Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск и изучение иммунологических маркеров opisthorchis felineus и исследование возможности их использования для иммунодиагностики описторхоза

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Поиск и изучение иммунологических маркеров opisthorchis felineus и исследование возможности их использования для иммунодиагностики описторхоза"

На правах рукописи

РГВ од

t 2 СЕЯ 711:

КОТЕЛКИН АЛЕКСАНДР ТИМОФЕЕВИЧ

ПОИСК И ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ 0Р1БТН011СН1Б РЕЬтЕиЯ И ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ИММУНОДИАГНОСТИКИ ОПИСТОРХОЗА

специальность 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово-2000

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор"

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Локтев В.Б.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В. И. Офицеров,

кандидат медицинских наук Е. Ф. Беланов.

Ведущая организация:

НИИ медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е. И. Марцнновского, Москва.

Защита состоится «» 2000 г. в И часов

на заседании специализированного совета Д 074.20.01 в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии "Вектор" по адресу: 630559, п. Кольцово Новосибирской области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" Автореферат разослан « » 1> -О)_2008 г.

Ученый секретарь |

диссертационного совета '

кандидат химических наук [убина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Описторхоз - широко распространенное природно-очаговое заболевание. На территории России из печеночных паразитических трематод наибольшее распространение имеет Ор'мИогсЫз /еИпеш. Этим паразитом в Европейской части России инфицировано приблизительно 0,02-0,1% всего населения. Данные эпидемиологических исследований показывают, что на территории высокоэндемичных районов Сибири поражено до 85-90% всего взрослого населения. Количество страдающих от этой инвазии людей только в этих районах может быть оценено в пределах 2-10 миллионов человек.

Описторхоз - тяжелое паразитарное заболевание человека и животных. Основными патогенетическими механизмами являются токсическо-аллергическое воздействие гельминтов и их яиц на организм человека, а также механическое повреждение тканей печени с последующим развитием симптомокомплекса, связанного с поражением печени, желчевыводящих протоков, желчного пузыря и поджелудочной железы. Инвазия способствует проникновению вирусных и бактериальных инфекций в биллиарную систему, возникновению хронического восходящего гепатита, камней в желчевыводящих протоках и протоках поджелудочной железы. Прогноз развития заболевания усугубляется возможным развитием холангнокарцином и изменением нейроэндокринной регуляции. Поэтому своевременная диагностика и лечение описторхоза, а также надежный эпидемиологический контроль над возбудителем этого заболевания, несомненно, являются актуальной проблемой, в том числе и в неэндемичных районах, поскольку описторхоз является типичной вновь возникающей инвазией во многих странах мира.

В настоящее время иммунодиагностика описторхоза, вызываемого Ор1иЬогсЫ5 /еИпеш, страдает низкой чувствительностью и специфичностью из-за недостаточной изученности свойств этого паразита. Диагностические наборы для выявления специфических при описторхозе антител содержат в качестве антигена соматические фракции гельминта, имеющие невысокую удельную концентрацию специфических антигенов паразита, вследствие чего обладают низкой диагностической ценностью. Поэтому главной задачей разработчиков иммунодиагностикумов является отладка принципиального звена системы - этапа связывания антиген-антитело. Кроме того, несомненно, перспективным направлением в совершенствовании диагностики

описторхоза является выявление маркерных антигенов паразита в физиологических жидкостях и выделениях.

Цель работы и задачи исследования. Основной целью исследования явились поиск и изучение иммунологических маркеров половозрелой трематоды O.felineus, а также создание иммунодиагностических систем для определения специфических антигенов и антител в клиническом материале.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

• изучение специфических свойств половозрелой печеночной трематоды O.felineus и ее основных антигенных фракций;

• определение иммунологических маркеров половозрелого паразита O.felineus и изучение их свойств;

• получение моноклональных антител к маркерным антигенам O.felineus и изучение их свойств;

• исследование перекрестной активности антигенов O.felineus и ряда гельминтов -паразитов человека с использованием гомологичных и гетерологичных поликлональных антисывороток и моноклональных антител;

• оптимизирование стандартной системы непрямого-ИФА для выявления специфических антител при описторхозе, вызываемом O.felineus, с использованием МКА;

• разработка альтернативной системы для диагностирования маркерных антигенов O.felineus в физиологических жидкостях и выделениях.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проделанной научной работы:

• получены и охарактеризованы антигены половозрелой печеночной трематоды O.felineus;

• впервые определены для человека белки-маркеры при описторхозе, вызываемом O.felineus-. р105 и р74, р70, рбб;

• впервые создана и охарактеризована панель мышиных гибридом-продуцентов МКА к основным антигенам O.felineus, среди которых основную долю составляют МКА к основному иммуногену р105 кДа экскреторно-секреторного антигена печеночной трематоды O.felineus;

• с использованием МКА и иммунных человеческих сывороток на ультраструктурном уровне изучены гистоиммунохимические свойства

половозрелых марит О./еИпею, в результате чего определены места локализации основных иммуногенов паразита;

• исследованы перекрестные реакции антигенов О./еНпеш с другими гельминтами-паразитами человека, показана выраженная перекрестная активность антигенов О./еИпеиз с антигенами ОлЫетт, Слие/ш* и умеренная с Мза1ттсоНса. Выявлены белки, ответственные за перекрестную активность;

• на основе МКА к белку 105 кДа экскреторно-секреторного антигена О./еПпеш модифицирована стандартная система непрямого-ИФА для выявления специфических антител, что привело к увеличению чувствительности, специфичности, а также повысило достоверность иммунологического анализа;

• на основе модифицированной МКА системы ИФА впервые разработан иммунодиагностический метод для выявления растворимого антигена печеночной трематоды О./еНпеия в желчи и кале. Метод позволяет проводить исследование по одному или нескольким доступным физиологическим образцам: желчь, кал, и требует минимальных объемов исследуемых материалов, отбор которых безболезнен и потенциально не опасен. Анализ с использованием МКА-ИФА позволяет обнаруживать незначительные количества маркеров паразитов в физиологических жидкостях и выделениях.

В результате проделанной работы получены весьма обнадеживающие результаты, показывающие перспективность разработанных иммунодиагностических методов для использования в клинических и эпидемиологических исследованиях людей с целью ранней диагностики острого и хронического описторхоза, а также для оценки эффективности лечебно-профилактических мероприятий. Дальнейшее расширение арсенала иммунодиагностических тестов на описторхоз является не только важным диагностическим направлением работы, но и одним из звеньев расширения эпидемиологического надзора, позволяющего контролировать ситуацию по паразитозам на качественно новом уровне.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации представлены на международном симпозиуме 'Тяжелые инфекционные заболевания: эпидемиология, экспресс-диагностика и предупреждение" (Киров, 1997), научной конференции "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" (Новосибирск, 1998) и семинаре перспективных исследований "Оценка спонсируемых биологических исследований в России для нового тысячелетия"

(Новосибирск, 1999). По материалам диссертации опубликовано 5 работ в отечественной печати и тезисы 3 докладов. Получено авторское свидетельство на МКА к р105 экскреторно-секреторному антигену Ори/Аогсй«[еИпет.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста, включая 26 рисунков и 22 таблицы, и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (89 наименований).

Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично диссертантом, под руководством и в соавторстве с Локтевым В. Б.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Биохимическое и иммунохимическое изучение О./еПпеш.

На первом этапе проводимых исследований наше внимание было сосредоточено на изучении белкового состава половозрелого гельминта и его основных антигенов с целью определения маркеров характерных для описторхоза, вызываемого О./еНпеш. Для детального изучения белкового состава О./еПпеш нами было использовано несколько антигенов половозрелого паразита: гомогенат марит, метаболический, соматический, экскреторно-секреторный (Э-С) и яичный. Белковый состав основных антигенов половозрелого паразита был исследован методом разделения в полиакриламидном геле, и полученные результаты показали, что содержание иммуногенных белков относительно невелико, хотя белковый состав его основных антигенов весьма разнообразен (таблица 1).

Таблица 1. Полнпептидный состав основных антигенов О./еПпеш: соматического, Э-С и яичного и их взаимодействие с _иммунными сыворотками.__

Белки «Да Соматический АГ Э-С АГ Яичный АГ

Электрофорс грамма Иммуиоблоттанг с иммунными сыворотками Электрофоре грамма Иммуноблотгинг с иммунными сыворотками Электрофоре грамма Иммуноблотгинг с иммунными сыворотками

ЧИС КИС ЧИС КИС ЧИС КИС

116 + ++ +

103 + ++ ++ ++ ++ + ++

90 + +

80 + ++ + ++ +

74 + + + ++

70 + + + ++ + ++ ++

бб + + + ++

60 + + + + +

50 ++ ++ + ++

44 + -ъ + ++

40 ++ + + + ++

34 + ++

33 + + + ++

32 + +

28 ++ ++ +

27 + ++

25 ++ + +

24 ++ ++ + +

21 + ++

17 ++

16 ++

15 ++

13 ++

12 +

И +

9 +

8 + ++ +

всего 20 1 8 11 1 9 25 3 5

Примечание: ЧИС-человеческая иммунная сыворотка, КИС-кроличья иммунная сыворотка, "+" - наличие белка на электрофореграмме или взаимодействие белка с АТ; "++" - основные

белки электрофореграммы или наиболее сильное взаимодействие белка с АТ.

Удельная концентрация высокоиммуногенных белков была максимальной в

препаратах метаболитных антигенов: метаболического и Э-С, которые в десятки раз

лучше реагируют с иммунными сыворотками в ИФА по сравнению с соматическими

антигенами (рис. 1).

АГ, нг

Рис. 1. Взаимодействие в ИФА иммунных к О./еПпет сывороток кролика и человека с различными видами антигенов О./еПпеш.

1,4 - соматический антиген; 2,5 - экскреторно-секреторный антиген; 3,6 -яичный антиген;

1,2,3 - связывание с кроличьей иммунной сывороткой, 4,5,6 - связывание с человеческой иммунной сывороткой.

Антигенные свойства белков половозрелого паразита изучались в иммуноблоттинге с использованием панели полученных нами антисывороток к О./еНпеиБ (таблицы 1,2).

Таблица 2. Сводные данные нммуноблоттинга препаратов АГ марит О./еИпем,

O.viverrini, C.sinensis, N.salmincolica с антнсывороткамн к O.felineus.

Зелки, кДа O.felineus \ O.viverrini \ C.sinensis | N salmincolica

Иммуйоблоттинг с иммунными сыворотками:

ЧИС КИС кгис КсГИС ЧИС КИС кгис КсГИС ЧИС КИС КГИС ЧИС КИС КГИС

200 200-260 +

165 + +

160 + +

155 + +

120 + + +

110 + + + +

105 ++ ++ + ++ + +

100 +

97 ++ + +

90 ++ ++ ++ ++ ++

89 ++ + + +

80 + + + + ++ +

83 +

76 + + +

74 ++ +

70 ++ ++ ++ ++ ++ +

68 + +

66 ++ + ++ ++ + +

64

60 + + + + ++ + ++

57 + +

54 + + + + + +

45 +

44 +

42 +

43 +

40 +

39 +

38 +

36 + + +

35 +

34 +

32 + +

28 + + + + ++

27

26 ++ + + + + +

25 + + + ++

24 + +

16 +

15 +

И ++ ++

всего 3 5 21 7 1 6 7 6 12 6 25 2 2 6

Примечание: ЧИС-человеческая иммунная сыворотка, КИС-кроличья иммунная сыворотка, КГИС-кроличы гипериммуннах сыворотка, КсГИС-крысиная гипериммунная сыворотка, "+" -взаимодействие белка с АТ;"++" - наиболее сильное взаимодействие белка с АТ.

Различия между спектрами белков, взаимодействующих с гипериммунными и иммунными сыворотками в иммуноблотгинге, свидетельствуют о том, что при естественной инвазии формируется гуморальный иммунный ответ только на ограниченное число белков O.felineus, а именно на полипептиды 105, 74, 70, 66 кДа как основных антигенов паразита: гомогената марит и метаболического антигена, так и отдельных видов антигенов: pi05 экскреторно-секреторного и соматического и р74, р70, рбб яичного антигена.

Обнаруженная ограниченность иммунного ответа человека отчетливо указывала на дальнейшие пути совершенствования иммунодиагностики описторхоза. В коммерческих тест-системах ИФА для определения специфических антител к O.felineus в сыворотке крови человека, в основном, используются препараты соматического антигена. Полученные нами результаты говорят о неадекватности использования этого вида антигена для иммунодиагностических тест-систем и объясняют значительно лучшие результаты с использованием метаболических антигенов, так как концентрация иммуногенных белков в них значительно выше. Таким образом, очевидно, что совершенствование тест-систем для выявления специфических антител при описторхозе прежде всего должно быть связано с повышением удельной концентрации высокоиммуногенных белков в препаратах антигенов.

Изучение перекрестной активности к O.felineus антигенов гельминтов

паразитов человека.

Специфичность является важнейшим показателем ммунодиагностической системы, и поэтому возможность выраженного антигенного перекреста должна учитываться исследователями при диагностике паразитарных инфекций, особенно в случае общего ареала обитания гельминтов. Для понимания характера перекрестных специфических взаимодействий O.felineus с другими паразитами человека был исследован белковый состав антигенов некоторых гельминтов паразитов человека: Opistorchis viverrini, Clonorchis sinensis, Nanophyetus salmincolica, Trichinella spiralis, Echinococcosus granulosus, Echinococcosus multilocularis, Toxocara canis. Электрофоретический анализ показал довольно сложный белковый состав их антигенов (таблица 3).

Наличие на электрофореграммах белков с подобным молекулярным весом у некоторых гельминтов дает основание предположить, что эти белки могут выполнять сходную функцию и иметь сходные антигенные свойства.

Д НС-электрофорез в 15% ПААГ

Белки Гом. Мет. АГ О. viver- С. sinen- Гом.

кДа марит O.felineus O.felineus rini sis Метац. N salm'mcolica T.spiralis Т. canis Е granulosus Е multilocularis

250 + + + +

200 +

160 + +

105 + ++ + +

90 + +

S0 + +

74 +

73 ++

70 + ++

66 + + + + ++

60

58 + +

57 +

54 ++ + ++ ++

53 ++

51 ++

50 ++

48 ++ ++

42 + ++

41 + + ++

40 ++ ++ +

38 ++ + +

37 +

36 + +

35 +

34 + + ++ +

32 + + +

31 +

30 ++ +

29 + +

28 + +

27 + +

26 ++ ++ + ++ +

25 ++ ++ + + ++ ++ ++

24 + +

22 +

21 + +

18 + ++ + ++

17 + ++ + +

16 ++ ++ ++ ++

15 + ++

14 ++ ++ ++ +

11 +

8 ++

всего 21 8 И 17 16 6 6 11 9

Примечание: "+" - наличие белка на электрофореграмме; "++" - основные белки электрофореграммы.

Исследована перекрестная активность антигенов O.felineus и ряда гельминтов, паразитов человека, методом ИФЛ и иммуноблотгинга с использованием антисывороток к O.felineus и C.sinensis. Была обнаружена выраженная перекрестная активность антигенов О felineus с антигенам» O.viverrini, C.sinensis и умеренная с антигенами N.salmincolica (рис.2).

-АГ N salmincolica + сыворотка к O.felineus —в—АГ С sinensis + сыворотка к O.felineus ■ —А—АГ О felineus + сыворотка к О felineus

- - АГ N saimincolica + сыворотка к C.sinensis ! —я—АГ С sinensis + сыворотка к С sinensis • -j —®—АГ О felineus + сыворотка к C.sinensis

6100 2700 900 300 100 33 11 4 АГ, нг

1 0,4 0,1 0,05 0,02

Рис. 2. Взаимодействие в ИФА антигенов гельминтов с человеческими иммунными сыворотками к O.felineus и C.sinensis.

Степень перекреста, по-видимому, обусловлена видовым сродством, что косвенно подтверждается нашими исследованиями антигенов O.felineus, O.viverrini, C.sinensis и литературными данными по перекрестной реактивности антигенов гельминтов, полученными разными группами ученых. Взаимодействие антигенов паразитов с гетерологичными иммунными сыворотками O.felineus установило сходство антигенных свойств метаболитов этих гельминтов. По данным иммуноблоттинга, за перекрестное реагирование отвечает белок 100 кДа O.viverrini, 70 и 90 кДа C.sinensis и 76 и ПО кДа N.salmincolica (таблица 2).

Получение и характеризация мышиных гибридом, секретируюших специфические МКА к основному растворимому антигену 0.fel^neus.

Следующим этапом работы было получение МКА на основные иммуногены 0.felineus. Нами была получена и охарактеризована уникальная панель из 21 мышиной

гибридомной линии, стабильно продуцирующей МКА, специфические к экскреторно-секреторному антигену О./еНпеш (таблица 4).

Таблица 4. Характеристика МКА к O.felineus.

Культуральная жидкость Очищенные МКА

N Название МКА Титр МКА в ИФА Титр МКА в ИФА Захват антигена из раствора сорбированными на пластик МКА Взаимодействие в иммуноблоттинге

1 5ЕЗ/А5 1:7371 1:512000 + 160,105

2 10Е7/А5 1:2457 1:512000 + 160,105

3 2Н11/В9 1:2457 1:64000 + 160,105

4 4Н2/В8 1:2457 1:64000 + 160,105

5 4Е7/А4/Е9 1:273 1:512000 - -

6 3G7/G7 1:2457 1:512000 + 160,105

7 4А4/Е2 1:273 1:256000 + 160,105

8 10B2/EI2/H3 1:7371 1:64000 + 160,105

9 10E6/A6/D8 1:7371 1:32000 + 170

10 6Е4/В10 1:7371 1:32000 + 160,105

11 10D5/C2 1:2457 1:64000 + 160,105

12 2H8/D4/C11 1:2457 1:64000 + 160,105

13 2А6/В2 1:7371 1:512000 + 160,105

14 4G12/F2 1:2457 1:512000 + 160,105

15 5В11/А5/Е9 1:22113 1:64000 + 160,105

16 6Н4/С10/В9 1:2457 1:256000 + 160,105

17 4С6/Е6 1:2457 1:256000 + 160,105

18 5G12/F2 1:273 1:64000 + 160,105

19 10В8/Н2/В11 1:7371 1:32000 + 160,105

20 1В7/С9 1:273 1:64000 + 160,105

21 4А7/С8/В7 1:81 1:32000 - 160

Все МКА, как и иммунные сыворотки человека, лучше взаимодействовали в ИФА с Э-С АГ, чем с соматическим или яичным (рис. 3).

РисЗ. Сравнительное связывание основных антигенов О./г/шеил: соматического, Э-С, яичного с МКА и иммунной сывороткой человека.

По характеру взаимодействия с антигенами О/еИпеш в иммуноблоттинге полученные МКА были условно разделены на 3 группы: 1) 18 МКА реагировали с белками 105 и 160 кДа соматического и экскреторно-секреторного антигенов и преимущественно с белками 74,70 и 66 кДа яичного антигена;

Таблица 5. Взаимодействие МКА и иммунной сыворотки больных

опнсторхозом в иммуноблоттинге с антигенами O.felineus.

Белки мишени в антигенах О./еНпеиз

Вид антител Соматический АГ Э-С АГ Яичный АГ

МКА группа 1

10Е7ХА5 р105,р160 pI05, р 160 р50, рбб, р70, р74 р!05, р160, р205

МКА группа 2

ЮЕ6\А6Ф8 р160 р160 рбб, р70, р74

МКА группа 3

4Е7\А4\Е9 р60, р80, р90 - р50, рбб, р70, р74, р85

Иммунная сыворотка человека р 105 р105 рбб, р70, р74

2) 2 МКА реагировали с белками 160 кДА соматического и экскреторно-секреторного антигенов и исключительно с белками 74, 70 и 66 кДа яичного антигена; 3) 1 МКА реагировало с белками 90, 80, 60 кДа соматического антигена и с белками 85, 74, 66 и 50 кДа яичного антигена, но не обнаружило взаимодействия с экскреторно-секреторным антигеном (таблица 5). Нужно отметить, что МКА, не обнаружившие взаимодействия с Э-С антигеном в иммуноблоттинге, хуже других связывались в ИФА со всеми основными антигенами половозрелого паразита, МКА не реагировавшие с р105 Э-С АГ также имели очень низкий уровень связывания в ИФА.

С использованием МКА доказана несомненная взаимосвязь белков 105 кДа Э-С, соматического и 66, 70, 74 кДа яичного антигенов. Изучена перекрестная активность МКА к Э-С антигену О/еНпеги с антигенами О. \'Ыегг1т, С.зтегкгя и М.$а1ттсоИса и показано их взаимодействие с белками той же молекулярной массы, что и иммунных сывороток человека к О./еИпеш (таблица 2).

Ультраструктурно-гистохимическое изучение О./еИпеш.

Для качественной и количественной локализации на суборганном уровне основных антигенов О./ё/шеих, узнаваемых МКА и иммунной сывороткой человека, была использована иммунная электронная микроскопия с визуализацией иммунных комплексов коллоидным золотом. Было установлено, что основные иммуногены половозрелого паразита связаны с тканями тегумента, мышц, матки, семенников, кишечника и яйцами (таблица 6). Результаты иммунохимического ультраструктурного исследования позволили

подтвердить тот факт, что ткани гельминта и его поверхностные структуры вызывают слабый иммунный ответ В-клеточной системы человека, а иммунный ответ формируется в основном на продукты экскреторно-секреторной системы паразита.

Таблица б. Локализация иммуногенов O.felineus.

Название структуры Иммунная антисыворотка человека МКА группы 1 (10Е7/А5) МКА группы 2 МКА группы 3 (10Е6/А6)

Тегумент

Гликокаликс ворсинок ++ -и- +++ -

Ворсинки - - -

Гликокаликс пикальной мембраны + ++ - -

Синцитиальный слой -н- + ++++ -

Базальная мембрана + ++ ++ -

Пространство под базальной мембраной - +++ - +

Мышцы

Циркулярный и продольный мышечные слои - +++ - -

Матка

Стенка матки + -Н- + ++

Слизеподобное вещество в полости +++ +++ - +++

Семенник ■НЮ.-

Стенка + + - и. и.

Слизеподобные структуры в полости + +++ + ++

Кишечник

Ламеллы эпителиальных клеток - +++

Электронно-плотный матрикс + 1 ++ - ++

Яйцо

Наружная часть оболочки +++ +++ ++ +++

Оболочка - +++ -и- +++

Внутренняя часть яйца - 1111 - +++

Примечание: В отрицательных контролях с использованием нормальной сыворотки человека и гетерологических МКА не было обнаружено специфического связывания с АГ О/еИпеш.

Н. И. - не исследовано;

"-" - нет метки;

"+" - от 3 до б частиц золота на 10* нм;

"++" - от 6 до 9 частиц;

"+++" -от 9 до 20;

" i i i i" - выше 20 частиц золота;

Ц^Ц^ - наличие выраженной концентрации антигена в органе.

Полученные данные по белковому, антигенному и иммуногенному составу О./еНпеия

позволили выявить новые маркеры этой глистной инвазии. Наиболее значимым является

высокоиммуногенный для человека белок 105 кДа, который является основным

иммуногеном в Э-С антигене гельминта. Получение панели МКА к этому белку создало

предпосылки для конструирования новых альтернативных иммунодиагностических

систем для выявления этого маркера описторхозной инвазии. С нашей точки зрения, хорошую перспективу имеет модификация стандартных систем непрямого-ИФА анти-р 105 МКА для обнаружения антител к 105, 74, 70 и 66 кДа белкам в сыворотках крови человека. Обнаружение белка 105 кДа как основного маркера в составе экскреторных АГ паразита позволяет использовать анти-р105-МКА для создания иммунодиагностических систем для обнаружения этого антигена в физиологических жидкостях и выделениях человека.

Разработка методов иммунодиагностики O.felineus, основанных на выявлении специфических АТ в сыворотках крови с использованием МКА против 105 кДа белка.

Завершающим логическим этапом работы явилась разработка и апробация иммунодиагностических систем. Нами впервые предложена и апробирована модификация моноклональными антителами стандартной системы непрямого-ИФА для обнаружения специфических антител при описторхозе. Суть модификации заключается в использовании анти-р!05-МКА к O.felineus на начальной стадии ИФА в качестве подложки для аффинной очистки основных иммуногенноа для человека: 105, 74, 70 и 66 кДа из антигена O.felineus. В результате этого повышается удельная концентрация специфических белков на поверхности твердой фазы, что в конечном итоге должно было привести к повышению чувствительности и специфичности иммуноферментного теста, а также уменьшению времени анализа образцов (рис. 4).

время, мин

Рис. 4. Зависимость сигнала ОП в системах стандартной и модифицированной МКА от времени инкубации сывороток.

Было показано, что специфический комплекс МКА-АГ полностью сохраняет способность взаимодействия с анти-описторхозными антителами сыворотки крови человека и надежно фиксируется на твердой фазе сорбированными МКА (рис. 5).

з

2.5 2 1.5 1

0.5 0

□ связывание с Э-С АГ после очистки В связывание с Э-С АГ после сорбции

4*7 ОД ЮЛ 1

Ы5»11«в10Я4*7Ю»Г«йУ4а<вИМ4ви«*5д121«7м

Рис. 5. Сохранение свойства специфического связывания МКА с Э-С АГ после очистки каприловой кислотой и сорбции на пластиковую поверхность планшета.

Наиболее перспективным для использования в диагностике описторхоза является Э-С антиген, так как он содержит наибольшее количество 105 кДа белка. Однако его получение сопряжено с особенностями культивирование in vitro печеночных тремотод, что затрудняет его выделение в препаративных количествах. Система с подложкой из специфических МКА позволяет использовать соматический антиген, который обычно используется в коммерческих диагностикумах. На рис. 6 показаны типичные кривые взаимодействия АГ O.felineus с сыворотками после сорбции или связывания с подложкой из МКА в сравнении с Э-С антигеном с системе базового непрямого-ИФА.

Э-С ЛГ+С-К1 О fdmeus ■ МКА-ИФА сом. АГ4С-М O.fdmeus ■ МКА-ИФА Э-С АГччса О f dmeus • непрямом-ИФА сом. АГ«с-«а O.ftfmeus ■ мепрямом-ИСА Э-С ЛГ+ЧНС ■ МСА41ФА сом. ЛГ+ЧНС ■ нелрямом41ФА

187 47 12 АГ HtfriyHicy

0.75 0.18

Рис. б. Взаимодействие АГ O.felineus с иммунными сыворотками в модифицированном МКА сэндвич-ИФА и в непрямом-ИФА.

26202626202626202610111111262611751135

Кроме того, в ходе работы нами был предложен и отработан новый диагностический критерий (Дк), основанный на сравнении значений оптической плотности результатов взаимодействия тестируемого образца со специфической и неспецнфической фракциями в ИФА. Анализ полученных данных по применению альтернативного диагностического критерия в стандартной и модифицированной МКА системе показал несомненную его перспективность.

Предложенные модификации системы позволили сократить время проведения анализа образцов, увеличили чувствительность и специфичность системы до 92,68% и 97,50% соответственно по сравнению со стандартной непрямой-ИФА системой - 85,36% и 87,50% соответственно (таблица 7).

Таблица 7. Результаты тестирования верифицированных сывороток человека к О./еНпеш в сэндвнч-МКА-ИФА и непрямом-ИФА с использованием _соматического антигена О./еНпет._

Верифицированные образцы МКА-ИФА Непрямой-ИФА

Дк Дк 95%Дк 99%Дк

количество + - + - + - + -

Положительные образцы сывороток 41 38 3 35 6 35 6 34 7

Отрицательные образцы сывороток 40 1 39 5 35 6 34 5 35

Чувствительность (Ч), % 92,68 85,36 85,36 82,92

Специфичность (С), % 97,50 87,50 85,00 87,50

Индекс достоверности положительных результатов (Д+), % 97,43 87,50 85,36 87,18

Индекс достоверности отрицательных результатов (Д.), % 92,86 85,36 85,00 83,33

Достоверность результата иммунологического анализа (Дифа), % 95,06 86,42 85,18 85,19

Где: Ч=(А/А+С)х 100%; С=(ОЯ)+В) х 100%; (Д+)=(А/А+В) х 100%; (Д.)=(0/0+С)х 100%;

(Дифа)=((А+0)/(А+С+0+В)) х 100%=((А+С) х Ч+ф+В) х Сп)/(А+С+ЕН-В); А - число положительных сывороток от лиц с подтвержденным диагнозом описторхоз;

В - число положительных сывороток от лиц с отрицательным диагнозом; С - число отрицательных сывороток от лиц с подтвержденным диагнозом описторхоз;

И - число отрицательных сывороток от лиц с отрицательным диагнозом.

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что предлагаемый способ тестирования маркерных АТ в сыворотках с использованием модификации подложкой из

специфического комплекса МКА-АГ может быть широко использован для клинической диагностики и серо-эпидемиологических исследований при описторхозе. Метод обладает повышенной чувствительностью и специфичностью по сравнению со способом прототипом. Более высокие индексы достоверности результатов модифицированной МКА системы показывают, что предлагаемый способ диагностирования описторхоза обладает существенно более высокой диагностической ценностью, чем прототип непрямой-ИФА. Модификация с использованием анти-р105-МКА к O.felineus позволяет дополнительно выявлять отдельные случаи заболевания, которые не определяются в непрямом варианте ИФА.

Разработка методов иммуиодиагиостики O.felineus, основанных на выявлении

специфического антигена в кале и желчи с использованием МКА против 105

кДа белка.

Одна из особенностей иммунного ответа на описторхоз заключается в характерном низком уровне специфических АТ в период хронической фазы заболевания, но титр специфических антител держится достаточно продолжительное время, что исключает повторное тестирование для оценки результатов лечения обычно в течение года. Поэтому традиционный анализ описторхоза основанный на обнаружении специфических антител, в лучшем случае, можно рассматривать как метод предварительной лабораторной диагностики. Этих недостатков лишен способ иммуноанализа, связанный с регистрацией специфических антигенов в физиологических жидкостях и выделениях больных. Вышеуказанные соображения подтолкнули нас на разработку новых альтернативных способов диагностирования O.felineus. За основу мы взяли разработанную нами систему сэндвич-ИФА с использованием подложки анти-р105-МКА. Сконструированная иммунодиагностическая система на основе МКА для выявления антигенов O.felineus обладала чувствительностью порядка 0,5-1 нг/мл Э-С антигена и была использована для выявления р105 антигена в желчи или кале больных описторхозом людей. В качестве модели было проверено использование в системе образцов кала и желчи от здоровых людей с добавкой Э-С антигена O.felineus (рис. 7).

АГ,нг

Рис. 7. Сравнительное связывание паразитарного АГ O./elineus в системе анти-р105 МКА сэндвич-ИФА в образцах фекалий и желчи.

Модельное тестирование образцов желчи и кала подтвердило работоспособность системы с чувствительностью до 10 нг антигена в реальных образцах. Скрининг образцов желчи в ИФА (рис. 7) показал, что концентрация антигена O.felineus колеблется в широких пределах от 20 до 2400 нг/мл. Аналогичное исследование кала обнаружило концентрацию антигена 10-500 нг/г образца. Следует отметить, что дополнительное исследование желчи показало наличие в некоторых образцах веществ, мешающих специфическому реагированию и уходящих при диализе.

Хотя пока нам не удалось непосредственно связать эти показатели с количеством гельминтов, которые MOFyr находиться у исследуемого, мы имеем данные, которые показывают, что взрослый гельминт, культивируемый in vitro, может секретировать до 5000 нг растворимого антигена ежедневно. Перенося эти результаты по продукции паразитом антигена на in vivo и учитывая, что Э-С антиген секретируемый в желчь может обычно разводиться в 1:500-1:1000 в кале взрослого человека, можно оценить нижний предел чувствительности разработанной нами системы детекции антигена O.felineus до единичного паразита.

Таким образом, нами впервые разработан новый альтернативный способ диагностирования маркерного антигена O.felineus в физиологических образцах (желчь, кал) с использованием МКА к белку 105 кДа O.felineus. Специфичность этого метода для образцов желчи составила 93,7% при 92% чувствительности, для образцов фекалий 85,71% и 71,42% соответственно (таблица 8).

Таблица 8. Результаты тестирования кала и желчи в анти-р105 МКА системе

сэидвнч-ИФА.

Верифицированные образцы кал желчь

количество + - количество + -

Положительный диагноз 42 30 12 39 36 3

Отрицательный диагноз 70 10 60 16 1 15

Чувствительность, % 71,42 92

Специфичность, % 85,71 93,7

Индекс достоверности положительных результатов (Д+), % 75 92,30

Индекс достоверности отрицательных результатов (Д.), % 83,33 83,33

Достоверность результата иммунологического анализа (Дифа), % 80,36 92,73

В дополнение стандартному методу непрямого ИФА он имеет несомненные перспективы, поскольку позволяет обнаруживать незначительные количества маркеров паразитов в физиологических жидкостях и выделениях. Таким образом, метод с использованием МКА-анти-р105, позволяет свести к минимуму названные ограничения в оценке диагноза с использованием ИФА и достоверно поставить его без привлечения опытных, квалифицированных паразитологов и микроскопистов.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые охарактеризован белковый состав печеночной трематоды О./еНпеш по антигенным фракциям. Показано, что антигены половозрелой трематоды весьма разнообразны по белковому составу, большинство из белков являются хорошими иммуногенами при активной иммунизации. Впервые обнаружена ограниченность иммунного ответа человека при описторхозе белками 105 кДа экскреторно-секреторного и соматического антигена и 74, 70, 66 кДа яичного антигена

2. Исследована перекрестная активность основных антигенов О./еНпеш и ряда гельминтов - паразитов человека Показана выраженная перекрестная активность антигенов О./еИпеш с антигенами ОМуеггШ, и умеренная с МзЫттсоНса. Установлено, что за перекрестное реагирование отвечает белок 100 кДа ОлчуеггШ, 70 и 90 кДа С.-я'лелт и 76 и 110 кДа МзаШпсоПса.

3. Впервые получена и охарактеризована панель из 21 мышиной гибридомной линии, стабильно продуцирующей МКА, специфические к О^еИпеиэ. МКА к О./еНпеиз, как и иммунные сыворотки человека, лучше взаимодействовали в ИФА с экскреторно-секреторным антигеном, чем с соматическим или яичным.

МКА взаимодействующие в иммуноблотгинге с р105 экскреторно-секреторного антигена перекрестно реагировали с теми же белками ОлчхеггМ, С^тетЬ и МзЫт^псоНса, что и иммунные сыворотки человека к О./еИпеиз.

4. С использованием иммунной электронной микроскопии было установлено, что основные иммуногены половозрелого паразита связаны в основном со слизеподобными структурами кишечника, матки и семенника паразита. Ткани гельминта и его поверхностные структуры вызывают слабый иммунный ответ В-клеточной системы человека, а иммунный ответ формируется в основном на продукты экскретоно-секреторной системы паразита.

5. Впервые предложена и апробирована модификация стандартной системы непрямого-ИФА для диагностирования специфических антител при описторхозе. Суть модификации заключается в использовании МКА к р105 иммуногену О./еИпеиз в качестве подложки для аффинной очистки на начальной стадии ИФА наиболее специфической фракции антигена О./еНпеиз, в результате чего повышается её удельная концентрация на поверхности твердой фазы. Предложенная модификация увеличила чувствительность и специфичность системы до 92,68% и 97,50% соответственно по сравнению со стандартной непрямого-ИФА (85,36% и 87,50% соответственно).

6. Впервые разработан новый способ диагностирования маркерного антигена О./еИпеш в физиологических образцах (желчь, кал) с использованием модифицированной анти-р105-МКА системы ИФА. Специфичность метода для образцов желчи составила 93,7% при 92% чувствительности, для образцов фекалий 85,71% и 71,42% соответственно.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Котелкин А.Т., Разумов И.А., Локтев В.Б. Сравнительное биохимическое и иммунологическое исследование соматического и метаболического антигена О/ийЛогсйю /еПпеиз. // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. N 2. 1996. с. 18-23.

2. Котелкин А.Т., Разумов И.А., Покровская И.В., Локтев В.Б. Сравнительное изучение соматического, экскреторно-секреторного и яичного антигенов ОрЫЛогсЛи /еНпеи5. // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. N 1. 1997. с. 12-16.

3. Котелкин А.Т., Разумов И.А., Локтев В. Б. Полипептидный состав основных антигенов и выявление доминирующих иммуногенных белков Opislhorchis felineus. // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. N 4. 1998. с. 29-34.

4. Котелкин А.Т., Разумов И.А., Локтев В.Б. Получение и характеризация мышиных гибридом, секретирующих специфические моноклональные антитела к основному растворимому антигену Opislhorchis felmeus. II Медицинская паразитология и паразитарные болезни. N 3. 1999. с. 6-10.

5. Котелкин А.Т., Колесникова JI.B., Рябчикова Е.И. Локтев В.Б. Локализация иммунодоминантных антигенов в маритах Opislhorchis felineus посредством иммунной электроной микроскопии. // Вестник РАМН. 2000. в печати.

6. Котелкин А.Т., Разумов И.А., Локтев В.Б. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., используемый для получения моноклональных антител к белку 105 кДа экскреторно-секреторного антигена Opislhorchis felineus. II Патент РФ N 97109065\13 от 29.06.99.

7. Локтев В.Б., Котелкин А.Т. Разработка альтернативной диагностической системы на описторхоз. // Международный симпозиум "Опасные инфекционные заболевания: эпидемиология, экспресс диагностика и предупреждение". Киров. Россия. 1997. / Доклады, с. 167-174.

8. Котелкин А.Т., Покровская И.В., Локтева Л.И., Локтев В.Б. Некоторые подходы к иммунодиагностике описторхоза, вызываемого Opislhorchis felineus, в Сибирском регионе. // Научная конференция "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера". Новосибирск. Россия. 1998. / Тез. докл. с. 16.

9. Локтев В.Б., Котелкин А.Т., Шустов A.B., Разумов И. А., Сорокин A.B., Локтева Л .И., Покровская И.В., Нетесов C.B. Иммунодиагностика печеночных трематод у человека. // Семинар перспективных исследований "Оценка спонсируемых биологических исследований в России для нового тысячелетия". Новосибирск. Россия. 1999. / Доклады т.2, с. 39-56.

ГЩВБ «ВЕКТОР» 3.24 т.80 2000г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Котелкин, Александр Тимофеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. ИММУНОДИАГНОСТИКА ОПИСТОРХОЗА

1.1 Описторхоз.

1.1.1 Распространение описторхозной инфекции.

1.1.2 Цикл развития трематод ОрШкогскн и аопогсМъ.

1.1.3 Ультраструктура паразитических печеночных трематод.

1.2 Диагностика описторхоза.

1.2.1 Клиническая диагностика описторхоза.

1.2.2 Копроовоскопия.

1.2.3 Диагностика описторхоза вызываемого ОргъИгогсМх хыегпт с использованием ДНК-зонда.

1.2.4 Иммунодиагностика описторхоза.

1.2.5 Специфичность антигенных препаратов описторхисов.

1.2.6 Получение и характеризация специфических моноклональных антител к печеночной трематоде Ор'Мкогс!ш \iverrini.

1.2.7 Локализация иммунореактивных компонентов ОрЫкогскк умеггШ в иммунофлюоресценции.

1.2.8 Методы иммунодиагностики описторхоза.

1.2.9 Иммунодиагностика описторхоза по специфическим антителам.

1.2.10 Иммунодиагностика описторхоза вызываемого ОрЫкогсМя хЬхегпт по специфическим антигенам с использованием МКА.

Глава 2. МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ

2.1 Работа с животными и клеточными культурами.

2.2 Иммунохимические методы.

2.3 Материалы и реактивы.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 70 3.1 Биохимическое и иммунохимическое изучение АГ О./еИпет.

3.1.1 Изучение белкового состава О./еИпет.

3.1.2 Изучение белкового состава гельминтов паразитов человека.

3.1.3 Иммунохимическое исследование АГ O.felineus при помощи иммунных и гипериммунных сывороток.

3.2 Получение и характеризация мышиных гибридом, секретирующих специфические МКА к основному растворимому АГ O.felineus.

3.3 Ультраструктурно-гистохимическое изучение O.felineus.

3.4 Разработка новых подходов к иммунодиагностике описторхоза.

3.4.1 Усовершенствование иммунодиагностики O.felineus, основанной на выявлении специфических AT в сыворотках крови с использованием МКА-анти-р105.

3.4.2 Разработка метода иммунодиагностики O.felineus, основанного на выявлении специфического антигена в кале и желчи с использованием МКА-анти-р105.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Поиск и изучение иммунологических маркеров opisthorchis felineus и исследование возможности их использования для иммунодиагностики описторхоза"

Актуальность проблемы.

Ежегодно в мире умирает от инфекционных и паразитарных болезней более 17 миллионов человек [1]. По официальной статистике в России в последнее пятилетие ежегодно регистрируется до 70 тысяч случаев заболеваний людей гельминтозами. В структуре этих инвазий около 97% составляют гельминтозы, возбудители которых развиваются с участием пресноводных и морских гидробионтов. Промысловые рыбы, ракообразные, моллюски, земноводные, пресмыкающиеся, и продукты их переработки, реализуемые в стране, являются потенциальными носителями 27 видов гельминтов, представляющих опасность для человека. Наиболее эпидемиолого-эпизоотически значимыми из них являются возбудители описторхоза, дифиллоботриозов, а также эндемичных трематодозов Дальнего Востока (клонорхоз, метагонимоз, нанофиетоз, парагонимоз) [2, 3].

Описторхоз - широко распространенное в России природно-очаговое заболевание [4, 5]. На территории России из печеночных паразитических трематод наибольшее распространение имеет Ор18ЛогсЫз /еМпеш. Этим паразитом в Европейской части России инфицировано приблизительно 0,02-0,1% всего населения. Данные выборочных эпидемиологических исследований показывают, что на территории высокоэндемичных районов Сибири поражено до 85-90% всего взрослого населения. Количество страдающих от этой инвазии людей только в этих районах может быть оценено в пределах 2-10 миллионов человек. Описторхоз -тяжелое паразитарное заболевание человека и животных. Основными патогенетическими механизмами являются токсическо-аллергическое воздействие гельминтов и продуктов их жизнедеятельности на организм человека, а также механическое повреждение тканей печени с последующим развитием симптомокомплекса, связанного с поражением печени, желчевыводящих протоков, желчного пузыря и поджелудочной железы. Инвазия способствует проникновению бактериальных и вирусных инфекций в биллиарную систему, возникновению хронического восходящего гепатита, камней в желчевыводящих протоках и протоках поджелудочной железы. Прогноз развития заболевания усугубляется возможным развитием холангиокарцином и изменениям нейроэндокринной регуляции [6, 7, 8, 9]. Г

Описторхоз широко распространен во многих странах мира, особенно в Юго-Восточной Азии. В этом районе заболевание вызывается близкородственными гельминтами Opisthorchis viverrini и Clonorchis sinensis (китайский описторхоз). Возбудитель описторхоза - О.viverrini отнесен Международным агентством по исследованию рака к первой группе канцерогенов человека. Аналогичные онкогенные свойства имеются и у близкородственного O.felineus [10, 8]. В Западной Сибири, в высокоэндемичных районах по описторхозу, регистрируется самый высокий уровень заболеваний раком желчных протоков и гепатокарциномой [2]. Для некоторых стран описторхоз является типичной вновь возникающей инвазией, и поэтому особенно важен своевременный эпидемиологический контроль над этими печеночными гельминтами как в эндемичных так и в неэндемичных районах [11].

В иммунодиагностике паразитарных заболеваний достигнуты значительные успехи благодаря последним достижениям в таких областях, как культивирование патогенных паразитов in vitro, внедрение новых методов получения и очистки иммунодиагностических реагентов, использование в качестве диагностических реагентов моноклональных антител (МКА) [12]. Это позволяет усовершенствовать имеющиеся и разрабатывать новые альтернативные высокоспецифичные и чувствительные методы иммуноанализа, которые способны обнаруживать незначительные количества патогенов или их маркеров в физиологических жидкостях и выделениях.

В настоящее время иммунодиагностика описторхоза, вызываемого Opisthorchis felineus, страдает низкой чувствительностью и специфичностью из-за недостаточной изученности свойств этого паразита. Диагностические наборы для выявления специфических при описторхозе антител содержат в качестве антигена соматические фракции гельминта, имеющие невысокую удельную концентрацию специфических антигенов паразита, вследствие чего обладают низкой диагностической ценностью. Поэтому главной задачей разработчиков иммунодиагностикумов является отладка принципиального звена системы - этапа связывания антиген-антитело. Кроме того, несомненно, перспективным направлением в совершенствовании диагностики описторхоза является выявление маркерных антигенов паразита в физиологических жидкостях и выделениях. Проблема создания новых альтернативных способов диагностики таких опасных для человека паразитарных инфекций как описторхоз, имеет особое, принципиальное значение для современного здравоохранения.

Цель работы и задачи исследования.

Основной целью исследования явились поиск и изучение иммунологических маркеров половозрелой трематоды О./еИпет, а также создание иммунодиагностических систем для определения специфических антигенов и антител в клиническом материале.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

• изучение специфических свойств половозрелой печеночной трематоды О./еИпет и ее основных антигенных фракций;

• определение иммунологических маркеров половозрелого паразита О./еИпет и изучение их свойств;

• получение моноклональных антител к маркерным антигенам О./еИпеиь и изучение их свойств;

• исследование перекрестной активности антигенов О./еИпет и ряда гельминтов - паразитов человека с использованием гомологичных и гетерологичных поликлональных антисывороток и моноклональных антител;

• оптимизирование стандартной системы непрямого-ИФА для выявления специфических антител при описторхозе, вызываемом О./еИпеш, с использованием МКА;

• разработка альтернативной системы для диагностирования маркерных антигенов О./еИпет в физиологических жидкостях и выделениях.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В результате проделанной научной работы:

• получены и охарактеризованы антигены половозрелой печеночной трематоды О./еИпет',

• впервые определены для человека белки-маркеры при описторхозе, вызываемом О./еИпет'. р105 и р74, р70, рбб;

• впервые создана и охарактеризована панель мышиных гибридом-продуцентов МКА к основным антигенам О./еИпет, среди которых основную долю составляют МКА к основному иммуногену р105 кДа экскреторно-секреторного антигена печеночной трематоды О./еНпеш,

• с использованием МКА и иммунных человеческих сывороток на ультраструктурном уровне изучены гистоиммунохимические свойства половозрелых марит O.felineus, в результате чего определены места локализации основных иммуногенов паразита;

• исследованы перекрестные реакции антигенов O.felineus с другими гельминтами - паразитами человека, показана выраженная перекрестная активность антигенов O.felineus с антигенами O.viverrini, С.sinensis и умеренная с N.salmincolica. Выявлены белки, ответственные за перекрестную активность;

• на основе МКА к белку 105 кДа экскреторно-секреторного антигена O.felineus модифицирована стандартная система непрямого-ИФА для выявления специфических антител, что привело к увеличению чувствительности, специфичности, а также повысило достоверность иммунологического анализа;

• на основе модифицированной МКА системы ИФА впервые разработан иммунодиагностический метод для выявления растворимого антигена печеночной трематоды O.felineus в желчи и кале. Метод позволяет проводить исследование по одному или нескольким доступным физиологическим образцам: желчь, кал, и требует минимальных объемов исследуемых материалов, отбор которых безболезнен и потенциально не опасен. Анализ с использованием МКА-ИФА позволяет обнаруживать незначительные количества маркеров паразитов в физиологических жидкостях и выделениях.

В результате проделанной работы получены весьма обнадеживающие результаты, показывающие перспективность разработанных иммуно диагностических методов для использования в клинических и эпидемиологических исследованиях людей с целью ранней диагностики острого и хронического описторхоза, а также для оценки эффективности лечебно-профилактических мероприятий. Дальнейшее расширение арсенала иммунодиагностических тестов на описторхоз является не только важным диагностическим направлением работы, но и одним из звеньев расширения эпидемиологического надзора, позволяющего контролировать ситуацию по паразитозам на качественно новом уровне.

Апробация работы и публикации.

Материалы диссертации представлены на международном симпозиуме "Тяжелые инфекционные заболевания: эпидемиология, экспресс-диагностика и предупреждение" (Киров, 1997), научной конференции "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" (Новосибирск,

1998) и семинаре перспективных исследований "Оценка спонсируемых биологических исследований в России для нового тысячелетия" (Новосибирск,

1999). По материалам диссертации опубликовано 5 работ в отечественной печати и тезисы 3 докладов. Получено авторское свидетельство на МКА к р105 экскреторно-секреторному антигену Ор1з&огсЫ$/еИпеш.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста, включая 26 рисунков и 22 таблицы, и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (89 наименований).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Котелкин, Александр Тимофеевич

выводы

1. Впервые охарактеризован белковый состав печеночной трематоды O.felineus по антигенным фракциям. Показано, что антигены половозрелой трематоды весьма разнообразны по белковому составу, большинство из белков являются хорошими иммуногенами при активной иммунизации. Впервые обнаружена ограниченность иммунного ответа человека при описторхозе белками 105 кДа экскреторно-секреторного и соматического антигена и 74, 70, 66 кДа яичного антигена

2. Исследована перекрестная активность основных антигенов O.felineus и ряда гельминтов - паразитов человека Показана выраженная перекрестная активность антигенов O.felineus с антигенами O.viverrini, С. sinensis и умеренная с N.salmincolica. Установлено, что за перекрестное реагирование отвечает белок 100 кДа O.viverrini, 70 и 90 кДа С.sinensis и 76 и 110 кДа N. salmincolica.

3. Впервые получена и охарактеризована панель из 21 мышиной гибридомной линии, стабильно продуцирующей МКА, специфические к O.felineus. МКА к O.felineus, как и иммунные сыворотки человека, лучше взаимодействовали в ИФА с экскреторно-секреторным антигеном, чем с соматическим или яичным. МКА взаимодействующие в иммуноблоттинге с р105 экскреторно-секреторного антигена перекрестно реагировали с теми же белками O.viverrini, С.sinensis и N.salmincolica, что и иммунные сыворотки к O.felineus.

4. С использованием иммунной электронной микроскопии для качественной и количественной иммунолокализации на суборганном уровне антигенов O.felineus, узнаваемых МКА и иммунной сывороткой человека было установлено, что основные иммуногены половозрелого паразита связаны в основном со слизеподобными структурами кишечника, матки и семенника паразита. Ткани гельминта и его поверхностные структуры вызывают слабый иммунный ответ В-клеточной системы человека, а иммунный ответ формируется в основном на продукты экскретоно-секреторной системы паразита.

5. Впервые предложена и апробирована модификация стандартной системы непрямого-ИФА для диагностирования специфических антител при описторхозе. Суть модификации заключается в использовании МКА к р105 иммуногену О./еИпеия в качестве подложки для аффинной очистки на начальной стадии ИФА наиболее специфической фракции антигена О./еМпет, в результате чего повышается её удельная концентрация на поверхности твердой фазы. Предложенная модификация увеличила чувствительность и специфичность системы до 92,68% и 97,50% соответственно по сравнению со стандартной непрямого-ИФА (85,36% и 87,50% соответственно).

6. Впервые разработан новый способ диагностирования маркерного антигена О./еИпет в физиологических образцах (желчь, кал) с использованием модифицированной анти-р105-МКА системы ИФА. Специфичность метода для образцов желчи составила 93,7% при 92% чувствительности, для образцов фекалий 85,71% и 71,42% соответственно.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор считает своим долгом поблагодарить своего научного руководителя Валерия Борисовича Локтева за организацию работы и помощь в оформлении диссертации. Автор выражает глубокую признательность Киселеву Николаю Николаевичу за обучение, консультации и техническую поддержку работы. Также автор благодарит Протопопову Елену Викторовну, Перебоева Александра Владимировича и Коновалова Евгения Евгениевича за бескорыстную помощь в работе. Искреннюю благодарность автор выражает Коротченко Людмиле Ивановне, чье трудолюбие и аккуратность способствовали выполнению работы, а также всем сотрудникам отдела молекулярной вирусологии за советы и научные дискуссии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основной целью исследования явились поиск и изучение иммунологических маркеров половозрелой трематоды О./еИпеая, а также создание иммунодиагностических систем для определения специфических антигенов и антител в клиническом материале.

На первом этапе проводимых исследований наше внимание было сосредоточено на изучение белкового состава половозрелого гельминта и его основных антигенов с целью определения основных маркеров характерных для инвазии О./еИпет. Для детального изучения белкового состава О./еНпеш нами были использованы несколько видов АГ половозрелого паразита: гомогенат марит, метаболический, соматический, экскреторно-секреторный и яичный. Белковый состав основных антигенов половозрелого паразита был исследован методом разделения в полиакриламидном геле и полученные результаты показали, что содержание иммуногенных белков относительно невелико, хотя белковый состав его основных антигенов очень разнообразен. Удельная концентрация высокоиммуногенных белков была максимальной в препаратах метаболитных антигенов: метаболического и Э-С, которые в десятки раз лучше реагирует с иммунными сыворотками в ИФА по сравнению с соматическими антигенами. Соматические АГ обычно используются в коммерческих иммунодиагностикумах и, по-видимому, имеют более низкую концентрацию высокоиммуногенных полипептидов. Полученные результаты показали перспективность использования метаболитных антигенов в иммуноферментных тест-системах для диагностики описторхоза. Антигенные свойства белков половозрелого паразита изучались в иммуноблоттинге с использованием панели полученных нами антисывороток. Различия между спектрами белков, взаимодействующих с гипериммунными и иммунными сыворотками в иммуноблоттинге, свидетельствуют о том, что при естественной инвазии формируется гуморальный иммунный ответ только на ограниченное число белков О./еМпет, а именно 105, 74, 70, 66 кДа полипептидов, как в основных антигенах паразита: гомогенате марит и метаболическом антигене, так и в отдельных видах антигенов; р105 в Э-С и соматическом и р74, р70, рбб в яичном АГ. Была обнаруженна ограниченность иммунного ответа человека, которая была связана с р 105. Это отчетливо указало на дальнейшие пути совершенствования иммунодиагностики описторхоза. В коммерческих тест-системах ИФА для определения специфических АТ к О./еМпеш в сыворотке крови человека, в основном, используются препараты соматического АГ с низкой удельной концентрацией белка 105 кДа. Это говорит о неадекватности использования этого вида АГ для диагностических тест-систем и объясняет значительно лучшие результаты с использованием Э-С АГ, так как концентрация белка 105 кДа в нем значительно выше. Таким образом можно предположить, что совершенствование тест-систем должно быть связано с повышением удельной концентрации высокоиммуногенных белков в препаратах АГ для иммунодиагностических систем.

Специфичность иммунодиагностики является важнейшим показателем системы и поэтому возможность выраженного антигенного перекреста должна учитываться исследователями при диагностике паразитарных инфекций, особенно в случае наличия общего ареала обитания гельминтов. Для понимания характера перекрестных специфических взаимодействий O.felineus с другими паразитами человека был исследован белковый состав антигенов некоторых гельминтов паразитов человека: Opisthorchis viverrini, Clonorchis sinensis, Nanophyetus salmincolica, Trichinella spiralis, Echinococcosus granulosus, Echinococcosus multilocularis, Toxocara canis. Электрофоретический анализ показал довольно сложный белковый состав их антигенов. Наличие на электрофореграммах белков с подобным молекулярным весом у некоторых гельминтов дает основание предположить, что эти белки могут выполнять сходную функцию и иметь сходные антигенные свойства. Исследована перекрестная активность антигенов O.felineus и ряда гельминтов, паразитов человека, методом ИФА и иммуноблоттинга с использованием антисывороток к O.felineus и С.sinensis. Была обнаружена выраженная перекрестная активность антигенов O.felineus с антигенами О.viverrini, С. sinensis и умеренная с антигенами N. salmincolica. Степень перекреста, по-видимому, обусловлена видовым сродством, что косвенно подтверждается нашими исследованиями АГ O.felineus, О.viverrini, С. sinensis и литературными данными по перекрестной реактивности АГ гельминтов, полученными разными группами исследователей. Взаимодействие АГ паразитов с гетерологичными иммунными сыворотками O.felineus установило сходство антигенных свойств метаболитов этих гельминтов. По данным иммуноблоттинга, за перекрестное реагирование отвечает белок 100 кДа О. viverrini, 70 и 90 кДа С. sinensis и 76 и 110 кДа N. salmincolica.

Следующим этапом было получение МКА на основные иммуногены O.felineus. Нами была получена и охарактеризована уникальная панель из 21 мышиной гибридомной линии, стабильно продуцирующей МКА, специфические к O.felineus. Все МКА, как и иммунные сыворотки человека, лучше взаимодействовали с Э-С АГ, чем с соматическим или яичным. По характеру взаимодействия с антигенами O.felineus в иммуноблоттинге полученные МКА условно разделили на 3 группы: 1) 18 МКА реагировали с белками 105 и 160 кДа соматического и экскреторно-секреторного антигенов и преимущественно с белками 74, 70 и 66 кДа яичного антигена; 2) 2 МКА реагировали с белками 160 кДА соматического и экскреторно-секреторного антигенов и исключительно с белками 74, 70 и 66 кДа яичного антигена; 3)1 МКА реагировало с белками 90, 80, 60 кДа соматического антигена и с белками 85, 74, 66 и 50 кДа яичного антигена, но не обнаружило взаимодействия с экскреторно-секреторным антигеном. Нужно отметить, что МКА, не обнаружившие взаимодействия с Э-С антигеном в иммуноблоттинге, хуже других связывались в ИФА со всеми основными АГ половозрелого паразита, МКА не реагировавшие с р105 Э-С АГ также имели очень низкий уровень связывания в ИФА. С использованием МКА доказана несомненная взаимосвязь белков 105 кДа Э-С, соматического и 66, 70, 74 кДа яичного АГ. Изучена перекрестная активность МКА к O.felineus первой группы с O.viverrini, С.sinensis и N.salmincolica и показано их взаимодействие с белками той же молекулярной массы, что и иммунных сывороток к O.felineus.

Для качественной и количественной локализации на суборганном уровне основных АГ O.felineus, узнаваемых МКА и иммунной сывороткой человека, была использована иммунная электронная микроскопия с визуализацией иммунных комплексов коллоидным золотом. Было установлено, что основные иммуногены половозрелого паразита связаны со слизеподобными структурами матки, семенников и кишечника. Результаты иммунохимического ультраструктурного исследования позволили подтвердить тот факт, что ткани гельминта и его поверхностные структуры вызывают слабый иммунный ответ В-клеточной системы человека, а иммунный ответ формируется в основном на продукты Э-С системы паразита.

Полученные данные по белковому, антигенному и иммуногенному составу O.felineus позволили выявить новые маркеры этой глистной инвазии. Наиболее значимым является высокоиммуногенный для человека белок 105 кДа, который является основным в Э-С антигене гельминта. Получение панели МКА к этому белку создало предпосылки для конструирования новых альтернативных иммунодиагностических систем для выявления этого маркера описторхозной инвазии. С нашей точки зрения, хорошую перспективу имеет модификация стандартных систем непрямого-ИФА анти-р105 МКА для обнаружения антител к 105 кДа белку в сыворотках крови. Обнаружение этого белка как основного маркера в составе экскреторных АГ паразита позволяет использовать анти-р105 МКА для создания макетных иммунодиагностических систем для обнаружения этого антигена в физиологических образцах человека.

Завершающим логическим этапом работы явилась разработка и апробация диагностических систем. Нами впервые предложена и апробирована модификация стандартной ИФА системы для обнаружения специфических к р105 антител при описторхозе. Суть модификации заключается в использовании анти-р105 МКА к О./е/шеш1 на начальной стадии ИФА в качестве подложки для аффинной очистки белка 105 кДа, как наиболее иммуногенного для человека специфического антигена О./еНпет, В результате этого повышается его удельная концентрация на поверхности твердой фазы, что в конечном итоге должно было привести к повышению чувствительности и специфичности иммуноферментного теста, а также уменьшению времени анализа образцов. Было показано, что специфический комплекс МКА-АГ полностью сохраняет способность взаимодействия с анти-описторхозными АТ сыворотки крови человека и надежно фиксируется на твердой фазе сорбированными МКА. Предложен и отработан новый диагностический критерий, связанный со сравнением значения оптической плотности образца на специфическую и неспецифическую фракции. Анализ полученных данных по применению альтернативного диагностического критерия в стандартной и модифицированной МКА системе показали несомненную их перспективность.

Предложенные модификации системы позволили сократить время проведения анализа образцов, увеличили чувствительность и специфичность системы до 92,68% и 97,50% соответственно по сравнению со стандартной непрямой-ИФА системой (85,36% и 87,50% соответственно). Все это позволяет сделать вывод, что предлагаемый способ тестирования маркерных АТ в сыворотках с использованием модификации подложкой из специфического комплекса МКА-АГ может быть широко использован для клинической диагностики и серо-эпидемиологических исследований при описторхозе. Метод обладает повышенной чувствительностью и специфичностью по сравнению со способом прототипом. Более высокие индексы достоверности результатов и достоверности самой модифицированной МКА системы показывают, что предлагаемый способ диагностирования описторхоза обладает существенно более высокой диагностической достоверностью, чем прототип непрямой-ИФА. Модификация с использованием высокоспецифичных МКА к О./еМпет позволяет дополнительно выявлять отдельные случаи заболевания, которые не определяются в непрямом варианте ИФА. Модифицированная система может быть рекомендована для использования в клинической диагностики и сероэпидемиологических исследований при описторхозе.

Одна из особенностей иммунного ответа на описторхоз заключается в характерном низком уровне специфических АТ в период хронической фазы заболевания, но титр АТ держится достаточно продолжительное время, что исключает повторное тестирование для оценки результатов лечения обычно в течение года. Поэтому традиционный анализ описторхоза основанный на обнаружении специфических АТ, в лучшем случае, можно рассматривать как метод предварительной лабораторной диагностики. Этих недостатков лишен способ иммуноанализа, связанный с регистрацией специфических АГ в физиологических жидкостях и выделениях больных. Вышеуказанные соображения подтолкнули нас на разработку новых альтернативных способов диагностирования O.felineus. За основу мы взяли разработанную нами систему сэндвич-ИФА с использованием подложки анти-р105 МКА. Сконструированная иммунодиагностическая система на основе МКА для выявления АГ O.felineus обладала чувствительностью порядка 0,5-1 нг/мл Э-С АГ и была использована для выявления р105 АГ в желчи или кале больных описторхозом людей. Было установлено, что концентрация р 105 АГ в клинических образцах желчи и кала от больных людей составляет 10-2000 нг/мл и 30-500 нг/мл, соответственно. Хотя пока нам не удалось непосредственно связать эти показатели с количеством гельминтов, которые могут находиться у исследуемого, мы имеем данные, которые показывают, что взрослый гельминт, культивируемый in vitro, может секретировать до 5000 нг растворимого АГ ежедневно. Перенося эти результаты по продукции паразитом АГ на in vivo и учитывая, что Э-С АГ секретируемый в желчь может обычно разводиться в 1:500-1:1000 в кале взрослого человека. Можно оценить нижний предел чувствительности 5-Юнг/мл/паразит как нижний предел детекции системы.

Таким образом, нами впервые разработан новый альтернативный способ диагностирования маркерного антигена O.felineus в физиологических образцах (желчь, кал) с использованием МКА к белку 105 кДа O.felineus. Специфичность этого метода для образцов желчи составила 93,7% при 92% чувствительности, для образцов фекалий 85,71% и 71,42% соответственно. В противоположность стандартному методу непрямого ИФА он имеет перспективы использования в клинических и эпидемиологических исследованиях как для ранней диагностики острого и хронического описторхоза, так и для оценки эффективности лечебно-профилактических мероприятий. Таким образом, метод позволяет свести к минимуму названные ограничения в оценке диагноза и достоверно поставить его без привлечения опытных, квалифицированных паразитологов и микроскопистов. Анализ с использованием МКА позволяет обнаруживать незначительные количества маркеров паразитов в физиологических жидкостях и выделениях. Способ позволяет использовать доступные образцы, требует минимальных объемов исследуемых материалов. Отбор диагностического материала безболезнен и потенциально не опасен. Дальнейшее расширение арсенала иммунодиагностических тестов на описторхоз является не только важным диагностическим направлением работы, но и одним из звеньев расширения эпидемиологического надзора позволяющего контролировать ситуацию на качественно новом уровне.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Котелкин, Александр Тимофеевич, Кольцово

1. Сергиев В. П., Лебедева М. Н. Распространенность паразитарных болезней и их профилактика в России. //Мед. Паразитол. 1997. N3. с. 5-9.

2. Беспрозванных В. В. Вопросы эпизоотологии некоторых трематодозов в Приморском крае. //Мед. Паразитол. 1994. N3. с. 28-31.

3. Менявцева Т. А., Ратнер Г. М., Стручкова С. В. и др. Иммуноферментный анализ в диагностике описторхоза. Сообщение 1. Разработка иммуноферментного метода определения ^М антител к описторхозному антигену. //Мед. Паразитол. 1996. N1. с. 41-43.

4. Кучерук В. В., Росицкий Б. Природная очаговость инфекций основные термины и понятия. //Мед. Паразитол. 1984. N3. с. 7-16.

5. Пальцев А. И., Сидоров Л. Д. Клинико-патогенетические особенности язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки при сочетании с описторхозом. //Мед. Паразитол. 1994. N4. с. 14-18.

6. Бодня Е. И. Описторхоз и гормоны. // Мед. Паразитол. 1993. N4. с. 17-22.

7. Иванских В. И., Близнюк В. В. Влияние описторхисов на проявления вирусов герпеса второго типа в эксперименте и их возможное участие в механизме возникновения первичного рака печени. //Мед. Паразитол. 1996. N2. с. 23-26.

8. Тун М. А., Белобородова Э. И. Морфологическая диагностика поражения печени при хроническом описторхозе. //Мед. Паразитол. 1993. N3. с. 19-21.

9. Бычков В. Г., Яроцкий Л. С. Проблема онкогенности паразитов. // Мед. Паразитол. 1990. N3. с. 46-49.

10. Отчет о мировом развитии 1993. «Инвестиции в здравоохранении». Всемирный банк. - Вашингтон, 1993.

11. Иммуноферментный анализ: Пер. с англ. / Под ред. Нго Т. и Ленхоффа Г. М.: «Мир». 1988. 446 с.

12. Бессонов А. С. Паразитарные зоонозы, передающиеся через объекты внешней среды и продукты питания (мясо, рыбу и др.). // Мед. Паразитол. 1997. N3. с. 56-60.

13. Алмазов В. А., Антонов М. М. и др. Тропические болезни / Под Ред. Е. П. Шуваловой. М.: «Медицина». 1987. 592 с.

14. Белоусов Ю. Б., Винокуров И. Н. и др. Тропические болезни / Под ред. Ильинского Ю. А., ЛучшеваВ. М. М.: «Медицина», 1984. 272 с.

15. Глумов В. Я., Глумова В. А. Некоторые аспекты морфо- и патогенеза хронического гепатита и церроза печени при описторхозе. // Мед. Паразитол. 1984. N2. с. 78-82.

16. Пальцев А. И. Клинико-лабораторное и патоморфологическое исследование печени у больных хроническим описторхозом. // Мед. Паразитол. 1998. N3. с. 28-32.

17. Завойкин В. Д. Структура ареала описторхоза и задачи борьбы с инвазией. // Мед. Паразитол. 1990. N3. с. 26-30.

18. Беэр С.А.// Мед. Паразитол. 1968. N5. с. 519-523.

19. Беэр С. А.// Мед. Паразитол. 1968. N6. с. 677-686.23. ЗНиСО /N5/50

20. Кузнецова В. Г., Куимова И. В., Буйкин В. Ф., Пальцев А. И. // Мед. Паразитол. 1987. N5. с. 29-31.

21. Завойкин В. Д., Дарченкова Н. Н., Зеля О. П. Структура нозоареала в Обь-Иртышском бассейне//Мед. Паразитол. 1991. N6. с. 25-28.

22. Sirisinha S., Sahassananda D., Bunnag D., Rim H. J. Immunological analysis of Opisthorchis and Clonorchis antigen. // Journal of Helminthology. 1990. v.66. p.133-138.27.