Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование транскрипции и природного полиморфизма гена Lim3, участвующего в контроле продолжительности жизни Drosophila melanogaster
ВАК РФ 03.02.07, Генетика
Автореферат диссертации по теме "Исследование транскрипции и природного полиморфизма гена Lim3, участвующего в контроле продолжительности жизни Drosophila melanogaster"
На правах рукописи
РЫБИНА ОЛЬГА ЮРЬЕВНА
Исследование транскрипции и природного полиморфизма гена ЦтЗ, участвующего в контроле продолжительности жизни ОгоьорМа те1аподаз&г
03.02.07 - генетика
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
О 3 0E3 2011
МОСКВА-2010
4843614
Работа выполнена в лаборатории геномной изменчивости отдела молекулярной генетики клетки Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН
Научный руководитель: доктор биологических наук
Пасюкова Елена Генриховна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Сулимова Галина Ефимовна УРАН Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН
доктор биологических наук, профессор
Тарантул Вячеслав Залманович
УРАН Институт молекулярной генетики РАН
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт
биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН
Зашита состоится «//» (¡¡¿¡¿МН/^2010 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 002.214.01 при Учреждении Российской академии наук Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991, ГСП-1, г. Москва, ул. Губкина, д. 3. Тел.: (499) 135-62-13 Факс: (495) 132-89-62
электронная почта: шцеп@,vigg.ru. aspirantura@vigg.ru адрес в Интернете: www.vigg.ru.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОГен РАН
Автореферат разослан ШС&ЛЛ 20//г
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук I / / (дХХ Синелыцикова Татьяна Аркадьевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Старение как процесс возрастных изменений организма, ведущий к снижению его функциональной активности и увеличению вероятности смерти, свойственен большинству живых организмов, но темп и форма этого процесса могут резко отличаться у представителей, как различных таксонов, так и внутри одного вида. Такие различия в продолжительности жизни (ПЖ) обусловлены взаимодействием генетических факторов и факторов внешней среды. Температура, питание, загрязнение окружающей среды, являясь внешними факторами, запускают в организме каскады реакций, являющиеся компонентами генетически детерминированных сигнальных и метаболических путей, и в результате могут влиять на изменение ПЖ организма. Таким образом, в генетическом контроле длительности жизни может принимать участие множество генов. Действительно, наследуемость ПЖ не превышает 30%, что характерно для иолигенного количественного признака.
В последнее время достигнут значительный прогресс в понимании того, какие гены определяют ПЖ у организмов различных систематических групп. Тем не менее, выявление новых генов, участвующих в контроле ПЖ, а главное, анализ особенностей их влияния на признак и характера их взаимодействия друг с другом являются актуальными задачами современной науки, решение которых необходимо для понимания причин и условий, обеспечивающих высокую ПЖ. Один из возможных подходов к решению этих задач заключается в изучении влияния структурного природного полиморфизма генов на изменение ПЖ организма.
Природный полиморфизм ранее был описан дня сравнительно небольшого числа генов Drosophila melanogaster (Hasson et al., 1998; Balakirev, Ayala, 2003; Palsson et al., 2004). В ряде случаев была продемонстрирована взаимосвязь описанного природного полиморфизма с количественными признаками, включая ПЖ (De Luca et al, 2003; Carbone et al., 2006). Однако при этом не уделялось должного внимания изучению причинпо-следственных связей между структурной вариабельностью гена и его экспрессией и, далее, изменением какого-либо признака организма. Очевидно, что именно такого рода информация имеет принципиально важное значение для понимания биологической роли генетической изменчивости. Хорошо известно, что ПЖ может существенно различаться у особей одного и того же вида. Понимание генетических причин такой внутривидовой и внутрипопуляционной изменчивости может быть достигнуто в результате исследования ассоциаций между структурной и функциональной вариабельностью генетического материала, приводящей к изменчивости ПЖ.
Ранее в Лаборатории геномной изменчивости Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН с помощью различных методов генетического
картирования было выявлено несколько групп генов, связанных с ранее неизвестными путями контроля ПЖ Drosophila melanogaster. В числе генов-кандидатов был ген ЫтЗ.
Lim3, расположенный в левом плече второй хромосомы, в цитологической позиции 37В13-37С1, кодирует транскрипционный фактор РНК-полимеразы II. Белок Lim3 является мишенью сложных регуляторных сетей и играет ключевую роль в регуляции развития нейронов дрозофилы. Lim3 вместе с белками Islet и Drifter образуют «комбинаторный код», который определяет свойства мотонейронов, контролирует миграцию их аксонов и в итоге играет важную роль в обеспечении правильной мышечной иннервации (Thor et al., 1999; Certel, Thor, 2004; Landgraf, Thor, 2006). Таким образом, роль ЫтЗ в развитии и функционировании нервной системы дрозофилы может являться существенным фактором для определения ПЖ дрозофилы.
Белок, кодируемый геном ЫтЗ, обнаруживает высокий уровень гомологии с белками LHX3/4 человека. Мутации в генах LHX3/4 приводят к нарушениям секреции гормонов гипофиза, что является причиной различных нарушений, связанных с репродуктивной системой, ростом и метаболизмом. Таким образом, ген ЫтЗ является геном-оргологом дрозофилы, перспективным для изучения не только ПЖ, но и механизмов нейроэндокршшой регуляции человека.
Цель и задачи исследования
Целью нашей работы являлось исследование роля молекулярной изменчивости гена ЫтЗ в определении уровня его транскрипции и контроле ПЖ Drosophila melanogaster.
В работе были поставлены следующие задачи:
1. Определить особенности организации 5' регуляторной области и инициации транскрипции транскрипта ЫтЗА гена ЫтЗ.
2. Описать молекулярный полиморфизм 5' регуляторной области и начала структурной области транскрипта ЫтЗА гена ЫтЗ в природной популяции Drosophila melanogaster.
3. Исследовать ассоциацию между молекулярным полиморфизмом 5' регуляторной области и начала структурной области транскрипта ЫтЗА гена ЫтЗ и ПЖ.
4. Исследовать ассоциацию между молекулярным полиморфизмом 5' регуляторной области и начала структурной области транскрипта ЫтЗА гена ЫтЗ и экспрессией ЫтЗА.
Научпая новизна результатов исследования
В работе показано существование новой, ранее неаннотироваппой мРНК гена ЫтЗ, ЫтЗС. Впервые определены особенности организации регуляторной области ЫтЗА, ЫтЗС: обнаружены регуляторные элементы в коровой и проксимальной промоторных областях, свидетельствующие о возможности инициации транскрипции этих мРНК со своего собственного промотора; показано наличие множественных стартов транскрипции с промоторов, не содержащих ТАТА-бокс.
В результате изучения молекулярной вариабельности регуляторной области, экзона и части интрона ЫтЗЛ и ЫтЗС описано распределение полиморфных сайтов по функционально различным районам гена и продемонстрировано действие стабилизирующего отбора на область ДНК, соответствующую первому экзону ЫтЗА и ЫтЗС.
Показано, что вариабельность регуляторной области гена, расположенной на расстоянии 680-380 п.н. от главного старта транскрипции, связана с изменением количества транскрипта на разных этапах развития и в разных частях тела взрослых мух. Этот результат свидетельствует о том, что в природной популяции полиморфизм выявляется в сайтах, существенных для регуляции общего, нстканеспецифического уровня транскрипции. Впервые показано, что природный полиморфизм регуляторной области гена может приводить к шестикратному изменению транскрипции гена.
Выявлен гаплотип, включающий два полиморфных маркера, расположенных в предсказанных на основе биоинформатического анализа сайтах связывания регуляторных белков, достоверно ассоциированный с количеством транскрипта ЦтЗА и ПЖ дрозофилы. Показано, что составляющая гаплотип комбинация маркеров, ассоциированная с промежуточным уровнем транскрипции и высокой ПЖ, встречается в популяции с высокой частотой, в то время как комбинации, ассоциированные с низким или высоким уровнем транскрипции и низкой ПЖ, встречаются в популяции с низкой частотой, что указывает на функциональное и селективное преимущество среднего уровня экспрессии гена ЫтЗ.
Таким образом, впервые показана функциональная связь между природным полиморфизмом гена ЫтЗ, определяющего развитие нервной системы, и ПЖ дрозофилы.
Научно-практическая значимость
Представленные в данной работе результаты расширяют представления о связи структурной изменчивости, в том числе природного полиморфизма регуляторной области гена с его функциональными возможностями: уровнем экспрессии и характером влияния на фенотип организма. Эти результаты должны быть учтены при создании генетических конструкций, используемых в различных биотехнологических проектах, с целью обеспечения требуемого уровня транскрипции используемых генов. Кроме того, полученные результаты могут быть использованы при чтении лекций и проведении практических занятий по общей генетике, генетике популяций, генетике количественных признаков, геронтологии в высших учебных заведениях биологического, медицинского и сельскохозяйственного профиля.
Апробация работы
Результаты, полученные в данной работе, были представлены на следующих научных семинарах и конференциях: на 41-ой конференции по популяционной генетике (Великобритания, 2007) на 40-ой американской ежегодной конференции по генетике дрозофилы (Сан-Диего, США, 2008); на 4-ом съезде российского общества биохимиков и
молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008); 20-ом международном генетическом конгрессе (Берлин, Германия, 2008); на международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009), 5-ом съезде Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров (Москва, 2009), на 35-ом FEBS/YSF симпозиуме «Molecules of life» (Швеция, 2010).
Декларация личного участия автора
Вся экспериментальная часть выполнена автором самостоятельно. Анализ секвенированных образцов был проведен на автоматическом секвенаторе ABI Prism 310 на базе «Центра определения последовательности ДНК» в Учреждении Российской академии наук Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. Анализ данных выполнен совместно с Е.Г. Пасюковой.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в международных реферируемых журналах.
Структура и объём диссертации
Диссертационная работа изложена на 119 страницах машинописного текста и содержит главы: общая характеристика работы, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы, список литературы, приложение. Диссертация содержит 11 рисунков, 3 таблицы, 2 приложения и 206 литературных ссылок.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Принципиальная особенность и новизна нашего подхода к изучению роли гена Lim3 в контроле ПЖ заключалась в попытке связать выявленную в природной популяции структурную вариабельность гена не только с изменчивостью исследуемого признака (ПЖ), но и с особенностями экспрессии гена. В связи с этим для исследования полиморфизма необходимо было выбрать район генома, включающий не столько структурную часть гена, соответствующую его функционально важному транскрипту, сколько его 5' регуляторную область, строение которой определяет характер и уровень транскрипции. В связи с этим необходимо было, прежде всего, выбрать наиболее функционально важный транскрипт гена ЫтЗ и определить, охарактеризовать его 5' регуляторную область.
Особенности организации проксимального промотора и инициации транскрипции ЫтЗА гена ЫтЗ
Ген Lim3 (28875 п.н.), образует две мРНК: ЫтЗА (2577п.н.) и ПтЗВ (2696п.н.) (Gen Bank accession nos. NM_165277 и NM 057258). Lim3A и Lim3B имеют одинаковые последовательности, за исключением первого экзона ЫтЗА и первого и второго экзонов ЫтЗВ (Рис. 1).
г
Именно работы, сделанные на трансгенных конструкциях с ЫтЗЛ, показали участие
гена ЫтЗ в развитие мотонейронов (Thor et al., 1999). В связи с этим, данный транскрипт был выбран для дальнейшего исследования. Механизм образования ЫтЗА и строение его регуляторной области были неизвестны. Таким образом, необходимо было охарактеризовать особенности инициации транскрипции и строения регуляторной области ЫтЗА.
Рис. 1. Структура гена ЫтЗ ОгоэорИИа теЫпоцаьгег.
Экзоны обозначены прямоугольниками; белые прямоугольники соответствуют нетранслируемой области, черные - транслируемой, интроны обозначены черными линиями.
Проведенный с помощью Neural Network Promoter Prediction, NNPP, version 2.2 биоинформатический анализ показал наличие двух типичных для нейрональных генов промоторных элементов с коэффициентом достоверности 0,98 и 1, расположенных от -540 до -491 п.н. и от -248 до -199 п.н. выше заявленного в базе данных старта транскрипции мРНК ЫтЗА (Рис. 2). Мы предположили, что найденные промоторы могут свидетельствовать о наличии старта транскрипции в непосредственной близости от них и, соответственно, могут участвовать в синтезе мРНК, отличных по длине от ЫтЗА. Для проверки этого предположения был использован Northern-блот анализ.
Действительно, Northern-блот анализ с зондом, комплиментарным части первого экзона ЫтЗА и 5' регуляторной области, непосредственно примыкающей к нему, показал наличие двух транскриптов вместо одного (Рис. ЗА). Мажорный транскрипт по размеру (2,6 т.п.н.) соответствовал транскрипту ЫтЗА базы данных. Минорный транскрипт, имевший, вопреки ожиданиям, не больший, а меньший размер (2,4 т.п.н.) был новым, прежде не аннотированным, и был назван ЫтЗС.
Для того, чтобы выявить старт транскрипции ЫтЗА и ЫтЗС, а также подтвердить наличие второй неаннотированной мРНК мы провели 5'RACE анализ (Рис. ЗБ).
Определение последовательности нуклеотидов 47 полученных клонов показало, что ЫтЗА и обнаруженный нами новый транскрипт ЫтЗС имеют множественные старты транскрипции (GenBank accession no. GU814523-GU814569).
Так, для ЫтЗА точка инициации транскрипции варьировала и была обнаружена в положениях -16 (3 клона), -2 (8 клонов) и +14 (4 клона) относительно старта, заявленного в базе данных, с преимущественным началом транскрипции в положении -6(18 клонов) относительно ранее аннотированного (Рис. 2).
ш
{Н+Н+Юитз
Л-Н-Н+С 1ША
IIIIIL итзв
D-»
tatttaaaaaaaaaactgttatcgttcagtgtataatgccattgtaaataaaatctgagaagcctagaagaactgcagaaataac aaagatacacatattccaaccagactgtcaagtcaaattacaaagaagagcc'tttataaactctccaaagtccgaatgccaaatg
T7A G46A.C A73G
cga<gtgtgtgggtttcctcgtttgcatgcgtgtgtgtgtgttggctacgcacattattttggcctttggaaaatg0ccgaaac C89A C151G 0156A G164A
caagaggc@gagagcgccgaccacttggcagctcatagccataagtctcgtctcgtctcgccttaccaacg3act@gcaaactg
actgacggacggtcgaagcgctcgagagtgctttaatgcactgagagaaatgtcggaccgacttgctgacaccacatgttgttca
C292T C316T
gttaggcatttatattttcaattagcatgatccaaggaaaat@tatttaattttattattgatgtc§gatggagacagcgtttt
G334A A346T G358A G364A C375T Т378С A382C T385C C386A
QaaatttgaataQacctatagcttQagttc^ttagaatttaQggQttt^cg^^taaaaatcaaagatctctaagcattacact
A433T
Ubx/Exd/Hth T449G.C C474A 491T AAACTTCTC A
gaaagaaaagagtaatBgtcgttggaatagaa@taattgtgatatttccaatatgac§attcgatactcctgca |aacaattta
Eve
ttttgaattgtagaataatagaattttgaatataaaccataaatccggagcatttgattgaattttr^' !¡-gtr.tgg^n ttttggc G586A Kr G598T Kr G631T T643G
tBcaaagggttagBggttaagggctaagggggttcgttggggttag@ggtcaggggta@gggtaggggtttctgggtggcagg tgcgcagacgttgctctcgatcagccggtcggtcggagtcagtcagtcagctatttaacggctttaaggtcattttcacagtta
Pho Snail Hairv C821A
iAAACAAT! >АС'ЛСЛЛСЛЛТЛЛ< ?CAATGGCAG( '< "AA( '•' "1 'AAA "A • АТАСА- 'ATT?' 'А1 Л A "•< A,' ) A, A 'A 'A- 1AA-Halrv CA845- G854A Kr G871C GRH
gcacgggca^^gatatgac^gggtagaagaagagtcBaccaaactgcagtgcagaacaatgcaaacatatttatgtgtatttt
A926G GRH GAGA
tagtgcacJccagtgtgttttccaaccgaatttgccaacaatgcgaaagcgagagagagaccacgaaagtggaatagaggtggg
G1021A С1046A A1050G
GAF/P»q Spl -540 Ze»l«-llk«proteln -491
ccgagtgccagaaagagaq^CGGGTGCTGGCAAAAAAGCCGAGjTGAl^AGAGCTTTTCAAGAGACCACTCCCCGAAAACTG
caggcgacgtcgacgcacacaaaacaaccaatcccaggcacaaacacacaaaaaagccaaaagaaaacccccctgtaacacaca
C1177T -1180CA C1183T CA/GT repeat binding protein
cacacacabacai TabgTACGCCAGACGCACACGCATGCCAGTGGAAAATGGAATGTGGCAAAGTGTTACAATGCAATTTCCCC
-248 HSF A1320- HS F HB
gctttttgtttttggcgaccaacccaaaotcaattgttgaggccaaagggaaaaaatacaaaagaaap0cagcgaaaaaaaggc cagtctggaaaactggcacagccagagcaacaacaacagcagcacacatttggcacagggtgcagctgaatcggctttccaattg
gaagcgctaagggttgggtttcccattccagctgtgattatgtcagcccctgtatgtgcgcgcgtgtgtgtgcgtgtgcggggct HSF -27 -22 +1 • +28 +33
gcattccagtccacccccttctccaataagcaaccgaatcOtggcccg^MBBGtcagttgctttccaAgcctcgaagttgc
HB T1658C HSF
cgctcggtttttttgcccggtcattcgtgcagctaaaagttctgtgataacggtagacaacaagccaag@:gaaaaatacaaat
BR-CZ4 BR-CZ3 HSF HB -24 -19 -И
aaaaagtaaactaaatccgaaattcgttagcgcaaaaaaaaagtttttccaa/vatcaAgtaaaatgtOga^B^Bc-^acgga
HSF
aaccacaaacaatgtgaaactgtgaaagtgatggttgattgctctgcataggaaaagaatccaatcagagtgcgtcgggatttc
caccgccaacaacagtatggaacttttgaagctaatgatgttcaaaa' r GACTTCCTGTCCAATGGCAAATGTGA
G1991A G2006A
af-cg'tgattaa'vtga 1 ' aatt'"' 'та-a'^t гт-- :tatgtaagtagcaaaaggagttaccacct@atatgttatacctast
G2038A T2044G C2058G
gggtcataggtcgtgccaagcctaagacaa0rtgtgggatttggaaaaga@aacggtcaaggatctacatttatatggatcgaa
t>gtatagtgttgttatggataatgatgattaaaaaaaaacatatcaattagaagagtaatcatcataattctattgatttagcg ttattctctttctgcaaatgtcaaaaaaaagaaggacaaatcatcaaattcgcggtataaatatcggttttaatcacaatatgag ttattttctcaatttaaataatgagtttataacaaatgtcgttttaacagattcttaatttgctt
Рис. 2. Структура 5' регуляторной области Lim3A, Lim3C.
Синими буквами обозначена некодирующая область первого экзона Lim3A, Lim3C\ красными буквами - кодирующая область первого экзона ЫтЗА, ЫтЗС, фиолетовыми буквами обозначена последовательность праймеров для ПЦР анализа и секвенирования; зелеными буквами-праймеры для количественного ПЦР анализа в реальном времени. </> - границы анализируемой последовательности. Промоторные последовательности, предсказанные Neural Network Promoter Prediction, NNPP, version 2.2, показаны светло-серым цветом; числа в скобках обозначают положение нуклеотида промоторного элемента относительно раннее предсказанного старта транскрипции. Последовательности, выделенные зеленым прямоугольником обозначают инициаторы. Старты транскрипции отмечены звездочками и выделены жирным шрифтом. Подчеркнутая последовательность обозначает предсказанные элементы корового промотора. Буквы, выделенные квадратом - полиморфные сайты, встречающиеся в исследуемом ДНК фрагмене с частотой 0.06. Инсерции обозначены черным прямоугольником. Заглавные буквы, выделенные квадратом и жирным шрифтом, обозначают полиморфные сайты, ассоциированные с ПЖ. Заглавные буквы, выделенные розовым квадратом и жирным шрифтом, обозначают полиморфные маркеры, образующие гаплотип, достоверно ассоциированный с ПЖ. Заглавные буквы, выделенные голубым квадратом и жирным шрифтом, обозначают полиморфные сайты, ассоциированные с транскрипцией ЫтЗА и ПЖ. Полиморфные сайты, ассоциированные с транскрипцией ЫтЗА, отмечены буквами, выделенными голубым цветом. Обозначения полиморфных маркеров расположены сверху над ними. Сайты связывания транскрипционных факторов обозначены пунктирной линией.
Для мРНК ЫтЗС также наблюдался разброс значений. Минорные старты транскрипции были обнаружены в положениях +169 (3 клона), +179 (3 клона), относительно ранее заявленного старта, а мажорный старт - в положении +184 (8 клонов) (Рис. 2).
В определении сайта инициации транскрипции ЫтЗА, ЫтЗС учитывались лишь те клоны, старты которых встречались три и более раз, чтобы избежать ошибок, связанных с появлением в анализе усеченных, деградирующих при выделении фрагментов полноразмерных мРНК молекул.
А. 1 2 Б. 1 2
Рис. 3(A). Northern-блот анализ ЫтЗА. Размеры стандартных РНК маркеров (п.н., Promega) показаны стрелками слева, размеры найденных транскриптов (т.п.н.), отмечены справа. (В). 5'RACE анализ ЫтЗА. Дорожка I- стандартный 1т.п.н. ДНК маркер (Fermentas), дорожка 2- продукты 5'RACE анализа, размеры (п.н.) которых отмечены справа.
Таким образом, было обнаружено, что ЫтЗС короче ЫтЗА на 190 п.н. за счет некодирующий области первого экзона ЫтЗС, ЫтЗА и имеет структуру, идентичную ЫтЗА (все семь экзонов присутствовали в обоих транскриптах).
Далее с помощью различных биоинформатических ресурсов был проведен анализ коровой и проксимальной промоторных областей обоих транскриптов, который позволил нам выявить в них различные регуляторные элементы.
Было обнаружено, что инициатор транскрипта ЫтЗА (T-T-A+iG-T-C) соответствовал каноническому консенсусу старта транскрипции дрозофилы (T-C-A+i-G/T-T-T/C) (Kutach, Kadonaga, 2000; Butler, Kadonaga, 2002). Такая же последовательность инициатора с отличием в один или несколько нуклеотидов была обнаружена у 13,2% генов, представленных в базе данных DCPD (Drosophila Core Promoter Database) (Табл. 1). Многие из этих генов, около 33% содержали только DPE (Downstream core promoter element). Их функция соответствовала функции гена Lim3 и заключалась в кодировании транскрипционных факторов РНК-полимеразы II, участвующих в регуляции различных клеточных процессов.
Используя базы данных Eukaryotic Promoter Database, Current Release 100 (EPD) и DCPD, мы обнаружили последовательность DPE в положении +28 - (+33) относительно мажорного
\
старта транскрипции ЫтЗА. Эта последовательность (AGTTGC) полностью соответствовала консенсусу DPE (A/G/T+28-C/G-A/T-C/T-A/C/G-C/T) (Kutach, Kadonaga, 2000; Butler, Kadonaga, 2002) и встречалась в 0.8% из 1926 генов базы данных EPD.
Ген Последовательность инициатора Промоторный элемент
* +1 * *
Lim3A TCGTGGCCCGTI^B GTCAGTTGCTTTCCAAGC
CecAl tcatcagtc ТАТА-бокс и DPE
СесА2 tcaacagtc ТАТА-бокс и DPE
dhod tagtc DPE
dpi ТАТА-бокс
Е74В tcagtc Нет
E74plb DPE
E74B p2 ttagtt DPE
G42 gcaotc DPE
G acagtc DPE
Gapdht gcaotc Нет
glass acaajtagtc DPE
Gld gaagctgagtc ТАТА-бокс и DPE
Gpdh gtagtc Нет
lib (zyg) TCAG(cagtc ТАТА-бокс и DPE
H2AvD gtagtc Нет
hsp27 acagtc ТАТА-бокс
hsp67bhs caaotc ТАТА-бокс и DPE
hsp83 cgagtc ТАТА-бокс
Labial GTAA|cagtc DPE
Ispl alpha acagtc ТАТА-бокс и DPE
Ispl beta acagtc ТАТА-бокс и DPE
Msl26Ab ttacagtc DPE
primase ttagtt ТАТА-бокс
sea ТАТА-бокс и DPE
Scr cgagcagtc DPE
sryAC ТАТА-бокс
yellow ccbitc ТАТА-бокс
Табл. 1. Структура и сходство компонентов 5' регуляторной области ЫтЗА и генов базы данных DCPD. Основной старт транскрипции обозначен (+1), минорные отмечены звездочками и выделены жирным шрифтом.
Регуляторных элементов, соответствующих ТАТА-боксу не было выявлено, но в положении (-27) - (-22) от старта Lim3A была обнаружена последовательность (СААТАА), часто встречающаяся в позиции (-36) - (-21) в регуляторных районах генов дрозофилы. Из 1926 генов базы EPD 0,6% содержали данную последовательность в своих промоторах. Например, СААТАА была обнаружена в регуляторных областях пяти Enchancer of split [E(spl)} генов (.НЬНтЗ, HLHm5, HLHm8, HLHmfi, HLHmy) (Maeder et al., 2007), которые кодируют bHLH транскрипционные репрессоры. Экспрессия этих генов, как и гена ЫтЗ, в основном приходится на эмбриональную стадию, а функция связана с развитием и функционированием нейронов.
В отличие от ЫтЗА транскрипт ЫтЗС имел менее вырожденный инициатор (TTG+iAGC). Для него не было обнаружено никаких известных промоторных элементов. Однако в положении (-24)-(-19) относительно мажорного старта транскрипции ЫтЗС была найдена последовательность (СААААТ), часто встречающаяся в регуляторных областях других генов. Такая последовательность была обнаружена в 0,6% из 1926 генов базы EPD в положении ! (-36)-(-18). i
Кроме найденных двух мажорных и нескольких минорных стартов транскрипции ЫтЗА и Lim3C 5ПАСЕ анализ показал наличие нескольких стартов, каждый из которых встречался не более чем в одном клоне, расположенных на расстояние около 250 п.н. выше мажорного старта ЫтЗА. В образовании этих одиночных транскриптов могли участвовать промоторы, предсказанные базой данных Neural Network Promoter Prediction ми так называемые «скользящие промоторы», которые являются типичными и для ТАТА-содержащих генов, и для генов, не содержащих ТАТА-бокс, и при этом имеющих множественные старты транскрипции (Yasuhara et al., 2005).
Далее, с помощью программ TFSEARCH version 1.3, MOTIF и других биоинформатических ресурсов в исследуемой области генома были найдены потенциальные сайты связывания ряда транскрипционных факторов с процентом гомологии 90.2 - 100.0. К их числу относятся Heat Shock Factor (HSF), который может участвовать в контроле экспрессии не только генов, кодирующих белки теплового шока, но и, например, even skipped, гена, участвующего в развитии эмбрионов дрозофилы (Kuchar et aL, 2007); Hunchback (HB), необходимый для ранней спецификации линий нейробластов (Isshiki et al., 2001), Broad-Complex Z3 и Broad-Complex Z4 (BR-C Z3/Z4), необходимые для метаморфной реорганизации ЦНС (центральная нервная система) дрозофилы (Spokony, Restifo, 2009) (Рис. 2). HB и BR-C Z3/Z4 являются специализированными транскрипционными факторами, участвующими в морфогенезе нервной системы дрозофилы и, возможно, играющими роль в регуляции транскрипции Lim3, который также необходим для развития и функционирования нейронов.
Таким образом, было показано, что структура коровой и проксимальной промоторных областей ЫтЗА, Lim3C типичны для транскрипционных факторов РНК полимеразы II, принимающих участие в развитии и функционировании нервной системы дрозофилы.
Исследование природного молекулярного полиморфизма в Lim3 локусе
Для того чтобы определить, влияет ли природный молекулярный полиморфизм гена Lim3 на его функцию, было проведено частичное определение последовательности нуклеотидов 50 аллелей гена, полученных из природной популяции Raleigh. Для этого было использовано 50 линий дрозофилы, каждая из которых содержала в гомозиготном состоянии вторую хромосому из популяции Raleigh в окружении хромосом изогенной лабораторной линии Samarkand дикого типа (De Luca et al., 2003). Для каждого из 50 аллелей Lim3 была определена последовательность фрагмента ДНК длиной 2094 п.н., включающая 1557 п.н. регуляторпой области ЫтЗА, 300 п.н. 5' некодирующей области (5' НТО), 109 п.н. кодирующей области первого экзона ЫтЗА и 128 п.н. следующего за ним первого интрона (GenBank accession nos 9GU814570, 33GU814571, 40GU814572, 44GU814573, 49GU814574, 58GU814575, 74GU814576, 76GU814577, 77GU814578, 87GU814579, 89GU814580, 98-21GU814581, 98-5GU814582, 100GU814583, 113GU814584, 115GU814585, 122GU814586, 161GU814587, 166GU814588,
180GU814589, 183GU814590, 200GU814591, 201GU814592, 207GU814593, 215GU814594, 226GU814595, 266GU814596, 273GU814597, 284GU814598, 285GU814599, 311GU814600, 316GU814601, 317GU814602, 325GU814603, 327GU814604, 336GU814605, 345GU814606, 351GU814607, 354GU814608, 361GU814609, 369GU814610, 376GU814611, 382GU814612, 407GU814613, 429GU814614, 434GU814615, 444GU814616, 461GU814617, 472GU814618, 473GU814619) (Табл. 2).
Всего было найдено 90 полиморфных маркеров, включающих 74 единичных нуклеотидных замены и 16 инсерций\делеций. Уровень полиморфизма оценивали с помощью следующих показателей: я - наблюдаемая средняя доля нуклеотидных различий между секвенированными аллелями (Nei, Tajima, 1981) и 0 - среднее число сегрегирующих нуклеотидов на сайт (Watterson, 1975), используя программу DnaSP (Rozas, Rozas, 1999).
Район Положение нуклеотида Число инсерций\делеиий + число единичных нуклеотидных замен IT (с.о.) 0(с.о.)
Вся последовательность 1-2094 16t74 0.00709 (0.00046) 0.00864 (0.00098)
Регушпорная область 1 -1557 14+58 0.00795 (0.00046) 0.00875 (0.00112)
1-779 8+39 0.01168(0.00069) 0.01118(0.00179)
780-1557 6+19 0.00421 (0.00043) 0.00631 (0.00135)
Этоон 1558-1966 1+7 0.00152(0.00059) 0.00600(0.00181)
5'НТО 1558-1857 1+5 0.00181 (0.00078) 0.00670 (0.00223)
Кодирующая область 1858-1966 0+2 0.00073 (0.00070) 0.00410 (0.00290)
Интрш 1967 - 2094 1+9 0.01443 (0.00131) 0.01570(0.00523)
Табл. 2. Молекулярная изменчивость регуляторной области и части структурной области
1лтЗА. В скобках приведены значения стандартного отклонения.
Уровень изменчивости исследуемого района генома (я = 0.00709±0.00046 и в = 0.00864±0.00098) находился в пределах, характерных для соответствующих областей генома Drosophila melanogaster (Moriyama, Powell, 1996) (Табл. 2).
Наиболее вариабельным оказался интрон (л = 0.01443±0.00131 и 9 = 0.01570±0.00523). Тем не менее, если 5' регуляторную область разделить произвольно на две равные части, то дистальный район регуляторной области имел приблизительно тот же уровень вариабельности, что и интрон (я = 0.01168±0.00069 и 9 = 0.01118±0.00179) (Табл. 2).
Менее вариабельным были проксимальный район регуляторной области (я = 0.00421±0.00043 и 9 = 0.00631±0.00135) и 5' НТО первого, экзона (я = 0.00181±0.00078 и 0 = 0.00670±0.00223). Самой консервативной оказалась кодирующая область первого экзона (я = 0.00073±0.00070 и 6 = 0.00410±0.00290), где было пайдено только две несинонимичных замены, каждая с минимальной частотой 0.02 (Табл. 2).
При исследовании вариабельности данной области генома достоверно сцепленными между собой оказались немногие полиморфные маркеры, в основном расположенные на
небольшом расстоянии друг от друга (Рис. 4). Такой характер сцепления указывает на существование нормального уровня рекомбинации в исследуемом районе генома. Этот результат благоприятен для выявления причинно-следственных связей между молекулярным полиморфизмом и его фенотипическим проявлением.
Едииичиые иукпмнид- НЫ« ММ^Кв! 4 0 п к 4 < ш § ь м от « 1> 1 2 1 9 § Б г- 3 о о г-р 8 сс о <х> р í 09 и 1Г) т 3 4 Ч Г- 3 4 ш 8 ь 03 8 0 4 т* ГЧ 8 < I ю О р 5 <9 г- о 8 о в
Т7А ■
А7К5 Я ш
С89А '1'
С392Т
0334А &
0358А ш
0344А ш Н
С375Т : и
Т378С
А382С 0х ■V-
ТМИС
США " < щ
А433Т
С474А ш
й686А МИ»
0598Т
С821А
0854 А II
Т2014С
0»38А ■ш
Т20440 Я
С20580
Рис. 4. Неравновесие по сцеплению между полиморфными сайтами в ЫтЗ локусе. Неравновесие по сцеплению представлено как матрица попарных сравнений, в которой расположение каждого полиморфного маркера представлено графически сверху вниз и слева направо. Полиморфные маркеры обозначены таким образом, что первым указан наиболее часто встречаемый нуклеотид, за ним следуют номер позиции в последовательности, где происходит замена, и далее наиболее редко встречаемый вариант нуклеотида. В таблицу включены только маркеры, имеющие, достоверное сцепление согласно двум подсчитанным с помощью программы ОпаЭР критериям, Фишера и с учетом коррекции Бонферрони (обозначено серым цветом).
Роль отбора в поддержании молекулярной вариабельности исследуемого района была оценена различными методами при помощи программы РпаЗР. Было показано, что первый экзон ИтЗА характеризуется достоверно отрицательными значениями Б (Та^та, 1989), Р* и Р*(Ри, Ц 1993) и О* и ¥*, вычисленных с использованием внешней группы (Табл.3). Достоверные значения О, Э* и Р* были в большинстве случаев получены как для 5'НТО, так и для кодирующей области первого экзона ЫтЗА, проанализированных отдельно (Табл. 3). В связи с тем, что в кодирующей области было обнаружено только две несинонимичных замены, других тестов на селективную нейтральность, основанных на анализе соотношения
синонимичных и несинонимичных замен (McDonald, Kreitman, 1991; Stoletzki, Eyre-Walker, 2010), ne применяли.
Район D D* F* D*, simulans F«, simulans D», yakuba F*, yakuba
Вся последовательность -0.63216 -1.75232 -1.59703 -1.99481 -1.89078
Регуляторная область -0.31834 -1.03457 -0.92083 -1.35484 -1.28096
Дисгальный район 0.15386 -0.88538 -0.60895 -1.11283 -0.91096
Проксимальный район -1.07509 -1.02695 -1.23886 -1.29958 -1.51835 -1.55057 -1.67083
Экзон -2.10512 -3.73109 -3.79399 -3.40290 -3.56259 -2.78912 -3.07972
5'НТО -2.04396 -3.26405 -3.37501) -2.78749 -3.02202 -2.08900 -2.46833
Кодирующая область -1.46443 -2.53305 -2.57464 -2.58770 -2.63091 -2.58770 -2.63091
Интрон -0.22559 -1.28572 -1.10719 -0.44091 -0.35893 -1.99059 -1.81791
Табл. 3. Результаты тестов на селективную нейтральность для регуляторной области и части структурной области LimiA. В качестве внешней группы использовали D. simulons и D. yakuba (соответствующие последовательности взяты из GenBank, accession nos. ХМ_002079849 и NT_167063) Достовдшые значения D, D*, F*, выделенны жирным шрифтом (Р0.05), выделенны жирным шрифтом и подчеркнутые (Р0.02).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что первый экзон ЫтЗА, характеризующийся низким уровнем вариабельности, подвергается действию стабилизирующего отбора. Поскольку уровень рекомбинации в исследуемом районе достаточно высок, можно предположить, что отбор действует именно на полиморфные сайты, расположенные в экзоне, а не какие-либо другие, сцепленные с ними.
Исследование ассоциации между природным молекулярным полиморфизмом в Lim3 локусе и продолжительностью жизни
Для того чтобы оценить биологическую роль молекулярной вариабельности, наблюдаемой в природной популяции Raleigh, мы проанализировали связь между обнаруженным нами полиморфизмом в ЫтЗ локусе и изменчивостью ПЖ дрозофилы.
В данном анализе мы ограничились рассмотрением лишь тех полиморфных сайтов, для которых частота редкого варианта в исследованной нами выборке хромосом равнялась 0.06 и более (одинаковые замены нуклеотидов обнаружены в трех и более линиях). С одной стороны, такое ограничение давало уверенность в том, что мы не имеем дело со случайными ошибками, возникшими в результате реакций амплификации, использованных для получения фрагментов ДНК исследуемого гена, и их секвенирования. С другой стороны, это ограничение позволяло составить впечатление о том полиморфизме, который действительно распространен и сегрегирует в природной популяции.
Из 90 найденных нами полиморфных локусов принятому критерию соответствовало 44 (Рис. 2). Двухфакгорный дисперсионный анализ позволил выявить достоверную ассоциацию между ГОК и шестью маркерами, при этом не было выявлено достоверной ассоциации между ПЖ и полом особей, а также между ПЖ и взаимодействием двух главных факторов,
МАРКЕР*ПОЛ. На основании этого данные для самцов и самок были объединены, и для анализа ассоциации между полиморфными маркерами и ПЖ использован непараметрический анализ. В результате такого анализа достоверная ассоциация с ПЖ была выявлена дня тех же шести полиморфных маркеров, четыре из них находились в регуляторной области (А433Т; G871C; A1050G; С1177Т), одни в 5'НТО (TI658C), один в первом шпгроне (G1991A) (Рис. 2, табл. 4). Ни один из найденных полиморфных маркеров не был достоверно сцеплен с другими в популяции Raleigh.
В то же время, все особи внутри каждой из 50 исследованных линий имеют идентичную вторую хромосому и, соответственно, одинаковый набор маркеров, абсолютно сцепленных между собой и образующих определенные гаплотипы. Транскрипция гена и, как следствие, ПЖ могут зависеть от того, какая комбинация маркеров присутствует в регуляторной области транскрипта. Чтобы проверить это предположение и определить, существует ли достоверная ассоциация между ПЖ и различными гаплотипами, образованными достоверно ассоциированными с ПЖ полиморфными маркерами, расположенными в регуляторной области, был также использован непараметрический анализ. Гаплотипы, состоящие из четырех маркеров (А433Т + G871C + A1050G + С1177Т), из трех маркеров, расположенных в непосредственной близости от структурной части гена (G871C + A1050G + С1177Т), и из двух полиморфных маркеров с наиболее значимой ассоциацией с ПЖ (G871C + С1177Т) были достоверно ассоциированы с ПЖ (Табл. 4).
В целом в ходе анализа один и тот же пул данных был использован для проведения 47 тестов на ассоциацию с ПЖ. Суммируя полученные результаты, можно заключить, что после использования поправки Бонферрони, позволяющей скорректировать результаты с учетом множественности тестов, достоверная ассоциация была выявлена между ПЖ и гаплотипом (G871C + CI 177Т) (Р=0,0010), а после использования менее консервативной поправки FDR (false discovery rate) - между ПЖ и двумя другими исследованными гаплотипами (А433Т + G871C + A1050G + С1177Т) (Р=0,0042) и (G871C + A1050G + С1177Т) (Р=0,0021), и маркером G1991A (Р=0,0028) (Табл. 4). Маркеры G871C и С1177Т входят во все гаплотипы, причем ассоциация с ПЖ наиболее значима для гаплотипа, в котором присутствуют только эти два маркера. Можно предположить, что в рамках данного исследования именно комбинация двух маркеров, G871C и CI 177Т, в геноме особей из природной популяции Raleigh наиболее важна для ПЖ.
Один из аллелей каждого полиморфного маркера, образующего наиболее значимо ассоциированный с ПЖ гаплотип, имеет низкую частоту в популяции (рС = 0.08 для C871G; рТ = 0.06 для CI 177Т). Из четырех возможных комбинаций аллелей только три (GC, СС, GT) были обнаружены в популяции.
Наблюдаемые частоты комбинаций аллелей хорошо согласуются с частотами, ожидаемыми на основе частот единичных аллелей в популяции (у1 = 0.0055), что подтверждает
отсутствие сцепления между маркерами в популяции.
Единичные Число линий с Среднее значение признака для сегрегирующих аллелей, гаплотипов/(с.о.)
нуклеотидные замены, инсерции/делеции, сегрегирующими аллелями, Признак Значение Р4
гаплотипы гаплотипами
А433Т 38/12'; 14/2' ПЖ 0.0357
РНК, эмбрионы АДО0/О.1384 0.7(0.06)/2.0(0,37)
РНК, головы 0.0682/0.1543
РНК, семенники 0.0325/0.3327
G586A, G598T 36/14'; 12/4' ПЖ 0.0992
РНК, эмбрионы 0. 0131/0.0896 0.7(0.06)/1.4(0.29)
РНК, головы 0.1773/0.2230
РНК, семенники 0.0198Ю.0Ш
G871C 46/4'; 13/3' ПЖ 0.0151
РНК, эмбрионы 0.0002/0.0059 0.6(0.061/1.8(0.27)
РНК, головы 0.010510.0180 0.4(0.05)/0.7(0.12)
РНК, семенники 0.0138/0.1924
A926G 47/3'; 14/2' ПЖ 0.0891
РНК, эмбрионы 0.0021/0.Ш2 0.7(0.061/2.0(0.37)
РНК, головы 0.0052/0.0025 0.4(0.05)/0.8(0.07)
РНК, семенники 0.02ЮЮАШ
G1021A, 40/10'; 10/6', ПЖ 0.7528, 0.6801
CI046A 42/8'; 10/6' РНК, эмбрионы 0.0018/0.0195 1.1(0.20)/0.5(0.09)
РНК, головы 0.0356/0.0091
РНК, семенники 0.009110.0014
A1050G 26/24'; 11/5' ПЖ 0.0226
РНК, эмбрионы 0.5153/0.8548
РНК, головы 0.9029/0.2550
РНК, семенники 0.9190/0.1039
С1177Т 47/3'; 14/2' ПЖ 0.0084
РНК, эмбрионы 0.003310.0037 0.9(0.11)/0.3(0.04)
РНК, головы 0.0021/0.0021 0.5<0.05)/0.1(0.02)
РНК, семенники 0.0121/0.0044
G1991A 46/4'; 13/3' Г1Ж 0.0028 37(1)/29<2)
РНК, эмбрионы 0.2992/0.2005
РНК, готовы 0.2183/0.2274
РНК, семенники 0.4115/0.2333
Т1.658С 45/5'; 13/3' ПЖ 0.0195
РНК, эмбрионы 0.1842/0.2881
РНК, головы 0.1111/0.1475
РНК, семенники 0.1407/0.0535
871 + 1177, 4/43/3'; 3/11/2' ПЖ 0.0010 31(2)/38(1)/29(2)
CC/GC/GT РНК, эмбрионы 0.0001/0.0014 1.8(0.27)/0.7(0.06)/0.3(0. 04)
РНК, головы 0.0011ЮМ16 0.7(0.12)/0.4(0.04)/0.1(0. 02)
РНК, семенники 0.0053Ю.0125
Табл. 4. Генотип-фенотип ассоциация в Lim3 локусе.
1 Выборка из 50 линий.
2 Выборка из 16 линий.
3 Этот маркер не сегрегирует в выборке из 16 линий.
1 Значения Р приведены для непараметрического анализа средних значений ПЖ и непарамегрического анализа количества транскрипта, охарактеризованного в Hr/C(t). Достоверные значения показаны курсивом; значение Р, оставшиеся достоверными после поправки FDR, обозначены курсивом и жирным шрифтом; значения Р, оставшиеся достоверными после поправки Бонферрони, показаны курсивом, жирным шрифтом и подчеркнуты. Маркеры и гаплотипы, достоверно ассоциированные с ПЖ, выделены жирным курсивом. В скобках приведены значения стандартной ошибки.
Множественное сравнение средних позволило разделить линии с различными вариантами гаплотипа, состоящего из маркеров G871C и С1177Т (GC, СС, GT), на две группы, достоверно различающиеся по ПЖ (Р<0.05). Первая группа, содержащая линии с наиболее часто встречающимся GC (86%) вариантом гаплотипа, имела среднюю ПЖ 38 (±1) день. Вторая группа включала линии с редкими СС (8%) и GT (6%) вариантами гаплотипа, характеризующимися средней ПЖ 31 (±2) день и 29(±2) дня.
Таким образом, комбинация двух маркеров (G871C и С1177Т), расположепных в 5' регуляторной области ЫтЗА, наиболее важна для ПЖ; комбинация маркеров, ассоциированная с высокой ПЖ, широко представлена в популяции Raleigh, в то время как комбинация маркеров, ассоциированная с низкой ПЖ, является редкой.
Исследование ассоциации между молекулярным полиморфизмом о Lim3 локусс и его экспрессией
Изменения в регуляторной области могут приводить к изменению уровня экспрессии гена, что, в свою очередь, может привести к изменению фенотипа особей, например, ПЖ мух. Для того, чтобы проверить это предположение, мы оценили связь между обнаруженным нами полиморфизмом в локусе Lim3 и изменениями количества мРНК ЫтЗА.
Транскрипты ЫтЗА, ЫтЗС различаются только 5' НТО, которая в Lim3C на 190 п.н. короче, поэтому измерить можно или количество одного Lim3A или количество обоих транскриптов вместе. Было показано, что мажорный транскрипт Lim3A (Рис.ЗА) необходим для развития нейронов (Thor et al., 1999), поэтому именно Lim3A был использован для измерения экспрессии гена Lim3 методом ПЦР в реальном времени в 16 линиях мух с различными вариантами найденного гаплотипа (G871C + С1177Т). Так как основная экспрессия гена Lim3 приходится на эмбриональную стадию, а в имаго она сосредоточена в основном в мозге и семенниках [FlyAtlas accession по. Fßgn0002023], то для измерения транскрипции мы использовали эмбрионы, головы и семенники (Табл. 4).
В выборке из 16 линий корреляция между повторными независимыми измерениями количества ЫтЗА как в эмбрионах, так и в головах была высоко достоверна (Р <0.0001, Р=0.0074, соответственно), что подтверждало надежность результатов. Корреляции между независимыми измерениями в семенниках была недостоверна (Р=0.1082), возможно из-за низкого уровня транскрипции ЫтЗА в этой ткани. Корреляция наблюдалась также между количеством мРНК ЫтЗА в эмбрионах и головах (Р=0.0064), в эмбрионах и семенниках (Р=0.0579), в головах и семенниках (Р=0.0204).
Из 44 полиморфных сайтов 30 сегрегировали в выборке из 16 линий мух, 8 из них были сцеплены с другими маркерами. В результате проведенных 24 тестов с 22 маркерами и двумя гаплотипами (непараметрический анализ) была выявлена достоверная ассоциация между количеством мРНК ЫтЗА в эмбрионах и 14 полиморфными сайтами. Для четырех из них
(G871C, A926G, G1021A, С1046А) достоверность ассоциации сохранилась после применения поправки Бонферрони, а для четырех других маркеров (А433Т, G586A, G598T, CI 177Т) - после применения поправки FDR (Табл. 4). Полиморфные сайты G1021A и С1046А, G586A и G598T были полностью сцеплены в выборке из 16 линий мух. Другой вариант непараметрического анализа (Yuan et al., 2006), основанный на использовании получаемых при измерении значений C(t), которые пропорциональны логарифму количества субстрата, был применен для проверки полученных результатов. Достоверная (после применения поправки FDR) ассоциация была подтверждена для маркеров G871C и С1177Т (Табл. 4). С помощью программы REST (Pfaffl et al., 2002), позволяющей при сравнении количества транскрипта в разных образцах учитывать различную эффективность реакции ПЦР в реальном времени для кДНК анализируемого и референсных генов, достоверная ассоциация с количеством мРНК ЫтЗА была подтверждена для маркеров G871C и CI 177Т (Р=0.0001 для обоих).
Маркеры G871C и С1177Т, образующие гаплотип, достоверно связанный с ПЖ мух, оказались также достоверно ассоциированными с количеством мРНК ЫтЗА в эмбрионах в результате анализа всеми перечисленными выше методами (Табл. 4), включая попарное сравнение, используя программу REST (Р=0.0001 для каждого сравнения). Множественное сравнение средних позволило разделить линии с различными вариантами гаплотипа (G871C + CI 177Т), на три группы, достоверно (Р<0.05) различающиеся по количеству транскрипта ЫтЗА в эмбрионах (СС: 1.8 ± 0.27; GC: 0.7 ± 0.06; GT: 0.3 ± 0.04). Различия между группами с максимальным и минимальным уровнем транскрипции достигают шести раз (Рис.5).
Стандартный непараметрический анализ позволил выявить достоверные ассоциации с количеством транскрипта ЫтЗА в головах взрослых мух для 5 полиморфных маркеров. Ассоциация с одним из них (С1177Т) осталась достоверной после применения поправки Бонферрони, а для двух других (G871C, A926G) - после применения поправки FDR (Табл. 4). Непараметрический анализ, основанный непосредственно на величинах C(t), выявил ассоциации, достоверные с учетом применения поправки FDR, для маркеров A926G и С1177Т (Табл. 4). Однако анализ с помощью программы REST не подтвердил эти результаты. Достоверная ассоциация между гаплотипом (G871C + С1177Т) и количеством мРНК ЫтЗА в головах была выявлена обоими методами непараметрического анализа (Р=0,0011; Р=0,0016; (Табл. 4). Программа REST обнаружила достоверное различие в количестве транскрипта ЫтЗА только между вариантами гаплотипа GT и СС (Р=0.023). Множественное сравнение средних позволило разделить линии с различными вариантами гаплотипа (G871C + С1177Т) на три группы, достоверно (Р<0.05) различающиеся по уровню экспрессии ЫтЗА в головах взрослых мух (СС: 0.7 ± 0.12; GC: 0.4 ± 0.04; GT: 0.1 ± 0.02). Группы с максимальным уровнем транскрипции отличались от групп с минимальным уровнем транскрипции в шесть раз (Рис.5).
Стандартный непараметрический анализ позволил выявить достоверные ассоциации между количеством транскрипта ЫтЗА в семенниках и 16 полиморфными маркерами. Однако ни одна ассоциация не осталась достоверной после применения поправок Бонферрони или FDR (Табл. 4). Достоверная ассоциация между гаплотипом (G871C + CI 177Т) и количеством ЫтЗА мРНК в семенниках была выявлена обоими методами непараметрического анализа, однако ни одна из них не была подтверждена после использования поправок на множественное тестирование (Табл. 4).
А. эмбрионы Б. головы В. Сененнит
2.5 0.9 -
S 0.035 -
t
Галлотип CC GC GT
ПЖ 31(2) 38(1) 29(2)
Число 4 43 3 хромосом
Галлотип CC GC
ПЖ 31(2) 38(1)
Число 4 43 хромосом
GT Галлотип CC GC GT
29(2) ПЖ 31(2) 38(1) 29(2)
3 Число 4 43 3 хромосом
Рис. 5. Уровень мРНК ЫтЗА в линиях с различными вариантами гаплотипа. (А).
Транскрипция ЫтЗА в эмбрионах. (В). Транскрипция ЫтЗА в головах взрослых мух. (С). Транскрипция ЫтЗА в семенниках. Для каждого варианта гаплотипа, состоящего из маркеров G871C, С1177Т, обозначена средняя ПЖ в днях со стандартной ошибкой, указанной в скобках. Число хромосом с соответствующей комбинацией маркеров в популяции Raleigh обозначено внизу диаграммы.
Множественное сравнение средних показало, что транскрипция ЫтЗА в семенниках достоверно различается (Р<0.05) между линиями с СС (0.04±0.004) и GT (0.01± 0.003) вариантами гаплотипа (Рис. 5).
Многие полиморфные сайты оказались достоверно ассоциированными с транскрипцией ЫтЗА в различных тканях. Разные методы анализа и поправки давали немного различные, но все же не противоречащие друг другу результаты (Табл. 4). Среди полиморфных маркеров самыми примечательными были G871C и С1177Т, образующие гаплотип, достоверно ассоциированный с ПЖ (Р=0.0010), с транскрипцией ЫтЗА в эмбрионах (Р=0.0001), головах взрослых мух (Р=0.0011) и семенниках (Р=0.0053). Каждый из этих двух маркеров был достоверно ассоциирован с транскрипцией в эмбрионах (G871C: Р=0.0002; С1177Т: Р=0.0033), головах (Р=0.0105, Р=0.0021), семенниках (Р=0.0138, Р=0.0121), а также с ПЖ (Р=0.0151, Р=0.0084). Полиморфные сайты A926G и G1021A+C1046A (сцеплены в выборке из 16 линий), расположенные между G871C и С1177Т, были достоверно ассоциированы с транскрипцией
Lim3A в эмбрионах (A926G: Р=0.0021; G1021A+C1046A: Р=0.0018), головах (Р=0.0052, Р=0.0356) и семенниках (Р=0.0209, Р=0.0091), как и гаплотип (G871C + A926G + (G1021A + С1046А) + С1177Т), состоящий из всех этих 5 маркеров: (Р=0.0005, Р=0.0058, Р=0.0053, для эмбрионов, голов и семенников (Табл. 4).
Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что область ДНК, расположенная на расстоянии от 380 до 686 п.н. выше мажорного старта транскрипции Lim3A играет важную роль в регуляции экспрессии Lim3A, поскольку именно в ней расположено большинство маркеров, достоверно связанных с уровнем транскрипции, два из которых ассоциированы с изменением ПЖ мух.
Все пять полиморфных сайтов, описанные выше, находятся в предполагаемых сайтах связывания различных транскрипционных факторов: G871C и A926G в сайте связывания Grainy Head (Grh), G1021A в сайте связывания specificity protein-1 (Spl)/Krüppel-like factor (KLF), C1046A в Zeste-подобном мотиве, CI 177T в (CA/TG)9-n0BT0pc (Рис. 2).
G871C и С1177Т оказались наиболее значимыми полиморфными маркерами для экспрессии ЫтЗА и ПЖ дрозофилы. В линиях, в которых С, наиболее часто встречающийся аллель в Raleigh популяции, присутствовал в положении 1177, транскрипция ЫтЗА бьиа средней, а ПЖ дрозофилы высокой. В линиях, в которых С был заменен на Т, более редкий аллель, транскрипция и ПЖ становились низкими (Табл. 5). Из этого следует, что в норме этот полиморфный сайт обусловливает активацию транскрипции ЫтЗА и, таким образом, должен находится в мотиве связывания белка-активатора. С1177Т оказался в предполагаемом сайте связывания белка, взаимодействующего с (СА/ТС)9-повтором, являющимся цис-регуляторным элементом (Sharma et al., 2007). Однако, ничего неизвестно про белок, связывающийся с повтором (СА)„, кроме его молекулярной массы (65-72 кДа) (Papatsenko et al., 2002; Vashakidze et al., 1988).
Транскрипция Lim3A и ПЖ дрозофилы зависит от маркера G871C, при условии, что в положении 1177 находится С (Табл. 5). В линиях, в которых G, наиболее часто встречающийся в популяции Raleigh аллель, присутствовал в положении 871, экспрессия ЫтЗА была средняя, а ПЖ высокая. В линиях, в которых G был заменен на С, более редкий аллель, экспрессия становилась выше, а ПЖ ниже (Табл. 5). Из этого следует, что в норме этот полиморфный сайт обусловливает репрессию транскрипции ЫтЗА и, таким образом, должен находиться в мотиве связывания белка-репрессора. Grh, в предполагаемый мотив связывания которого попадает маркер G871C, принимает участие во многих регуляторных сетях, в том числе в комплексной регуляции спецификации нейробластов и апоптоза нейронов (Brody, Odenwald, 2000; Cenci, Gould 2005). Показано, что Grh, являясь репрессором, может взаимодействовать с Polycomb-group (PcG) белками (Dring, Pho) (Tuckfield et al., 2002, Blastya'k et al., 2006) и сайты связывания Grh часто находятся в составе Popycomb response elements (PREs) вместе с сайтами
связывания других белков: SP1/KLF, GAGA (GAF), Pho (Muller, Kassis 2006). Предполагаемые сайты связывния этих белков также были обнаружены в регуляторной области Lim3A (Рис. 2).
Еще один полиморфный маркер, A926G, находится в предполагаемом сайте связывания Grh. Однако наши данные показывают, что маркер A926G менее значим для транскрипции . Lim3A, чем маркер G871C. Можно предположить, что оба сайта функционируют синергично, при этом G871C является ведущим в этом взаимодействии (Табл. 5).
Полиморфный сайт С.Ю1С А926С. GI02JA С1046А C1177T
Предположительные сайты связывания транскрипционных факторов Grainy head Grainy head Spl Zcste-подобный белок Белок, свяэы-заюший ZMTG-повтор
Эффект связывания транскрипционных факторов СилР СлР СлР СлА СилА Количество транскрипта Средняя ПЖ в группах линий мух с различными
Консснсусный нуклеотид рсференсного генома дрозофилы G А G С С мух (нг) (с.о.) гаплотмпа (дни) (с.о.)
головы эмбрионы
284 с А G С С 0.910 (0.078) 2.578 (0.241)
207 с G G С с 0.774 (0.195) 1.369 (0.116) 31(2)
285 с G G С с 0.514 (0.077) 1.361 (0.119)
100 G А А А с 0.432 (0.061) 0.876 (0.097)
40 О А G С с 0.402 (0.059) 0.847 (0.028)
115 а А G С с 0.490 (0.034) 0.729 (0,085)
336 с А G С с 0.420 (0.144) 0.481 (0.130)
200 G А А А с 0.349 (0.009) 0.457 (0.138)
461 G А G С с 0.394 (0.022) 0.452 (0.043) 38(1)
180 G А А А с 0.193 (0.022) 0.439 (0.134)
74 G А G С с 0.301 (0.067) 1.045 (0.043)
472 G А G С с 1.068 (0.364) 0.232 (0.027)
201 G А А А с 0.757 (0.085) 0.676 (0.033)
325 G А G С с 0.712 (0.057) 0.615 (0.148)
76 G А А А т 0.127 (0.005) 0.358 (0.039) 29(2)
226 G А А А т 0.161 (0.049) 0.236 (0.049)
Табл. 5. Анализ ассоциации полиморфизма регуляторной области ЫтЗА и его экспрессии.
Колонки с маркерами, образующими гаплотип, выделены серым цветом. СлР-елабый репресеор, СилР-сильный репреесор, СлА-елабый активатор, СилА-сильный активатор. В скобках приведены значения стандартной ошибки.
В используемой нами выборке из 16 линий маркер С1046А полностью сцеплен с ОЮ21А. С1046А вместе с А10500 попадает в 2е51е-подобный мотив (Рис. 2). Наши данные
показывают, что полиморфизм маркера A1050G не связан с транскрипцией Lim3A. Таким образом, мы предполагаем, что этот Zeste-подобный мотив не функционален, по крайней мере, в эмбрионах, головах и семенниках. В этом случае ассоциация маркера 1046 с транскрипцией ЫтЗА, вероятно, объясняется его полным сцеплением с другим маркером - Gl021 А.
В линиях, в которых G, наиболее часто встречающийся в популяции Raleigh аллель, присутствовал в положении 1021, транскрипция ЫтЗА была средняя или высокая в зависимости от аллелей, располагающихся в позиции 871 и 1177. В линиях, в которых G был заменен на А, более редкий аллель, транскрипция становилась средней или низкой в зависимости от аллеля, располагающегося в позиции 871 и 1177 (Табл. 5). Мы предположили, что Spl/KLF, который предположительно взаимодействует с мотивом, в котором локализован Gl 021А маркер, функционирует синергично с транскрипционными факторами, в предполагаемых сайтах связывания которых находятся маркеры G871C и С1177Т. Spl/KLF принимает участие в регуляции транскрипции гена человека LHX3, гомолога гена Lim3 дрозофилы (Yaden et al., 2006). Spl/KLF участвует в ремоделировании хроматина и как белок-активатор, являясь членом Trithorax group (TrxG) белков, и как белок-репрессор, являясь одним из PcG белков (Brown et al., 2005).
Наличие потенциальных сайтов связывания различных белков, встречающихся в составе PREs и TREs свидетельствует о возможной роли этих белков в поддержании активного и неактивного транскрипционного состояния ЫтЗА.
Таким образом, мы обнаружили, что полиморфные маркеры G871C и С1177Т находятся в предполагаемых сайтах связывания белков репрессора и активатора, которые могут играть важную роль в регуляции транскрипции Lim3 и определении ПЖ мух. При этом мы предположили, что белок-репрессор, Grh, и неизвестный белок-активатор, связывающийся с (CA/TG)9-noBTopoM, обеспечивают позитивно-негативную регуляцию транскрипции ЫтЗА и, вследствие этого, влияют на ПЖ дрозофилы. Разрушение равновесия между позитивной и негативной регуляцией приводит к отклонению уровня транскрипции ЫтЗА от нормы и уменьшению ПЖ мух. В целом, можно предположить, что средний уровень экспрессии, основанный на равновесии между активацией и репрессией гена и благоприятный для высокой ПЖ, может обеспечиваться взаимодействием PcG и trxG белковых комплексов, принимающих участие в активации и репрессии транскрипции различных генов. Было показано, что PcG и trxG белковые комплексы связываются с генами, кодирующими транскрипционные факторы, в том числе гомеодомен-содержащие белки, такие как Lim3, и, тем самым, участвуют в их регуляции (Schuettengruber et al, 2007).
выводы
1. Ген ЫтЗ образует новый, ранее неаннотированный транскрипт, названный ЫтЗС.
2. ЫтЗА и ЫтЗС имеют множественные старты транскрипции, которая обеспечивается с промоторов, не содержащих ТАТА-бокс. В коровой и проксимальной промоторпых областях ЫтЗА и ЫтЗС присутствуют обнаруженные с помощью биоинформатического анализа рсгуляторныс элементы, свидетельствующие о возможности инициации транскрипции этих мРНК со своего собственного промотора.
3. В природной популяции Raleigh первый экзон транскриптов ЫтЗА и ЫтЗС характеризуются наименьшим уровнем полиморфизма по сравнению с 5' регуляторной областью и нитроном и подвергается действию стабилизирующего отбора.
4. Гаштотип, включающий два полиморфных маркера G871C и С1177Т, расположенных в предсказанных на основе биоинформатического анализа сайтах связывания регуляторпых белков, достоверно ассоциирован с количеством транскрипта ЫтЗА и ПЖ дрозофилы. Изменение гаплотипа может приводить к шестикратному изменению транскрипции гена и изменению ПЖ на 25%.
5. Вариабельность регуляторной области гена, расположенной на расстоянии 680-380 п.н. от главного старта транскрипции ЫтЗА, связана с изменением количества транскрипта на разных этапах развития и в разных частях тела взрослых мух, что свидетельствует о существовании в популяции полиморфизма в сайтах, важных для регуляции общего, нетканеспецифического уровня транскрипции.
6. Комбинация маркеров G871C и С1177Т, ассоциированная с промежуточным уровнем транскрипции и высокой ПЖ, встречается в популяции с высокой частотой, в то время как комбинации, ассоциированные с низким или высоким уровнем транскрипции и низкой ПЖ, встречаются в популяции с низкой частотой, что указывает на функциональную и селективную ценность среднего уровня экспрессии гена ЫтЗ.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи
1. Симоненко А. В., Рыбина О. Ю.. Пасюкова Е. Г. Молекулярная изменчивость генов shuttle craft и ЫтЗ, контролирующих развитие нервной системы, в природной популяции Drosophila melanogaster II Генетика, 2008, Т. 44, № 9. с.1172-1177.
2. Rvbina O.Y.. Pasyukova E.G. A Naturally occurring polymorphism at Drosophila melanogaster Lim3 locus, a homolog of human LHX3/4, affects Lim3 transcription and fly lifespan // PLoS ONE, 2010, V. 5(9): el2621.
Материалы всероссийских и международных конференций
1. Rvbina O.Y.. Pasyukova E.G., Molecular variation in the Lim3 locus controlling neuron development is associated with Drosophila melanogaster lifespan. 41st Population Genetics Group meeting UK, Department of Plant Sciences, University of Oxford, United Kingdom. 2007. P. 44
2. Rvbina O. Y.. Pasyukova E.G. Molecular variation in the Lim3 locus controlling intemeuron and motorneuron development is associated with Drosophila melanogaster lifespan. 49 Drosophila Research Conference. San-Diego. USA. 2008.
3. Рыбина О. Ю.. Пасюкова Е.Г. Молекулярный полиморфизм гена ЫтЗ связан с изменчивостью продолжительности жизни Drosophila melanogaster в природной популяции. IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск. Россия. 2008. С.115.
4. Pasyukova E.G., Rvbina О. Y. Molecular variation in Lim3 locus controlling neuron development is associated with Drosophila melanogaster lifespan. XX International Congress of Genetics, Berlin. Germany. 2008, C.193.
5. Рыбина О.Ю.. Пасюкова Е.Г. Полиморфизм гена ЫтЗ в природных популяциях Drosophila melanogaster сопряжен с уровнем экспрессии гена и продолжительностью жизни мух. Пятый съезд Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров. Москва. Россия. 2009. Ч. 2.С. 86.
6. Рыбина О.Ю.. Пасюкова Е.Г. Природный полиморфизм 5' регуляторной области гена ЫтЗ D. melanogaster, гомолога генов человека LHX3/4, определяет различия в уровне его экспрессии и продолжительности жизни дрозофилы. Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и биоианотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова. Москва. Россия. 2009. Т. 2. С. 206-207.
7. Rvbina О. Y.. Pasyukova E.G. Molecular variation in Drosophila melanogaster Lim3 gene, a homolog of human LHX3/4, is associated with fly lifespan. 35th FEBS Congress "Molecules of life". Gothendurg. Sweden. 2010. P. 297.
Подписано в печать 27.12.2010 г. Формат 60x90 1/16 Печать на ризографе. Тираж 120 экз. Заказ № 2436. Объем 1,0 п.л. Отпечатано в типографии ООО "Алфавит 2000", ИНН: 7718532212, г. Москва, ул. Маросейка, д. 6/8, стр. 1, т. 623-08-10, www.alfavit2000.ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рыбина, Ольга Юрьевна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
1.1. Актуальность проблемы.б
1.2. Цель и задачи исследования.
1.3. Научная новизна результатов исследования.
1.4. Практическая ценность.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
2.1. Общая характеристика белков, содержащих LIM- и гомеодомены.
2.1.1. Структурно-функциональная организация белков, содержащих LIM- и гомеодомены.
2.1.2. Классификации белков, содержащих LIM- и гомеодомены.
2.2. LIM-HD факторы транскрипции в развитии нервной системы D. melanogaster
2.2.1 Особенности формирования нервной системы дрозофилы.
2.2.2 «Ранние» транскрипционные факторы, участвующие в развитии нервной системы дрозофилы.
2.2.2.1 Спецификация нейроэктодермы. Спинно-брюшное и передне-заднее структурирование нейроэктодермы дрозофилы.
2.2.2.2. Образование и спецификация нейробластов.
2.2.2.3. Асимметричные деления нейробластов.
2.2.2.4. Временная генная сеть в спецификации нейробласта.
2.2.2.5. Асимметричные деления ганглиальных материнских клеток.
2.2.3. «Поздние» транскрипционные факторы,' участвующие в терминальной дифференцировке клеток нервной системы дрозофилы.:.
2.3. Иейроэндокринная система в контроле продолжительности жизни Drosophila melanogaster.
2.3.1. Инсулин/IGF сигнальный путь и эндокринная функция нервной системы в контроле продолжительности жизни Drosophila melanogaster.
2.3.2. TOR сигнальный путь и нервная система в контроле продолжительности жизни Drosophila melanogaster.'.
2.3.3. JNK сигнальный путь и нервная система в контроле продолжительности жизни Drosophila melanogaster.
2.3.4. Деацетилирование и нервная система в кош роле продолжительности жизни Drosophila melanogaster.
2.3.5. Окислительный стресс и нервная система в контроле продолжительности жизни
БгозоркИа melanogastev.
2.3.6. Поиск новых нейрональных генов, участвующих в контроле продолжительности жизни дрозофилы.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1. Линии дрозофилы.
3.2. Выделение геномной ДНК ОгоБорШа.
3.3. Полимеразная цепная реакция.
3.4. Секвестрование.
3.5. Выделение тотальной РНК ВгояорЬИа.
3.6. Обратная транскрипция.
3.7. Количественная ПЦР в реальном времени.
3.8. Нозерн-блот гибридизация.
3.9. Определение стартов транскрипции с помощью 5'-КАСЕ.
3.9.1. 5'-КАСЕ.
3.9.2. Очистка продуктов ПЦР, полученных в результате 5'-11АСЕ.
3.9.3. Дотирование фрагментов кДНК, полученных в результате 5Ч1АСЕ.
3.9.4. Трансформация клеток Е. соИ.
3.9.5. Выделение плазмидной ДНК для секвенирования.
ЗЛО. Биоинформатический анализ.
3.11. Статистический анализ.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ.
4.1. Особенности организации проксимального промотора и инициации транскрипции ЫтЗА гена ЫтЗ.
4.2 Исследование природного молекулярного полиморфизма в ЫтЗ локусе.
4.3 Исследование ассоциации между природным молекулярным полиморфизмом в ЫтЗ локусе и продолжительностью жизни.
4.4 Исследование ассоциации между молекулярным полиморфизмом в ЫтЗ локусе и его экспрессией.
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
5.1. Модель инициации транскрипции мРНК ЫтЗА, ЫтЗС гена ЫтЗ.
5.2. Оценка действия отбора на исследуемую область ЫтЗА, ЫтЗС.
5.3. Белки Рев и йхв в регуляции транскрипции ЬшгЗА и контроле ПЖ дрозофилы.
5.4. Основные механизмы участия ЫтЗ в контроле ПЖ дрозофилы.
6. ВЫВОДЫ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование транскрипции и природного полиморфизма гена Lim3, участвующего в контроле продолжительности жизни Drosophila melanogaster"
Старение как процесс возрастных изменений организма, ведущий к снижению его функциональной активности и увеличению вероятности смерти, свойственен большинству живых организмов, но темп и форма этого процесса могут резко отличаться у представителей как различных таксонов, так и внутри одного вида. Такие различия в продолжительности жизни (ПЖ) обусловлены взаимодействием генетических факторов и факторов внешней среды. Температура, питание, загрязнение окружающей среды, являясь внешними факторами, запускают в организме каскады реакций, являющиеся компонентами генетически детерминированных сигнальных и метаболических путей, и в результате могут влиять на изменение ПЖ организма. Таким образом, в генетическом контроле длительности жизни могут принимать участие множество генов. Действительно, наследуемость ПЖ не превышает 30%, что характерно для полигенного количественного' признака.
В последнее время был достигнут значительный прогресс в понимании того, какие-гены определяют ПЖ у организмов различных систематических групп. Тем не менее, выявление новых генов, участвующих в контроле ПЖ, а главное, анализ особенностей их влияния на признак и характер их взаимодействия друг с другом являются актуальными задачами современной науки, решение которых необходимо для понимания причин и условий, обеспечивающих высокую ПЖ.
Один из возможных подходов к решению этих задач заключается в изучении влияния структурного природного полиморфизма генов на изменение Г1Ж организма.
Природный полиморфизм ранее был описан для сравнительно небольшого числа генов Drosophila melanogaster (Hasson et al., 1998; Balakirev, Ayala, 2003; Palsson et al., 2004). В ряде случаев была продемонстрирована взаимосвязь описанного природного полиморфизма с количественными признаками, включая ПЖ (De Luca et al., 2003; Carbone 6 et al., 2006). В настоящее время в США проводится полное секвенирование геномов дрозофилы из природных популяций. Однако до сих пор при исследовании природного полиморфизма не уделяется должного внимания изучению причинно-следственных связей между структурной вариабельностью гена и его экспрессией и, далее, изменением какого-либо признака организма. Очевидно, что именно такого рода информация имеет принципиально важное значение для понимания биологической роли генетической изменчивости. Хорошо известно, что ПЖ может существенно различаться у особей одного и того же вида. Понимание генетических причин такой внутривидовой и внутрипопуляционной изменчивости может быть достигнуто в результате исследования взаимосвязи между структурной и функциональной вариабельностью генетического материала, приводящей к изменчивости ПЖ.
В Лаборатории геномной изменчивости Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН с помощью различных методов генетического картирования было выявлено несколько групп генов, связанных с ранее неизвестными путями контроля ПЖ Drosophila melanogaster. В числе генов-кандидатов был ген ЫтЗ.
ЫтЗ, расположенный в левом плече второй хромосомы, в цитологической позиции 37В13-37С1, кодирует транскрипционный фактор РНК-полимеразы II. Белок Lim3 , является мишенью сложных регуляторных сетей и играет ключевую роль в регуляции развития нейронов дрозофилы. Lim3 вместе с белками Islet и Drifter образуют «комбинатороный код», который определяет свойства мотонейронов, контролирует миграцию их аксонов и в итоге играет важную роль в обеспечении правильной мышечной иннервации (Thor et al., 1999; Certel, Thor, 2004; Landgraf, Thor, 2006). Таким образом, роль Lim3 в развитии и функционировании нервной системы дрозофилы может являться существенным фактором для определения ПЖ дрозофилы:
Белок, кодируемый геном ЫтЗ, обнаруживает высокий уровень гомологии с белками LHX3/4 человека. Мутации в генах LHX3/4 приводят к нарушениям секреции 7 гормонов гипофиза, что является причиной различных нарушений, связанных с репродуктивной системой, ростом и метаболизмом. Таким образом, ген ЫтЗ является геном-ортологом дрозофилы, перспективным для изучения не только ПЖ, но и механизмов нейроэндокринной регуляции у человека.
1.2. Цель и задачи исследования
Целью нашей работы являлось исследование роли молекулярной изменчивости гена ЫтЗ в определении уровня его транскрипции и контроле ПЖ ОгозорИПа melanogaster.
В работе были поставлены следующие задачи:
1. Определить особенности организации 5' регуляторной области и инициации транскрипции транскрипта ЫтЗА гена ЫтЗ.
2. Описать молекулярный полиморфизм 5' регуляторной области и начала структурной области транскрипта ЫтЗА гена ЫтЗ в природной популяции 'йговорЫШ melanogaster.
3. Исследовать ассоциацию между молекулярным полиморфизмом 5'регуляторной области и начала структурной области транскрипта ЫтЗА гена ЫтЗ и ПЖ.
4. Исследовать ассоциацию между молекулярным полиморфизмом 5' регуляторной области и начала структурной области транскрипта ЫтЗА гена ЫтЗ и экспрессией ЫтЗА.
1.3. Научная новизна результатов исследования
В работе показано существование новой, ранее неаннотированной мРНК гена ЫтЗ, ЬгтЗС. Определены особенности организации регуляторной области ЫтЗА, ЫтЗС: обнаружены регулярные элементы в коровой и проксимальной промоторных областях, свидетельствующие о возможности инициации транскрипции этих мРНК со своего собственного промотора; показано наличие множественных стартов транскрипции с промоторов, не содержащих ТАТА-бокс.
В результате изучения молекулярной вариабельности регуляторной области, экзона и части интрона ЫтЗА и ЫтЗС описано распределение полиморфных сайтов по функционально различным районам гена и продемонстрировано действие стабилизирующего отбора на область ДНК, соответствующую первому экзону ЫтЗА и ЫтЗС.
Показано, что вариабельность регуляторной области гена, расположенной на расстоянии 680-380 п.н. от главного старта транскрипции, связана с изменением количества транскрипта на разных этапах развития и в разных частях тела взрослых мух. Этот результат свидетельствует о том, что в природной популяции полиморфизм выявляется в сайтах, существенных для регуляции общего, нетканеспецифического уровня транскрипции. Показано, что природный полиморфизм регуляторной области гена может приводить к шестикратному изменению транскрипции гена.
Выявлен гаплотип, включающий два полиморфных маркера, расположенных в предсказанных на основе биоинформатического анализа сайтах связывания регуляторных белков, достоверно ассоциированный с количеством транскрипта ЫтЗА и ПЖ дрозофилы. Показано, что составляющая гаплотип комбинация маркеров, ассоциированная с промежуточным уровнем транскрипции и высокой ПЖ, встречается в популяции с высокой частотой, в то время как комбинации, ассоциированные с низким или высоким уровнем транскрипции и низкой ПЖ, встречаются в популяции с низкой частотой, что указывает на функциональное и селективное преимущество среднего уровня экспрессии гена ЫтЗ.
Таким образом, впервые показана функциональная связь между природным полиморфизмом гена ЫтЗ, определяющего развитие нервной системы, и ПЖ дрозофилы. 1.4. Практическая ценность
Представленные в данной работе результаты расширяют представления о связи структурной изменчивости, в том числе природного полиморфизма регуляторной области 9 гена с его функциональными возможностями: уровнем экспрессии и характером влияния на фенотип организма. Эти результаты должны быть учтены при создании генетических конструкций, используемых в различных биотехнологических проектах, с целью обеспечения требуемого уровня транскрипции используемых генов. Кроме того, полученные результаты могут быть использованы при чтении лекций и проведении практических занаятий по общей генетике, генетике популяций, генетике количественных признаков, геронтологии в высших учебных заведениях биологического, медицинского и сельскохозяйственного профиля.
Заключение Диссертация по теме "Генетика", Рыбина, Ольга Юрьевна
6. выводы
1. Ген ЫтЗ образует новый, ранее неаннотнрованный транскрипт, названный
ЫтЗС.
2. ЫтЗА и ЫтЗС имеют множественные старты транскрипции, которая обеспечивается промоторами, не содержащими ТАТА-бокс. В коровой и проксимальной промоторных областях ЫтЗА и ЫтЗС присутствуют обнаруженные с помощью биоинформатического анализа регуляторные элементы, что свидетельствует о возможности инициации транскрипции этих мРНК со своего собственного промотора.
3. В природной популяции Raleigh первый экзон транскриптов ЫтЗА и ЫтЗС характеризуются наименьшим уровнем полиморфизма по сравнению с 5' регуляторной областью и интроном и подвергается действию стабилизирующего отбора.
4. Гаплотип, включающий два полиморфных маркера G871C и С1177Т, расположенных в предсказанных на основе биоинформатического анализа сайтах связывания регуляторных белков, достоверно ассоциирован с количеством транскрипта ЫтЗА и ПЖ дрозофилы. Изменение гаплотипа может приводить к шестикратному изменению транскрипции гена и изменению ПЖ на 25%.
5. Вариабельность регуляторной области гена, расположенной на расстоянии 680-380* п.н. от главного старта транскрипции ЫтЗА, связана с изменением количества транскрипта на разных этапах развития и в разных частях тела взрослых мух, что свидетельствует о существовании в популяции полиморфизма в сайтах, важных для регуляции общего, нетканеспецифического уровня транскрипции.
6. Комбинация маркеров G871C и CI 177Т, ассоциированная с промежуточным уровнем транскрипции и высокой ПЖ, встречается в популяции с высокой частотой, в то время как комбинации, ассоциированные с низким или высоким уровнем транскрипции и низкой ПЖ, встречаются в популяции с низкой частотой, что указывает на функциональную и селективную ценность среднего уровня экспрессии гена ЫтЗ.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рыбина, Ольга Юрьевна, Москва
1. Фроликс ВВ. Адаптационно-регуляторная теория возрастного развития. // Изв. РАН. Сер. биол. 1992. №4. С.631-34.
2. Abraham RT. TOR Signaling: An Odyssey from Cellular Stress to the Cell-Growth Machinery. // Curr
3. Arber S, Caroni P. Specificity of single LIM motifs in targeting and LIM/LIM interactions in situ. //
4. Drosophila //Cell. 2004. V. 119(1). P. 87-96. Bateman JM., McNeill H. Insulin/IGF signalling in neurogenesis. // Cell. Mol. Life Sci. 2006. V.63(15). P. 1701—1705.
5. Bauer JH, Chang C, Morris SN, Hozier S, Andersen S, Waitzman JS, Helfand SL. Expression of dominant-negative Dmp53 in the adult fly brain inhibits insulin signaling. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104(33). P. 13355-13360.
6. Bauer JH, Chang C, Bae G, Morris SN, Helfand SL. Dominant-negative Dmp53 extends life span through the dTOR pathway in D. melanogaster. // Mech. Ageing Dev. 2010. V. 131(3). P. 193201.
7. Bauer JH, Morris SN, Chang C, Flatt T, Wood JG, Helfand SL. dSir2 and Dmp53 interact to mediate aspects of CR-dependent lifespan extension in D. melanogaster. II Aging (Albany NY). 2009. V. 1(1). P. 38-48.
8. Bauer JH, Poon PC, Glatt-Deeley H, Abrams JM, Helfand SL. Neuronal expression of p53 dominantnegative proteins in adult Drosophila melanogaster extends life span. // Current Biol. 2005. V. 15(22). P. 2063-68.
9. Benjamini Y, Hochberg Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. // J. R Statist. Soc. B. 1995. V.57(l). P. 289-300.
10. Benveniste RJ, Thor S, Thomas JB, Taghert PH. Cell type specific regulation of the Drosophila FMRF-NH2 neuropeptide gene by Apterous, a LIM homeodomain transcription factor. // Development. 1998. V. 125(23). P. 4757-65.
11. Berdnik D, Torok T, Gonzalez-Gaitan M, Knoblich JA. The endocytic protein alpha-Adaptin is required for numb-mediated asymmetric cell division in Drosophila. // Dev. Cell. 2002. V. 3(2). P. 221-31.
12. Betschinger J, Mechtler K, Knoblich JA. The Par complex directs asymmetric cell division by phosphorylating the cytoskeletal protein Lgl. // Nature. 2003. V. 422(6929). 326-30.
13. Blair SS, Brower DL, Thomas JB, Zavortink M. The role of apterous in the control of the dorsoventral compartmentalization and PS integrin gene expression in the developing wing of Drosophila. // Development. 1994. V. 120(7). P. 1805-15.
14. Blastya'k A, Mishra RK, Karch F, Gyurkovics H. Efficient and Specific Targeting of Polycomb Group Proteins Requires Cooperative Interaction between Grainyhead and Pleiohomeotic. // Mol. Cell Biol. 2006. V. 26(4). P. 1434-44.
15. Blenau W, Baumann A. Molecular and pharmacological properties of insect biogenic amine receptors: lessons from Drosophila melanogaster and Apis mellifera. //Arch. Insect. Biochem. Physiol 2001. V.48(l). P. 13-38.
16. Bourgouin C, Lundgren SE, Thomas JB. apterous is a Drosophila LIM domain gene required for the development of a subset of embryonic muscles. // Neuron. 1992. V. 9(3). P. 549-61.
17. Broadus J, Skeath JB, Spana EP, Bossing T, Technau G, Doe CQ. New neuroblast markers and the origin of the aCC/pCC neurons in the Drosophila central nervous system. // Mech. Dev. 1995. V. 53(3). P. 393-402.
18. Brody T. Odenwald WF. Programmed transformations in< neuroblast gene expression during Drosophila CNS lineage development. // Dev. Biol. 2000. V. 226(1). P. 34-44.
19. Brody T, Odenwald WF. Cellular diversity in the developing nervous system: a temporal view from Drosophila. II Dev. 2002. V. 129(16). P. 3763-70.
20. Brogiolo W, Stocker H, Ikeya T, Rintelen F, Fernandez R, Hafen E. An evolutionarily conserved function of the Drosophila insulin receptor and insulin-like peptides in growth control. // Curr. Biol. 2001. V. 11(4). P. 213-221.
21. Broughton S., Partridge L. InsuIin/IGF-like signalling, the central nervous system and aging // Biochem J. 2009. V. 418(1). P. 1-12.
22. Brown JL, Grau DJ, DeVido SK, Kassis J A. An Spl/KLF binding site is important for the activity of a Polycomb group response element from the Drosophila engrailed gene. // Nucleic. Acids Research. 2005. V. 33(16). P. 5181-89.
23. Burke TW, Kadonaga JT. The downstream core promoter element, DPE, is conserved from Drosophila to humans and is recognized by TAFII60 of Drosophila. II Genes& Dev. 1997. V. 11:3020-3031.
24. Butler JEF, Kadonaga JT. The RNA polymerase II core promoter: a key component in the regulation of gene expression. // Genes. Dev. 2002. V. 16(20). P. 2583-92.
25. Cai Y, Chia W, Yang X. A family of snail-related zinc finger proteins regulates two distinct and parallel mechanisms that mediate Drosophila neuroblast asymmetric divisions I IEMBO J. 2001. V. 20(7). P. 1704-14.
26. Carbone MA, Jordan KW, Lyman RF, Harbison ST, Leips J, Morgan TJ, DeLuca M, Awadalla P, Mackay TF. Phenotypic variation and natural selection at Catsup, a pleiotropic quantitative trait gene in Drosophila. // Curr. Biol. 2006. V. 16(9). P. 912-19.
27. Carroll SB. Evolution at two levels: on genes and form. II PLoS Biol. 2005. V. 3(7). e245 194.
28. Cassata G, Kagoshima H, Andachi Y, Kohara Y, Diirrenberger MB, Hall DH, Biirglin TR. The LIM homeobox gene ceh-14 confers thermo sensory function to the AFD neurons in Caenorhabditis elegans. //Neuron. 2000. V. 25(3). P.587-97
29. Cenci C, Gould AP. Drosophila Grainyhead specifies late programmes of neural proliferation by regulating the mitotic activity and Hox-dependent apoptosis of neuroblasts. // Development. 2005. V. 132(17). P. 3835-45.
30. Certel SJ, Thor S. Specification of Drosophila motoneuron identity by the combinatorial action of POU and LIM-HD factors. //Development. 2004. V. 131(21). P. 5429-39.
31. Chan YM, Jan YN. Conservation of neurogenic genes and mechanisms. // Curr. Opin. NeurobioL 1999. V. 9(5). P.582-8
32. Cheng C.-L, Gao T.-Q, Wang Z, Li D.-D. Role of insulin/insulinlike growth factor 1 signaling pathway in longevity. // World J. Gastroenterol. 2005. V. 11, (13). P. 1891-5.
33. Chitnis AB. The role of Notch in lateral inhibition and cell fate. // Mol. Cell Neurosci. 1995. V. 6(6). P.311-21.
34. Choi YJ, Di Nardo A, Kramvis I, Meikle L, Kwiatkowski DJ, Sahin M, He X. Tuberous sclerosis complex proteins control axon formation. // Genes Dev. 2008. V. 22(18). P.2485—95.
35. Choksi SP, Southall TD, Bossing T, Edoff K, de Wit E, Fischer BE, van Steensel B, Micklem G, Brand AH. Prospero acts as a binary switch between self-renewal and differentiation in Drosophila neural stem cells. // Dev. Cell. 2006. V.l 1(6). P.775-89.
36. Clancy DJ, Gems D, Harshman LG, Oldham S, Stocker H, Hafen E, Leevers SJ, Partridge L. Extension of life-span by loss of CHICO, a Drosophila insulin receptor substrate protein. // Science. 2001. V. 292(5514). P.104-6.
37. Cohen B, McGuttin ME, Pflege C, Segal D, Cohen SM. apterous: a gene required for imaginal disc development in Drosophila encodes a member of LIM family of developmental regulatory proteins. // Genes Dev. 1992. V. 6(5). P. 715-729.
38. Crawford D, Libina N, Kenyon C. Caenorhabditis elegans integrates food and reproductive signals in lifespan determination. // Aging Cell. 2007. V. 6(5). P. 715-21.
39. Curtiss J, Heilig JS. Establishment of Drosophila imaginal precursor cells is controlled by the Arrowhead gene. // Development. 1995. V. 121(11). P. 3819-28.
40. Curtiss J, Heilig JS. Arrowhead encodes a LIM homeodomain protein that distinguishes subsets of Drosophila imaginal cells. // Dev Biol. 1997. V. 190(1). P. 129-41.
41. Davis WJr, Schultz RM. Developmental change in TATA-box utilization during preimplantation mouse development. // Dev. Biol. 2000. V. 218(2). P. 275-83.
42. De Luca M, Roshina NV, Geiger-Thornsberry GL, Lyman RF, Pasyukova EG Mackay TF. Dopa-decarboxylase affects variation in Drosophila longevity. // Nat. Genet. 2003. V. 34(4). P. 429-33.
43. De Velasco B, Shen J, Go S, Hartenstein V. Embryonic development of the Drosophila corpus cardiacum, a neuroendocrine gland with similarity to the vertebrate pituitary, is controlled by sine oculis and glass. // Dev. Biol. 2004. V. 274(2). P. 280-94.
44. Deane JE, Mackay JP, Rwan AH, Sum EY Visvader JE, Matthews JM. Structural basis for the recognition of ldbl by the N-terminal LIM domains of LM02 and LM04. // EMBO J. 2003. V. 22(9). P: 2224-33.
45. Deane JE, Ryan DP, Sunde M, Maher MJ, Guss JM, Visvader JE, Matthews JM. Tandem LIM domains provide synergistic binding in the LM04:Ldbl complex. // EMBO J. 2004. V. 23(18). P. 3589-98.
46. Doe CQ. Molecular markers for identified neuroblasts and ganglion mother cells in the Drosophila central nervous system. // Development. 1992. V. 116(4). P. 855-63.
47. Duan ZJ, Fang X, Rohde A, Han H, Stamatoyannopoulos GLiQ. Developmental specificity of recruitment of TBP to the TATA box of the human gamma-globin gene. // Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99(8). P. 5509-14.
48. Fernandez R, Tabarini D, Azpiazu N, Frasch M, Schlessinger J. The Drosophila insulin receptor homolog: a gene essential for embryonic development encodes two receptor isoforms with different signaling potential. // EMBO J. 1995. V. 14(14). P.3373-84.
49. Flatt T, Min KJ, D'Alterio C, Villa-Cuesta E, Cumbers J, Lehmann R, Jones DL, Tatar M. Drosophila germ-line modulation of insulin signaling and lifespan. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105(17). P. 6368-73.
50. Freyd G, Kim SK, Horvitz HR. Novel cysteine-rich motif and homeodomain in the product of the
51. Heitzler P, Simpson P. The choice of cell fate in the epidermis of Drosophila. // Cell 1991. V. 64(6).i1. P.1083-92.
52. Hekmat-Scafe DS, Dang KN, Tanouye MA. Seizure suppression by gain-of-fonction escargot mutations. // Genetics. 2005. V. 169(3). P. 1477-93.
53. Hewes RS, Park D, Gauthier SA, Schaefer AM,Taghert PH. The bHLH protein Dimmed controls neuroendocrine cell differentiation in Drosophila. // Development. 2003. V. 130(9). P. 1771-81.
54. Hill WG, Robertson A. The effect of linkage on limits to artificial selection. // Genet. Res. 1966. V. 89(5-6). P. 269-94.
55. Hobert O, Mori I, Yamashita Y, Honda H, Ohshima Y, Liu Y, Ruvkun G. Regulation of interneuron function in the C. elegans thermoregulatory pathway by the ttx-3 LIM homeobox gene. // Neuron. 1997. V. 19(2), P.345-57.
56. Hobert O, Westphal H. Functions of LIM-homeobox genes. // Trends Genet. 2000. V. 16(2). P. 75-83.
57. Humphrey DM, Toivonen JM, Giannakou M, Partridge L, Brand MD. Expression of human uncoupling protein-3 in Drosophila insulin-producing cells increases insulin-like peptide (DILP) levels and shortens lifespan. //Exp. Gerontol. 2009. V. 44(5). P. 316-27.
58. Johnson JD, Zhang W, Rudnick A, Rutter WJ, German MS. Transcriptional synergy between LIM-homeodomain proteins and basic helix-loop-helix proteins: the LIM2 domain determines specificity. // Mol. Cell. Biol. 1997. V. 17(7). P. 3488-96.
59. Jurata LW, Thomas JB, Pfaff SL. Transcriptional mechanisms in the development of motor control. // Curr Opin Neurobiol. 2000. V. 10(1). P.72-9.
60. Kadonaga, J.T. The DPE, a core promoter element for transcription by RNA polymerase II. // Exp. Mol. Med. 2002. V. 34(4). P. 259-64.
61. Kanai Mi; Okabe M, Hiromi Y. seven-up Controls switching of transcription factors that specify temporal identities of Drosophila neuroblasts. // Dev. Cell. 2005. V. 8(2). P. 203-213.
62. Kapahi P, Zid BM, Harper T, Koslover D, Sapin V, Benzer S. Regulation of lifespan in Drosophila by modulation of genes in the TOR signaling pathway. // Curr. Biol. 2004. V.14(10). P.885-90.
63. Kaplan DR, Miller FD. Neurotrophin signal transduction in the nervous system // Curr. Opin. Neurobiol. 2000. V.10(3). P. 381-91.
64. Karlsson O, Thor S, Norberg T, Ohlsson H, Edlund T. Insulin gene enhancer binding protein Isl-1 is a member of a novel class of proteins containing both a homeo- and a Cys-His domain. // Nature. 1990. V. 344(6269). P. 879-82.
65. Katewa SD, Kapahi P. Dietary restriction and aging, 2009. // Aging Cell. 2010. V. 9(2). P. 105-112.
66. Knoblich JA. Mechanisms of asymmetric stem cell division. // Cell. 2008.132(4). 583-97.
67. Kuchar J, McDonough C, Sackcrson C. Heat shock factor controls expression of a non-heat shock protein gene in Drosophila embryos. // BIOS. 2007. V.78(2). P. 62-68.
68. Kusama S, Ueda R, Suda T, Nishihara S, Matsuura ET. Involvement of Drosophila Sir2-like genes in the regulation of life span. // Genes Genet: Syst. 2006. V. 81(5). P. 341-48.
69. Martín-Bermudo MD, Martínez C, Rodríguez A, Jiménez F. Distribution and fonction of the lethal of scute gene product during early neurogenesis in Drosophila. // Development. 1991. V. 113(2). P.445-54.
70. Mettler U, Vogler G, and Urban .J. Timing of identity: spatiotemporal regulation of hunchback in neuroblast lineages of Drosophila by Seven-up and Prospero. // Development. 2006. V. 133(3). P. 429-37.
71. Milan M, Cohen SM. Regulation of LIM homeodomain activity in vivo: a tetramer of dLDB and Apterous confers activity and capacity for regulation by dLMO. // Mol. Cell. 1999. V. 4(2). P. 267-73.
72. Milan M, Cohen S. Temporal regulation of Apterous activity during development of Drosophila wing.
73. Development. 2000. V. 127(14). P. 3069-78. Min KJ, Yamamoto R, Buch S, Pankratz M, Tatar M. Drosophila lifespan control by dietary restriction independent of insulin-like signaling. //Aging Cell. 2008. V. 7(2). P. 199-206.
74. Morrow G, Samson M, Michaud S, Tanguay RM. Overexpression of the small mitochondrial Hsp22 extends Drosophila lifespan and increases resistance to oxidative stress. // FASEB J. 2004. V. 18(3). P. 598-609.
75. Nuzhdin SV., Pasyukova E.G., Dilda C.L., Zeng Z.B., Mackay T.F.C. Sex-specific quantitative trait loci affecting longevity in Drosophila melanogaster. II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1997. V.94(18). P. 9734-9.
76. O'Keefe DD, Thor S, Thomas JB. Function and specificity of LIM domains in Drosophila nervous system and wing development. //Development. 1998. V. 125(19). P.3915-23.
77. Olovnikov A M. Hypothesis: lifespan is regulated by chronomere DNA of the hypothalamus // J. Alzheimers Dis. 2007. V. 11 (2). P. 241-52.
78. Orr WC., Mockett RJ, Benes JJ, Sohal RS. Effects of overexpression of copper-zinc and manganese superoxide dismutases, catalase, and thioredoxin reductase genes on longevity in Drosophila melanogaster. II J. Biol. Chem. 2003. V. 278(29). P. 26418-22.
79. Orr WC, Radyuk SN, Prabhudesai L, Toroser D, Benes JJ, Luchak JM, Mockett RJ, Rebrin I, Hubbard JG, Sohal RS. Overexpression of glutamate-cysteine ligase extends life span in Drosophila melanogaster. //J. Biol. Chem. 2005. V. 280(45). P. 37331-8.
80. Palsson A, Rouse A, Riley-Berger R, Dworkin I, Gibson G. Nucleotide variation in the Egfr locus of Drosophila melanogaster. II Genetics. 2004. V. 167(3). P. 1199-1212.
81. Papatsenko DA, Makeev VJ, Lifanov AP, Rergnier M, Nazina AG, Desplan C. Extraction of Functional Binding Sites from Unique Regulatory Regions: The Drosophila Early Developmental Enhancers. // Genome Res. 2002. V. 12(3). P. 470-81.
82. Park D, Han M, Kim YC, Han KA, Taghert PH. Ap-let neurons—a peptidergic circuit potentially controlling ecdysial behavior in Drosophila. // Dev. biol. 2004. V. 269(1). P. 95-108.
83. Parker GE, Sandoval RM, Feister HA, Bidwell JP, Rhodes SJ. The homeodomain coordinates nuclear entry of the Lhx3 neuroendocrine transcription factor and association with the nuclear matrix. // J Biol Chem. 2000. V. 275(31). P. 23891-8.
84. Parkes TL, Hilliker AJ, Phillips JP. Motorneurons, reactive oxygen, and life span in Drosophila. H Neurobiol. Aging. 1999. V. 20(5). P. 531-5.
85. Pasyukova EG, Roshina NV, Mackay TFC. Shuttle craft: a candidate quantitative trait gene for Drosophila lifespan. II Aging cell. 2004. V.3(5). P. 297-307.
86. Pasyukova EG, Vieira C, Mackay TFC. Deficiency Mapping of Quantitative Trait Loci Affecting Longevity in Drosophila melanogaster. H Genetics. 2000. V. 156(3). P. 1129-46.
87. Paul A, Belton A, Nag S, Martin I, Grotewiel MS, Duttaroy A. Reduced mitochondrial SOD displays mortality characteristics reminiscent of natural aging. // Mech. Ageing Dev. 2007. V. 128(11-12). P. 706-16.
88. Pérez VI, Bokov A, Van Remmen H, Mele J, Ran Q, Ikeno Y, Richardson A. Is the oxidative stress theory of aging dead?// Biochim. Biophys. Acta. 2009. V. 1790(10). P. 1005-1014.
89. Perez-Alvarado GC, Miles C, Michelsen JW, Louis HA, Winge DR, Beckerle MC, Summers MF. Structure of the carboxy-terminal LIM domain from the cysteine rich protein CRP. // Nat. Struct. Biol. 1994. V. 1(6). P. 388-98.
90. Pfaffl MW, Horgan GW, Dempfle L. Relative expression software tool (REST(C)) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. // Nucl. Acids Res. 2002. V. 30(9). e36.
91. Pipes GC, Lin Q, Riley SE, Goodman CS. The Beat generation: a multigene family encoding IgSF proteins related to the Beat axon guidance molecule in Drosophila. // Development. 2001. V. 128(22). P. 4545-52.
92. Pueyo JI, Couso JP. Chip-mediated partnerships of the homeodomain proteins Bar and Aristaless with the LIM-HOM proteins Apterous and Liml regulate distal leg development. // Development. 2004. V. 131(13). P. 3107-20.
93. Pueyo JI, Galindo MI, Bishop SA, Couso JP. Proximal-distal leg development in Drosophila requires the apterous gene and the Liml homologue dliml. // Development. 2000. Y. 127(24). P. 5391402.
94. Puig O, Marr MT, Ruhf ML, Tjian R. Control of cell number by Drosophila FOXO: downstream'and feedback regulation of the insulin receptor pathway. // Genes Dev. 2003. V. 17(16). P. 2006-20.
95. Ringo J, Werczberger R, Altaratz M, Segal D. Female sexual receptivity and juvenile hormone synthesis are defective in mutans of the apterous gene in Drosophila melanogaster. II Behav. Genet. 1991.V. 21(5). P. 453-69.
96. Rogina B, Helfand SL. Sir2 mediates longevity in the fly through a pathway related to calorie restriction. //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101(45). P.15 998-16 003.
97. Rozas J, Rozas R. DnaSP version 3: an integrated program for molecular population genetics and molecular evolution analysis. // Bioinformatics. 1999. V. 15(2). P. 174-175.
98. Rúan H, Tang XD, Chen ML, Joiner ML, Sun G, Brot N, Weissbach H, Heinemann SH, Iverson L, Wu CF, Hoshi T. High-quality life extension by the enzyme peptide methionine sulfoxide reductase. //Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002. V.99(5). P. 2748-53.
99. Sambrook J, Maniatis T, Fritsch EF Molecular, cloning: a laboratory manual. // 1989. Cold Spring Harbor, N. Y: Cold Spring Harbor Laboratory.
100. Sánchez-García I, Osada H, Forster A, Rabbitts T H. The cysteine-rich LIM domains inhibit DNA binding by the associated homeodomain in Isl-1. // EMBO J. 1993. V. 12 (11): 4243-4250.
101. Schneider LE, Sun ET, Garland DJ, Taghert PH. An immunocytochemical study of the FMRFamide neuropeptide gene products in Drosophila. // J. Comp. Neurol. 1993. V. 337(3). P.446-60.
102. Schuettengruber B, Chourrout D, Vervoort M, Leblanc B, Cavalli G. Genome regulation by polycomb and trithorax proteins. // Cell. 2007. V. 128(4). P.735-45.
103. Sharma VK, Kumar N, Brahmachari SK, Ramachandran S. Abundance of dinucleotide repeats and gene expression are inversely correlated: a role for gene function in addition to intron length. // Physiol. Genomics. 2007. V. 31(1). P. 96-103.
104. Shen. CP, Jan LY, Jan YN. Miranda is required for the asymmetric localization of Prospero during mitosis in Drosophila. // Cell. 1997. V. 90(3) P.449-58.
105. Simonsen A, Cumming RC, Brech A, Isakson P, Schubert DR, Finley KD. Promoting basal levels of aytophagy in the nervous system enhances longevity and oxidant resistance in adult Drosophila. //Autophagy. 2008. V. 4(2). P. 176-184.
106. Skeath JB. The Drosophila EGF receptor controls the formation and specification of neuroblasts along the dorsal-ventral axis of the Drosophila embryo // Development. 1998. V.125(17) . P. 3301-12 .
107. Skeath JB., Carroll SB. Regulation of proneural gene expression and cell fate during neuroblast segregation in the Drosophila embryo. // Development. 1992. V. 114(4). P. 939-46.
108. Skeath JB, Panganiban GF, Carroll SB. The ventral nervous system defecetive gene controls proneural gene expression at two distinct steps during neuroblast formation in Drosophila. // Development. 1994. V. 120(6) P. 1517-24.
109. Skeath JB, Thor S. Genetic control of Drosophila nerve cord development. // Curr. Opin. Neurobiol. 2003. V. 13(1). P.8-15.
110. Sloop KW, Dwyer CJ, Rhodes SJ. An isoform-specific inhibitory domain regulates the LHX3 LIM homeodomain factor holoprotein and the production of a functional altérnate translation form. // J Biol Chem. 2001. V. 276 (39). P. 36311-9.
111. Sloop KW, Meier BC, Bridwell JL, Parker GE, Schiller AM, Rhodes SJ. Differential activation of pituitary hormone genes by human Lhx3 isoforms with distinct DNA binding properties. // Mol. Endocrinol 1999. V. 13(12). P. 2212-25.
112. Spana EP, Doe CQ. Numb antagonizes Notch signaling to specify sibling neuron cell fates. // Neuron. 1996. V. 17(1). P. 21-26.
113. Spokony RF, Restifo LL. Broad complex isoforms have unique distributions during central nervous system metamorphosis in Drosophila melanogaster. II J. Comp. Neurol. 2009. V. 517(1). P. 15— 36.
114. Stathakis DG, Burton DY, Mclvor WE, Krishnakumar S, Wright TRF, O'Donnell JM The Catecholamines up (Catsup) protein of Drosophila melanogaster functions as a negative regulator of tyrosine hydroxylase activity. // Genetics. 1999. V.153(3). P.61-382.
115. Stoletzki N, Eyre-Walker A. Estimation of the Neutrality Index. // Mol. Biol. Evol. 2010 (в печати).
116. Stroumbakis ND, Li Z, Tolias PP. A homolog of human transcription factor NF-X1 encoded by the Drosophila shuttle craft gene is required in the embryonic central nervous system // Mol. Cell Biol. 1996. V.16(l). P.l92-201.
117. Sun J, Tower J. FLP recombinase-mediated induction of Cu/Zn-superoxide dismutase transgene expression can extend the lifespan of adult Drosophila melanogaster flies. // Mol. Cell. Biol. 1999. V. 19(1). P. 216-28.
118. Sun J, Folk D, Bradley TJ, Tower J. Induced overexpression of mitochondrial Mn-superoxide dismutase extends the life span of adult Drosophila melanogaster. // Genetics. 2002. V. 161(2). P. 661-72.
119. Taira M, Evrard JL, Steinmetz A, Dawid IB. Classification of LIM proteins. // Trends in Genetics.1995. V. 11. (11). P. 431-432.
120. Tajima F Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism. // Genetics. 1989. V. 123(3). P. 585-95.
121. Tatar M, Kopelman A, Epstein D, Tu MP, Yin CM, Garofalo RS. A mutant Drosophila insulin receptor homolog that extends life-span and impairs neuroendocrine function. // Science. 2001. V. 292(5514). P.107-110.
122. Thaler, JP, Lee S, Jurata LW, Gill GN, Pfaff SL. LIM factor Lhx3 contributes to the specification of motor neuron and interneuron identity through cell-type-specific protein-protein interactions. // Cell. 2002. V. 110(2). P. 237-49.
123. Thor S, Andersson SGE, Tomlinson A, Thomas JB. A LIM-homodomain combinatorial code for motorneuronpathway selection. //Nature. 1999. V. 397(6714). P.76-80.
124. Thor S, Thomas JB. The Drosophila islet gene governs axon pathfinding and neurotransmitter identity. //Neuron. 1997.V. 18(3). P. 397-409.
125. Thor S, Thomas JB. Motor neuron specification in worms, flies and mice: conserved and 'lost' mechanisms. \\ Curr. Opin. Genet. Dev. 2002. V. 12(5). P. 558-64.
126. Tolias PP, Stroumbakis ND. The Drosophila zygotic lethal gene shuttle craft is required maternally for proper embryonic development. // Dev. Genes Evol. 1998. V.208. P. 274-82.
127. Torigoi E, Bennani-Baiti IM, Rosen C, Gonzalez K, Morcillo P, Ptashne M, Dorsett D. Chip interacts with diverse homeodomain proteins and potentiates Bicoid activity in vivo. // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 2000. V. 97(6). P. 2686-91.
128. Torres-Aleman I. Toward a comprehensive neurobiology of IGF-I. // Dev. Neurobiol. 2010. V. 70(5). P. 384-396.
129. Vieira C, Pasyukova EG, Zeng ZB. Hackett JB, Lyman RF, Mackay TFC. Genotype-environment interaction for quantitative trait loci affecting life span in Drosophila melanogaster.U Genetics. 2000. V. 154(1). P. 213-27.
130. Villares R, Cabrera CV. The achaete-scute gene complex of D. melanogaster: conserved domains in a subset of genes required for neurogenesis and their homology to myc. I I Cell. 1987. V. 50(3). P.415-24.
131. Voutev R, Keating R, Hubbard EJ, Vallier LG. Characterization of the Caenorhabditis elegans Islet LIM-homeodomain ortholog, lim-7. // FEBS Lett. 2009. V. 583(2). P. 456-64.
132. Wang MC, Bohmann D, Jasper H. JNK extends life span and limits growth by antagonizing cellular and organism-wide responses to insulin signaling. // Cell. 2005. V. 121(1). P. 115-125.
133. Wang MC, Bohmann D, Jasper H. JNK signaling confers tolerance to oxidative stress and extends lifespan in Drosophila. //Develop. Cell. 2003. V. 5(5). P. 811-16.
134. Wang HD, Kazemi-Esfarjani P, Benzer S. Multiple-stress analysis for isolation of Drosophila longevity genes. // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2004. V. 101(34). P. 12610-15.
135. Watterson GA. On the number of segregating sites in genetical models without recombination. // Theor. PopuL Biol. 1975. V. 7(2). P. 256-76.
136. Way JC, Chalfie M. Mec-3, a homeobox containing gene that specifies differentiation of the touch receptor neurons in C. elegans. // Cell. 1988. V. 54(1). P. 5-16.
137. Whiteley M, Noguchi PD, Sensabaugh SM, Odenwald WF, Kassis JA. The Drosophila gene escargot encodes a zinc finger motif found in snail-related genes. // Mech. Dev. 1992. V. 36(3). P. 117127.
138. Willy PJ, Kobayashi R, Kadonaga JT. A basal transcription factor that activates or represses transcription. // Science. 2000. V. 290(5493). P. 982-5.
139. Wodarz A, Ramrath A, Grimm A, Knust E. Drosophila atypical protein kinase C associates with Bazooka and controls polarity of epithelia and neuroblasts. // J. Cell Biol. 2000. V. 150(6). P. 1361-74.
140. Wu PS, Egger B, Brand, AH. Asymmetric stem cell division: lessons from Drosophila. // Semin. Cell
141. Dev. Biol. 2008. 19(3). P.283-293. Wullschleger S, Loewith R, Hall MN. TOR Signaling in Growth and Metabolism. // Cell. 2006. V. 124(3). P. 471-84.
142. Yaden BC, Garcia M 3rd, Smith TP, Rhodes SJ. Two promoters mediate transcription from the human LHX3 gene: involvement of nuclear factor I and specificity protein 1. // Endocrinol. 2006. V. 147(1). P. 324-37.
143. Natl Acad. Sci. USA. 2005. V. 102(31). P. 10958-63. Yuan JS, Reed A, Chen F, Stewart CN Jr. Statistical analysis of real-time PCR data. // BMC
144. Bioinformatics. 2006. V. 7. P. 85-97. Yue Q, Groszer M, Gil JS, Berk AJ, Messing A, Wu H, Liu X. PTEN deletion in Bergmann glia leads to premature differentiation and affects laminar organization. // Development. 2005. V. 132(14). P.3281-91.
145. Zhou T. Chiang C.-M. The intronless and TATAless human TAFII55 gene contains a functionalinitiator and a downstream promoter element. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276(27). P. 25503-11.
-
Рыбина, Ольга Юрьевна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2010
-
ВАК 03.02.07
- Изучение генетической гетерогенности высокоинбредных линий Drosophila melanogaster
- Эндосимбионт Wolbachia в природных популяциях Drosophila melanogaster Северной Евразии
- Радиационно-индуцированное изменение продолжительности жизни Drosophila melanogaster
- Особенности поведения Drosophila melanogaster при различной структуре гена limk 1
- Характеристика белков центральной нервной системы в линиях Drosophila melanogaster, селектированных на изменение уровня двигательной активности
