Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Описторхоз плотоядных животных в условиях Западной Сибири

ВАК РФ 03.02.11, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Описторхоз плотоядных животных в условиях Западной Сибири"

ШИБИТОВ Самат Карабасвич

ОПИСТОРХОЗ ПЛОТОЯДНЫХ ЖИВОТНЫХ В УСЛОВИЯХ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ (распространение, патогенез, диагностика, меры борьбы)

03.02.11 - паразитология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

3 ОКТ 2013

005533783

Москва - 2013

005533783

Работа выполнена в проблемной лаборатории ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им К.И. Скрябина» Россельхозакадемии

Научный руководитель:

-доктор ветеринарных наук, профессор Сафиуллий Ринат Туктарович

Официальные оппоненты:

-Ястреб Валерий Брониславович, доктор ветеринарных наук, ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И.Скрябина, старший научный сотрудник лаборатории иммунодиагностики и клеточной технологии

-Толстенков Олег Олегович, кандидат биологических наук, Центр паразитологии Института проблем экологии и эволюции им. А.Н.Северцова РАН, научный сотрудник лаборатории экспериментальной паразитологии

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет»

Защита диссертации состоится о 2013 г. в »

часов на заседании совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание учёной степени доктора наук Д. 006.011.01 созданного на базе ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина» Россельхозакадемии

Адрес: 117218, г. Москва, Б.Черемушкинская ул., д. 28 . '

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИГИС.

Автореферат разослан ОЗ- УчЛ" 2013 г.

Ученый секретарь совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание учёной степени доктора наук,

д.б.н., профессор: Бережко Вера Кузьминична

/7

1. Введение

Актуальность проблемы. Описторхоз является наиболее широко распространенной инвазией плотоядных животных и человека в регионах Западной Сибири, данное заболевание характеризуется хроническим течением, сменяющееся частыми обострениями, отягощает многие сопутствующие заболевания и заканчивается, как правило, циррозом или возникновением первичного (биологического) рака печени.

В Западной Сибири действующий очаг Opisthorchis felineus находится в Ханты-Мансийском автономном округе в пределах среднего течения Оби, менее распространенными регионами в порядке убывания считаются Томская область, Ямало-Ненецкий автономный округ, Новосибирская, Тюменская и Омская области. В общемировом масштабе на Россию приходится не менее 70% заболеваемости людей, Украину и Казахстан -примерно по 7-10%, Беларусь - около 3-5% и на долю стран Западной Европы, включая страны Балтии, - оставшиеся 3^4%. Иными словами, Россия продолжает «держать первенство» по распространенности этого опасного заболевания. В южном полушарии аналогичная ситуация по описторхозу, где в очаге сконцентрировано 70-80 % заболеваемости, наблюдается в Юго-Восточной Азии (Таиланд, Камбоджа, Вьетнам, Китай), но возбудителем там является Opisthorchis viverrini (С.А. Бэер, 2005).

В начале двадцатого века паразитологи интенсивно изучали зараженность промежуточных и дефинитивных хозяев, биологию, патогенез, клинические признаки, а также разрабатывали новые методы диагностики и меры борьбы с описторхозом в Западной Сибири (И.М. Исайчиков, 1925; A.B. Светлов, Р.К. Окулова, 1928; К.И. Скрябин, 1929-1932; H.H. Плотников, JI.K. Зарчанинов, 1932). В связи с широким распространением описторхоза среди людей, К.И. Скрябин считал описторхоз социально-экономической проблемой и призывал к борьбе с данным заболеванием.

В середине XX века изучение описторхоза в Западной Сибири, в том числе по зараженности первых, вторых промежуточных хозяев, а также поиск новых методов борьбы с описторхозом плотоядных, продолжались, но проблема так и не была решена, а только разрасталась, не поспевая за миграцией большого количества населения в связи с открытием месторождений полезных ископаемых в Западной Сибири и как правило, увеличение количества больных описторхозом (С.Д. Титова, 1946-1965; В.Ф. Мартынов, 1958; H.H. Плотников, 1967).

К концу XX столетия в Западной Сибири была принята первая Межотраслевая комплексная научная программа "Описторхоз" (1976), в которой участвовали 40 учреждений-соисполнителей в России, Украине и Казахстане. Благодаря этому разработаны и изданы кадастры очагов описторхоза Урала, Сибири и Российской Федерации. В кадастрах представлены сведения за период с 1929 г. о зараженности населения, инвазированности домашних и диких млекопитающих, рыб семейства карповых и моллюсков возбудителем описторхоза во всех регионах России. В этот период разработаны меры профилактики, диагностики, появились

достаточно эффективные средства для лечения описторхоза, средства для уничтожения первых промежуточных хозяев описторхисов. Все это привело к заметному снижению описторхоза в отдельных областях таких как: Тюменская (Юг) обл., Омская, Новосибирская, Курганская и другие регионы.

В 90- е годы XX столетия данная программа перестала действовать в связи с развалом СССР, с другой стороны в Западной Сибири (Ханты-Мансийском автономном округе) наблюдалась вторая волна миграции населения для развития нефтяной отрасли России. Проблема описторхоза в данном регионе обретает очаговый характер и остается предельно актуальной для современной медицины и ветеринарии по настоящее время. Предложенные ранее средства для лечения животных и человека были практически малопригодны в связи с высокой токсичностью и недостаточной эффективностью, методы диагностики были малоинформативными и морально устаревшими. (ВЛ. Пустовалова, В.П. Сергиев, 1996, Т.М. Гузеева, 2011).

В последние годы санитарно - паразитологические исследования почвы уменьшились, соответственно снизилось количество выявлений яиц гельминтов и простейших. На долю яиц аскарид приходится 50%, токсокар -38%, власоглава - 5%, цист лямблий - 3%, остриц - 2%, в 2%-х проб обнаружены яйца описторхисов (Г.Г. Онищенко, 2010).

В современных условиях необходимо проводить изыскание новых высокоэффективных химиопрепаратов против описторхоза плотоядных животных, совершенствовать существующие методы диагностики, своевременно информировать владельцев животных о необходимости соблюдать культуру кормления домашних плотоядных и эти меры помогут снизить заболеваемость описторхозом среди животных и человека.

Цель и задачи исследований. Целью нашей работы было изучение эпизоотической ситуации по описторхозу плотоядных животных в Западной Сибири и усовершенствование мер борьбы с данной инвазией.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие конкретные задачи:

• изучить распространение описторхоза среди промежуточных и дефинитивных хозяев с учетом сезонной и возрастной динамики зараженности;

• определить контаминацию объектов внешней среды яйцами описторхисов, их роль в циркуляции инвазии в природе;

• оценить развитие описторхоза на модели in vivo и in vitro в условиях лаборатории;

• оценить и усовершенствовать методы диагностики описторхоза плотоядных животных;

• изучить противоописторхозную активность новых препаратов в эксперименте и на спонтанно зараженных животных, определить экономическую эффективность их применения;

• разработать рекомендации по борьбе с описторхозом плотоядных животных в условиях Западной Сибири.

Научная новизна. Разработана экспериментальная модель развития метацеркариев Opistorchis felineus в морских свинках при разных способах введения in vivo в условиях лаборатории, установлена их выживаемость при разных температурных режимах и в разных средах in vitro.

Получены новые данные по распространению, сезонной и возрастной динамике зараженности дефинитивных хозяев Opisthorchis felineus. Определена загрязненность объектов внешней среды яйцами описторхисов. Оценена зараженность первых промежуточных хозяев личиночными стадиями Opisthorchis felineus. Впервые испытан метод диагностики описторхоза плотоядных животных с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР). Опробован метод седиментационной диагностики описторхоза плотоядных животных с использованием одноразовых концентраторов «Parasep».

Впервые испытан новый комбинированный препарат для лечения описторхоза плотоядных животных празиотрем в эксперименте и в условиях производства, установлена его высокая экстенсэффективность (97,3-100%) и экономичность.

Практическая значимость. По материалам проведенных исследований разработаны: «Рекомендации по борьбе с описторхозом плотоядных животных в условиях Западной Сибири», одобренные секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (протокол №3 от 23 сентября 2009 г.); «Методика постановки полимеразой цепной реакции при описторхозе (Opisthorchis felineus) плотоядных животных», одобренная на заседании секции «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (протокол №3 от 23 сентября 2011г.); «Способ лечения описторхоза плотоядных животных» (патент РФ № 2440109 от 20 января 2012 г.); «Расценки на постановку ПЦР для диагностики описторхоза плотоядных животных», одобренные на заседании секции «Организация, экономика и история ветеринарии» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (протокол № 1 от 1 июня 2013 года).

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на отчетных научных конференциях ВИГИС (20082012 гг.); на научно-практических конференциях «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (г. Москва, 2010,2011,2012).

Личный вклад соискателя. Представленная диссертационная работа является результатом пятилетних научных исследований автора. Исследования по изучению распространения описторхоза среди промежуточных и дефинитивных хозяев с учетом сезонной и возрастной динамики, контаминации объектов внешней среды яйцами описторхисов, их роль в циркуляции инвазии в природе, развитие

описторхоза на модели in vivo и in vitro в условиях лаборатории, апробирование и усовершенствование новых методов диагностики описторхоза плотоядных животных - выполнены соискателем лично.

Рекомендации по борьбе с описторхозом плотоядных животных в условиях Западной Сибири, способ лечения описторхоза плотоядных животных (патент РФ № 2440109 от 20 января 2012 г.) и расценки на постановку ПЦР для диагностики описторхоза плотоядных животных выполнены совместно с научным руководителем. Работа выполнялась под руководством доктора ветеринарных наук, профессора Р.Т. Сафиуллина, который оказывал научно-методическую помощь в проведении исследований и анализе полученных результатов. Статьи, написанные в соавторстве, включают не менее 80 % материалов в исследовании соискателя. Соавторы не возражают в использовании результатов совместных исследований.

Основные положения, выносимые на защиту:

• распространение описторхоза среди промежуточных и дефинитивных хозяев с учетом сезонной и возрастной динамики; контаминация объектов внешней среды яйцами описторхисов;

• экспериментальная модель развития метацеркариев Opistorchis felineus in vivo и in vitro в условиях лаборатории;

• методы прижизненной диагностики описторхоза плотоядных животных (ПЦР, седиментация);

• противоописторхозная активность новых препаратов в эксперименте и на спонтанно зараженных животных, экономическая эффективность их применения.

Публикации. По результатам проведенных исследований по теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в которых изложены основные положения и выводы по работе, 6 из них в изданиях рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 167 страницах компьютерного набора текста, состоит из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Список литературы включает 154 наименований, в том числе 112 работ отечественных и 42 иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 16 рисунками, 33 таблицами, 4 диаграммами. Приложение к диссертации включает: титульные листы нормативных документов, копию патента, выписку из протоколов заседаний секций «Инвазионные болезни животных» и «Организация, экономика и история ветеринарии» Отделения ветеринарной медицины РАСХН.

2. Обзор литературы

Представлен анализ литературы по распространению описторхоза плотоядных животных и человека, патогенному действию описторхисов на организм, диагностике и лечению описторхоза.

3. Собственные исследования 3.1 Материалы и методы

Изучение зараженности плотоядных животных описторхисами проводили в проблемной лаборатории Всероссийского института гельминтологии имени К.И. Скрябина (ВИГИС), ветеринарных клиниках и лабораториях продовольственных рынков г. Нягань Ханты-Мансийского автономного округа (ХМАО), г. Курган и г. Москвы.

Для исследования на зараженность гельминтами были отобраны спонтанно зараженные кошки и собаки, поступавшие на прием в период 2008-2011 годов. Исследованиям подвергали собак и кошек от 3 - месячного до 15-годовалого возраста, живой массой 1-27кг. Для копроовоскопии материала от больных и подозреваемых в заболевании животных использовали методы: Като и Миура, последовательного промывания, седиментации при помощи одноразовых концентраторов для забора и фильтрации фекалий «Рагавер».

Изучение сезонной и возрастной динамики зараженности проводили в условиях действующего очага в Ханты-Мансийском автономном округе г. Нягань на спонтанно инвазированных животных, поступавших на прием в ветеринарную клинику теми же методами.

Эпидемиологические данные получали в официальных источниках Роспотребнадзора, статистические данные из официальных источников Росстата.

Моллюсков собирали при помощи бентосного сачка в Октябрьском районе ХМАО из трех водоемов, двух рек и одного озера исследовано в лаборатории ветклиники в г. Нягань компрессорным методом 144 экземпляра моллюсков семейства ВкИупМае.

В лабораториях рынков указанных регионов и в проблемной лаборатории ВИГИС исследовали спонтанно зараженную рыбу (язь, плотва, лещ, карась, щука, муксун). Возраст, которых колебался от 1 до 6 лет, масса от 70 до 900 г, длинна тела от 7 до 40 см. Для выявления метацеркариев в тканях рыб использовали два метода в зависимости от условий работы: компрессорный и переваривания мышц в искусственном желудочном соке. И в том, и в другом случае с исследуемой рыбы удаляли чешую и снимали кожу. Для переваривания в искусственном желудочном соке использовали пассивное переваривание и с помощью аппарата АВТЛ, выделенных метацеркариев подсчитывали с помощью камеры Мак Мастера.

Контаминацию объектов внешней среды изучали в г. Нягань Ханты-Мансийского автономного округа, для этого исследовали 18 проб почвы из

трех районов города (берег реки, поселок, и спальный район) по методу H.A. Романенко (1996) и на очистных сооружениях города было исследовано 52 литра воды методом седиментации.

Изучение экспериментальной модели описторхоза проводили в условиях лаборатории ВИГИС. Для наблюдения за развитием метацеркариев in vitro их выделяли методом переваривания в искусственном желудочном соке из спонтанно зараженного язя и помещали в пробирки по 100 метацеркариев, после чего помещали в разные среды и температурные режимы и через определенное время учитывали результаты. Также создавали группы лабораторных животных (хомяки и морские свинки) для исследований in vivo, которых заражали метацеркариями Opisthorchis felineus с помощью шприца перорально, в 12-перстную кишку, внутрибрюшинно и интракардиально. Через 21 день после неполного гельминтологического вскрытия оценивали результаты.

Для изучения изменений гематологических показателей зараженных лабораторных животных создавали группы из сирийских хомяков, от которых получали цельную кровь из полости сердца с помощью шприца, затем кровь переливали в пластиковые пробирки объемом 2,0 мл, содержащих ЭДТА в качестве антикоагулянта и исследовали в условиях сертифицированной лаборатории на гематологическом анализаторе.

В своей работе использовался для диагностики описторхоза животных использовали одноразовые концентраторы «Parasep», предназначенных для концентрирования яиц описторхисов методом центрифугирования через специализированный фильтр (модификация формалин-эфирного метода). Этим методом, исследовали зараженных лабораторных в виварии ВИГИС и спонтанно инвазированных плотоядных животных в условиях ветеринарных клиник.

ПЦР диагностику проводили в условиях ПЦР-лаборатории ВИГИС, предварительно определяли праймеры с помощью генбанка и синтезировали в специализированной сертифицированной лаборатории, для ПЦР применяли оборудование (амплификатор, система электрофореза) «Bio-Rad», центрифугу, вортекс и лабораторный пластик «Eppendorf», наборы для выделения ДНК «Invitrogen» и для постановки ПЦР, наборы ООО «Изоген».

Норму затрат времени на постановку ПЦР при описторхозе плотоядных животных устанавливали по данным хрономегражных наблюдений за работой каждой категории исполнителей в условиях ПЦР лаборатории ВИГИС.

Лечебную эффективность назначения препаратов, разных доз и их комбинаций определяли по результатам клинических наблюдений, копроскопических исследований, а так же убоя и вскрытия опытных, спонтанно зараженных животных через 30-35 суток после лечебного назначения с установлением экстенс - и интенсэффективности.

Полученные данные обрабатывали методом вариационной статистики по Стьюденту (В.Ю.Урбах, 1975) с использованием программного обеспечения MS Exel 2007, «Статистика».

При выполнении работы руководствовались следующими нормативными документами: МУ по лабораторным исследованиям на гельминтозы плотоядных, МУК 4.2.796-99 «Методы санитарно-паразитологических исследований: Методические указания», МУК 3.2.988-00 «Методы санитарно-паразитологической экспертизы рыбы, моллюсков, ракообразных, земноводных, пресмыкающихся и продуктов их переработки: Методические указания», МУК 4.2.735-99 «Паразитологические методы лабораторной диагностики», инструкция «О мероприятиях по предупреждению и ликвидации заболеваний животных гельминтозами» (1999), инструкция по применению аппаратов (АВТ или АВТ-У) для выделения личинок трихинелл при групповом методе трихинеллоскопии свинины (1986), СанПиН 2.1.5.980.00. «Гигиенические требования к охране поверхностных вод», СанПиН 3.2.1333-03 "Профилактика паразитарных болезней на территории Российской Федерации".

4. Результаты исследований

4.1 Изучение распространения описторхоза среди окончательных, промежуточных и дополнительных хозяев

4.1.1 Заболеваемость описторхозом населения РФ и Западной Сибири

Вопросы эпидемиологии в Западной Сибири проанализированы нами в регионах, с административными центрами расположеными в бассейне реки Обь с Иртышем - это Омская, Новосибирская, Тюменская, Томская области, Ханты-Мансийский (ХМАО), Ямало-Ненецкий (ЯНАО) автономные округа, а также в целом по России, и в отдельно взятом городе ХМАО, Нягань. Данные любезно предоставлены Федеральным Государственным учреждением здравоохранения «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора, и территориальным управлением Роспотребнадзора по г. Нягань.

В процентах из числа заболевших к общему числу населения России и регионов Западной Сибири, показала что, большая часть, 32,39% приходится на Ханты-Мансийский АО, затем следуют Томская 14,17%, Тюменская 10,11%, Новосибирская область- 8,46%, Ямало-Ненецкий АО 5,07% и Омская область 4,75%. В целом, процент заболеваемости в данных субъектах составил 74,95%, тогда как остальные 25,05% приходится на все оставшиеся субъекты Российской Федерации.

Полученные данные свидетельствуют что, по абсолютному показателю заболеваемость увеличивается с юга на север, т.е. Омская, Новосибирская, Тюменская, Томская и достигает максимума в ХМАО и снижается в ЯНАО.

Источником инвазии всегда была недостаточно обезвреженная рыба, по данным статистики Роспотребнадзора по г. Нягань в 2006 г. из восьми заразившихся, четверо употребляли в пищу вяленого язя, трое слабосоленого язя и один употреблял в пищу пироги с язем.

4.1.2 Зараженность кошек и собак в ХМАО, Курганской области и г.

Москве

По результатам проведенных за 2009-2011 годы исследований в очаге описторхоза г. Нягань было обследовано: кошек - 251 голов, из которых описторхоз регистрировали у 121 кошки, общая экстенсивность инвазии (ЭИ) была на уровне 48,2 %. За 7 месяцев 2009 года заболело 24 головы из 45 обследованных при этом ЭИ составила 53,06%, в 2010 заболело 44 из 89 обследованных, ЭИ - равнялась 49,43% и в 2011 г. 53 кошки заболели из 117 обследованных, ЭИ составила 45,29%.

Полученные результаты свидетельствуют о медленном снижении заболеваемости кошек описторхозом в очаге данной инвазии (диагр. 1) - это можно объяснить тем что, современных кошек чаще стали кормить промышленными кормами, которые доступны и удобны в применении для владельцев кошек, немаловажную роль в этом процессе играет разъяснительная работа ветеринарных врачей среди населения эндемичной территории.

Из числа зараженных описторхозом кошек самцы болели чаще самок 75 и 46 (62 и 38%) соответственно. Основной возраст заболевших колебался от одного до шести лет - это можно объяснить тем что, качество и срок жизни при описторхозе сокращается и зависит от интенсивности инвазии, поражения печени и реже поджелудочной железы. Согласно нашим данным, сезонность заболевания практически не отличалась из года в год, пики наблюдались зимой и летом т.к. заболевание характеризуется хроническим течением и способностью обострятся в пик как летнего, так и зимнего сезона.

Диаграмма 1

Экстенсивность описторхозной инвазии у кошек в очаге заболевания г. Нягань (ХМАО) за 2009-2011 г.г.

Собак разного возраста в очаге заболевания было обследовано 35 голов, из которых 6 были поражены описторхозом, экстенсивность инвазии составила 17,14%. По анамнестическим данным собаки реже подвержены

скармливанию рыбы владельцами, в соответствии с этим нами исследовались только те собаки, которым в рацион добавляли сырую рыбу.

В Кургане экстенсивность описторхозной инвазии составила 21,73 % у кошек, и 10 % у собак. Такую высокую зараженность можно объяснить тем, что в данной местности практически всех кошек кормили «со стола» или смешанно, и почти всегда в рационе присутствовала сырая рыба.

В Москве, по данным наших исследований, экстенсивность описторхозной инвазии у кошек составила 1,6%, а собаки были свободны от описторхоза. Все случаи заболевания носят «завозной» характер, чаще зараженная рыба поступает из эндемичных регионов или же наоборот больных животных завозят из других регионов.

По полученным данным необходимо отметить, что в очаге описторхоза г. Нягань (ХМАО) заболеваемость кошек имеет тенденцию к медленному снижению. И напротив высокий показатель заболеваемости у кошек в Кургане, где в 80-х годах прошлого столетия эффективно искореняли инвазию разными методами у людей благодаря принятой всесоюзной программе борьбы с описторхозом. Учитывая, что кошки могут быть биологическим маркером заболеваемости человека описторхозом можно предположить значительную заболеваемость людей в данном регионе. Москва, как и следовало ожидать, оказалась благополучной по описторхозу кошек.

4.1.3 Распространение первых промежуточных хозяев - моллюсков в условиях Ханты - Мансийского автономного округа

По результатам обследования трех водоемов в Октябрьском районе ХМАО лишь в одном были обнаружены моллюски битиниид родов Codiella и Opisthorchophorus. При исследовании собранных в июле моллюсков из 72 просмотренных зараженными оказались три особи, экстенсинвазированность личиночными формами описторхисов составила 4,2%, количество личинок трематод у зараженных особей колебалось от двух до пяти экземпляров. Тогда как при обследовании собранных в августе моллюсков зараженных было пять из 72, экстенсинвазированность описторхозной инвазии составила 6,9% (табл.2), а количество личиночных форм трематод колебалось от двух до семи экземпляров. Средняя экстенсивность описторхозной инвазии у первых промежуточных хозяев, собранных в июле и августе составила 5,6%, а количество личинок трематод колебалось от двух до семи экземпляров.

Относительно высокая плотность битиниид в водоеме Вандмтор объясняется благоприятными условиями для поддержания популяции моллюсков, такие как; отсутствие течения, прогрев воды, высокая растительность и большая территория разлива в весенний период. Так, площадь водного зеркала весной, в период разлива, составляет 127 км2. Такие места, как правило, богаты рыбой, в связи с благоприятной для неё кормовой базой, с высокой вероятностью заражения церкариями Opisthorchis felineus.

Таблица 1

Характеристика водоемов в Октябрьском районе ХМАО на наличие битиний и их зараженность описторхисами

№ Расположение водоема Наличие и ЭИ личиночными

п/п плотность формами

битиний экз/м2 в описторхисов, % в

июль август июль август

1 Сор Вандмтор 177 186 4,2 6,9

2 Берег реки Обь нет нет - -

3 Берег реки Нягань-Юган нет нет - -

4.1.4 Зараженность вторых промежуточных хозяев метацеркариями Opisthorchis felineus

Для изучения зараженности рыб семейства карповых метацеркариями Opisthorchis felineus в Обь - Иртышском бассейне нами были выбраны два участка, первый неблагополучный пункт по описторхозу карповых находился на участке реки Обь в районе п. Октябрьское Ханты-Мансийского Автономного округа, второй находился на участке реки Тобол в районе г. Кургана (табл. 2). Сезонную динамику зараженности язя изучали на примере первого пункта, одновременно исследуя интенсивность инвазии при помощи переваривания мышц в АВТЛ по анатомическим областям рыбы.

Таблица 2

Инвазированность рыб метацеркариями Opisthorchis felineus в реке Объ (п. Октябрьское, Ханты-Мансийского А.О.)

Вид рыб Исследовано экземпляров Заражено ЭИ %. ИИ, экз./МЦ

Язь {Leuciscus idus) 46 46 100 976 ±7,12

Лещ (Abramis brama) 30 0 0 0

Плотва сибирская(Л«//7«5 rutilus lacusíris) 45 3 6,7 84 ±3,36

ЩукаС&ол: lucius) 20 0 0 0

Муксун (Coregonus muksun) 15 0 0 0

По данным наших исследований в очаге описторхоза, расположенного в ХМАО на участке реки Обь, п. Октябрьское, зараженными метацеркариями Ор1зЙюгсЫ5 felineus оказались два вида рыб; язь и плотва сибирская, причем ЭИ - у язя составила 100%, а у плотвы 6,7%, ИИ - составила 976 и 84 соответственно. На участке реки Тобол в районе г. Кургана из шести обследованных видов рыб был выявлен один зараженный метацеркариями

Opisthorchis felineus - язь, ЭИ - составила 100%, а ИИ - равнялась в среднем 130 экз. на особь. Подводя итог можно отметить 100%-ную зараженность данной инвазией язя в обоих очагах, но интенсивность инвазии существенно отличалась. Это можно объяснить природно-климатическими и ландшафтными различиями двух регионов. Исходя из отмеченного можно сделать вывод, что употребление в пищу не обезвреженного язя является основной причиной заболевания описторхозом окончательных хозяев в рассматриваемых регионах.

В теплый сезон года - весенне-летний период средняя интенсивность спонтанной описторхозной инвазии в расчете на одну зараженную рыбу была выше (1953 экз.) на 58,4%, чем в осенне-зимний период (1141 экз.), более интенсивное заражение рыбы в весенне-летний период, связано с активностью и зараженностью промежуточных хозяев моллюсков.

Метацеркарии Opisthorchis felineus локализуются практически во всех поверхностных мышцах язя, при этом, не проникая во внутренние органы, наиболее пораженными оказались мышцы спины - 58,73 %, мышцы живота-26,15% и меньше всего в хвостовых -15,12% . По полученным нами данным можно сделать вывод, что после первого переваривания в мышцах язя остается около 50% метацеркариев, а после второго переваривания выявляли только единичные метацеркарии.

Диаграмма 2

Локализация метацеркариев Ор1$А10гс1п8 ГеПпеив в разных группах мышц у спонтанно зараженного язя

4.2 Изучение контаминации объектов внешней среды яйцами и личинками гельминтов

4.2.1 Контаминация яйцами Opisthorchis felineus стоков из очистных сооружений г. Нягань ХМАО-Югры

Проведенные исследования показали что, очищенные сточные воды являются дополнительным и вполне значительным фактором загрязнения реки Нягань-Юган, который в свою очередь является притоком реки Обь с Иртышем. Интенсивность инвазии колеблется в пределах одного десятка жизнеспособных яиц описторхисов в одном литре очищенной воды или в пересчете на кубический метр несколько тысяч яиц. Содержание яиц гельминтов в сбрасываемой очищенной воде в июне было выше, чем в апреле и мае, что совпадает с полученными и выше описанными нами, данными по заболеваемости людей, а так же домашних плотоядных. Помимо яиц Opisthorchis felineus в обследованных пробах нами обнаружены яйца других гельминтов, в том числе Diphyllobothrium spp. - 12%, Ascaris spp. - 11%, Toxocara spp. - 10%, Taenia spp. - 7%, цист простейших -7% и разных личинок нематод - 22%, доля яиц Opisthorchis felineus составила- 31%.

4.2.2. Контаминация почвы в поселковых (сельских), городских условиях и в окрестностях водоема яйцами гельминтов

Отбор образцов проводили в трех районах города Нягань расположенного в действующем очаге описторхоза: поселок с одноэтажными домами население 3 тысячи человек; спальный район с населением 30 тысяч человек и берег реки Нягань-Юган близ города (диагр.З).

Диаграмма 3

Загрязненность почвы в разных районах г. Нягань яйцами гельминтов

Песелок-

Сжяьны! район

Eèper р«-

По данным исследований, наибольшая контаминация почвы яйцами описторхисов в г. Нягань установлена на берегу реки Нягань-Юган - 43 экз. или 57% от всех обнаруженных жизнеспособных яиц в разных районах населенного пункта, затем идут поселок (частный сектор) 23 экз. или 31 % и

спальный район 9 яиц в или 12 % соответственно в 1 кг почвы. Результаты проведенных исследований показали, что в пробах из территории поселка выявлено 64 жизнеспособных яиц гельминтов, в том числе; Opisthorchis felineus - 23 (37 %), Taenia spp. - 11 (17%), Ascaris spp - 15 (23%), Toxocara spp. - 15 (23%). В Спальном районе всего выявлено 22 жизнеспособных яиц гельминтов, в том числе; Opisthorchis felineus 9 (41%), Ascaris spp - 6 (27%), Toxocara spp. - 7 (32 %). На берегу реки Нягань-Юган обнаружено 68 жизнеспособных яиц гельминтов, в том числе; Opisthorchis felineus - 43 (63%), Toxocara spp. - 13 (19%), Diphyllobothrium spp. - 12 (18%). Высокую зараженность почвы прибрежной территории можно объяснить низменным расположением и соответственно загрязнением сточными водами.

4.3 Изучение описторхоза на модели лабораторных животных in vivo и in

vitro

4.3.1 Развитие метацеркариев Opisthorchis felineus в разных средах

in vitro

По результатам исследований in vitro установлено что, при температуре 38°С выход метацеркариев (далее МЦ) путем разрыва оболочки, наступал в период от 1-12 часов, а продолжительность жизни эксцистированных МЦ составила от 12 до 48 часов; при комнатной температуре выход МЦ путем разрыва оболочки, наступал в период от 1 по 15 сутки, а продолжительность жизни эксцистированных МЦ в среднем составила 10 суток; при температуре 4°С выход МЦ путем разрыва оболочки, наступал в период до 20-е сутки, а продолжительность жизни эксцистированных МЦ в среднем составила 20 суток; в растворе Рингер-Локка при температуре 4°С, выход МЦ путем разрыва оболочки, наступал только к 60-му дню и составил всего 5%, а нежизнеспособных МЦ было лишь 6%, через 100 дней наблюдения инвазионных (живых), МЦ было 54 %.

Из отмеченного следует, что МЦ помешенные в физраствор могут разрывать соединительнотканную оболочку, а температура физраствора влияет на сроки выхода и выживаемость МЦ, чем выше температура, тем быстрее происходит выход МЦ и снижается продолжительность жизни, а в растворе Рингера-Локка при температуре 4°С, выход МЦ замедлялся и продолжительность жизни МЦ увеличивалась до нескольких месяцев.

4.3.2 Развитие метацеркариев Opisthorchis felineus в морских свинках при разных методах введения in vivo

В опыте in vivo приживаемость МЦ наступала при пероральном и при введении в 12-ти перстную кишку через оперативный разрез, причем при энтеральном введении МЦ приживаемость составила на 24% выше, чем при пероральном - это можно объяснить негативным влиянием кислой среды желудка на жизнеспособность МЦ, а так же анатомической близостью

желчного протока к верхнему отделу кишечнику. Все обнаруженные описторхисы находились в крупных желчных протоках печени морских свинок. При введении МЦ в брюшную полость и в кровяное русло, заражение морских свинок не наступало, что свидетельствует о энтеро-гепатобилиарной миграции эксцистированных МЦ в организме морских свинок.

4.3.3 Изучение гематологических показателей хомяков, при хроническом описторхозе

Изучение гематологических показателей хомяков при экспериментальном их заражении метацеркариями Ор'шЪогсЫь /еНпеш, по сравнению с контрольными животными проводили в условиях вивария ВИГИС на 12 хомяках 3-х месячного возраста, средняя масса которых составила 120 г. Хомяки первой группы оставались без заражения и служили незараженным контролем. Хомяков 2-й группы заражали путем дачи метацеркариев (^¡вШогсЫв ГеНпеиэ в дозе 50 экземпляров на голову. Животных третьей группы также подвергали экспериментальному заражению путем дачи аналогичной дозы метацеркариев и через 30 дней после заражения им назначали в качестве лечения празиквантел 100 мг/кг массы внутрь однократно. Кровь от хомяков для морфологических исследований брали до заражения и через 1 месяц после начала лечения.

Полученные результаты показали что, у зараженных животных в сравнение с контролем, наблюдали эозинофилию, тромбоцитоз и нейтрофилию со сдвигом лейкограммы влево, анемию разной степени выраженности. Гематологические показатели животных, получающих в качестве этиотропного лечения празиквантел в острой фазе заболевания, находятся в пределах физиологической нормы.

4.4 Современные методы диагностики, описторхоза плотоядных и их усовершенствование

4.4.1 Использование систем пробоподготовки для

паразитологических исследований «Рагаэер» при описторхозе плотоядных

В своей работе при диагностике описторхоза, как у опытных животных, так и спонтанно зараженных собак и кошек использовали инновационный метод систем пробоподготовок (пробирок концентраторов) для паразитологических исследований «РагаБер», в которой реализован модифицированный метод эфир-формалиновой седиментации. При использовании этого метода для диагностики описторхоза плотоядных животных, нами отмечено что, данный метод обладает следующими положительными качествами: повышается выявляемость яиц описторхисов, улучшается стандартизация метода анализа, уменьшается время анализа (более удобное исследование пробы, улучшенная визуализация), снижается

риск заражения персонала (нет контакта с пробой), повышается достоверность анализа, уменьшается количество отходов образующихся в результате проведения анализа и удобство при отборе проб и транспортировки их до места исследования.

4.4.2 Постановка полимеразой цепной реакции при описторхозе (Ор1$№огс1ш ГеНпедо) плотоядных животных

По результатам исследований с применением современного метода ПЦР для диагностики описторхоза плотоядных, нами были получены данные, (табл. 3) по существующим олигонуклеотидам (И.И. Брусенцов и др., 2010), которые показали высокую эффективность при постановке ПЦР для выявления метацеркариев ОрЫИогсШз /еНпеш в мышцах карповых рыб, при диагностике описторхоза у плотоядных животных (обнаружения генетического материала в фекалиях), а также при детекции взрослых червей (марит) из печени зараженных лабораторных животных.

Таблица 3

Название используемых олигонуклеидов при ПЦР ОрШкогсМз/еИпею

№п/ п Наименование праймера Последовательность5' - 3' Количество (мкмоль)

1 (Ж АТОАПТССССАСОСАТ 0,04

2 1Т82ехЯ ССААСОАССГСААСАССА 0,04

4.4.3 Нормы затрат времени и расценки на постановку ПЦР при описторхозе плотоядных животных

По данным хронометражных наблюдений нами установлено что, в структуре затрат времени на прижизненную диагностику описторхоза плотоядных животных с использованием ПЦР на подготовительные работы затрачивается 11,1%, оперативное - 80,65% и заключительное - 8,25%.

При разработке расценки на диагностику описторхоза плотоядных животных методом ПЦР установили что, на приготовление и постановку ПЦР затраты материалов на технологические цели в денежном выражении составили 359,9 руб. В прямых затратах доля материалов составила 80,8% и в полной себестоимости 77,7%. Затраты денежных средств на оплату труда ветеринарных работников при постановке ПЦР для диагностики описторхоза плотоядных животных составили 65,94 рубля. Доля затрат на оплату труда в прямых затратах на постановку ПЦР для диагностики описторхоза плотоядных составила 14,8% и в полной себестоимости 14,2%. В обязательные фонды отчисления составили 30% от затрат на оплату труда, накладные расходы в расчете на одно паразитологическое исследование составили - 12,3 руб, фактические прочие расходы в расчете на одно паразитологическое исследование составили 5,2 рубля. В результате проведенной работы установлены нормы затрат времени, себестоимость подготовки и постановки ПЦР для диагностики описторхоза плотоядных

животных, и она составила 463,12 руб., при расценке на исследование одного образца 610 руб.

4.5 Испытание терапевтической эффективности препаратов при описторхозе плотоядных 4.5.1 Оценка разных схем лечения хронического описторхоза кошек бильтрицидом в условиях клиники

Испытания проводили на базе ветеринарной клиники «Анималз» ХМАО-Югра г. Нягань, в период с октября по ноябрь 2010 г. Данный период является пиковым по числу обращений в ветеринарную клинику по поводу описторхоза плотоядных. На спонтанно зараженных кошках (табл. 4) в 1-3 группах наблюдали разные клинические проявления интоксикации, а в четвертой группе признаков интоксикации организма кошек не отмечали. По полученным данным было установлено, что, схема лечения кошек при хроническом описторхозе должна проводиться с разделением дозы на три приема и параллельно с внутривенным назначением препаратов снимающих токсическое действие бильтрицида. Дегельминтизацию кошек против описторхоза нужно проводить в условиях стационара в связи с выраженным проявлением признаков интоксикации и необходимостью оказания экстренных мер ветеринарной помощи больным животным.

Таблица 4

Схемы лечения кошек при спонтанном описторхозе бильтрицидом

1 группа 2 группа 3 группа 4 группа

Бильтрицид 100 мг/кг per os однократно. Бильтрицид 100 мг/кг per os однократно; Рингер-Локка подкожно 20 мл однократно; Гамавит подкожно 6 мл однократно. Бильтрицид 100 мг/кг с разделением дозы на три приема с интервалом 6 часов. Бильтрицид 100 мг/кг с разделением дозы на три приема с интервалом 6 часов; Рингер-Локка не более 100 мл на кошку внутривенно; Гамавит 2мл трехкратно с интервалом 6 часов.

4.5.2 Применение препарата профендер для этиотропного лечения описторхоза на модели сирийских хомяков

Испытание проводили на экспериментально зараженных хомяках, которым назначали новый препарат профендер (Рп^епс1ег)-комплексное лекарственное антигельминтное средство, содержащее два активных действующих вещества - эмодепсид и празиквантел.

Анализ результатов проведенных исследований показывает, что хомяки, получавшие профендер в дозе из расчета 0,14 мл/кг массы были

заражены описторхисами на 9,5%. Экстенсэффективность равнялась 78,40 %. Экстенсэффективность профендера в дозе 0,42 мл на кг/массы составила 97,72%. Таким образом, препарат профендер в трехкратной дозе показал высокую эффективность на модели сирийских хомяков без признаков интоксикации, преимущество этого препарата состоит в удобстве его применения (перкутанное) в сравнение с пероральным назначением.

4.5.3 Испытание терапевтической эффективности препаратов и разработка схемы комплексного лечения описторхоза в зависимости от тяжести течения (этиотропное, патогенетическое)

В качестве лечебного средства (этиотропное лечение) при описторхозе плотоядных животных был использован комбинированный препарат празиотрем, состоящий из празиквантела (35%) и политрема (40%), а для нормализации деятельности печени после изгнания паразитов назначали гепатопротектор растительного происхождения тыквеол (патогенетическая терапия).

Изучение лечебной эффективности оптимальной лечебной дозы празиотрема при экспериментальном описторхозе хомяков проводили в условиях вивария и лаборатории ВНИИ гельминтологии им. К.И. Скрябина.

По результатам проведенных исследований установили экстенсэффективность комбинированного препарата празиотрема в дозах из расчета 75 мг празиквантела + 100 мг политрема и 80 мг празиквантела +125 мг политрема на 1 кг массы внутрь однократно с последующим назначением гепатопротектора составила 100%. Полученные данные дают нам основание считать оптимальной дозой комбинированного препарата празиотрема по составляющим из расчета 75 мг празиквантела + 100 мг политрема на 1 кг массы животного внутрь однократно с последующим назначением тыквеола в дозе 10 мг на животное 5 дней, которые обеспечили при описторхозе 100%-ную эффективность.

На следующем этапе исследований мы должны были подтвердить полученные на хомяках результаты по части эффективности комбинированного препарата при описторхозе кошек. Данная работа проведена в условиях вивария ВИГИС на 18 беспородных кошках в возрасте 1-1,5 лет, масса животных колебалась от 0,8 до 3 кг. Через 28, 29 и 30 дней после заражения всех животных подвергали копроскопическим исследованиям для установления их инвазированности. По результатам проведенных исследований все кошки, подвергнутые экспериментальному заражению, были инвазированны описторхисами, а количество выделяемых яиц колебалось от 4 до 15 экз.

Учитывая результаты исследований, зараженных кошек разделили на четыре аналогичные группы. Животным первой группы (6 голов) назначали комбинированный препарат празиотрем в дозе из расчета 75 мг/кг празиквантела и 100 мг/кг массы политрема внутрь однократно, а в последующие пять дней им давали гепатопротектор тыквеол в дозе 100 мг/кг массы животного. Животным второй группы (3 головы) назначали

празиквантел в дозе 100 мг/кг массы внутрь однократно. Животные третьей группы (3 головы) получали рекомендованную дозу политрема - 150 мг/кг массы внутрь однократно. Животных четвертой группы лечению не подвергали, они служили контролем, как и животные пятой группы (незараженный контроль).

Результаты проведенного лечения определяли по данным двукратных копроскопических исследований через 30 дней после назначения препаратов.

Проведенные в период лечения и в последующие 10 дней после наблюдения показали, что животные, получавшие комбинированный препарат празиотрем с гепатопротектором и празиквантел, переносили назначенное лечение без каких-либо осложнений. А животные, обработанные политремом в течение семи дней после лечения, были угнетены и малоподвижны, но через 10 дней после дачи препарата мало чем отличались от контрольных по физической активности.

Результаты копроскопических исследований показали, что животные первой группы, получавшие комбинированный препарат празиотрем с гепатопротектором тыквеолом были свободны от описторхисов, как и животные второй группы, дегельминтизированные празиквантелом. При исследовании трех кошек, леченных политремом, яйца описторхисов нашли у одной в количестве 2-3 экземпляров. ЭЭ политрема составила 66,7%, ИЭ -87,5%. Животные первой контрольной группы все были заражены описторхисами, а количество выделяемых яиц составило 9-16 экземпляров, тогда как животные второй контрольной группы были свободы от инвазии.

Результаты испытаний показали, что комбинированный препарат празиотрем в дозе из расчета 75 мг/кг празиквантела и 100 мг/кг массы животного политрема внутрь однократно с последующим в течение 5 дней назначением гепатопротектора тыквеола обеспечивает при экспериментальном описторхозе кошек высокую антгельминтную эффективность (ЭЭ - 100%) и хорошо переносится животными.

Результаты производственного испытания подтвердили высокую эффективность комбинированного препарата празиотрема с последующим назначением гепатопротектора тыквеола при описторхозе кошек разного возраста.

Учет затрат на лечение животных с использованными и предлагаемыми препаратами, показал, что обработка одной кошки массой 1,0 кг обходилась - празиквантелом 0,4 руб., политремом 0,1 руб., комбинированным препаратом празиотремом 0,35 руб. и гепатопротектором тыквеолом 0,8 руб., а за весь курс 1,15 руб. В расчетах была использована следующая исходная информация: цена 1 кг празиквантела - 4000 руб., политрема - 500 руб., 1 флакон тыквеола 100 мл - 160 руб.

5. Обсуждение результатов

Дано обсуждение результатов собственных исследований и данных литературы по эпизоотологии описторхоза плотоядных животных в условиях

Западной Сибири, патогенезу, диагностике и мерам борьбы с данной инвазией.

6. Выводы

1. Экстенсивность описторхозной инвазии у кошек в условиях ХМАО г. Нягань составила 48,2%, а у собак 17,4%. Данные за последние 10 лет свидетельствуют о снижении общей экстенсивности инвазии, как у кошек, так и собак, на уровне от 2,7 % до 4% в год.

В г. Кургане экстенсивность описторхозной инвазии равнялась 22% у кошек и 10 % у собак.

Экстенсивность описторхозной инвазии у кошек в Москве составила 1,6%, а собаки были свободны от описторхоза. Все случаи заболевания у кошек носят «завозной» характер из эндемичных регионов.

2. По данным Роспотребнадзора на долю Западной Сибири приходится 74,95% от всей заболеваемости населения описторхозом, тогда как на другие субъекты Российской Федерации остается 25,05%.

Зараженность описторхозом у населения в условиях ХМАО одна из самых высоких в городе Нягань. За последние годы наблюдалась тенденция к снижению заболеваемости описторхозом. По видам рыб только недостаточно обезвреженный язь являлся источником заражения.

3. Средняя экстенсивность описторхозной инвазии в водоемах ХМАО г. Нягань у битиниид, собранных в июле и августе составила 5,6%, а количество личинок трематод колебалось от двух до семи экземпляров.

4. Вторые промежуточные хозяева два вида рыб; язь и плотва сибирская в ХМАО заражены метацеркариями Ор15ЙюгсЫз ГеНпеиБ, язь на 100%, а плотва на 6,7%, ИИ - составила 976 и 84 экз. соответственно.

На участке реки Тобол в районе г. Кургана из шести обследованных видов рыб только язь оказался зараженный метацеркариями Ор151ЬогсЫз ГеНпеиБ, ЭИ - составила 100%, а ИИ - равнялась в среднем 130 экз. на особь.

5. Метацеркарии Ор1зШогсЫз ГеНпеиБ локализуются практически во всех поверхностных мышцах язя, при этом, не проникая во внутренние органы, наиболее пораженными оказались мышцы спины - 58,73 %, мышцы живота-26,15% и меньше всего в хвостовых -15,12%.

6. Сточные воды очистных сооружений г. Нягань содержат жизнеспособных яиц описторхисов и других гельминтов, и их количество в сбрасываемой очищенной воде в июне было выше, чем в апреле и мае.

Наибольшая контаминация почвы яйцами описторхисов в г. Нягань отмечена на берегу реки Нягань-Юган - 43 экз. или 57,3% от всех обнаруженных жизнеспособных яиц в разных районах населенного пункта, затем идут поселок (частный сектор) 23 экз. или 30,7% и спальный район 9 яиц, или 12 % соответственно в 1 кг почвы.

7. Морские свинки успешно заражались при выпаивании им физраствора, содержащего метацеркариев О. ГеНпеиБ и при их введении в 12-ти перстную кишку. При вскрытии через 21 день экстенсинвазированность составила 24% и 57% соответственно. При введении МЦ в брюшную полость

и непосредственно в кровяное русло, заражение морских свинок не наступало.

8. У животных, зараженных Ор'ШЪогсМь /еИпеш, эозинофилия, тромбоцитоз и нейтрофилия со сдвигом лейкограммы влево - являются характерными признаками изменений гематологических показателей периферической крови, зараженные животные, которых не лечили имели анемию разной степени выраженности (от слабой до выраженной). Гематологические показатели животных, получающих адекватное терапевтическое лечение в острой фазе заболевания, находились в пределах физиологической нормы.

9. Использование систем пробоподготовки для паразитологических исследований «Рагазер» обладает преимуществами перед традиционными методами и повышается выявляемость яиц описторхисов.

10. Полимеразная цепная реакция при описторхозе (Ор1зШогсЫз ГеНпеиз) плотоядных животных может использоваться для прижизненной диагностики инвазии в ветеринарных лабораториях, для выявления метацеркариев в мышцах карповых рыб в лабораториях ВСЭ на рынках и при детекции взрослых червей (марит) из печени зараженных животных в научных целях.

11. Определены нормы затрат времени, а также себестоимость подготовки и постановки ПЦР для диагностики описторхоза плотоядных животных, которая составила 463,12 руб., при расценке на исследование одного образца 610 руб.

12. Лечение кошек при хроническом описторхозе должно проводиться в условиях стационара с разделением дозы празиквантела на три приема, параллельно с внутривенным назначением препаратов снимающих токсическое действие бильтрицида.

Применение препарата для накожного применения профендер в трехкратной дозе показал 97,72%-ную ИЭ на модели сирийских хомяков без признаков интоксикации.

Новый комбинированный препарат празиотрем в дозе из расчета 75 мг/кг празиквантела и 100 мг/кг политрема внутрь однократно с последующим в течение 5 дней назначением гепатопротектора тыквеола обеспечивает 100%-ную лечебную эффективность при описторхозе хомяков и кошек и снижает себестоимость этиотропного лечения.

7. Практические предложения

По материалам проведенных исследований предложены: «Рекомендации по борьбе с описторхозом плотоядных животных в условиях Западной Сибири», которые одобрены секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (протокол №3 от 23 сентября 2009 г.), методика постановки полимеразой цепной реакции при описторхозе (Ор1зйюгсЫз ГеНпеиБ) плотоядных животных, одобренная на заседании секции «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (протокол №3 от 23 сентября 2011г.),

способ лечения описторхоза плотоядных животных (патент РФ № 2440109 от 20 января 2012 г.), расценки на постановку ПЦР для диагностики описторхоза плотоядных животных одобренные на заседании секции «Организация, экономика и история ветеринарии» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (протокол № 1 от 1 июня 2013 года), в которых изложены комплексные меры борьбы, диагностики и терапии больных описторхозом плотоядных животных.

1. В условиях Западной Сибири необходимо проводить мониторинг заболеваемости описторхозом по всему жизненному циклу инвазии от первых промежуточных до дефинитивных хозяев, используя при этом современные методы диагностики, такие как ПЦР и одноразовые наборы пробоподготовок «Рагавер», а в комплекс мероприятий по мониторингу необходимо включать обследование объектов внешней среды на загрязненность инвазионными элементами.

2. При лечении животных использовать только химиопрепараты, в том числе новый препарат празиотрем в сочетании с патогенетической и симптоматической терапией. Агрессивным или диким животным при необходимости возможно накожное применение препарата нового поколения профендер в трехкратной дозе (0,42 мл).

3. Новые данные по развитию метацеркариев в искусственных средах и в организме животных необходимо использовать при изыскании новых методов борьбы с описторхозом плотоядных животных. На основании гематологических исследований животных дают прогноз течения заболевания и делают корректировку лечения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.Шибитов С.К. Оценка разных методов лечения хронического описторхоза кошек бильтрицидом в условиях клиники / С.К.Шибитов // Сб.науч.конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». -М., 2007.- Вып. 8.- С.387.

2.Шибитов С.К. Система иробоподготовки для паразитологических исследований «Parasep» и ее апробация для диагностики гельминтозов свиней» / Р.Т. Сафиуллин, С.К. Шибитов, A.B. Котков // Российский паразитологический журнал. - М., 2008. - № 3. -С. 81-86.

3.Шибитов С.К. Рекомендации по борьбе с описторхозом плотоядных животных в условиях Западной Сибири / С.К. Шибитов, Сафиуллин Р.Т. // Российский паразитологический журнал. - М., 2010. -№3.-С. 115-118.

4.Шибитов С.К. Развитие метацеркариев Opisthorchis felineus в разных средах in vitro и в морских свинках при разных методах введения in vivo / С.К. Шибитов // Российский паразитологический журнал. - М., 2009.- № 4.- С. 39-42.

5.Шибитов С.К. Распространение описторхоза в Западной Сибири / С.К. Шибитов, Р.Т. Сафиуллин // Сб.науч.конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» - М., 2009.- Вып. 10.- С.432.

6.Шибитов С.К. Применение препарата профендер для этиотропного лечения описторхоза на модели сирийских хомяков / С.К. Шибитов, Р.Т. Сафиуллин // Сб.науч.конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» - М., 2010. Вып. 110,- С.506.

7.Шибитов С.К. Методика постановки полимеразой цепной реакции при описторхозе (Opisthorchis felineus) плотоядных животных / Шибитов С.К. //М., 2011.-9 с.

8.Сафиуллин Р.Т., Шибитов С.К. Патент на изобретение №2440109 «Способ лечения описторхоза плотоядных животных» зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20 января 2012 г. Опубликовано 20.07.12. Бюл. 2 - 10 с.

9.Шибитов С.К. Нормы затрат времени на постановку ПЦР при описторхозе плотоядных животных/ С.К. Шибитов, Р.Т. Сафиуллин // Сб.науч.конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». -М., 2012. - Вып. 13,- С.455-459.

10. Шибитов С.К. Описторхоз плотоядных животных/ Р.Т. Сафиуллин, С.К. Шибитов // Ветеринария. - М., 2012. - №12. -С. 30-33.

Н.Шибитов С.К. Расценки на поставку пцр для диагностики описторхоза плотоядных животных / Сафиуллин Р.Т., Шибитов С.К.// Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. 2013. Т. 214. С. 368-372.

12.Brusentsov, I.I.; Katokhin, А. V.; Brusentsova, I. V.; Shekhovtsov, S. V.; Borovikov, S. N.; Goncharenko, G. G.; Lider, Lyudmila A.; Romashov, В. V.; Rusinek, О. T.; Shibitov, S. К.; Suleymanov, M. M.; Yevtushenko, A. V.; Mordvinov, V. A. Low Genetic Diversity in Wide-Spread Eurasian Liver Fluke Opisthorchis felineus Suggests Special Demographic History of This Trematode Species // PLoS One. 2013 Apr 25;8(4): p. e62453.

Подписано в печать:

07.10.2013

Заказ № 8714 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата ветеринарных наук, Шибитов, Самат Карабаевич, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕЛЬМИНТОЛОГИИ ИМ. К.И. СКРЯБИНА

ШИБИТОВ Самат Карабаевич

ОПИСТОРХОЗ ПЛОТОЯДНЫХ ЖИВОТНЫХ В УСЛОВИЯХ

ЗАПАДНОЙ СИБИРИ (распространение, патогенез, диагностика, меры борьбы)

Специальность 03.02.11 - паразитология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор Р.Т. САФИУЛЛИН

Москва 2013 г.

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

Список сокращений..............................................................................3

1. ВВЕДЕНИЕ....................................................................................4

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................9

2. 1 Распространение описторхоза плотоядных животных в Западной

Сибири, методы диагностики...........................................................9

2. 2 Средства и методы лечения описторхоза плотоядных животных.......32

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ................................................35

3.1 Материалы и методы исследований.............................................35

3.2 Краткая природно-климатическая характеристика регионов Западной Сибири....................................................................................46

^РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ...................................................52

4.1 Изучение распространения описторхоза среди окончательных, промежуточных и дополнительных хозяев................................................52

4.1.1 Заболеваемость описторхозом населения РФ и Западной Сибири за 2003-2006 г.г................................................................52

4.1.2 Зараженность кошек и собак в условиях ХМАО, Курганской области и г. Москве.....................................................................57

4.1.3 Распространение первых промежуточных хозяев-молюсков в условиях Октябрьского района, Ханты-Мансийского автономного округа......................................................................................69

4.1.4 Зараженность вторых промежуточных хозяев метацеркариями Ор18ЙюгсЫз felmeus....................................................................74

4.2 Изучение контаминации объектов внешней среды яйцами и личинками гельминтов...............................................................................85

4.2.1 Контаминация яйцами Ор1з1:110гсЫ8 felineus стоков из очистных сооружений г. Нягань ХМАО-Югры................................................85

4.2.2 Контаминация почвы в поселковых (сельских), городских условиях и в окрестностях водоема яйцами гельминтов.......................89

4.3 Изучение описторхоза на модели лабораторных животных in vivo и in vitro........................................................................................92

4.3.1 Развитие метацеркариев Opisthorchis felineus в разных средах in vitro........................................................................................95

4.3.2 Развитие метацеркариев Opisthorchis felineus в морских свинках при разных методах введения in vivo...............................................98

4.3.3 Изучение гематологических показателей хомяков, при хроническом описторхозе............................................................101

4.4 Современные методы диагностики, описторхоза плотоядных и их усовершенствование..................................................................105

4.4.1 Использование систем пробоподготовки для паразитологических исследований «Parasep» при описторхозе

плотоядных......................................................................105

4.4.2 Постановка полимеразой цепной реакции при описторхозе (Opisthorchis felineus) плотоядных животных...................................108

4.4.3 Нормы затрат времени на постановку ПЦР при описторхозе плотоядных животных...............................................................113

4.5 Испытание терапевтической эффективности препаратов при описторхозе плотоядных.............................................................117

4.5.1 Испытание терапевтической эффективности Оценка разных схем лечения хронического описторхоза кошек бильтрицидом в условиях клиники..................................................................................117

4.5.2 Применение препарата профендер для этиотропного лечения описторхоза на модели сирийских хомяков......................................120

4.5.3 Испытание терапевтической эффективности препаратов и разработка схемы комплексного лечения описторхоза в зависимости от тяжести течения (этиотропное, патогенетическое).......................................122

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ....................................................136

6. ВЫВОДЫ...................................................................................146

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ...............................................149

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................151

9. ПРИЛОЖЕНИЕ...........................................................................168

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. МЦ - метацеркарии

2. ПЦР- полимеразная цепная реакция

3. ЭИ - экстенсивность инвазии

4. ИИ - интенсивность инвазии

5. ХМАО- Ханты - Мансийский автономный округ

6. ЖКТ- же луд очно кишечный тракт

7. OAK- общий анализ крови

8. СОЭ- скорость оседания эритроцитов

9. ДВ - действующее вещество

10. ИЭ - интенсэффективность

11. ЭЭ -экстенсэффективность

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Описторхоз является наиболее широко распространенной инвазией плотоядных животных и человека в регионах Западной Сибири, данное заболевание характеризуется хроническим течением, сменяющееся частыми обострениями, отягощает многие сопутствующие заболевания и заканчивается, как правило, циррозом или возникновением первичного (биологического) рака печени.

В Западной Сибири действующий очаг Opisthorchis felineus находится в Ханты-Мансийском автономном округе в пределах среднего течения Оби, менее распространенными регионами в порядке убывания считаются Томская область, Ямало-Ненецкий автономный округ, Новосибирская, Тюменская и Омская области. В общемировом масштабе на Россию приходится не менее 70% заболеваемости людей, Украину и Казахстан - примерно по 7-10%, Беларусь -около 3-5% и на долю стран Западной Европы, включая страны Балтии, -оставшиеся Ъ—<\%. Иными словами, Россия продолжает «держать первенство» по распространенности этого опасного заболевания. В южном полушарии аналогичная ситуация по описторхозу, где в очаге сконцентрировано 70-80 % заболеваемости, наблюдается в Юго-Восточной Азии (Таиланд, Камбоджа, Вьетнам, Китай), но возбудителем там является Opisthorchis viverrini (С.А. Бэер, 2005).

В начале двадцатого века паразитологи интенсивно изучали зараженность промежуточных и дефинитивных хозяев, биологию, патогенез, клинические признаки, а также разрабатывали новые методы диагностики и меры борьбы с описторхозом в Западной Сибири (И.М. Исайчиков, 1925, К.И. Скрябин, 19291932; H.H. Плотников, J1.K. Зарчанинов, 1932). В связи с широким распространением описторхоза среди людей, К.И. Скрябин считал описторхоз социально-экономической проблемой и призывал к борьбе с данным заболеванием.

В середине XX века изучение описторхоза в Западной Сибири, в том числе по зараженности первых, вторых промежуточных хозяев, а также поиск новых методов борьбы с описторхозом плотоядных, продолжались, но проблема так и

не была решена, а только разрасталась, не поспевая за миграцией большого количества населения в связи с открытием месторождений полезных ископаемых в Западной Сибири и как правило, увеличение количества больных описторхозом (С.Д. Титова, 1946-1965; В.Ф. Мартынов, 1958; H.H. Плотников, 1967).

К концу XX столетия в Западной Сибири была принята первая Межотраслевая комплексная научная программа "Описторхоз" (1976), в которой участвовали 40 учреждений-соисполнителей в России, Украине и Казахстане. Благодаря этому разработаны и изданы кадастры очагов описторхоза Урала, Сибири и Российской Федерации. В кадастрах представлены сведения за период с 1929 г. о зараженности населения, инвазированности домашних и диких млекопитающих, рыб семейства карповых и моллюсков возбудителем описторхоза во всех регионах России. В этот период разработаны меры профилактики, диагностики, появились достаточно эффективные средства для лечения описторхоза, средства для уничтожения первых промежуточных хозяев описторхисов. Все это привело к заметному снижению описторхоза в отдельных областях таких как: Тюменская (Юг) обл., Омская, Новосибирская, Курганская и другие регионы.

В 90- е годы XX столетия данная программа перестала действовать в связи с развалом СССР, с другой стороны в Западной Сибири (Ханты-Мансийском автономном округе) наблюдалась вторая волна миграции населения для развития нефтяной отрасли России. Проблема описторхоза в данном регионе обретает очаговый характер и остается предельно актуальной для современной медицины и ветеринарии по настоящее время. Предложенные ранее средства для лечения животных и человека были практически малопригодны в связи с высокой токсичностью и недостаточной эффективностью, методы диагностики были малоинформативными и морально устаревшими. (В.Я. Пустовалова, В.П. Сергиев, 1996, Т.М. Гузеева, 2011).

В последние годы санитарно - паразитологические исследования почвы уменьшились, соответственно снизилось количество выявлений яиц гельминтов и простейших. На долю яиц аскарид приходится 50%, токсокар - 38%,

власоглава - 5%, цист лямблий - 3%, остриц - 2%, в 2%-х проб обнаружены яйца описторхисов (Г.Г. Онищенко, 2010).

В современных условиях необходимо проводить изыскание новых высокоэффективных химиопрепаратов против описторхоза плотоядных животных, совершенствовать существующие методы диагностики, своевременно информировать владельцев животных о необходимости соблюдать культуру кормления домашних плотоядных и эти меры помогут снизить заболеваемость описторхозом среди животных и человека.

Цель и задачи исследований. Целью нашей работы было изучение эпизоотической ситуации по описторхозу плотоядных животных в Западной Сибири и усовершенствование мер борьбы с данной инвазией.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие конкретные задачи:

• изучить распространение описторхоза среди промежуточных и дефинитивных хозяев с учетом сезонной и возрастной динамики зараженности;

• определить контаминацию объектов внешней среды яйцами описторхисов, их роль в циркуляции инвазии в природе;

• оценить развитие описторхоза на модели in vivo и in vitro в условиях лаборатории;

• оценить и усовершенствовать методы диагностики описторхоза плотоядных животных;

• изучить противоописторхозную активность новых препаратов в эксперименте и на спонтанно зараженных животных, определить экономическую эффективность их применения;

• разработать рекомендации по борьбе с описторхозом плотоядных животных в условиях Западной Сибири.

Научная новизна. Разработана экспериментальная модель развития метацеркариев Opisthorchis felineus в морских свинках при разных

способах введения in vivo в условиях лаборатории, установлена их выживаемость при разных температурных режимах и в разных средах in vitro.

Получены новые данные по распространению, сезонной и возрастной динамике зараженности дефинитивных хозяев Opisthorchis felineus. Определена загрязненность объектов внешней среды яйцами описторхисов. Оценена зараженность первых промежуточных хозяев личиночными стадиями Opisthorchis felineus. Впервые испытан метод диагностики описторхоза плотоядных животных с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР). Опробован метод седиментационной диагностики описторхоза плотоядных животных с использованием одноразовых концентраторов «Parasep».

Впервые испытан новый комбинированный препарат для лечения описторхоза плотоядных животных празиотрем в эксперименте и в условиях производства, установлена его высокая экстенсэффективность (97,3-100%) и экономичность.

Практическая значимость. По материалам проведенных исследований разработаны: «Рекомендации по борьбе с описторхозом плотоядных животных в условиях Западной Сибири», одобренные секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (протокол №3 от 23 сентября 2009 г.); «Методика постановки полимеразой цепной реакции при описторхозе (Opisthorchis felineus) плотоядных животных», одобренная на заседании секции «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (протокол №3 от 23 сентября 2011г.); «Способ лечения описторхоза плотоядных животных» (патент РФ № 2440109 от 20 января 2012 г.); «Расценки на постановку ПЦР для диагностики описторхоза плотоядных животных»,

с

одобренные на заседании секции «Организация, экономика и история ветеринарии» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (протокол № 1 от 1 июня 2013 года).

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на отчетных научных конференциях ВИГИС (2008-2012 гг.); на научно-практических конференциях «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (г. Москва, 2010,2011,2012)

Личный вклад соискателя. Представленная диссертационная работа является результатом пятилетних научных исследований автора. Исследования по изучению распространения описторхоза среди промежуточных и дефинитивных хозяев с учетом сезонной и возрастной динамики, контаминации объектов внешней среды яйцами описторхисов, их роль в циркуляции инвазии в природе, развитие описторхоза на модели in vivo и in vitro в условиях лаборатории, апробирование и усовершенствование новых методов диагностики описторхоза плотоядных животных - выполнены соискателем лично.

Рекомендации по борьбе с описторхозом плотоядных животных в условиях Западной Сибири, способ лечения описторхоза плотоядных животных (патент РФ № 2440109 от 20 января 2012 г.) и расценки на постановку ПНР для диагностики описторхоза плотоядных животных выполнены совместно с научным руководителем. Работа выполнялась под руководством доктора ветеринарных наук, профессора Р.Т. Сафиуллина, который оказывал научно-методическую помощь в проведении исследований и анализе полученных результатов. Статьи, написанные в соавторстве, включают не менее 80 % материалов в исследовании соискателя. Соавторы не возражают в использовании результатов совместных исследований.

Основные положения, выносимые на защиту:

• распространение описторхоза среди промежуточных и дефинитивных хозяев с учетом сезонной и возрастной

динамики; контаминация объектов внешней среды яйцами описторхисов;

• экспериментальная модель развития метацеркариев Opisthorchis felineus in vivo и in vitro в условиях лаборатории;

• методы прижизненной диагностики описторхоза плотоядных животных (ПЦР, седиментация);

• противоописторхозная активность новых препаратов в эксперименте и на спонтанно зараженных животных, экономическая эффективность их применения.

Публикации. По результатам проведенных исследований по теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в которых изложены основные положения и выводы по работе, 6 из них в изданиях рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 167 страницах компьютерного набора текста, состоит из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Список литературы включает 154 наименований, в том числе 112 работ отечественных и 42 иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 16 рисунками, 33 таблицами, 4 диаграммами. Приложение к диссертации включает: титульные листы нормативных документов, копию патента.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Распространение описторхоза плотоядных животных в Западной Сибири, методы диагностики

Заболевания человека и животных, вызванные трематодами семейства Opisthorchidae, имеют широкое распространение. Известно, что наиболее крупный природный очаг описторхоза, вызванный Opisthorchis felineus, находится в Обь - Иртышском речном бассейне в Западной Сибири.

Из краткого исторического экскурса видно, что Риволта в 1884 году, назвал найденный им в печени кошки паразит Distomum felineum, признав его самостоятельным видом.

В дальнейшем русский врач, профессор Томского университета, К.Н. Виноградов в 1891 году констатировал первый случай этого паразита в печени человека. Не подозревая, что найденная им трематода является идентичной Opisthorchis felineus от кошки (Rivolta, 1884), К.Н. Виноградов признал ее новым видом и назвал Distomum sibiricum.

Тождество трематоды Distomum felineum от собаки и кошки с Distomum sibiricum от человека установил Браун в 1884 г. С 1895 г. этот паразит был причислен Бланшаром к созданному им роду Opisthorchis и получил современное название Opisthorchis felineus (Rivolta, 1884).

В последующие годы, по мере расширения гельминтологических исследований, описторхоз стал обнаруживаться в разных странах Европы Vogel Н. (1929-1934), как у человека, так и у животных.

В нашей стране в 1925 г. И.М. Исайчиков изучает вопросы передачи описторхоза, а затем ставит вопрос о ветеринарно - санитарном осмотре рыбы для предупреждения заражения трематодами (Исайчиков И.М, 1925, 1929).

В конце 20-х годов XX века в Тобольск, а затем в Обдорск (ныне Салехард) приезжает для проведения исследований крупнейший русский ученый, гельминтолог, академик К.И. Скрябин (1927) группа работала во многих городах и поселках Обского бассейна, и везде ученые сталкивались с массовыми случаями заболевания описторхозом. Чем дольше они работали, тем серьезней для России представлялась им эта проблема. Совсем скоро описторхоз был уже обнаружен на Украине (на Днепре) и в центральной России (на Волге и Каме).

В то же время было намечено дальнейшее изучение биологии опис�