения системн саморегуляции транспозиций и множественной гетерозиготности по хромосомам балан-серной линии (Пасюкова и др., 1987), воздействие через- систему теплового шока (Korimoto, 1993; Ратнер, Васильева, 1996), конформ&ционше изменения хроматина (йайданов и др., 1ууь) и др., однако бесспорного экспериментального доказательства ни одна из гипотез до сих пор не имеет.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рзгзгаруа сСинйШйниых теистических и молеку-

гпрло I онемчесяих исследований района локализации лз-о и полигенной системы в целом, можно представить ее архитектонику и принцип функционирования следующим образом: олигоген системы формирования щетиночного узора aohaete-soute представлен кодирующей единицей в AS-c, транскрипция которой направляется набором цис-располокенных регуляторных (энхансерных) элементов, ответственных за инициацию формирования матгрохет в определенных топографических зонах тела дрозофиле в ответ на ат-иу.фическ'.-й сигнал цредструктуры. Последовательность Слонов, -^явжшых в построенных картах функциональных проявлений му-тыглй soute, на уровне молекулярно-генетической организации J.S-C онеечает последовательности энхансерных элементов, Белки ге-.сч -j.ch.ae со-ьоихе юлэют 7-смологию с известными транскрипци-0iiH-.ï3ï факторами и ясаболее активны в качестве таковых з вида гэгеродйыеров с продуктом гена daughter]ess.

Основные характеристики поведения аллелей soute и построенных карт - "ступенчатость" проявлений и кемпломентационные :-4фзкты в компаундах, зависимость фенотипа от хзшаратуры, полярность карт мокно связать с характером мутации в олигоге-не и активностью его комплексных белковых продуктов.

Щетиночный узор складывается при нормальном функционировании двух основных генов комплекса, achaete и scute. Ведущая роль в этом тандзме принадлежит гену scuts: он контролирует формирование подавляющего большинства щетинок. Оба гена функционально эквивалентны и экспрессируются в большинстве про-нейральшх кластеров совместно, дополняя друг друга. Каждый

из них может участвовать в той или иной степени в формировании сенсорных органов, зависящих от экспрессии другого. Дефект или утрата функции генов ao/so могут быть в той или иной мере скомпенсированы и за счет других генов комплекса (Ruiz-Gomez, Ghysen, 1993). Этим могут частично объясняться феномен неполной пенетрантности, свойственный фенотипическим проявлениям аллелей ао/во, и обнаруженные при анализе компаундов комплементационные эффекты различного характера.

Формирование признака зависит не только от олигогена, но и от набора полигенов, локализованных в геноме дисперсно. Признак числа щетинок является онтогенетически канализованным, что подразумевает подпороговке относительно олигогена эффекты полигенов. В случае мутации олигогена возникает явление неполной пенетрантности по реализации признака. Уровень пенетрантности в мутантвнх линиях, наряду с компенсаторными взаимодействиями генов комплекса achaete-soute, определяется также и комбинаторикой полигенов. Выявлены голигены двух противоположных по характеру действия типов - усиливающие аффект мутации олигогена и нейтрализующие его.

Вопрос о том, какова природа полигенов, являются ли полигоны истинными генами, т.е. существуют ли как самостоятельные генетические единицы с фиксированной локализацией и приписанной функцией или их эффекты являются результатом плейотропно-го действия олигогенов систем детерминации других признаков, все еще является предметом дискуссий. Неясна до конца и связь мобильных элементов с полигенами и изменчивостью по количественным признакам. Некоторые авторы склонны отождествлять полигены с мобильными элементами (Harada et al., 1990). Другие считают их только молекулярными маркерами полигонов, осуществляющими эту функцию благодаря тесному сцеплению или совпадению с полигенными локусами (Нувдин, Пасюкова, 1992). -Третьи полагают, что мобильные элементы "являются модификаторами вклада полигенов в количественные признаки" (Васильева и др., 1995) или изменяют аллельное состояние полигенов, из чего автоматически следует и их маркерный эффект (Clark et al., 1995).

Очевидно, что однозначно разрешить этот вопрос может лишь модельный эксперимент, включающий выделение полигенов, их мо-

лекулярно-генетический анализ и проверку в системе тестирования. Тем не менее, наличие в структуре мобильных элементов самых разных функциональных сайтов подразумевает возможность та активного влияния на экспрессию генов в зонах инсерций, а также участия в создании "и/или" увёлйче'ния аллельного разнообразия, в том числе и полигенов.

Пека усилия исследователей сосредоточены на идентификации полигенов, и наилучшие результаты на этом пути, по-видимому, могут быть достигнуты при поиске и анализе корреляций "мобильные элементы-параметры признака". Независимо от того, тождественны ли мобильные элементы полигенам, являются ли факторами активного прямого воздействия на экспрессию количе-СТ22Ш2Х uuiSiiaKOft или еопутстругя' reus?', ссушотшамшим ТН-ксо воздействие, изучение корреляций будет способствовать выявлению полигенов, а сами мобильные элементы могут сыграть значительную роль в анализе структуры и функции полигенов, подобно той роли, которую они уже сыграли и продолжают играть в исследовании многих известных олигогенов и генома в целом.

ВЫВОДЫ

На основании экспериментального исследования механизмов кснтрс;:л код формированием щетиночного узэрз в полигенной системе achaete-scu.te у Droeophila moianogaster сформулированы представления о структурно-функциональной организации олиго-генз сcutа и система в целом, которые мотивируются следующими кокпрз тными выводами:

1. На основании сравнительного анализа фенотипов 12 мутаций scuta в гомозиготных линиях мутантов и их компаундах при трех температурах построены корта функциональных проявлений, в структуре которых выявлены инвариантные к изменяющимся факторам (температуре, дозе гена, направлению скрещиваний) блоки индексов мутаций и отвечающие им блоки индексов щетинок. Устойчивость числа, состава и порядка блоков дают основание считать их проекцией реальных субструктур локуса и интерпретировать их последовательность как истинную генетическую карту локуса eoute. Результаты и интерпретация хорошо согласуются с более поздними данными молекулярно-генетическо-

го анализа локуса.

2. в системе дисгенетических скрещиваний получена серия из 18 новых мутантов soute, не имеющих аналогов среда "классических" аллелей. Анализ фенотишческих проявлений позволил разбить их на шесть групп. Мутанты пяти групп различаются качественно - наборами редуцированных макрохет, тогда как мутанты шестой группы различаются лишь уровнем пенетрантности по редукции одной и той же пары щетинок. 'Выявленные характеристики проявлений дают основание предполагать не только изменение в структуре олигогена soute, но и модулирующее влияние полигенов, входящих в систему формирования признака.

3. Исследовано распределение мобильных элементов шести семейств в шести линиях мутантов, различающихся пенетрантно стью по редукции гукзральных щетинок. Чзрэз индексы сходства проведена оценка близости линий по рисункам мобильных элементов. Показано, что только обобщенные распределения мобильных элементов позволяют1 указать зависимость между характером распределения элементов и уровнем редукции.

4. С целью верификации найденной зависимости проведена изогенизация исходных линий, в результате которой получен набор из 18 изогенных производных первого порядка. В изогенных линиях спектр изменчивости по редукции щетинок относительно родительских линий существенно расширен.

5. Показано, что изменения в пенетрантности сопровождаются изменением в совокупных распределениях мобильных элементов. Проведена оценка близости линий по индексам сходства и построены деревья сходства линий. Показано, что линии общего происхождения, различающиеся по уровню редукции, различны и по рисункам мобильных элементов. Линии разного происхождения, сходные по уровню редукции, близки и по характеру расположения мобильных элементов.

6. Проведена повторная изогенизация двух изогенных линий первого порядка с контрастным выражением признака через 65 поколений их лабораторного разведения. На основе анализа расширенной выборки изогенных производных доказано существование корреляции "распределение мобильных элементов - уровень пенетрантности" и выявлены сайты локализации мобильных элементов, специфичные для разных уровней пенетрантности. Выявленные

сайты не связаны с происхождением линий, что определенно указывает на эти сайты как на позиции гипотетических полигенов,

ответственных за определенный уровень пенбтрантности.

7._ В результате^ исследования спектра распределений мобильных элементов в изогенннх линиях разного порядка и балан-серной линии показано, что изогенизирующле скрещивания являются источником полиморфизма по сайтам кисерций мобильных элементов. Позиционное разнообразие обеспечивается рекомбинациями с балансерными хромосомами, а также транспозициями в процесс© изогепизацпи, частота которых при этом существенно возрастает.

8. Сформулированные на основаниии обобщения полученных иоаулыа±ий л яаюрахуриии данных прздстагл"1г:" "5 зрхптот'то-нике полигенной системы aohaete-soute у Drosophila melanoga-ster сводятся к следующему: олигоген системы формирования ще-тиночного узора aohaete-soute представлен кодирующей единицей в AS-C, транскр1шция которой направляется набором цис-расположенных регуляторных (энхансерных) элементов, ответственных за инициацию формирования макрохет в определенных топографических зонах тела дрозофилы. Последовательность блоков, ьчлвлекшх в кпртах функшганздышх проявления мутаций о, с Lite, на уровне молекулярно-генетической сргакизвшэд .такуса отвечает последовательности знхансорннх элементов;

"рнэтрантность в линиях мутантов модифицируется нлбором полатенов, локализованных в геноме дисперсно. Выявлены и локализовали полигоны двух противоположных по характеру действия типов - усиливающие эффект нутации олигогена и нейтрализующие его.

Список публикаций по теме диссертации

1. Ратнер В.А., Фурман Д.П., Никоро S.C. Исследование генетической топографии локуса soute у Drosophila melanoga-ster // Генетика. 1969. T.5. С.72-85.

2. Иванов Ю.Н., Фурман Д.П. Анализ' зависимости между • проявлениями признаков на правой и левой сторонах тела для генов с билатеральным фенотипическим действием. Экспериментальные исследования на дрозофиле // Генетика. 1975. T.XI.С.66-76.

3. Фурман Д.П., Родин С.Н. О строении и функционировании локуса soute у Droeophila melanogaster // Труды Ilt-ro съезда ВОГиС им. Н.И.Вавилова. Л.: Наука, 1977. С.431.

4. Фурман Д.П., Ратнер В.А. Исследование генетической топографии локуса soute у Drosophila melanogaster. Сообщение II. Влияние температуры на мутационные проявления гомозигот // Генетика. 1977. Т.13. С.667-680.

5- Фурман Д.П., Родин С.Н., Ратнер В.А. -Исследование генетической топографии локуса soute у Droeophila melanoga-Bter. Сообщение Iii. Влияние температуры на карты функциональных проявлений гомозигот // Генетика. 1977. Т.13. С. 1042-10536. Фурман Д.П., Родин С.Н., Ратнер В.А. Исследование генетической топографии локуса soute у Drosophila melanogaster. Сообщение IV. Влияние температуры на мутационные проявления гетерозигот//Генетика. 1977. Т.13. С.1220-1232.

7. Фурман Д.П., Родин С.Н., Ратнер В.А. Исследование генетической топографии локуса soute у Drosophila melanogaster. Сообщение V. Карты функциональных проявлений ге-терозигот и модель явления // Генетика. 1977. Т.1Э. С. 1387-1397.

8. Фурман Д.П., Родин С.Н. . Ратнер В.А. Влияние температуры на проявления мутаций локуса soute у Drosophila melanogaster // Вопросы теоретической и прикладной генетики / Новосибирск: ИЦиГ СО АН СССР, 1977Г. С.85-86.

9. Нигматуллин P.C., Бакенов С.Р., Фурман Д.П., Родин С.Н. Анализ организации локуса soute у Drosophila melanogaster методами теории классификаций // Вопросы теории мо-лекулярно-генетических систем. Новосибирск: ИЦиГ СО АН СССР. 1977. С.118-145-

ю. Фурман Д.П., Родин С.Н. Анализ структуры и функции локуса Boute у Drosophila melanogaster // Труды XIV-го Международного генетического конгресса. М.: Наука, 1978.

11. Ратнер В.А., Фурман Д.П. Исследование генетической топографии локуса soute у Drosophila melanogaster. Сообщение VI. Возможная роль хромосомных перестроек и эффекта положения // Генетика. 1978. Т.14. С.1662-1664.

12. Фурман Д.П. Анализ мутаций локуса soute у Drosophila me-

______lanogaster^в связи-с проблемами строения генов, их действия в онтогенезе и генетики количественных признаков // Дрозофила в экспериментальной генетике / Новосибирск: Наука, 1978. С.113-141.

13- Гштаап D.P., Rodin 3.N., Ratner V.A. Struotural and. functional analysis of the scute loous in Drosophila melanogaster // Thsor.Appl.Genet. 1979. V.55. P.231-238.

14. Ратнер В.А., Фурман Д.П. Локус soute-у Drosophila mela-nogaster: некоторое геисппзскпэ :: .молекулярные данные и раоочая модель /./ Генетика. 19ВЗ. Т. 19. С. 1261-1264.

15. Фурман Д.П., Ратнер В.А. Анализ функционирования гена soute у Drosophila melanogaster методом температурных сдвигов // IV"Всесоюзный съезд ВОГиС (тезисы докладов). Кишенев: Штиинца, 1983.

16. Фурман Д.П., Ратнер В.А. Структурная организация гена scute у Drosophila melanogaster // Молекулярные механизмы генетических процессов. М. t Наука, 1993. С.51.

17. Фгрман Я.П. О некоторых закономерностях 'мутационного процесса в локусэ soute у Drosophila melanogaster при гибридном ДИСГЭК339 // йолекулярнно механизмы генетических предо ссов. М.: Наука, 1987. 0,102,

18. Гурман Д.П., Забэнов С.А. Влияние повгораой инсершги ? ЦНК на сопряженное фенотишческоо Бкрааенке мутаций ft-ute к singed у Drosophila melanogas fcer // Молекулярные механизмы генетических процессов. М,: Наука, 1987. С.102-103.

]■), У\ххтт D.P., Sabanov 5.л. Influence of Р element insertion on conjugated expression of soute, singed, and forked mutations in D.melanogaster // Dros.Inf.Serv. 1988. V.67. P.38-39.

20. Фурман Д.П., Ножемякина Т.А. О корреляции между пенотра-нтностью и распределением МДГ у мутантов soute Drosophila melanogaster // Молекулярные механизмы генетических процессов. М., Наука, 1990. С.63.

21. Purman D.P., Koahemyakina Т.A. On the correlation between MGE distribution throughout the mutant soute genome in D.melanogaster // Modelling and oomputer methods in molecular biology and genetios. Novosibirsk, 1990.

P. 152-153.

22. Furman D.P., Kozhemyakina T.A. The Walker: a new homeo-tio mutation of D.melanogaster // Droe.Inf .Serv. 1991. V.70. P.269-273.

23. Rodin S.N., Furman D.P., Kozhemyakina T.A. Mobile elements ав an influenoe upon the penetranoe of the soute mutations in D.melanogaster // Dros.Inf .Serv. 1991. Y.70. P.192-194.

24. Фурман Д.П., Родин С.Н., Кожемякина Т.А. О влиянии мобильных элементов на пенетрантность количественного признака у Drosophila melanogaster // Докл. Акад. наук. 1992. Т.324. С.206-209.

25- Фурман Д.П. Характеристика мутаций soute Droeophila me-lanogaeter, индуцированных в системе Р-М гибридного дис-генеза // Сиб. биол. журн. 1993. Т.5. С.3-9.

26. Фурман Д.П., Родин С.Н., Кожемякина Т.А. Распределение мобильных элементов и пенетрантность количественных признаков В линиях мутантов soute Drosophila melanogaster, индуцированных в системе Р-М гибридного диагенеза // Генетика. 1993. Т.29. С.960-977.

27- Furman D.P. Properties of the soute mutations of Drosophila melanogaster induoed in in the P-M - system of hybrid dysgenesis // Dros.Inf .Serv. 1994. V.75. P.72-75.

28. Kozhemyakina T.A., Furman D.P. Copy number and distribution of P and hobo transpoeable elements in Altai population of Droeophila melanogaster // Dros.Inf-Serv. 1994. V.75. P.71-72

29. Kozhemyakina T.A., Furman D.P. Increased transposition rates of oopia-like TEs while deriving isogenio lines of D.melanogaster//DroB.Inf.Serv. 1995. V.76. P.100-103- 7.

30. Фурман Д.П., Бухарина Т.А. Система Р-М гибридного дисге-неза в природной популяции Drosophila melanogaster Алтая // Докл. Акад. наук. 1995. Т.345. С.569-571.

31. Furman D.P., Rodin S.N., Kozhemyakina Т.А. Transpoeable elements and the penetranoe of quantitative oharaoters in Drosophila melanogaster // Theor. Appl. Genet. 1995., V.91. P. 1095-1100.

32. Фурман Д.П., Бухарина Т.А. Р-м гибридный дисгенез в при-

- - родной популяции" дрозофил Алтая // Генетика. 1996а. Т.32. С.1074-1079.

33. Фурман Д.П., Бухарина Т.А. Увеличение частоты перемещений оор1а-подобных мобильных элементов в процессе получения изогбнных линий ВгоБорМ1а те1гг.о§ао4ег // Докл. Акад. наук. 19966. Т.348. С.711-715.

34. Фурман Д.П., Бухарина Т. А. Мобильные элементы генома дрозофилы как маркеры кроссинговера при изсгзапзнруйиии; скрещиваниях с балашзврной линией // Гекзтаса. 139бв. Т.32. С.1291-1294.

Подписано к печати 16/Х-96.

Формат бумаги 60x90 l/i6. Печ.л. 2.0. Уч.-лзд.л. 1.5. Тирак 110 экз. Заказ 74-

Ротапринт .Института цитологии и генетики СО РАН

930090, Новосибирск, проспект академика М.А.Лаврентьева, 1 о.