Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Принципы иммунодиагностики лептоспироза и разработка иммунодиагностических и иммунотерапевтического препаратов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Принципы иммунодиагностики лептоспироза и разработка иммунодиагностических и иммунотерапевтического препаратов"

М1Н1СТЕРСГВ0 ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРА1НИ

КП'ВСЬКИЙ НАУКОВО-ДОСЛIДНИЙ 1НСТИТУТ ЕП1ДЕШОЛОГП ТА 1НФЕКЦ1ЙШХ ХВОРОБ 1м. акад. Л.В.Громашевськсго

На правах рукопису МЕЛЬНИЦЬКА Олена Васил1вна

УДК 616.98:679.834.115.616-036-227-07-08-084

ПРИНЦИПИ 1МУН0Д1АГНОСТИКИ ЛЕПТ0СП1Р03У ТА Р03Р0БКА

1МУНОД1АГНОСТИЧШХ ТА 1МУНОТЕРАПЕВТИЧНОГО ПРЕПАРАПВ.

03.00.07. - м!кроб1олог1я

Автореферат дисертацН на здобуття вченого ступени доктора медичних наук

Ки1в - 1995 р.

Робота виконана в науково-досл1дному 1нститут1 еп!дем1ологП та 1,нфекц1йних хвороб 1м. ■ академ1ка Л.В.Громашевського

Науковий консультант доктор медичних наук,професор

БЕРНАСОВСЬКА Елiзавета Петр1вна

0ф1ц1йн1 опонент!:

доктор медичних наук,професор PESHIK Семен Рафа1лович доктор медичних наук,професор СИТН1К 1ван Олександрович засл.д1яч наук,чл.-кор. АМН УкраЗни,доктор медичних наук, професор ЧЕРНУШЕНКО 'Катерина Федор1вна.

Пров1дна установа : Ки1вськ1й институт удосконалення Л1кар1в

Захист в1д0удеться jc£>ts&< KJL. ^,995 в ^^ °годин

на зас1данн1 специал1зовано1 Ради Д.088.04.01 в науково-досадному iHCTiTyTi еп1дем1ологП та 1нфекц1йних хвороб iM. Л. В. Громашевськог* за'адресом : 252038, Ки1в, ysBis Нротас1в Яр,4

3 дисертавдею можна ознайомитись в б1бл!отец1 КНД1 EIX 1м.Л.В.Громашевського

Автореферат роз1сланий " ^ " березня 1995 р.

Вчений секретар спец1ал1зовано'1 Ради, кандидат медичних наук

Л.С.Красюк

ЗАГЛЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальшсть проблема.Проблема лептооарозу наОузае вел Шшого значения.За даними Всесв1тньо1 сргаШзацП охрони здо-ов'я ця 1нфекц1я наложить до 5 &оонов1в»як1 завдагать величеяну коду людству.Ца природно-вогнивда шфегада мае• глобально розпов-ядження.В европейському perioHi лептплп»syrrpI^i'mM мам»«

В Укра'1'Hi лелтосгпроз с найбз.льш значною зоонозною 1нфекц1-о. На наши краиш широко розпоЕсюдженш природк! та антропурПч-i вогниша лептосгирозу, що являють пост!йну небевпеку для зара-эння людей.Захворювая1сть лептосшрозом на УкраШ за останна port мае неухильну тенденЩю до зростання.в 1994 poul вона складача ,26 на 100 тис. населения .Летальность залишаетъея високо.о , в 394 р.вока перевищувала 10 X.

Незватаючи на численн! досл1дження,як1 присвячен1 лептосп!-эзу в багатьох красках св1ту,ряд науксвих та при,задних аопектт ie'i проблеми яалилаються маловиеченими.Немае достатньо повни.ч ai-змостей про антигенн1 властпвосп лептосчпр,одним з найваадивших стань е удосконалення 1снуючих та розробка нових,особливо приско-;них методов Д1агноотики хрсробн.

Лабораторна дгагностика лептосгпрозу в сучасиий перюд вдхйс-эеться лише в спещаялзованих лабораториях в1ддШв особливо не-гзпечних 1нфекц1й MlcbKix та обласних СЕС,з чим в певн!й Mlpi га'язача тзня д1агностика хвороби i те,¡но значиа частина захво-юань валииаеться взагал! нерозшифрованою.

В ocTaiiHi десятир!ччя в багатьох крашах св1ту проводиться iTtsHCHBHi досл1дження по розробЩ метод1в д1агностики лептосШро-'.спрямован! на виявлення антилептосгпрознкх антит1л,але особливо

дерспективний напрямок д1агностики лептосп!роэу - роэробка метод!в !ндикацП специМчних антиген!!« чи ДНК.Це так! методи.як !мунсфер-ментний анал!з,рад!о!мунолог1чн! методи.реакцП феномену непрямо! гемаглютинадп,!муноблот!нг^ланц|огова пол!меразна реакц!я та íhdií (Е.П.Вернасовська та соавт.., 1983;Назарова О.Г. та соавт. Д983;Во-лика Е.Г. та соавт.,1988;В Adler et al.,1983;W.Terpstra,1983; A.Chapman et al.,1987;N. Palmer et al.,1990;D.Trap et al.,1990 та íhuií) .Перевагою таких метод!в e мсжлив1сть "ix використання в;ке з перших дн1в хвороби.швидке одержання результата,можлив!сть вияв-лення мертвкх та зруйнованих кл:тин бактер!й- в умовах антиб1отико-repani "i.

. Однак, paHiüie розроблен1 д1агностичн1 методи потребую«. ni,n-вищення 1ндчкаторних мождивостей i широкого клШчного випробуван-ня.Особливе значения мають розробка та виготовлення комерц!йних препарат!з i тест-систем для "ix влровадцення в практику.Не розроб-лене питания про дощльн1сть широкого використання ,експрес-метод1в для епхдрозв^дки вогнищ дептосп1розу,еп1днагляду за виявленими всгнищами в динам1ц!,вир1шення питания про шляхи !х оздоровления.

Як за кордоном,так i в наайй краЗн! в-зв'язку з важким кл1-начним переб!гсм лептосп1розу, виконуються досапдження по розробц! метод1в !нтенсивно! Tepani'i uieí iH$esatf'i, особливо патогенетично! (В.М.Плетнев та соавт.,1982;Д.Ф.Кривулис та соавт.,1982;А.П.Чепкий та соавт.,1982 та !нш1 ).

Значно менша увага прид!лаеться розробц! ет1олог1чно1 Tepani'i. В колшньому.- СРСР, як в1домо,для л1кування лелтосп!рову використо-вували волов'ячий лептосгПрозний гама-глобул1н,який в!докий ежа майже 30 pokíb (А.А.Варфоломеева та соавт.,1958,1976,1980;П.м.Ва-рьипев та соавт. 1964,1976,1980,1983; та iffiní).

На:цей час при одержали! волов'ячого гама-глобул1ну не лрово-

(иться кой'троль на присутШсть .р-глобул1ну, та вмЮт макроглоСул!-[1в в 2 рази перевишуе ганцентрац!ю м1кроглобул!1йв, препарат не-:тапдартизований за концентращею специфгчних антит1л.Кр1м то-•о,лептосп1ровний 1муногло6ул!н мае обмеження 1 у вжовому аспект! вводиться т3.льки з 8-рачного в1ку).

Таким чином.створення препарата . для 1нунотеоппП .аокр^-и, рпяппли;?. а»огвннг>го длгт ждала 1ыуяиЛрепсраху мой дули ьилика тачення .В план1 одержання останнього доц1льн! два шляхи : 1му1ц-1ащя донор1в та сканування сироЕаток одноразових донор!в з вогиищ [ептоспгрозу.З еконокично! то^ки зору другий шлях б!льш ефектив-¡ий.До цього часу в!дсутн!сть стандартного д!агиостичного препара-■у гальмувала широке досд!дження кровх донор!в на присутшсть сгю-;иф1чних антилептосп1розних антител.Тому перед нами поотало зав-;ання розробки лептоспзрозного антигенного пол1валентного еритро-¡итарного д1агнсстикуму,к.отрий м!г бути використаний не тгльки для дагностики,але й дозволяв зд1йснювати масов1 дослгдження донор1в метою виявлення в сироватках кров1 антилептосп1розних антитич.що кладаються з 1еМта 1 характеризуются родовою та серогрупо-ою специфачнхстю.Де вхдкривае перспективу одержання алогенних мунотерапевтичних препарзт!в.

Мета роботи.Розробка принцип1в ет1олог1чно1 д1агностики яеп-осп1розу та конструювання ефективних 1мунод1агностичних препара-1в,а також створення аяогекного 1мунотерапевтичного препарату.

Завдання роботи.

1. Вивчити бЮх1м1чну, природу 1 спектр серологгчно! специф!ч-ост1 комплексних антигенних препарат1в лептостр.

2.Розробити лептосп!розний полгвалентний антигенний еритроци-арний д!агностикум ! непрямий !муноферментчий тест для виявлення нтилептосШрозних антит!л на основ! комплексних антиген 1В.

З.Розробити !мунолог!чн1 методи для виявлення антиген!в лептосп!] 1 провести поргвняльне вивчення '¡х чутливост! 1 специф1чност!. .

4.0ц1нити ефекгивн1сгь розроблених метод!в в клоачному дос- . л1д! 1 широких польових обсте.ценнях.

б.Сформулювати основн1 принципи !мунод1агностики лептосп!розу.

б.Розробити алогенний препарат для 1мунотерап11 лептосиро-зу,оц1нити в експеримент1 його ефективнгсть.

Наукова новизна.,

Одержан! ноти в1допоет: про зв'язок серолоочно! специф1чнос-т! а 01ох1ьичною природою антигенов лептоспЗр в комплексних анти-генних препаратах,одёржаних за допомогою ультразвуку та додецил-сульфату натрию.

Вперше .Естановлена кореляЩйна залежн!сть антигенной актив-ност! св!жовид!лених штаи!в леятосп!р з 5х в!рулентн1стю.

Вперше гд!йснений комплексний п!дх1д до конструювапня анти-генних д!агностичних перпарат!в 1 тест-систем на основ! не тлльки родового,але й широкого спектру серогрупових антиген!в лептос-п1р,що дозволяе одержати найб1льш актявн! 1 слециф1чн! препарати.

Розроблений ориг1нальний препарат - лептосШрозний антигенний пол1валентний еритроцитарний д1агностикум (ПЕД) ,що дозволяе вияв-ляти антилептосп1розн1 антит!ла на 3-4 дн1 ранше,н!ж традиц!йний тест- - реакц1я м1кроаглютина1Ш - 1 скорочуе час обстеження в 6 раа!в,що дозволяе проводити масов1 обстеження.

' Вперше для еп1дрозв1дки вогнкщ лептосп1розу застосован! роз-роблен1 ПЕД та непряма 1муноферментна реакц!я в.комплекс! з екс-прес-методами,як1 виявляють: опециф!чн1 антигени лептосп1р,ш.о дозволило одержати нов! дан! про просторове розповсюдження цих вогнищ на УкраШ.

. Вперше розроблена алогенна плазма для !мунотерап!'1 лептосп1-

юзу у людей та одержане експериментальне гпдтвердження м ефект-.яост!.

Практичне значения.

На основ! проведенних досл1джень розроблекз антигенн1 прегта-ати 1 тест-системи,що дозволяють виконувати ефективну д1агностику ептострозу.Щ препарата використовуються в щодэщий робот 1 леп--СЛ1Р>С»««и1о шнтр« ко»! ¡г.! *.1 •ТРор0!"'. 1. ?37Е0РД2".С 115'»1ЬНи-'1ч»х-ачна документащя на "Д1агностикум лептосп1розний еритроцитарний ятигенний ргдкий" (позитивне' р!шення Фармакологгчного комитету кратки В1Д 24.06.1994 р.).Розроблена нормативно-техн1чна докумен-авдя на "Плазму людську лептост розну суху" (подана до Фармаколо-1чного ком!тету Укра1ни ) .Надруковшп методичн1 рекомендац1 'I. по кспрес-д!агностиц1 в1русних та бактер1алмгах 1нфекц1й МОЗ Украпм 1989 р.),де в1дтворен1 модиф!кован1 методики використання _:муно-ерментного анализу для д!агностики лептоапрозу.Одержан! резуль-ати знайшли воображения в 1нформац1 иному лист1 "Особенности гу-оральиого иммунного ответа и критерии оценки реакции мнкроагглюти-ации у больных ле.птоспирозом" (1987 р.).Одержане авторське свг-оцтво на винах1д N '1792709 ,1992 р. "Способ отбора сырья для поучения антилептоспирозной плазмы".3 метою удосконалення метод1 в 1агностики лептосшрозу затверджено 7 рац]онал1заторських пропо-шцй.Розроблений ПЕД впроваджений в 20 областях Укра1ни.

Основн! положения,що виносяться на захист.

1. Комплексний п!дх!д до конструювання аятигешшх препаратов

ля д1агностики лептосп1розу з включениям до ¡х складу найб!льш поено-о набору як родоспециф1ч1гах,так 1 серогрупоспепиф1чних компонен-1в дозволив одержати препарати високо'1 активност! та специфШнос-1,що вабезпечують найб!льш ефективну д!агностику захворювання.

2.Розроблен1 лептосп1розн1 антигеаний пол1валентний еритроци-

- б -

тарний д!агностикум та непряма 1муноферментна реакгЦя.що дозеоля-

ють визначати антилептосп1розн1 антит!ла на 3-4 дн! ран1ше,н!ж за-

гальноприйнятна реакЩя м1кроаглютинацН (РМА);чутлив!сть розроб-

ленкх тест1в виде РМА в 3,9-24,1 рази.

З.Розроблений комплекс метод1в,спрямованих на визначення спе-

цифгчних антигек!в мептосгИр (РИГА в антитхльними д!агностикумами

а також вар!анти 1.муноферментного анал1зу),як! дозволявть виявляти

ч

антигеки леп'1'осл1р в концектрацП 10 клИин в 1 мл 1' алробован! в доел iдач на тваринах.

4.3асюсован1 комплексна мет од и для визначення антигаив леп-тосп1р та антилептооИрозних актит1л,що дозволяв вииконувати масо-в1_обстежекня хворих людей та тварин в природних 1 антропурПчшк вогнадах.Це б!льш е^ективно,н1ж застосування традицгйних метод!в.

5.Сформульован1 OCHOBHÎ принципи 1мунод1агностики лептосшро-зу : a)ouiльне коректне використання методов виявлення антилептос-п1розних антит!л i антиген1в у в1дпов!дност1 з розробленою схемою; б)використання антигенних препарат!в i тест-систем для виявлення антит!л,вигоговлених на ochobî комллексних антигешв б1лково-пол1-сахаридно'! природи,як1 характеризуются високою д1агностичною ефективн!стю sa рахунок присутност1 в ïx склад1 родо- та серогру-поспециф!чних антиген1в;. в) використання в 1мунод1агностиц1 perio-нальних штам!в .антигенна активн!сть яких в 2-6 раз1в перевищус: еталонн1.

на основ!

6.Розроблений новий препарат для амунотэраиП лептосШрозу у людей - алогенна лептосп!розна плазма. Одержан! позит1вн1 результата И терапевтичного ефекту ■ в експеримент!.

Апробац1я роботи. . • Материи дисертацП допов1дались на Всесоюзнш конфзренцП

Эпизоотология,эпидемиология,средства диагностики,терапиии,следи-ической профилактики инфекционных болезней,общих, для человека л ивотных" (Льр1в,1988);конференц!1 по в!русслогП та 1нфектологП Львгв, 1989)¡VII м1кроб1олоПчному з'1"зд! (Черн 1 ¿ад, 1963);конфе-енцН по д1агностиц1 !нфекц!йних хвороб 1з эастосув&нням метод 1 и муноферментного анал1зу (Алушта,1990);VI!I (3) г/гздх УМТ (Оде-а, 1993) ;також на наукових 1 науково-практии««у •*г:^-Ич,ш11><* НЛ1Е1Х .

ПублгкацН.

По темх дисертацП надрукован! 21 роботи 1 4 методичнЗ мате-аали.одержане одне авторське св!доцтво,подан1 2 зэяеки на одер-;ання патенту Укра'1ни. 1х перел!к наведений в к!нщ автореферату.

Структура 1 об'ем дисертацП.

Дисерташя складаеться з вступу,2 глав огляду Л1трратури,5 •лав власних досл!джень,загального обговореннн 1 висновклв робота. Пбл1ограф1я складае 256 найменуваиь .Робота викладена на 237 стоянках ррукованого тексту та а.люстрована 45 таблицами, 12 малюнками . 27 фотограф!ями.

Головн1 результата,що приведен! в-дисертацП .одержан 1 особнего автором.Досл1дження за окремими розд!ллми роботи виконувалися в комплекс! в старшим науковим сп!вроб!тникш лабораторН патоморфо-гогП КНД1Е1Х,канд. мед. наук Ю.М.Ан!с!мовою,з старшим науковим :п!вроб!тником лабораторП м!кроб!ологп того ж институту,канд.бшл чаук. Д.е.Диковинною,з пров1дним науковим сп!вроб!тником лаборато-311 м!кробшлогП КНД1 гематологи та переливания кро-В1 ,докт.мед.наук Л.В.Назарчук.

- в -

3MICT ДИСЕРТАЦ11.

В С Т У П

У вступ! обгрунтована актуальшсть розробки прияципово нових п1дход!в в 1мунод1агностицг лептострову i розробки нових iMyHon-penapaiiB для д1агностики i терал.Н ц!е! !нфекцН ,в!дображена нау-1сова новизна та практичне значения одержаних результат!в.

Глава I.СУЧАСНI УЯЕШЕННЯ ПРО АНТИГЕННУ СТРУКТУРУ ШГГОСШР.

Наведен! загальн1 видошст! про антигени лептосп!р,!х 6ioxi-м!чну природу,серологi4Hy слециФ!чн!сть,локал1зацхю в кл!тин1.Показана складн!сть антигенно! структури цих м!кроорганi3Miв.Критично розглянутий !снуючий стан анань про характеристику антиген1в лептосШр.

Глава ! Г. 1МУН0Л0Г1ЧШ I ШЛЕКУЛЯРНО-Б1ОЛОГIЧНI МЕТОДИ Д1АГ-НОСТИКИ ЛЕПТ0СП1Р03У.

Викладений критичний анал!з м!кроб1олог!чних метод!в д!агнос-тики лептоопрозу,наведен! основн! в!домост! про розробку !муноло-. г!чних метод! в, спрямованих на виявлёння антилептосп!розних антит!л та лептосшрозних антиген!в,а також молекулярно-б!олог!чн!х методов 1ндикац11. лептосп1р.Визначена . 1х чутливЮть i специф!ч~ н!сть.В1д8чачеко,ш,о ц! методи в практичних лаборатор!ях не вико-ристовуються.

Глава' III.MATEPIАЛИ .I МЕТОДИ Д0СЛ1ДЖЕНБ.

Для вир!шення основних завдань роботи були використан! pisni методи : м!кроб1олог!чн!,б!ох!м1чн!,!му нолог1чнi,1мунохi м!чн!,г!с-толог!чн! та статистичнь •

При проведенн! досл!дженъ використан! 37 штам!в культур леп-тосп!р,що належать до 14 серогруп.З них 36 - патогенних 11- сап-роф!тний.Еталоннi штами лептосп!р одержували з НД1 еп!дем!олог1! .

'a MiKpo6icuiori'i iM. М.Ф.Гамале'1 (м.Москва). Для вид!ленни культур 1ептосп1р,эбереження музейних штам1в та накопичення бЮмаси корис-?увалися р1дким поживним фосфатно-сироваточним середовищем з вм!с-юм 5-10 7. CBixo'i сироватки кроля.Культивування лелтосп1р на сере-(овищах проводили при температур! 28вС на протяз1 4-9 дЮ.При ви-юнанШ експериментально! роботи викоркстано СЛля 1500 л р1дко!

Г/ЛЬX>'Ji'ciIiООП lt>.

В npoueci роботи приготован! б!ля 150 препарат1в антиге-(1в,б1ля 200 cepiii еритроцитарних д1агностикум1в.3д1йснено б1ля ^50 реакщй хмунодифузП та 1муноелектроферезу.Досл!джено близью Ю00 зразк!в сироваток кров! людей ,б!льше 3000 зразк!в сироваток !,варин,б1ля 600 гомогенат1в нирок,печ1нки,легень диких гризун!в та гкспериментальних тварин.

Для вшцлення родоспециф1чного антигену лептосшр використо-зували метод формам!дно? екстракцп за Фулером в модифхкацп ^.П.Бернасовсько'1 (1972) (умовно-Фулеровський антиген),а також зприятливкмя методами : д1ею розчину додецилсульфату натрш по методу N.C.Fathalla i I.D.Coghlan (1980) (SDH-препарат«) ; д1ею ультразвуку на 6актер1альну масу (УЗ-препарати) . За результатами се-золог!чно1 активност! ! х1м!чного складу оптимальней режим сбробгаг ш anapaTi УЗДН-1 становив 2,5-3 хв. при частот! 44 кГц та потуж-rocTi на виход1 200 в. «

В препаратах.одержаних р!зними способами,визначали вм!ст 01л-<iB за Lowry et al.(1959),вугдеводн1в за Hamilton et al. (1958),нукле!нових кислот (НК) за П.С.CnipiHHM (1958);2-ке-го-3-дезокс1октанату (КДО) за Warren (1950).

Розд1лення антигенних препаратгв на фракцП зд1йснювали .за депомогою сефадексу G-200.1муноелектрофоретичний анал1з (Р1ЕФ) 1ровадили за методом Грабар П. (1966),реакц!ю 1мунодифуз11 (Р1Д)

- 10 -

виконувапи sa Ouchterlony (1965).

rinepiMVHHi ceporpynoBi сироватки - 48 еер!й-' одержували 5-

кратнас внутршньовенною 1мун1зац1ею крол1в живою 7-9 добовою

8 »

культурою лептостр,що мЮт.ила 10 -2 х 10 кл!тин /мл в об емах ■0,1;0,5;1,0;2.С; 4,0-5,0 .мл.Титр аглютин1н1в,який визначали .в ИЛА,не мав бути нтчт.тх 1:40 ООО.

JleiiTOcniposHy родоспециф1чну сироватку одержували за розроб-леною нами методикою.Титр родоспециф1чних антит!л визначали в РИГА s лептосп!розним родоспецифгчним еритроцитарним д!агностикумом (ЛРЕД).Всього таким чином були сдержан! 37 сер!й сироваток.

Класи антит!л визначали за' О.В.Чернохвостовою (1965).

В робот!,okpím Р1Л та Р1ЕФ, для виявленяя антит!л застосову-вали таю 1мунолог!чн1 тести,як реакд1я мхкроаглютинац!! з живими культурами лептосгпр (РМА).реаквдя зв'язувазгая комплементу (РЗК) ,реакц1я непрямо! гемаглютинацП (РИГА) та непряму !мунофер-ментну реакцш (Н1ФР).Для 1дентиф1кац!! аитиген!в .використовувапи. реакщю гьльмування непрямо! гемаглйтинацП (РГНГА),реакц!я галь-мування непрямого гемол!зу (РГНГем),реакц!ю коаглютинап!ï (РКА) [Костюкова H.H., 19813', реакщю агрегат-гемаглютинад1'1 (РАГА) ЕГо-piHa Л.Г.,197Б!,також були эастосозач! методи 1мукоферментього анализу: непрямий, прямий (П1ФР) та "сендв1ч"-вар1анти на полгсти-ролових планшетах та н!троцелюлозних ф!льтрах.Для !мукофер'ментного aHanisy використовувапи пероксидазн! кон'югати виробництва НД1 еи1дем1олог1'1 .MiKpoGîoMorlï !м.Н.Ф.Гамале! (Москва) та власного виготовлення за методикою P.K.Nakane (1974)..

Експериментальну лептосп!розну хнфекщю в!дтворювали на 155 морських свинках ! 96 золот1стих ховрашках внутр!шньочеревнйм введениям штамами лептосп1р (музейними та св!жовид!ленними).

Шд час патоморфолог!чних дослйджень MäTepian обробляли за

загадь ноприйнятими методиками .Зр1ги фарбували гематокси.пном, sosiHDM та за.Враше (МАГ).Спецкф1чн1стъ антигенних препаратов вии-1али при досл!дкенн1 б!ля 1300 хворих на лептосшроз людей. Саля 3000 хворих 1яшими захворгаваннями та б1ля 5000 практично здоровых подей-донорХв. KpiM того.були досл1д*«>и1 147 собак та спльше ГЛОО 1р1бних гризун1в.

Bei результати nor.ni w™ бул.. uiüäi&i от?™!"?т:пп1Л миибт я ьикоримтарнп?.? uozzz.iu в^нйщйно! статистики (Ашмар1н 1.П. .Воробйов ,19б2;Сайдулд1н Т., 1980) i кр!гер1я Ст'юдента.

Глава IV.АНТИГЕННА ТА СЕРОЛОГ1ЧНА АКТИВНГСТЬ АНТИГЕННИХ

ПРЕПАРАТ!В ЛЕПТОСПIР,ОДЕРКАНИХ Р13НКМИ МЕТОДАМИ.

3 метою досягнення максимального облжу специфичного антилеп-госгпрозкого imyhitety одним в поотавлених вавдань ми вватали ви-илення антигенних npenapaTiB,то м!стять комплексуй актигени,як1 идпов1ДсЖ)ть як за родову.так 1 за серогрупову специф1Чхисть.Для ;ъого були використан1 м'як1 засоби обробки дептоаар,наведен! ви-ie. Визчення цих антигенних препарат!в ' вкконували в пор!вняшп .г юдоспециф1чним антигенном препаратом.

Були використащ лептосп!розн1 культури.що в1др!знялися за герогруповими антигенами та к!лькЛсним hmictom родоспеш:ф!чнсго штигену.Антигенн: препарата, !зольован1 р1зними за ступеней се-¡eKTHBHocTi методами,закономерно в1др1знялисл за основними показ-шками xiMi4Horo складу (таблиця 1).

Вих1д антигенних npenapaTiB при рхзних методах одержання шачно Е1др1знявся.Максимальний вих1д спостерхгався Шел я ультраз-syKOBO'i обробки культур лептоспхр i досягав 63-75% по в1дношешш io сухо! маси 0актер1й.Вих!д антигенних npenapaTiB,одержаних об-гобкою лептосп!р розчином SDSN'a,склад.нв 21-30%,найменший вих!д~ан-

тиген!в спостер!гався при формам1Дн1й екстракц!1 - 6,6-8,2%.За х1-м1чним складом УЗ- та Б05-антигенк1 препарата були б!дково-пол1са-харидними та мало в!др1знялися одинв!д одного.1ндекс в!дношення б!лку до вуглевод!в (1 б/в) УЗ- 1 ЗП5-анткгенню< препарат1в скла-дав В1ДП0В1ДН0 2,1-3,28 та 2,72-3,44.Формам1дний антиген (Ф-АГ) мхстив найб1льшу к!льк1сть пол!оахарид!в 30,6-32,?%.1 идеке в!дно-шення 01лку до вуглевод!в складав 0,12-0,23.Тобто,вм1ст б1лку у формам!дному антиген! Оув в 6,08-7,60. раз нижчий,н!ж в УЗ- та БОБ-препаратах,а вм1ст'пол1сахарид1в вище в 2,9-3,6 рази.

Таблиця 1.

ХНичний склад антигенних препарат!в,вид1лених р1зними

методами з культур лептосп1р. ------1----------------^------------------------------------------^

Тип +■ Штам + % по в!дношенню до сухо! б1омаси

препа-+ лептосп!р ^-------т------т--------т-----т-----т------

рату + + Вих1д + Б1лок+Пол1сах.+ Н К + КДО +1 б/в

УЗ М-20 63,0 38,2 12,6 7.10 0.03 .3,00

ЗОБ М-20 29,0 ' 35,0 10.7 6.80 0,02 3,27

УЗ 542 71.0 42,0 14.1 . 6,87 0,01 2,98

542 26,0 41.0 12,1 4,94 0,01 3,20

УЗ Нопс1-и1гесЬ1 75.0 41,0 12,5 7,63 О', 01 3,28

. ■ Нопё-ШгесЫ аз. о 38,5 11,2 6,54 0,02 3,44

УЗ Моэкуа-У 68,0 38,8 14,5 7,80 0,01 2,08

ЗОБ МоБкуа-У ■21,0 36,4 13,4 7,23 0,01 2.72

УЗ Ак1о'ат А . 73,0 39,8 15,0 8,38 0,02 2,68

Ак1зат А 30,0 38,4 13,8 6,67 0,02 2,72

Ф-АГ М-20 6,6 6,9 30,6 1,80 0,006 0,23

Ф-АГ Ак^ат! А 8,2 4,6 38,7 2,90 0,005 0,12

Присутн!сть в УЗ- та ЗПЗ-препаратах значно!: юлъкост: нукле!-нових кислот св1дчила,з одного боку,про натившсть компонент!в,як! входили до IX складу,а з другого - про певну дез1нтеграц1ю шптин лептосп!р навгть при м'якому режим1 обробки.

На основ! 1мунох1(.ачного анализу та серолог1чних досл1джень специф1чност1 препарат1в в реакцП прецип!тац!!,Р1Д,Р1ЕФ та РИГА з

pÜMOCnüUi:Ítl4Hü!0 та С<?иОГОУПОГ:Г1РЦИф!иыиим

¡до в препаратах,вид!лених за допомогою SDS та ультразвуку,м!стять-ся як родоспецщйчнкй.так i серогрупоспецифхчн! компонентов най-менш!й Mipi emíct родоспециф1чного компоненту спостер1гався в SDS - i' УЗ-препаратах .ввдцлених з штама Moskva- -V серогрупи Grippotyphosa.

ГелыМльтращя УЗ- та 3DS-препаратов на сефадекс! G-í'OO дозволила одеряати з цих яоекарат!в 2 фрзкцИ з pi зною молекулярной масога : в/.сокомолекулярну Фракц1:о I ( M-1J0±5 kD ) та низькомоле-кулярну фракцш ¡I ( Ы < 40 kD ).Результата визначення х!м!чиогс складу та серолог!чно1 а^тивност! Фракц1й в РИГА та РЗК показали',що вс i ,Д муке лог i чн' awTKBHí компонент'.; вих!дного пропарату кои-центрувалися- в 4-5 pasts У фракцЛ I УЗ та ЗСЗ-антигваХв

Одержан! si лги/пет! подтверди,™ прилущенля про ™",1дну рось високшолекуляриих компо.ч«?ат!ь в антигска1й i серолог!'-:;;!;"! актев-нос-Ti антигенних комплёкс1в лептосп1р i показали,цо гелъф!лътрац!я' може бути ефективним гасобом очистки та концентрувэкня УЗ- та SDS-антигенних препарат:в.

Сдuie:o з Бахакькх характеристик еидх-тажх з дептоси1р ярева-paTiB в IX геу.ссенсктиька актившсть.осюльки з Щсю Е^астив1стю гэе'звана лерсп.екх;:ва кснструйваяня ьисокочутливих д1агностакум1в. При ;<до»эпк1 гемосенситквно! активное?! зитигенньл препарат!в,цо . 3 • ;<згоко:.р1 дпраиьовувалп ¿i napawcr;-«:! peacrov

сенсибШзацП еритрэцитхв барака (час,значения рН,температура на етапах виготовлення д1агкостикума,до8и сенситинхв.методи обробют еритрощт1в).ГемосенсибШзуюча активн1сть Ф-АГ-препарат1в значно поступалася активност! хкщих препаратíb.Оптимальна сенсиб!л!зуюча доза складала 221,Q t 60,8 мкг/мл,що значно перевишуе П для УЗ-та SOS-антиген i в. При сенсибЬтхзацП' еритроцит1в формамхдним антигеном TaHísaniH не зм1нювала активност! одержаних ' д1агностику- . м1в,тобто,цей препарат поводив себе в РИГА як пол!сахарид.

УЗ- та SDS-антигени мали високу гемооенситизну активн!сть за рахунок cop6n.i'i ÍX б!лкових компонент1в.Це було доведеие тим.шр при тан!зацП еритроцитхв ргзко зменшувалася сенсибШзуюча доза (22,6 ± 5,5 v.kt/мл проти 250-600 мкг/мл) i значно пхдвищувалась активиста д1агНостикум1в (1:25600 - 1:204800" проти ' 1:100 - 1:800). Гемосенситивна активн!сть УЗ-д!агностикум1в наведена в таблиц! 2.

В результат! порхвняльного ви.вчення серолог]чних властивостей трьох Tknls aHTireiúB виявлена залежнЮТь ix активност! та спеди-$í4hoctí в!д антигенного спектру препарат i в. Показана найб!льша ак-THBHicTb комплексних пренарат!в,одержаних методами ультразвуковой екстракцх! та обробга SDSN'a,¡ao мгстять як родо- ,так i серогрупос-neiw<í>i4Hi компонента.

Оск!льки SDS- антдаени 30epira¡m свою активн!сть в р1дкому станх на протяз1 короткого перходу (1 м1сяць) i вих!д 'ix був значно нижчий.нхж У3-антиген1в (ш збер1галися на npoTHsi Í року),вс1 подальш1 досл!дження по конструювакню високоактивних лептосп!роз-них дхагностикум!в провадилися на УЗ-антигенних препаратах.

Одним з найб1льш надШих засоб1в визначення антигенного складу препарату е вивчення актигенно! специфхчност! i природи -л-тит1л,щр виробляються в MaKpoopraHiBMi у в!дпов1дь на иого введения.Роль . родоспецифхчного i серогрупових ' антигешв' у формуванн!

LtviyHHoï гуморачьно! вОповш оргашзму Сула вивчена на 32 крочях га 14 морскьких свинках д1сля 1-кратного введения препарату .а тагах при 5- кратнш 1мун1зац11 живими культурами та УЗ-антигена-т.Родоспециф1чн1 антит1ла з'являлися на 2-й тиждень.ранше В1Д зерогрупових (3-й тиждень). Середн! тктри серогрупоспециЦпчних ан-шты були виде р!вня родоспециф1чних (1:5120 проти 1:121 ) (р >

Î.Clî.CcHwiùVuuhl HHTHTi TMrèUùuiu iiu Iffi wini a» pc

5ослециф1чн1 антит1ла були представлен! здеб!льшого IgM.IU факти /згоджуються з в!домостями л!тератури.Рання поява родоспециф!чних антит!л та значний р1вень серогрупоспециф!чних антит1л е важливим фактором патогенезу лептосп!розно! 1нфекцП,що' дозволяе висунути положения про високу д!агноотичну значимость комплексного виявлен-ня як родо-,так 1 серогрупоспецифгчних антиачл.

Ми проводили cboï розробки на отагонних ига1,fax лептосп!р,од-нак.на приклад) \нших м!кроорган1зм:в показано,що найбгльш ефек-тивн! антигени для !мунод1агностики одержують при використачнх ре-г!ональних итатв.Здавалося важливим еивчити це питания на лептос-П1рах.Нами були -вид1леш 22 штамп лептосп!р серогрупи Icterohaemorrnagiae,'mo циркулюзали у вогнищах лептоснхрозу на Укра-ïHl, та вивчена ïx антигенна активн!сть v сп1встаяленя1 з в!ру-лентн1стю та давниною видыення.ЕЦдомзст! про в1рулентн1сть штамп-та час ыуЦлення наведен! в таблиц! 3.

Показано,що в1рулентн! штами лептостр при ïx застосуванн1 в РМА виявляли в сироватках хворих лептоапрозсм антит1ла в титрах в 3-4 рази 63лье високих,н!ж штами стандартного набору.Де м<?ншою Mi-рою було пов'язано з давн!стю вид!лення штемулпж з вхрулешшстю : так.штами 139/101 та 140/115,вид!лен1 Е 1990 poui, але при вип-робуваннях - ав1рулентн1,аглютинуваляся на piBHi эталонного шта-му.Щ результат« св1дчать про необх!дн1сть введения до д!агностич-

AKTUBHiarb V3- epfiTpoiWTapHMX

Ceporpyna LDraM Tmpu ¡MyHHux cMpoBotoK

Icterohaemorrhagäe Grippotyphosa

Wagnberg / M-20 542 Moskva-V

Icterohaemor Wajnberg 12800* 6400* 6400* 200

542 6400* 6400* 12800* 200

M-20 12800* 25600* 12800* , 200

Canicola Hond- 1600 800 800 400

Utrecht

Pomona Pomona 200 100 200 100

Grippotyphosa Moskva-V 200 200 100 6400*

Hebdomadis 3705 800 800 800 200

Autumnalis Ikijami A 100 50 50 25

Semaranga Patoc-I.' 100 100 50 50

ÜPEfl 100 50 50 50

flpUMflTKa. Tvrrp chpobatok aa a&hhmh PMA ctanobvnb 40000.

- TKrpH A'arHOCTHKyMiB 3 roM0A0riHHHMH CHpoBaTKaMH.

Таблиця 2.

д/'агносгикум/в.

до лептосп'р cspcrpyn

- Canicola Pomona Hebdonadis Autumnalis Havanica Semoranga

d Родоспец.

Hond- Pomona 3705 . Akiami A Poi Patoc-I сироватка

Utrecht *

1600 100 500 400 400. 200 102400

1600 100 25 400 200 100 25600

3200 100 25 200 200 100 25600

12800* 200 100 400 100 200 51200

400 6400* 400 800 100 200 25600

400 200 400 200 50 100 12800

200 50 6400* 400 100 50 102400

100 50 100 12800* 50 25 102400

100 200 100 2.00 50 3200* 12800

50 50 25 100 50 50 2560

ного набору культур лептоспгр для реакцП м1;фоаглютинац1! реПо-нальних штам1в лептосп1р серогрупи 1с1его!г|аетогтЬа- £1ае,ш,о мають б1льш високу активнЮтъ.

Аналог1чн1 в1домост1 були одержан! ! при вивченн! серолог!ч-но! активност! еритроцитарних д!агностикум!в,антигени для яких були одержан! !з штам1в лептосир р!зно1 варулентност!. Активн!сть д1агноотикум!в ,приготованих на основ! в!рулентного штаму.була б!льи шж в 6 раз1в вищою.шж з ав!рулент.чого.

'Таблиця 3.

В1рулентн!сть лептоетпр серогрупи ¡^егоЬаетоггЬадхае, вид1лених у вогнищах лептосп!розу на Укра!н!.

NN + Номер г Р1к + Р1к + Загибель + Ступхнь + п/п + стаму гвид!леннягвивчення + тварин л +в!рулентност!1

1 +

+

+

6

■1

1 . 149/1 1991 1991 3/3 В1рулентн1

2 75/600 ' 1988 1990 3/3

3 146/2 . 1990 1991 2/3 Середня

4 145/67 1990 1991 2/3 в!рулентн!сть

5 141/3 1990 1991 2/3

' 6 138/103 1990 1991 2/3

7 137/96 1990 1991 2/3

8 74/599 .1988 1990 2/3

9 67/406. '1988 1990 2/3

10 82/51 1938 1990 2/3

11 . 81/15 1938 1990 2/3

Продовження таблиц! 3.

1 2 3 4 5 6

г

12 147/66 1990 1991 1/3 Слабка

10 П' /лс А «ООО А ПО-( л /п ■ Ч-У-.'- --"'-и

14 77/412 1988 \ 991 1/3

15 73/598 1988 1990 1/3

16 79/13 1988 • 1990 1/3

17 139/101 1990 1991 0/3

18 140/115 1990 1901 0/3 Ав!рулентн1

19 109/20 1989 1991 0/3

20 108/19 1989 1991 0/3

21 94/263 1983 1991 0/3

22 1зма1Л-1 1980 1991 0/3.

* - чн&пвник - к!льк!сть ?ьарин,що загинули-.знаменник - к1льк1сть тварин.ввятих для дослгду.

Глава У. КОНСТРУЮВАННЯ АНТИГЕНЯИХ ПРЕПАРАТ 1В Д.'1Я СС^ОД! АГНОСТИКИ ЛЕПТ0СП1Р03У I 0Д1НКА IX ЕФЕКТИВТОСТI.

1.Розробка лептосп!розного еритроцитарного пол1валентного антигенного д!агностикуку (ЛЕД) 1 йоге апроСатця.

Питаниям ровробки технологи одержання еритроцитарпих д!аг-иостикумив (ЕД) на основ! ползсахаридзв присвячен! небагэточисель-н! роботи (Берчас-овська Е.П. за соавт. ,1973,1979;Рудь Н.Р. та соавт., 1991 та 1нш1).Нами виконана розробка пемйвалентних д!агностичних еритроцитарних препарат1в з лептоапр.заснованих на комплексних

б1лково-пол!сахаридних антигенах,що дозволяють еиявляти як серог-рупо- та родоспециф1чн1 антит!ла.

Розроблений нами м'який режим обробки лептосгпр ультразвуком дав можлив!сть одержати б1лково-пол1сахаридн1 комплекси в найменш зм1неному вигляд1,що забезпечило високу активн1сть ЕД .При конс-труюванн1 пол!валентного антигену враховували рег!ональну" частоту розпод1лу лептосп1роз1в,викликаних лептосирами pisHitx серог-руп.В зв'язку з тим.що пров!дне значения для Укра"1ни машть лептос-nipn серогруп Icterohaemorrhagia, Canicola, Grippotyphosa,Pomona, Hebdomadis для конструювання пол1валентного антигену (ПА) були вибран! штами лептосшр.названих серогруп ( М-20, Hond-Utrecht,Pomona, Moskva-V, 3706).

KpiM вибору антигену, при розробц! ЕД був вирШений ряд спещаль-них питань в!дностно величини сенсибШзуючо! дози ПА,способу пер-винно1 фжсацП еритроцит!в,спектру антигенно! специф1чност1 ПЕД, способу пол!валентно! сенсибШзацп ,його стабШзацп та 1н-ше.

Вивчення цих питань проведене 'на 41 cepi'i ПЕД i 68 сер!ях мо-яоьалентних ЕД.а в якост! сенситин!в використовували-УЗ-антиге-ни,Еид!лен1 з 9 uiTaMiB лептосп1р.Пор!вняння двох метод1в первинно! фжсацП еритроц!т1в барана по А.М.Оловнжову та по R.Weinbah показали придатн!сть 'ix обок для одержання лептосп1розних ■ ЕД тому, що . не виявлен! iCTOTHi в1дм!нност! (р > 0,5) в адсорбц1йнш здат-HocTi еритроцит!в,фжсованих цими методами.

Найб1льш картавим питаниям,майже не висв!тленим в л!терату-р!,було визначення оптимального для комплексних антиген!в методу пол!валентно! сенсибШзацп еритроципв.Нами встановлена повна перевага одночасно! сенсибШзацп над посл!довною (таблиця 4).

Результати вивчення 16 сер1й ПЕД ,приготованих на основ! по-

- 21 - . .. валентного оенситину.з антигешв 5 серогруп лептос^р.псказаяи ; здатшстъ вияаяяти високий р1вень анттчл - 1 : 6400 - 1: 12вР0, також тестувати родоспециф!чн1 антит1ла 1 : 12800 - 1 : 51200. . досуйдження доводить можливЮть формування ПЕЛ з р1зш"м складом ¡тйгенав для використакнн в !нших регюнах.як! в1др18няються за лолог!чною структурою лептосп1роз!в.

»ci uctívjih-THTr"* Crní¿a¿i/¡i;¡A VMuH »"IW-

;ння Jitm.ocHOBHHMH принципами ïx конструювання можна вважати : жплексексне включения родових та серогрупових антиген!в,що ма-пь найбальше ет1олог1чне значения,поеднання ïx в пол!сенситиш у 1дпов1дност1 з оптимальною дозою кожного,одночасна сенсибШзац1я эитроцит1в антигенами.На основи виконаних досл!джень була розроб-?на нормативно-техШчна документашя на лептосШрозний ерктроци-1рний пол1вапентний антигенний дгагностикум,яка затв^рджена 1>ар-1колог1чним комитетом УкряЛни.

ДОагностячн! моялибост; розробленого пол1валентного ЕД üvjhj -¡пробован! при досл1дже!йй 1343 хворих на лептосгйроз. Р1вень ан-мептоспiposHHX антит1л коливався в межах 1:320 - 1:40 960.Сер*-д-i титри РИГА з ПЕД i ДРЕД.а tîiKO.y. PMA наведен! в таблиц! Ечтюги-íibhí результата РИГА з 11ЕД ствпйДали з даними загальноприйнятого 1агносткчкого тесту РМА.

Дослхджешш ь циоте!нов1й проб! б!льш 150 зразгав сироваток ворих лептосшрозом показали мо*лив!ть Еиявлення за допомогою эзробленого ПЕД антит1л,що складаються з IgM та ígG.PKí'A з ПЕД ае можлив!сть вкявляти антил9птссп1р0зн1 антиПла на 3-4 дн! ра-i¡ne,HiK РМА.Титри РИГА з ПЕД в 3,9 рази вище,н1л титри в РМА.

Розооблений ПЕД використовували також з метою виявлення леп-ocnipGHOciHGTBâ у гризун!в,в!дловлених в 9 областях Укра!нк.Всьо-о було обстежено 2102 грикуни,результата наведен! на мал.1.

Таблица

Залежшсть чугливосп' П€Д Ь серогруповими сироватками в'щ способу сеисабт&аци еритроциш УЗ-антигенними препаратами.

Кеть-юстъ сенси- тии!в впед Споаб сенсаб^зацй П£Д МЬновалентний €Д

паралельнии послщовний кшькклъ - сер|й .ед р'|вень гемосен-сибшвацм

юльгасть сер!й пед р1вень гемосен-сибшвацп . кшыасть серм пед ' рвень гемосесибйзацй при посл1доеносп введения сенситму

1 II III

2 5 14700 гту=0,19 (+14,1;-12,3)* 5 116890 т5=0,38 (+30,1;-23,1) 800 т5=0,38 (+30,1,-23,1) ' - 68 19400 гп-=0,1 (+7,2;-б,7)

3 18 11140 т5=0,07 (+5,0,-4.8) 3 119400 т,=0,38 (+26,6.-21,1) 800 т5=0,б8 {+60,2;-37,5) 110 . п\=0,51 (+42,0;-29,6) - -

4 5 - 9050 т5=0,17 (+12,3;-11,1) - - - - - -

5 18 8440 т5=0,05 (+3,5,-3,3) - - - ■ • -

* - в'щхипення в'щ середнього у %.

Таблиця 5.

--------------------1---------1-----------------------------------,

Досл!джуг>ан! +К1льк1сть+ СерологШний тест ■)

+ ^-----------т------------т---------^

+СИроваток(- РИГА 3 ПЕД-1- РИГА 3 ЛРЕД+ РМА I

____________________л_________J____________1_____________________J

лко|)1 ия 12-13 1; I • 11 :•< 1

(+18,9;-13,91*(+12,5-11,1) (12,5-11,1)

% -0,25 -0,17 т^ -0,17

Хвор1 з 1ншши захв. 2556 <1:10 <1:5. <1:10

Практично 8Д0Р031 2230 <1:10 <1:5 <1:10

Заувакення : * - в!дхилення в^д середнього в X.

2000

150С

23И«<0 ЕЗИНС») .

гэвшо етмж-о

Мал.1.Результата обстежеккя на лептоспхроносхйство гризун1в за допомогою РИГА з ПЕД та РМА з живими культурами лептосп1р.

Одержан! результата св1дчать про перспективн!сть використання розробленого д!агностикуму для од!нки ступени !нф!кування гризун!в

в антропург1чних i природних вогнищах лептос.шрозу.РНГА з роероб-леним ЩЦ спрощуе д1агностику лептосп1розу- i,як скр1н1кг-тест може бути використана для одзнки еп1дем1олог1чно! та еп1зоотично'1 ситу-ацп.скорочуючи час на дослздаення в 6 раз1в.

Е.Розробка непрямо! 1муксфермектно1 реакцП для серод1агнос-тики лептосп1розу.

На основi УЗ-антигенних npenapaTiB була розроблена непряма амуноферментна реавдя для серод1агностики лептоаарозу.

В хсдх розробки Н1ФР визначали оптимальна сенсибШзуюч! дози антигену (25-50 мкл/мл),концентрацИо пероксидазних кон'югат1в та.пшп. лараметри.Було встановлено.що у Н1ФР в1дбуЕаеться комп-лексне виявлення як серогрупо-, так i род оспе диф1чних антиПл.що дозволяе встановлювати д1агноз ранше ,и1ж в РМА.Н1ФР була апробо-вана на 175 зразках сироваток хворих лептострозом 1 110 зразках сироваток хворих 1ншими захворюваннями i практично здорових.Р1вень антит!л,що виявлялися в Н1ФР,був в 24,1 рази вищий ,н1ж в РМА (титр Н1ФР 1:18100 проти 1:750 для РМА).Був визначений ор1ентовний Д1агностичний титр НИР - 1:400.Проведен! досл!дження з метою ôttfH-ки д!агностичних можливостей розроблених тест1в в порхвнянна в mïk-рокапсульним агдютинацПним (МКАГ) тестом,запропонованим японськими досл!дниками Arimitsu J.et al. (1982),показали, що р1вень антилепто-сп1розних антит!л .визначених в Н1ФР,був видай (р < 0,01).Р1зниця в показниках thtpîe антит!л РНГА з 1ЖЦ та МКАГ статистично недос-тов1рна,РМА значно поступалася вищзозначеним тестам (р > 0,001 , р > 0,01) (мал.2).

2ЭВД ачсят

Мал.2.Пор1вняльна чутливз.сть р1зних серолог1чних тест1в(в зворотн1х значениях титр1в).

Глава VI. РОЗ РОБКА ТА 0Ц1НКА ДЕЯКИХ 1МУНОЛОГ1ЧПИХ ТЕСТ IВ ДЛЯ 1НДИКАЦ11 АНТИГЕН 1В ЛЕПТ0СП1Р.

1.Розробка та порхвняльне вивчення шунологз'чних тест'в. В д1агности:и бактер1альних ¡.нфегадй все б1лысе значения на-бувають експрес-методи,спрямован1 на виявлення антигенов мжроср-ган1эм1в.Щ методи довво'ляють б найкоротший строк,Еже в перших дн1в захворювання.встановити етшлоПчний диагноз.

Надзвичайно актуальною е розроСнса методт визначення антиге-Н1в при лептосп1роз1.Для цього були розрсОлеи! 1 вшсористши най-

^ тг ь. ггг ггу!тчтмр2 т ТТП.П<Р1!П111 гллппц* аи- РЦРА РЛПЛ ОПНПЛ РГЧч'Гс.и

а такок реакцг! МЛ.При розроОи! них метод!в використсвуьалась ориг1нальна розроблена нами родоспецифгчна лептострозна сироват-ка,а також р1зн1 комб!нацП пол!валентних серогрупових сироваток 1 1муноглобул1н1в.Використан1 тести в1др]знатися за принципом Л11 ,чутл1в1стю,характером використаних реагент1в.

Розробка цих тест1в мала на уваз1 /Цферентйоьану оцшку зд1бност! вияблятк родоспецифхчиий антиген 1 антигени б1льш вувь-ко1 сиециф1чносп,в тому числ1,серогрупов1 антигени лептос-

nip.OitfHKy досл!джуваних !мунолог!чних тест1в едшснювали за двома

KpiTepiflMH : чутливост1 i специф1чност!.Чутлив1сть реакцЗЛ визна-

чаяи за , м1н!мальною встановленою концентрац!ею антиген!в живих

юитин лептосШр (кл/мл) .Одержан! bíaomoctí наведен! в таблиц! 6.

РГНГА проводили як в УЗ-ЕД,так 1 з ЛРЕД.Встановлено.що чут-

лив1сть цього тесту з УЗ-ЕД при виявленн! серогрупових антигеШв

становить (0,96 ¿ 0,22) х Ю^кл/мл; при використанн! ЛРЕД родоспе-

циф1чний антиген виявляли в концентрацп (1,2 + 0,26) х 10*

кл/мл.Чутлив!сть РГНГем значно нижче, н1ж РГНГА. '•

Розроблена нами РКА для шдикацП ант1ген!в лептосШр виявляла

виключно серогрупову специф!чн!сть i, на наш погляд, може бути

видор^стана для типування культур лептосШр до рдвня серогрупи.

При розробд! РИГА з антит!льними ЕД (АТ-ЕД) останн! готували з bí-

користанням кон'югату б1д!азобензидину натрш, танину ,а також

глютарового альдег1ду. Проведен! досл!дження показали високу чут-

лив!сть РИГА ( BapiaHT PATA) при 1ндикац!1 лептосщр^окрема по

серогруповим антигенам, в тому числ1 i при використанн! полива-

V

лентних (2-4-х валентних) АТ-ЕД - (2,62 ± 0,6 ) 10 кл/мл.При використанн! танину вдалося одержати АТ-ЕД з родоспециф1чною активШс-тю,що складала (2,25£ 0,75) х 10 кл/мл.Для проведения реагадй 1ФА були одержан! 3 антилептосп1розних пероксидазних кон'югата.Вико-ристання трьох вар!ант!в 1ФА - прямого 1ФР,непрямого 1ФА та "сенд-,в!ч"-метода 1ФА - дозволило встановити.що максимильиа чутлив!сть

була характерна для Н1ФР i "сендв!ч"-методу - (3,29 ±_ 1,31) х и

10'кл/мл.

■ Високий CTyniHb специф!чност! розроблених tcctíb був доведений при використанн! чужер!дного антигенного матер1алу (суспензП rpl-тих та живих иНтин штам!в лроте1в,шигел,сальмонел,ешер!х!й.По-зитивн1 результата че були вареестрованх.

Габлиця С.

Чутлив1сть ХмунолоУ^чних тестхв при виявлених антигшив

дептосп:р

1мун.тест Препарат ИШмалька концентра;л антигс; а в (1С1/М.-,)

mi m « . ii- i*. УСЕД У /-> /1/- . пл \ ;; р : С,С"

РГНГА ЛР-ЕД ( 1,20±0,2б) X ю' р <, 0,05

РГНГем УЗ-ЕД ( 2,60+0,24) X 10' р < 0,05

РГНГем ЛР-ЕД С 5,20+0,40) X ю' р < 0,05

РИГА" АТЕД-серогр. (11,47+2,60) X 10*- р < 0.05

РИГА АТЕД-родосл. ( 2,25±0,75) X ю5"- р < 0,05

РАГА АТЕД-серсгр. ( 2,62.1.0,60) X 10 4 р i 0,01

РКА АТ-серсгр. V 2,50^0,50) X ю6 р < с,01

HliP Рсдсспэд. ( С,65- 1,50) г 10

if ¡С-Р Серсгруп. ( 5,80.-.!,20) V 10 v р < 0,05

'сендвхч" ч X,._ -, L X '.С* р <- 0.02

2. Викор;;стс-.а::л ¿:г/иС<>грме:гт;.ого ана.i'Х^нд^дш

антигенов лептссгпр у експ«римзкта.г.ьнкх тваргш.

РИГА, ГООЛ тг; /ПО; булх ^икорн^та.:: при bxlx^hxi до.-. :-д'X/ тептсаир в тканинах та органа1; експериментаяьно заракених тварик. 3 KKooTi експернкентально! модедг буди використал! морсы:! свинки r:i.\;ift:.oro в!ку мзсао 100-150 x.^x.x улдахендл зхюрхсгсгувдли 3-9 ;i'j',oni культур;: р в дог; х 1С, дх'мл двох ;,iyxe::x;:x

LTaMiB i трьох сыловг-дичен/у. и:т?>и1в .пе::тс;:;1р середкь01 :;:рул;'нт-ност! серогруш; leteronseirorrhsgl ае 77/А :",V4/5iiy,70/503.При дхв-наченн! антигегав £ ШФР та Н1ФР встачозлено.що момиво заресстру-

вати антигени в сироватц! кровГ в 75-77 %,що перевищуе результат. бактер1олоПчного методу- 66 Антигени виявлен1 також в печ1нцх -65-69 %,нирках - 80-83%, легенях - 54 %,тод1 як позит!вн! резуль-тати культураньного метода, даримая! в 48,76,37 % зразк1в в1дпов1д-но.

При зараженнх експериментальних тварин ав!рулентними музейними штамами на 3 добу п1сля заражения лептосшри вже не вид!лялися,не виявлялися 1 IX антигени.При зараженн! тварин лепгёсп1рами се-редньо! та слабко! вирулентност! культури 1 антигени ^находили на-в1ть на 7 добу .Найбхльша частота вид!лення лептосп1р спостерхга-лася з тканини нирок.Рхвень антйген1в в кров1 в перш1 3 доби коли-вздся в!д 1:16. до 1:64,на 7 добу в1н знижувався до 0-1:4.

3. Результата досл1джень на наявнЮТь антиген!в лептосп!р у хворих людей та лептосп!ронос!!в.

Методи !ндикац!1 антиген!в лептосп!р серогрупово! та родово! специф!чност! були застосован! при обстеженнх людей,хворих на леп-тосп!роз,а також при досл1дженн1 на наявн1сть нос!йства тварин, в 1дловлених у вогнищах лептосп1розу.

При доогцдженн! в РКГА з АТ-ЕД материалу в!д 49 хворих хкте-рогеморагхчним лептосп!розом на 2-9 день хвороби лептосшрозн! антигени в крови були знайден1 у 85 X (42 зразка) та в сеч! в 90 % випадк1в (44 зразкй);титр родо,специф!чних антиген1в в сироватц1 коливався в1д 1:4 до 1:16,а в сеч1 - 1:2-1:8; р!вень серогрупоспе-циф1чних антиген!в в скроватцх був 1:4-1:64;в сечх - 1:2-1:32.Проведен! паралельно бактер!олоПчн! дослдаення позитивних резуль.та-т1в не дали.Надал! у хдах хворих були одержан! позит1вн! результата в РИГА з ПЕЦ та.РМА.'

Обстеження на наявн!сть антигенхв лептосп!р в РИГА 866 гризу-н!в дало, позитивн! результати в 49 зразках,титри антиген1в були

1:2-1:64. Шд час ОактерЮскоп1Чного доа.'Идження коркового шору ни-рок позитивы! результата були одержан! в 37 зравках.Важливо тдк-реслити.що у 49 тварин,у яких був выявлений антиген,ачтилептосШ-poBHi антитг.ча були знайден! в 4" випадках.що с клад ал о 79 X.

МожливЮть тестування антиген1в за допомогою методов M'A була ппи иОьхСлс;;::! ?'7 ^ипоих !ь.1ерсгс"~рог''>"ним лептося!-розом.в якост! контрольно! групи досл1джували wait-pir^, Ci людей-донор!в.Лептосп!ро8н1 антигени виявлен! в 17 зразках (62,9 Z) сироваток кров! i в 15 зразках сеч1 (55,5 7,).

На н!троделюлозних ф!льтрах з родоспециф1чним кон'югатом поставлено 145 зразк!в супернатант!в гомогена'пв нирково! тканини гризун!в,в 21 зразку знайдений антиген (14,5 Z).Вактер!оскоп1я дала позитивний результат лише в 12 зразках (8,2 Zj.Bc! позитивн! результати бактерзоскопП сгпвпадали з позитивними даними !муно-ферментного тесту.Тагам ''ином, !мунолог!чн1 методи.спрямосан! на виявлення антиген1в лептоапр,високсчутлив! i специф1чи1 та з ус-nixoM можуть бути використат як для д1агностики лептосшрозу у людей ,так ! для виявлення лептосп!роносгй.ства у тварин.

4. СбгрунтувАннй оптимально! схеми !мунод!агностики лйитосяироьу.

Для експериментальнс) ощнки р!зиих метод!в i засоб1в д!аг-ностичних досл!дкень на морських свинках Суда вмодельсвана внут-р1шньочеревна 1нфекц1я штамом середньо! в!рулентност1 74/599 в до-3i 10^ кл/нл.За тваринами наглядали на протяз! 7 д1б - заражения супроводкувалося захворюванням.В результат! комплексного обстежен-ня тварин спсстерггали динам!ку виявлення антиген1в лептосп1р в сеч1.сироватщ кров!,а такох формування специф!чного гуморального !мун!тету (серогрупових та родоспециф1чних антит!л).Антигенур!я ь максимально титрах ф1ксувалася таком перш! дн1 - титр 1:16-1:32.В сироватщ кров! антигени виявляли в перший тиждень. Найб!льшиГг pi-

вень - перил 3 дШ (1:32-1:64)

Серолог1чн1 досл1дження показали,що у вс!х уражених тварин 1нфекц1йний процес супроводжувався вираженою 1мунною перебудо-вою.РНГА з ПЕД сироватков1 антитхла рееструвала-.вже на 3-4 добу,а на 9-11 добу спостерхгалося ч1тке каростання титр1в антитхл б!льш нхж в 4 рази.де дозволяв тдтдердити ет!олог1чний дхагноз^не чека-ючи 'результатов РМА,поз1!т1вк1 результати яко! спостер1галися на 68 добу.

Базуючись на отриманих експериментальних даних.а також на результатах, одержаних при досл!дженн1 матер!алу в!д хворих,оптимальна схема комплексно! 1муиод1агкостики лептосп!розу повинна-склада-тися з визначення антигенемП та антигенурП в пёрни дн1 захворю-вання 1 серолог1чне досл!дження парних сироваток на 3-4 та 9-11 дн1 в РНГА з розробленим наии леатоспхрозним пол!валентним д!аг-ностикумом.Уточнения серогрупово! належност1 лептосп!розу за допо-могою традшцйно! РМА сл1д робити.починаючи з 6 доби.

Глава VII. РОЗ РОБКА МЕТОДА' ОДЕРЖАННЯ' ЛЕПТ0СП1 РОЗНО "I-ЛЮДСЬКО'Г

ИМУННО'1 ПЛАЗМИ ТА ЕКСШЕРИМЕНТАЛЬНЕ ВИВЧЕКНЯ II ТЕРАПЕВТИЧНО!

ЛИ.

3 метою скр1н1нга антилептосп!розних антит1л в сироватках кров1 одноразових донорхв для наступного 1х використання в якост! матерхалу для одержання 1мунопрепарат1в був використаний роеробле-ний нами полхвалентний антигенний еритроцитарний дхагностикум.За-допомогою цього препарату ■ були досл1джен1 6 688 сироваток крови донорхв.Антилептосп1рознх антитхла в титрах в!д 1:10 до 1:320 були виявлехи в 39,0 % випадк1в,в д1агностичних титрах (1:160)- у 5,2 %. Найохльш часто висок1 титри ант1лептосп1розних антит1л виявляли в

- si -

сироватц1 кровi донор1в групи А (II) - 7,3)1,9 %.р1дше - серед групи О (I) - 4,4+1,33 Z та В (III) - 3,9+0,8 X, наймемте - 'в си-роватках кров i АВ (ÏV) - 1,8н0,"3 %.

Б реакцП мжроаглнзтинацП досл1джували 100 сироваток кров] донф1в,що позитивно реагували в РИГА в титрах 1:80-1:320.Позитивна РМА в титрах 1:10-1:160 рееструваляся в 76 X зразад.З цих по-

1:10 виявляли.в 25 %, 1:20 - в 39,19% , 1:40 - в 13,15 Z; 1:80 -13,15 %; 1:160 - 9,21 % зразк1в.Найб1льш часто антилептосгпрозни антит!ла в РМА були знайден1 до лептосп1р серогрупи Icterohaenorrhaglae - 46,05 %.Необх1дно п!дкреслити,що позитивы! реагсцП з сапроф1тни.м штамом Patoc I визкачен! в 35,02 Z сироваток KpoBi.KpiM того,у 18,4? % сироваток спостерн'али бэгаточисельну аглютинащю лептосп1р,шо належали до серогруп Icterohaemorrhñgií-e, Ро.тюг.а, Grippotyphosa.Hebcio.T, aciis, Can i cola. Титри антитип до лептос-nip pí&Hiix серогруп коливалися в!д 1:10 до 1:40.Досл1дженкя кяас!в iMyHor^cóyjiiHiP. позитивна сироъаток крови донор]в показало,що аи-титЫа представлен! иереьажно igG.

В "npoueai сп1льно7 роботи s Ки!вським Оститу том гематологiï та п<?религаккя крсв* бу.-о одержано copiü азгг;к1гг.тссп1рогпс1 пл&еми з тигре»/ анти'пл з РИГА 1:160 i б!льИ'е.В доопцах по ьмв-ченкю терапевтично! д 1 ï' антилептосшрозно! плазмк людини були ви-користан1 62 MopcbKi свинки.У тварин створювали експёрикентальну лептосШрсону 1нфеадзг5 ¡¡.тамом бйсочо! зирулевтност! 75/60Э. Твариия Сули розд1.иен1 на 7 досл1дних i 4 контрольных групи Сгайдаця 7).

Тваринам досл1дних груп вводили людську плазму з тигром анти-Т1л В РИГА 1:160, !муноглобул1Н людини (титр РНАГ 1:1024), хмуногло-бул1н морськш свинки (титр РИГА 1:1024) ,комепц1йний волов'ячий ]муног..обул1н (тис* РИГА 1:80) .Розвиток 1н1>йкцП та П переб!г у

тварин оц!нювали за змшами загального стану, ni двшценням температу-ри Tiла,еб!льшенням ШОЕ та лейкоцитозу, !,що особливо важливе.пато-морфолог!чними дооглдженнями та загибеллю тварин.

■ Bei використан1 1мун;опрепарати справляли певний захисний вшшв.загибель тварин в контрольн!й rpyni N 11 становила 100 % на Е добу.Найб1льш яскравий ефект справляли людський !муноглобул!н та плазма,а також !муноглобул1н морсько! свинки.Щ 3 препарата пере-Бищували за ефективШстю комерцШшй волов'ячий iмунсглобулiн,який використовують в наш час при лжуванн! хворих на лептоспгроз.

Таким чином,експериментально п!дтверджена ефектившеть тера-. гевтично! дП людсько! лепто<Зп1розно'1 плазми.На основi одержаного нами авторського св!доцтва N 1792709 СРСР "Cncciö вхдбору сировини для одержання антилептосп1розноi плазми" сп1льно з институтом гематологи. та переливания кров! оформлена нормативно-техн!чна-доку-

Таблиця 7.

■ Ефективн!сть л1кувально! дх! iMyHonpenapaxiB при експериментаньн1й 'лептосп1рйзн1й !нфекцп.

Групи Навва препарату К1льк1сть Тварин,що

тварин' та строки введения тварин в rpyni вижили

о

Плазма лептосп!розна людська до заражения Леятосп!розний Ig морсько! свинки,до заражения Волов'ячий lg комерц!йний, до заражения

Плазма людська лептосп1розна, лЛсдн зарзкення.

Продовження таблиц] 7.

5 Лептосп1розний 2морсько:

свинки, теля заражения 4 4

6 Волов"ячий !§■ комерц1йний,

п1сля заражения 4 2

у Люлський лептоса1рознпЛ

п!сля заражения 3 • 3

8 Нормальний морсько! свинки,

П1сля заражения 3 1

9 Нормальний людський 1е,

толя заражения 3 0

10 Плазма людська нормальна 3 1

11 Ф1з1олог1чний розчин 10 0

мептащя на антилептострозну людсъку плазму,яка представлена до Фармаколог1чного.комитету №03 Укра!ни.

ВИСНОВКИ.

1.На основ1 проведених досл1джень сформульован! основш прин-

ципи 1мунод1агностики лептосп1розу : а)сп1льне коректне викорис-тання метод1в Еиявлення антилептосп!розних антител 1 антиген1в у в!дпов!дност1 з розробленою схемою; б)використання антигенних пре-парат1в 1 тест-систем для Биявлення антит!л .виготовлених на осно-в1 комплексных антиген1в 61лково-пол1сахаридно1 природи.що харак-теризуються високою д1агностичною ефективн1стю за рахунок присут-носп а '¿х склад: родо- та серогрупослецифхчних антиген1в; в)вико-ристання в 1мунод1агностиц1 реПональних штамхв.антигенна активность яккх в 2-6 раз1в переЕищуе еталонн!.

Охарактеризована серолог1чна специф1чн1сть 1 б1ох1м!чна природа антиген1в лептосп!р,одержаних сприятливими методами за допо-МОГОЮ додецилсульфату натр1ю та ультразвуково!' екстракцП. Показано, ир Ц1 антигенн! препарати м1стять як родоспециф!чн1,так 1 с-е-рогрупоопециф1чн1 компонента,що Шдтверджувться в Р1Д, Р1ЕФ, РКП , РНГА.Рм1от б1лку в ультразвукових антигенах 38,3-41,0 %,?1ол1саха-рид!в - 12,5-15,0 %,индекс сп1вв1дношення б1лк!в до вуглевод!в складав 2,10-з,28;ь ЭОЗ-антигенах щ показники були в1дповадно 36,4-38,4 10,7-13,8 %; 2,72-3,44.

3.3а допомогою фракцЮнування УЗ-та 5В5-антиген1в на сефадек-с1 0-200 були вид1лен1 важкомолекулярну фракщю 1,активн1сть яко! в серолог1чних тестах (.РНГА.РСК ) була вице в 4-5 раз1в (за величиною робочого розведення препарату).

4.Доведена висока гемосенсибШзуюча активность УЗ- та Б03-антиген1в,що носить комплексний характер - сенсибШзацгя еритроцитгв зд1йснювться як серогрупоспециф1чними .так 1 родовим антигеном; сенсибШзуюча доза цих антигенов 0,02-0,03 мг/мл.

б.Враховуючи значно б1льший вйХ1д антиген1в з волого! бакте-р1ально'| маси,б1лыи довготривалий строк ёбер1гання,б1льшу техноло-г1чн1сть в наступних досл!дженнях по розробц! 1мунолог1чних . екс-прес-методхв д!агностики лептосп1розу б якост1 комплексного антигену рекомендоване використання препаратгв.одержаних за допомогою ультразвуку.

6. Розроблений новий д1агностичний препарат - лептоспхрозний еритроцитарний жуцвалентний антигенний д1агностикум на основ1 комплексних антиген1в,одержаних з 5 серогруп лептосп1р,що забезпе-чило широкий ргвень лерехрестно! активноот1 1, в свою чергу, б1дыл високу д!агноотичну можливЮть цього препарату.Визначений техноло-г1чно придатний та ефективний метод сенсибШзацП еритроцит!в

- ----- 35 -по/Лантигеном - температура 45 С на протяз! 60 хв. з настуиною ф!ксащею 1 % формальном. Використання лептосл1розного пол патентного антигенного д1агностикуму в (л pasíB скорочуе витрати часу на проведения дссл!джень i дозволяв виконузати wacoBi обстеження.

7.На основi полхвалентного антигену розроблена тест-система -непряма iMVHofienueHTHa nearaiifl - для комплексного виявлення анти1 леитоон ¡ рил uu ojiiíu'íji (pui»o 1 ссрсгрупссп^цй51";|;1л) .В тсс tí i;: користанi 5-валентн1 ультразвуков! ачтигени в дсз1 0,05 ,мг/мл та антилюдськ1 комерп!йн1 пероксидазн! коньюгати.

8.Показана д!агностична ефективн1сть лептоспiрозного еритро-цитарного пол1валентного д!агностикуму i Н1ФР при -доаНдженнях си-роваток кров i хворих лептосп!розом та 1ншими !нфекц!йними захворю-ваннями.а також здооових людей.Специф1чн!сть методíb складзла 100%, ■а титр аптит1л',що тестувалися, був в 3,9 i 24,1 рази еище, hím титри в традюЦйному д1агностичнсму тесп - реакцп м^фоа^лю^ина-цП.Антилептосп1розн1 антитчла виявляли на 3-4 дн1 ратиелЯж в РМА.

Э.Вперше встановлена корелявдйна гал^даис.ть знтигенно! актив-hoctI св1Жовид1лених итам1в з ix вирулентн1стю.

Ю.Ь1дл?ацьоваи1 методи виявлення аьтигаин ¿emrouulp.Kvonpoc-•iobhí п<ф -ваги га чутлиЫстю га слецифлчихсю нгпелть рига а ан-тит1льними еритроцщ-арними дАагностикумами.а також методам 1муио-ферментного анал1зу.Чутлив1сть РИГА 1 "сендв1ч"-вар1анту Ш bhmí-рювалася десятками нанограм1в антигена в 1 мл або десятками тисяч кл1тин на 1 мл.

11.3а допомогою методов виявлення эчтигэюв у хворих iK™opare-мораг1чним лептострозом в перш! дн! нахворювання антиген в сиро-ватц! кров! знайдений в 85 % ,а в сэч! - в Э0 % ( ъ РИГА з анти-т1льним Д1агностикумом).Титр-родоспециф!чних антиген1в коливався

в1д 1:2 до 1:16,серогрупоспециф1чн1 антигени виявляли в титрах 1:4 -1:32.

12.0бгрунтована оптимальна схема комплексно'! 1мунод1агностики

леитосп1розу.Схема складаеться з визначення антигенемП та знтиге-

нурП в перш1 3 «Hi вахворювання i серологi4Horo досл1дження парг t -них сироваток на 3-4 та 9-11 дн: -в РИГА s розробленим нами" лептос-

п1розним пол1вапентним еритроцитарним д!агностикумом;уточнения се-

рогрупи збудника за допомогою РМА сл1д виконувати не ран1ше 6 доби

захЕорювання.

13.Розроблен1 препарати та методи вперше апробован! для еп!дрозв!дки в антропург1чних та природних Еогнищах лептосп!ро-зу,проведен! дослиження.гризун1в на !нф!кування за допомогою ПЕД та метод!в виявлення антиген!в.К1льк!сть позитиених результатов в РИГА з ПЕД складала 14,3 % проти 10,5 X в РМА.Антиген лептосп1р в. прямому !муноферментному тест! виявляли в 14 % зразк! в. Результата розроблених тестiв в 90,4 % сп!впадали 8'данями традиц!йних тест!в (РМА,бактер!оскоп!я нирково! тканини.культуральний метод).

54. Розроблений ориг!нальний'препарат для !муко'терапН лепросШ-розу - лептооп1розна -плазма людини ,одержана на основ! скр!н1нгу сироваток кров! одноразових донор!в на наявн1сть антилелтосп!роз-них антат1л за допомогою розробленого нами ПЕД. Терапевтичний ефект лептооп!розно! плазми людини був доведений на морських свинках з експериментальною лептосп!розною !нфекц1ею.

Перелж po6iT, надрукованих по TeMi дисертацП.

1. Мельницкая Е.В., Беркасовская Е.П., Кондратенко В.Н.Н. Повышение чувствительности реакции агрегат-гемагглютинации для вы-

- - 37 -

явления антигенов леитоспир // Тез. докл.II Съезда гигиенистов и санитарных врачей, микробиологов, .эпидемиологов и паразитологов Молдавской ССР, Кишенев Л987. - С. 314-315.

2. Мельницкая Е.В.Изучение гемосекситивной активности анти-генйых препаратов,выделенных из лелтоспир //Сб. эпигоотол., эпиде-кяй?., опвлптва диагн.. терапии и проф.инфекц. болезней общих для человека и млшт. Льве г ,19*«. - »МШ-19Г.

3. Бернасовская Е.П. .Кондратенко В. Н..Мельницкая Е.В., Современные аспекты и экспресс-методы элиднадзора за очагами этой инфекции // Сб."Эпизоотол.,эпидемиод.средства диагн.терапии и про-фил.инфекц.болезней, общих для человека и животных." Львов ,1933. -С.144-146.

4. Бернасовская Е.П. .Кондратенко В.И. .Мельницкая Е.В. Сценка новых тестов для изучения степени инфицирование: ти лептос-пирами грызунов // Сб. Тез. доил.Всесоюзн.конф."Человек и биосфера" Киев ,1988. - С.16.

5. Бернасовская Е.П/,Серебрякова Т.Л. .Ленартови': Л.С. .Кондратенко В.Н. .Мельницкая Е.В. Особенности гуморального иммунного ответа и критерии, реакции микроаглютинации при лептослиро&э / Информационное письмо МЗ УССР.-Ките,1983.-4 с,

6. Мельницкая Е.В. .Кондратенко В.II. Использование реакции ко-агглютинации для типирования культур леитоспир // Лабораторное дело. - 1939. - N 6. - "С. 11-13.

7. Фролов Л.Ф. .Харитонов И.Г. .Дьяченко Н.С. .Рыбалко • С.Л. .Мельницкая Е.В. и др.Иммуноферментный метод г диагностике вирусных и бактериальных инфекций / Методические рекомендации МЗ УССР.-Киев,1989.- 25 С.

8.Мельницкая Е.В. Иммуногенные свойства антигенов лептос-пир,экстрагированных ультразвуком //Тез.докл.VII съезда УМО.Чер-

НОВШ, 1989.- С. 61-62.

Э.Назарчук Л.В..Мельницкая Е.В. Лентоспирозные антитела в сыворотке крови доноров //Врачебное дело.-1989.-N 4.-С. 108-109.

Ю.Мельницкая Е.В..Бернасовская Е.П.Оценка чувствительности иммуноферментного метода для выявления антигенов лептоспир// Тез.докл.респ.конф.по иммуноферментному анализу.Харьков, 1989.-С.81 'И.БернасоЕская Е.П. .Мельницкая Е.В. .Кондратенко В.Н.Непрямой иммуноферментный анализ для выявления антилептоспирозных антитет// там же.-С.68.

12.Бернасовская Е.П..Мельницкая Е.В. .Кондратенко В.Н.Антигенный поливалентный уритроцитарный лептоспирозный диагностикум //Тез.докл. совещания па прикл.микробиологии.Москва,1989.-С.32-33.

13.Шап1ро A.B..Мельницька О.В. 1муноферментний анал1~ в д1аг-НОСТИЦ1 бактер1альних 1нфекц1й //Тез.допов.респ. с.ем1нару-наради головних 1нфекц1он1ст1в обл.в!ддШв охорони здоров'я з актуальних питань KJiiHi4HO'i в!русологП та 1нфектологП.Льв1в,1989.-С.4.

14.Волина Е.Г..Мельницкая Е.В. .Бернасовскач Е.П..Киктенко B.C.. ' Arimitsu J., Kobai achi S. 'сравнительная оценка чувствительности различных методов серологической диагностики лептоспироза // Курн.микробиол.- 1990.-N 12.-С. 73-77..

15.Бернасовская Е.П. .Мельницкая Е.В.. .Кондратенко В.Н.Разработка лептоспирозного комплексного антигенного эритроцитарного диаг-ностикума // Микробиол.журн.-1990.-52,N 4.-C.74-79.

. 16.Назарчук.Л.В..Мельницкая Е.В. Способ выявления антилептоспирозных антител в сыворотке крови доноров//Тез.докл.мевду-нар.конф.по проблеме медицины катастроф.Киев,1992.-т.3.-С.118.

17.Мельницкая Е.В. Использование непрямого иммуноферментного ' метода для диагностики лептоопироза//М1кробiол.журн.-1994.-56,N 5. -С.24-27.

J8.Мельницкая E.В.Перспективы применения непрямого иммунофер-ментного метода для диагностики лептоспироза//Врач .-1994.-N 5-6.-С.64-66.

19.Мельницкая Е.В..Бернасовская Е.П..Кондратенко В.Н. Разработка и оценка лептоспирозного поливалентного эритроцитарного ди-агностикума // Журн.микробиол.-1994.-N

г;о.Мельницкая E.S..Кондратенко В.Н..Еттатсгсяяя к.п.н»а*ктив-ность реакции непрямой гемагглютинации для определения антллептос-пирозных антител у сельскохозяйственных животных.Тез.I (VIII) 3'18ДУ УМТ, 1993,0деса//'М1Кро0?ОЛ.журн. -1994. -55,N 4.-0. V0.

21.Бернасовская Е.П. .Кондратенко В.Н..Мельницкая Е.В.Связь антигенной активности лептоопир с их вирулентностью //MiKpo6i-ОЛ. журн. -1994. -56, N й.-С. 46-50.

Перел1к документ!в по застосуЕанню наукових до:;ягнекь в лрак-тиц!.

1.Авторское свидетельство N 1792709.27.07.90. Способ отбора сырья для получения антилептоспировной плазмы. ( соавторы .-Наэарчук Л.В. , В°рнаоовг.кяя Е.П. .ФедоровскаЙ Е. А. .Кондратенко В.Н.).

2.Нормативно-техшчна документац1я на "Д1агностикум леп-тосп1розний полгвалентний антигенний еритроцитарнкй, рЗдкий'ЧЗат-верджёна Фармаколог i чним ком1тетом Укра'1ни 28 липня ■ 1S94 р. (сШвавтори Вернасозська Е.П'. .Кондратенко В.Н.).

3.Нормативно-техническая документация на "Плазма антилелтоспи-розная сухая".Подана в Фармакологический комитет Украины в'феврале 1994 г. (соавторы : Наеарчук Л.В..Федоровская Е. А. ,Е^рнасоякая Е.П. .Кондратенко В.Н.)

4.Удостоверение на рацпредложение N 26/350 "Усовершенствова-

ный способ получения родоспецифического лептоспирозного эритроцитарного диагностикума".Утверждено 25.10.1987 г.

5.Удостоверение на рацпредложение N 28/352 "Способ получения биомассы лептоспир для выделения родоспецифического антигена".Утверждено 15.11.1987 г.

6.Удостоверение на рацпредложение N 32/313 "УсоверщейЬтвованый способ бактериологического исследования органов при лептоспиро-зе.Утверждено 27.05.1986.

7.Удостоверение на рацпредложение N 31/312 "Усовершенствованный способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции агрегат- гемагглютинации при выявлении антигенов лептоспир".Утверждено 26.05.1986 г.

8.Удостоверение на рацпредложение И 25/349 "Способ дисхностики -лептоспироза с помощью поливалентного эритроцитарного диагностикума". Утверждено 19.10.1987 г.

9.Удостоверение на рацпредложение N 511 "Способ выявления ан-тилептоспирозных антител в сыворотке крови доноров".Утверждено 13.03.1988 г. ' '

10. Удостоверение на рацпредложение N 1093 "Скрининг-метод отбо-

ч

ра вирулентных штаммов-лептоспир".Утверждено 18.04.1990 г.

SUMMARY

Melnitskaya E.V. "The principles uf immunodi agnostics of leptospirosis and the development of the new Immunodiagncstic and un-thcur^r'"*' 1 r prttTVn.r?>.tes". "imromolotrv - o3.oO.G7.

Gromashevsky Institute of Epidemiology and Infection Diseases, Kiev - 1995.

The new principles necessary in modern immunodiagnostics of

leptospirosis has been described. The data of ccnsf.raction of-new inimunodiagnostics preparates and test-systems to leptospirosis antybodies and to specific antygenes have been shown.

The activity,sensitivity and specificity of the prepárete? and tests have been given'.Moreover their effectivity has been shown experimentallv,in clinical use and epidemiological studies. Tiie leptospiric human plasma has also been develop!ed.

АННОТАЦИЯ

Мельницкая Е.В, .. "Принципы иммунодиагностики лептоспир'оза и разработка иммунодиагностических^и иммунотералевтического^ препаратов" .рукопись , микробиология - 03.00.07.

Киевский научно-исследовательский институт епидемиологии и инфекционных болезней им.Л.В.Громашевского.Киев-1995 г.

В работе показаны принципиальные положения,которые необходимо использовать в иммунодиагностике лептоспироза.Приведены, данные по разработке новых иммунодиагностических препаратов,направленных как на выявление антилептоспирозных антител,так и антигенов лептоспир.

Представленя данные об активности,чувствительности и специфичности разработанных препаратов и тестов.Показана их эффективность в экспериментальных условиях,,в широком клиническом опыте,а также при обследовании очагов лептоспироза.

Представлены материалы по разработке иммунотерапевтического препарата - лептоспирозной плазмы человека,

Ключов! слова : лэптос.п1ра,антит!ло,антиген,диагностика,ерит-роцитарний д1агностикум,плазма,1нфекц1я.