Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПРИМЕНЕНИЕ СЕРОДИАГНОСТИКИ В ИЗУЧЕНИИ ТАКСОНОМИИ И ЭКОЛОГИИ МЕТАНОТРОФОВ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ПРИМЕНЕНИЕ СЕРОДИАГНОСТИКИ В ИЗУЧЕНИИ ТАКСОНОМИИ И ЭКОЛОГИИ МЕТАНОТРОФОВ"

АКАДОМН НАУК СССР ' институт биохинии и физиологии микроорганизмов

На правах рукописи уда 576.8.01

БЕЗРУКОВА Лилия Васильевна

ПРИМЕНЕНИЕ СЕЮДИА1ТОСТИКМ В ИЗУЧЕНИИ ТАКСОНОМИИ

и экологии мьТАжтювои

03.00.0? Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание \ученой степени кандидата биологических наук

Пуцино ~ 1964

Работ* выполнена.в Донецком медицинекок институте км.Горького .; к Иаспггутебноэамнн » физиологи« 1ш*роорганиэмов № 0ССР.

Ыаучныердгководнтедихчмн-корреспонцвнтШСС^

биологических наук М.В.Иванов; кандидат медицинских наухР.И.Ннкоаекко.

Официальные оппоненты:доктор;.'биологических наук»зав,отделок :

Л.В.КалакуцкнЯ;

кандндат биологячесжих науЕ.доцент . . . ■ А.И.Нетруооэ. 1

Ведущее учревдешадГШИйсинтезбелок

Защита диссертации состоится 1984г. в

,3 мин« ыа а асе дани и специализированного совета К 053-05.14 в М1У им. М* В#Ломонсюова,1198У9,г.Москва<В-г34, Денгоры,ЫГУ,бйолоппескийфакул1>9ет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультеташ.'и.В.Ломоноаова. ^ ^

Автореферат разослан » /У«: велЛг.^ 1984 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Л»И.Лебедева

Актуальность проблемы. Цетаяотрофи являются физиологически в таксовоиическн единой группой микроорганизмов. Снз обладает спышфичесгами морфологическими, физиологическими и биохимическими признаками. Ш принадлежит важная роль в круговороте углерода биосфера.

Кроме того, оСлкгатяые метанотрофвые бактериа представляют значительный практический интерес. Б настоящее врет суяеста^-сг реальные перспективы использования этих микроорганизмов в различных областях биотехнологии - для производства бедна и полисахаридов вз природного газа, для снижения содеряашя метана в угольных вахтах, для биотраисфор^ации различных углеродных соединений с двяьо получения полезных химических вацеов и при создании микробиологических ташшвных алвментов.

За последние года из разнообразных природных суйстрагоз выделено большое число культур метаяокисляэдих микроорганизмов. Однако общепринятая идентификация метаяотрофав по совокупности признаков трудоемка, а отсутствие подних видовых диагнозов не всегда позволяет однозначно дифференцировать эти бактерии. В связи с этим являшсл актуальными поиск и разработка доступных экспресс-методов диагностики метанотфофов, п в частности применение для этой дели методов серсдиагностиги.

Соу^ято^ pompea, роль ц задачи исследования. В настоящее время описано 26 видов облигатннх мэтанотрофннх <3актери2. Однако таксономия этих микроорганизмов все еще остается в ве-^ которой степени неопределенной. Классификационная система» предложенная Виттенбери, Филдиасоы и Удлкинсоно« (¡rütteixbuiY» Hiillipe a» wHk±riBon, 1970) практически признается засеки иссдадоэатедями, но она не имеет статуса официальной, в то время как в восьмом издании определителя Берги при кдассифи-каши метанотрофов не учтены их биохимические, я ультраструкТурные различия. Четкая и быстрая идентификация иэтанотро<£ов осуществляется на основе кирно-^ислотного я фосфолнпидного состава клеток мотаяотрофов {Андреев я Гальчедво, 1978, 1Э7Э\ их белковых спектров (Гальчвяко, Нестеров» 1Э81). Однако названные подхода позволяют проводить кдентйфжапип метаяотрофов только в чистнх кудъту>ах» Подточу в вжслопкесквд исследованиях »та иетодн веирииекэвн. Несмотря на то» что и литературе : имоютсч шогочислесзно дрйгахащш о првкененив ссхщдяагвосгж-ки для идентификалд* рааличаых ис&роорганззыов, в отжшюшш verasorpoío^ts^rüjLsSüBaHO-лишь-дв»-^гатьи.

.■■'-" ЦакьЕ ^гк^ей'^^о^^^дает одадва возмсоаос^ей во« пользовадаж; ^раадрч&свэк кек^^ уи решения адцач ш так-

\ZEmm.

соноиии и вколоти метано^рофов.

Основные задачи исследования состояли в следупце»*

1. разработать слеьцу шкунизацпй животнш: антигенным материалом метанотрофоР а аолучять специфические ■ 10«ушше си£м>— роткЕ с достаточно ,вйсокгали титрами.

2. Определять основные серологические свойства метано-трофвы* бактерий» ,

3. Уточада таксономическое положение метаногрофов; серо— доисческими метОДакк. .

4. шенить возможность■ исвйдьасдаания сервдюГЕ'Чбсыпе методов для адентифакаяЕИ мвтанотрофов в чистых. нуль турах и в ■. пркрожнах ойразяах. " ■ Л" .

Идущая цпвязн^.. Разработан способ иммунизации яивоткнх комплексными антигенами метанотрсфоэ. Получены иммунные снво— ротки к 32 штаммам иетанотрофов с достаточно высовьтя титрами а четкой вадовоР сдедйфачность». Изучены шмувогенность и антигенная саецвфгечность более 70 штаммов ие-гаяотрофоэ. Полученные при использовании серологических методов результат позволили уточнить сувфстэупцуюкшссвфижаяпоннуо састецу метано— , , тройных бактерий« разработать метода адешяфивацки ыегадотро— $ов в природных' экосистемах.

Пкуггячесдая -ценности. Разработанные,методы серодиагвос-гики могут быть применены дня быстрой вдентификурдт метав строкой пра тсаолъэозаник этгсх микроорганизмов в разлачшхобдас-тях биотехнологии, , а таюсе при изучении та аутозкодогшг. .

^{^рпАдтптст metpfti.. Ыааетздады дассетеаща докжеаы.да конференциях мотэднх учеявх ¡¿акеевского ваучво-*сследоватеяьско-го института по безопасности горных-работ (р. Макеевка, 1978 тЛ, Шмятуга шкробаогогва.и^ вирусологтга шс. Д.К. Заболотно-го (г.Киев,-1981 г.), Института.бисссишж и физиологии микроорганизмов АН СССР (г,П7Т5Йво, 1982 г.}, наУ1 съездо Всесоюзного микройиатогячесяого -^кЗщеотва {г.Рига, 1380 г.), да научное конференции по итога* ■'научно-исследовательских работ Дон №1 (г.Донецк, 1962т гЛ.на расширенном заседании кафедры гшв^ робиаюгшг Донецкого государственного медапшекого института iwutÄ. Горького. (г.Донецк, 1982 г.). Диссертация апробирована на odi единенном - сеиаыаре лаборатории анатомта я бгофдоиюн иик«-роорганиамоэ а лаборатории бяогеотимин КИМ АН СССР ЗОишя 1983 Г. ■ ■ " . ' ■

Мест? проведения таботы. Работа проводилась в iSzcigr/sw <>хъхшш и фазиопотта микрсюрганишов АН ССЖР в лаборатортл бвогеохямии (заведуздий лабораторией -чл. корр. АЯ СССР, док-

тор биол,- наук Ы, В. Иванов). Некоторые раздели работы выполнена в Донецком государственном медицинском института им.М.Горького на кафедре микробиологии (заведувдий кафедрой-заслу^ен-иый деятель наука УССР, доктор мад. наук, проф. Г. D.Кондратенко) и Цакеевском научно-исследовательском институте по безопасности горкых работ в лаборатории "Управления состоянием массива горшие пород" (заведущий лабораторией - кандидат технических наук В.А,Громов). Род лабораторных работ проводили совместно с В.<5. Гальченко. -

Стоткттпа и объем работц. Диссертация излетана ва 147 страницах машинописного теиста, включая 19 таблиц, 18 рисунков и состоит из введения, 6 глав, обсуждения результатов и выведав. Список литературы вкличает 357 работ, аз них 127 отечественных а 230 зарубежных. '

Объект» а методы исследований ' Микроорганизм я их культивировали^. в работе для получения иммунных сывороток использовала штаммы 12 видов обли— гатных метаыогрофов, относящиеся к I л Л группам, из полдел-циа ИБФЦ АНСССР, а такае штаммы ОВЗв, 0В4, 0В5в, ОВВР, 5,12, Y,slt во8^шЗеэяо предоставленные профессором Квейлом и профессором Виттенбари (Англия), а "штамкы. лг/1, 10529, GB26, любезно предоставдешше доктором Майер и доктором Вшше (ГДР) (табл.1).

Культуры выршцивали на минеральной. среде еяедупцего состава (в г/л, дистиллированной вода): кко^-1,0; i5gS0^*7H20-0,2; Ea2KT04t5H2a-1,5i КН2р04-0,7 (в мг/л)| трИЯОН Б-5 ; PeSO^ * *72г0-2 ít3trA)l.ZiiS04»7H2(>r100t JlnCl2*4H20-30i CoClg'HgO -200¡ CuC12*5H20 - 100; К1С1г»6Н£0 - 20j Ha^íoO^ - 30; рИ среды 0,9 ¿ 0,2.

Ку-гугивированце проводили в конических колбах о^ъемш 0,7 и 2 л, в которые добавляли 0,1 и 0,5 л кадкой среды соответственно. Посла посева колбы заполняли смесыз метана я воздуха (1:2) и культивировали на роторной качалке (120 оЗ/шн.) при 30°.

Для шмлунизадии клетки метанотрофов отбирали в конце эк-споневцгальноЗ фазы роста, двалды o-шавали 0,15 U раствором Kaci к реезгепевлировааи в том не растворе до концентрации I09 клеток/кя. .

Ва Примере двух культур - iie-thylomot.es methenica (щтЛ2) a Jíethyloelnuetrishosporium (тт.44) — была изучены иммуно-генные свойства метанотрофов: токсигенаость, токсичность,ви-

Таблица I

Титра антител в шмушшх сыворотках к иетанотрсфшм бактерия»

й Й! Организм I Штемм ( Титры

п/п! I 1 антител

1; М'Ьа.пвШапАса

г^

3.

4. 1ИЪ;т1лв1ап<1И

5. М1Ь,Ъотг±е .

6 4 Ц^;сЬгооооос1Ш

^i 1№с1оар&ц1в1ие

84

9; Шэ', *г±еЬоер ог1гип 10,

11; 12*

13* ЗДа.&роПиа 14; -»15. -V 16 ; ДОсв.т1и1ти8 17»

18; Ы1св.швгЬвпо11сив

19.

го.

21; »Нее.рХгеГогтХв

22; )Ш>в,есЩ_по1йеа 23.

25. -й-

26. -«-

рулентность, аолерти злругацв е влияние на микроорганизмы.

Мм-ту^изадиа кроликов проводили по разработанной трех-цикличноЯ схеме: подкожно (две инъекции), внутримышечно (две инъекции) и внутривенно (три инъекции)» с использованием как прогретых, так и нативкых комплексных антигенов ттанотрофов* а также спорового материала. При первой инъекции вводили корпускулярные антигены совместно с неполным адъпвантом Фрейнда. Ьп весь период иммунизации каздое животное подучило 7*Ю9 . микробных глеток (1,4 иг белка). Дозы, методы, срони введения под<5;фалнсь шпирпческЕо В процессе иммунизации изучали анти-телогенеэ. Пря достаточно высоких титрах Сне шне 1:в0) проводили эвтаяацию животных методой тотального обескровливания из бршноР аорты под эфирным наркозом. Подученные иммунные сыворотка хранили в аамороаенном состоянии о добавлением для консервация кьртполата (1:10000). Специфичность ркмунких сн-воротон проверена в перекрестных реавдилх с радом, штаммов ке—

12 111024

52 1)640

«V 1(640

87 1*1280

69 1*2048

90 1*640

Техав 1*1280

113 1*1280

44 1*1024

СВЗВ 1*160

СВ4 1*640

0В5В 1*7280

5 1*640

19 1*3»

35 1*1024

42 1x2048

82 1(1280

10 1*1280

24 1*1024

32 1*160

14 ■из»:

1 1*1280

г 1*1280

54 1*160

57 1*320

аав? 1*320

танотрофов, а также с 32 балластными штаммами, полученными из коллекций ДМИ (г.Донецк) и ИБФМ АН СССР (г.Цущияо).

В .работе использовали следующие иммунологические методыi в реакции агтлиткнмши (классический вариант и микрометод) . определяли тптри иммунных сывороток, искомые антигены в пробах г выявляли перекре стноре згирухщие антигены» Непрямой иммт-нолшикеснснтннй метод (по общепринятой методике-ИЗД им.Гамалея) использовали для таксономических и экологических исследований. Апробировали ряд тушителей фона с целью более четкого выявления специфически лшинесплрухщих клеток бактерий. В реакции тфегутрк-р1!*"! (реакция Оухтерлони) сравнивали исследуемые антигенные системы метанотрофов, предварительно проводили раститрозку в каждой системе "антиген-антитело*. Для контрастирования линий преципитации гели обрабатывали 0,065$ раствором сернокислого кадмия, красили раствором амидо-черного или раствором Coomaoie Brilliant Blue, фотографировали в проходящем свете.

При определении в природных образцах видового состава метанотрофов пробы проходили этап предварительной подготовки: осадок профильтровывали через бактериальный $ильтр №2,центрифугировали (4000 об/мин), несколько раз промывали забуферен-ним физиологическим раствором. К отмытому осадку добавляли иммунную сыворотку против определенного вида метанотрофов, встряхивали (3 мин.), центрифугировали (4000 об/(шн.).Последующий этап-добавление флуоресцирующей сыворотки, отмывка не— прореагировавших реагентов, просмотр мазков под леминесцевт-ным микроскопом Щ-2, Подготовку фильтров провощили по методике АртеыовоЙ в Корта (1972). Для выявления и идентификации клеток метанотрофов в накопительных культурах использовали как поливалентные, так и видозые иммунные сыворотки. При определении метанотрофов в угле использовалимодифицированный метод микроскопического анализа численности бактерий в почвах. С целью изучения характера распределения и фильтрации метанотрофов в угле применяли стендовую установку УФ-I. На внутренних сколах кернов клетки метанотрофов определяли методом окраски акридиновым оранжевым и иумунолшинесцептным методш. Эти же методики использовала при определении зоны микробиологической обработки угольного пласта, применяемой для снижения метаяоносности.

Результаты работы

Разработанные применительно к метанотрофаы методы серодиагностики позволили решить ряд вопросов таксономии, а также экологии этих микроорганизмов.

Изучены иртчурруенные свойства метанотрофов. Показано,что ыэтанотрофи не обладают выраженной токсигенностью, ккест низкую токсичность „ сяабуи вирулентность и оказывают аллергнзи— рупцее влияние на организм в больших дозах с применением адь-свантов. Данные свойства нетанотрофов учитывались при разрез ботке схемы иммунизации жяботшх. Сйнояратное введение неполного адъпванта Фрейнда било обусловлено наблццалдашнсд аллергическими реакциями у животных при повторных инъекциях.Интенсивность антителогенеза при иммунизации кроликов метанотрофа-ш оказалась недостаточно высокой. Про изучении кинетики нарастания антител в сыворотках отмечены все характернее стадия антителоген еза, степень напряженности иммунитета высока и сохраняется длительное время. Антигенность изученных отаммов метанотрофов различна, о чем свидетельствую? титры полученных иммунных сывороток (таОд.1). При хранении в замороженном состоянии титры иммунных сывороток изменялись незначительно в течение трех лет. ' ■

Чувствительность непрямого иммунолшк^еггзнтдоур ме^д^ при приготовлении мазков бактерий непосредственно из взвеси бактерий колеблется в пределах 1«10® - 5*10® кл/ыл . Примене-' ние этого метода в качестве экспресс-метода при диагностике метанотрофов позволило установить отсутствие штаммовой специфичности полученных иммунных сывороток наряду с их строгой видовой специфичность» (тайл.2,3).В контрольных реакциях строгая видоспецифичность иммунных сывороток била подтвертдена -выявлена антигенная изолированность метанотрофов в перекрестных реакциях агглютинации и иммунофлуоресцешшл. При наличии колебания интенсивности свечения имыунолшинесцежюи в гомологичных рядах' штаммов метанотрофов специфичность свечения периферии клеток сохраняется. Полученные го-мунные сыворотки против метанотрофов дают положительные реакции иммунолдящес-ценции независимо от формы, величины клеток, наличия капсулы. Возможность зафиксировать реакция отдельных пар "антиген-антитело" ууя/гторионтгнм методом дозволила 'провести детальные таксономические анализ изучаемых штаммов метанотрофов (табл.4,5). При оценке антигенных комплексов, полученных при разрушении клеток метанотрофов разными способами, установлен на недостаточная эффективность использования метода замороха-

Tadoma 2

Реакции иммуиофлуореецекщи ыетанотрофных йахтерий I грушш со специфическими .

ишунаыш сыворотками

Организм j Штамм ! ! Сывототка к штату

j 12 1 52 ift j 87 ] 80 j 90 \щ ! Texas

HtB.methímica 12 4f 2+ 3f - — ' - * —

52 2+ 3+ + - - - -

.и. sr 3+ + 4+ - - ** - ■

033 3+ + + «4 - -

Utiii »albus JM/1 H.O. 2+ - - - -

Utoaalbu0 16 " + *.+ - - — » " •

ВС 8 + - — - . - - « - -

Mtb.vineltmdii 30 - - 4t + - « -

87 - 4t + - **

tttb.bovie 89 - - - + 4+ - - -

98 - » - + 4+ - - -

2Jtb, capsula tus Y - - - + ■ + + -

11 tb. ohroo oo с cum 90 - - - + + 3+ *m -

Ktc.cepsulatua 113 - - - #* - - 4+- 3*

Texao - - - •* - - 2+ 3f

m - - - _ - - 2+ 3f

и.о. - не определяли

Рашсшм ижунофчгорвсцеиш« нмддорофнис бимрыЛ D грущщ с« ммцифйчмтш тунгам* еимрмшм

OprtKNtM

~г : (тшк ï

CutopoTK* * it «м«)г

; |;шн J——г—г—i-. — ¡■■■—i ■ ' 1 i и i ... i i- i.....11 . i i ... i J i !-1 " t"

í ¡44 i0B3Bí0B4!0B5BÍI5 ; 19 i 3S tAZ г BZ t » í 24 t 32 i M i I'i 2 ï 64 î67 :

I t t li t î ltt t î ! i t ! ? t 1

O0BP

Ut* •trlehuporlui

20 3+ U - it-

44 (t ît !»

сод г* к* t*

CM 4+ if 4»

CB6B if 4+ 4+

if 3* ■

■tt.«poilu*

_t m

W

и

19

35 37

+ — if, Zf if •

* Zf if' 2+ -. 3+ 3+ 3-r - -

и.о. и.о. и.о. и.о. 3» -+ ♦ Z* 3» Zf

>t.«. -

и,». H.a. •

■tele «tulBOI

26

42

43

ег

3» 4f- -

if if ' ■-■

3» 3f. -

â* 4* f

kt«4 .MthUUllCHU

xo

24

25 32

if z* ■ z*

i* ■ Zf i*

3* Zf z*

гf Zf Zf

Hto* .M tïuol leu*

36

Zf

Htoa.pyrlfcrmif

14

♦ - . ♦

I ■

г

С493Л

♦ ♦

3» tf Z*

Zf 3t 3»

KtM>f«jTu*

IS 54 ST

свет

♦ .. ♦

4+ 4* 4+

3+

Э* 3* 4» 3*

4f i* 3« 4.

к,в, » M определили

Таблица 4

Перекрестные реакции иммуводиффуэии между иммунными сыворотками и антигенами метанотрофных бактерий I грушш

- Антигены \ Штамм!- ^всроткд к 01Таммг--

микроорганизмов { | |ха ¡87 ¡89 ¡90 ¡Техае |ПЗ

Ив1Ьг1оюопав к^ЬаЩса 5 X + ■+•'+■. +

';' ЛГ/1 I Г + . + - -

12 4 + > + : +

>■ ; 46 I I + + . + +

75 2 I + + + +

Не-Изотопов вХЪив В08 + I + — — (+) (

: 16 - I + - : - (+) (

líethyloЪacteг У1пе1аш311 87 ■ + ■ ■' — 4 , I I..

30 + 4 X. +

МеЗДуЗ.оЬас'Свх- ЪОУ1З 89 + ■ I ; 4 'Г'- +

98 Т ... I 3 I •

Ма-Ыцг1оЬас1ег сЬгоососсиш 90 ; + _ 1 2 5 + +

, ■' ■ —«— 72 I 1+ 4' + ■У

МегЬу1оЬас^ег сврви1&Ъиа Т - - — . ' г <+> +

МеЙ1у1ососсив сйрзи1а1гив. Техаа ■ +■ „ - в- ■■ ■ - 9 I

■ —■ "ч СШ2б + . - + + I Г

■ - 10529 - + + 2 I

■ 113 1+ + + - 6 го

117 + + — + + 2 I

2—9 — количество -я™« Я преципитации а гомологичной системе антиген-антисыворотка(АГ-АС);

I . — количество линий преципитации в гетерологичной системе АГ-АС;

+ *» линии преципитации со "шпорой" (частичная идентичность); — перекрещивающиеся лцции преципитации (неродственные

антигены);

С » дкффуегля линия превдаттацинг.

Тайгаца 5

П»рмрмтю* р*ип0<и имиунадий}"01 "!4Í кхиумкшя emporium > актягенАш «ит&жгтрофшх tfáttcpia П груши

(кткгвни тгнрооргшшэм*

; с • * о t о

i..... I I '¡

Í0B33 t 03t 10B5B í 44 "

X

t * »

т1г

J_

■ tiKKjf

t 42 i_

es î г

i i f24 i 14 ! t

M í 8Ï

ittthjloituu« trlobuporlua

0ВЭ8 ZD

ОМ I

0ЮВ I S ' - *

20 ♦

44 *

U В 4 I

I SD * . ♦

♦ * +

I.

spoïlwt

Wlî"

18 »

ar

1,(0 í*) M M (♦)

u*

W Ы M (O

7 2

I . 9

k*ûvle«î«tla BtnlM

S6

42 . ~ 62 I

- I I

■«ttiyloii/tUi мЫооМм

2 83

I

24

K«Hiyl»t»lí» чЧипдНош

94

■•thrtMJatl* pjflfer»!»

14

79

I.+

*«tfcyl»<7»tlo г«гтм«

■vi

0 EBP 94 97

01

I.* ■ ♦

1,0

i.» i

■ ■ , i * От мим, пмуивммие Ot проф. Р.Скггениари. Другие ойдэмчмм ыимгкчни Тыюош в тавдиц» 14.

вания-оттаивания проб (метода Грасса) для получения раствори» mux антигенов при ультразвуковое обработке суспензии отмечена потеря антигенов» В опытах установлено преимущество получения растворимых антигенов путем дезинтеграции на прессе КЕСМ," я также незначительное влияние температурного режима на ход реакция*

Методом ишмунодиффузии определены внутривидоьые серолог»-ческие связи, выявлены строгая видовая и неотчетливо выражен— ная родовая специфичность иммунных сывороток к металотрофам к проведен серологический анализ антигенных связей микроорганизмов по сравнению с вышерассмотрендами методами агглютинация и иммунофлуоресцегаии. В реакшш Оухтерлони обнаружены внутривидовые серотшш метанотрофов. Иммунодиффуэионный метод, позволяя исследовать глубиннорасположенные клеточные антигенные комплексы, выявлял даже слабо выраженные антигенные связи бактерий.

Анализ большого числа вариантов превдпитационяых линий, полученных в гомологичных и перекрестных реакциях иммунодиф-фуэии антигенов метанотрофов I к П група, подтвердил результаты иммувофяуоресценгоог. Данные указывают на серологическую обособленность исследованных пяти родов метанотрофов, котодае, однако, обладает некоторыми внутригрупповыми родственными связями, Анализ данных позволил построить предварительные схемы взаимоотношений между отдельными видами и родами исследован- , них облигатных метанотрофов (рис.1). Внутри рода Metbyiotac-ter наиболее иммунологическа. близкими оказались Kethylobac-ter ЪоПе и Uethylobact»i\ chrooeocoum, к которым примыкает líethylobacter vin elaxtdli. Несколько изолированным является Hethylobacter серaulatua, .серологически связанный только с M в thylobac ter chroo со ccum. Последний также является связущгм звеном мевду родами Uethylobacter и Uethylococeue.c Vethylo-monae род líe thyloba et ер связан через Mathylobacter borle. В роду Methjlccyatis ВИД Methylocyetia minimis оказался наиболее изолированным и связан тслько с Kethylocyatiв methanol!-cue. Серологические связи между родами «ethyloainùa и íiethy-. locyatía прослеживаются через líetbylooinua trichoeporium и Kathylocystia echlnoldes (рис.1).

Образование в перекрестных иымунодиффуэионных реакциях линий преципитации свидетельствует о наличии общего группового антигена СА («оагаоп antigen) у изученных в эксперименте штаммов метанотрофов. Полученные имыунофлуоресцентным ж им-мунодиффузионным методами данные позволяют рекомендовать ce-

ll

ü

lítos.echitioidus

Mtcs.parvua

(Utos.pyrifomis

I Utes,

fmathonollcus

iltcs.mlnlrms

I

ftic.I;. Предварительные схемы серологических взаимоотношений мекку отдельный! видами а родами исследованных эблкгатных метано-

А jl - виды I группы меганотрофов; '

В (1У-У) - виды II группы метано гро<ров. _ „ __, I - Methyl ¿»monas ; II - Kethylobaeterj III - Bietbylocoociis ; -IT - Y - Kethylocyatis.

lí

ретинирование культур при таксономической изучении метано тронов* •

Наличие строгой видовой специфичности Ещунных сывороток явилось основой для применения метода нммунофлуоресценцки при определении метанотрофов в природных образцах. Проведена родовая и видовая экспресс-диагностика метанотрофов в пробах, отобранных в Черном море. Для этого в 45 накопительных культурах с помощь» поливалентных иммунных сывороток к определенным родом метанотрофов выявляли наличие ила отсутствие представителей данного рода непрямым юлмунолшинесцентным методой (табл.в).

Таблица 6

Определение родового состава метанотрофов в осадках Черного моря иммунофлуоресцентным методом

.Станция 555 ' !5бЭ! 568 !573!580! 590 15981620

ХГорДЗО^т| (22 м) | (2^| (86 (66

Род !0-Х}2-б57- |о-2{5- О- ¡5- (о-1{2-б1о-1'

\ I I * 1_тп!_тп1 !_тп!_тп!_тп! ! I

i f-xo]-io] . j-io|-ioj-ioj I {

0-2

Hethylostmia + + ■ ■»■ * + + .+ — + + + +

Metbjlocystle + + ■»• + +■ + — — + + + +

Yethyloaonas - — + + — + — + — + — —

üethylobacter ™ + + + + + — — + + + +

?4ethylococcus + - — + + — + + + + — -

Поливалентные тиунные сьсворотки для каждого из пяти родов метанотрофов представляли собой смесь ранее полученных к отдельным видам специфических сывороток. Предварительная сценка родового состава метанотрофов г культурах с помощь» поливалентных сывороток позволила сократить время идентификации метанотрофов. Чаще всего встречались. представители рода Kethy-losiaua — Uts.trlchoeporium и Kta.eporium реже Других ВИДОВ метанотрофов ВЫЯВЛЯЛИСЬ В образцах клетки Kethylononae bovis. rftnrn üethylobaoter vinelandli И Methylobacter chroococcum определены в четырех и пяти станциях соответственно. Результаты определения видового состава метанотрофов. иммунофлуоресцент-ным я бактериологическим методами практически совпали.

При работе с образцами угля установлено, что, являясь прекрасным адсорбентом, уголь изменяет pH среды к адсорбирует красит зли. Поэтому при просмотре мазкОЕ, приготовленных из

угольной шли е содержащимися,в ней метанотрофами, приходилось пользоваться тушителями (альбуъта, мочений родагошом; india ink . Добавление в исследуемую водную пробу с фяуорохромтел* соляной кислоты обеспечивало высокую эффективность связива-ння флуоресцирующие анионов флуорохрома микробной клеткой,что приводило к резкому увеличению квантового выхода флуоресценции красителя, то есть к возрастанию интенсивности флуоресценции бактериальных клетои. При окраске образцов акридиновым-оранжевым наблвдали свечение всех микроорганизмов, кото- ' pue находятся в пробе. В данной ситуации только опыт исследователя макет помочь отделить на общем фоне клетки метанотро-фов. Ишунофлуоресцентный метод позволяет сразу по специфическому свечения, по сравнению картины фтуоресценцки и вэда данного поля в фазовом контрасте, идентифицировать клетки ыетаао-трофов.

Непрямой икмунофлуоресцентный метод был использован при промышленном испытании способа вскрытая внбросоопасннх. угольных пластов с применением микробиологического воздействия на оахто "Комсомолец".

Серодиагаосигзескика методами исследовано распространение металотрофов, введенных в угольный пласт, и определены размеры зоны пласта,, обсемененной этими микроорганизмами.

На основании полученных результатов моано заключить, что метанотрофы являются серологически обособленной групйой.Реак- . цияма агглютинации, иммунофлуоресценции и Оухтеркони показана антигенная изолированность I и П групп метанотрофов, в частности серологический анализ таксономических связей метанотро-фов подтвердил разделение метанотрофов на I и П группы,' доказал правомочность выделения новых видов, описанных Гальченко с соавт. (гальченко, 1977; Гальченко с соавт., 1977). '

Даяние иммунофлуоресцентного и амдунодиффузионного методов согласуются с данными нумерического анализа белковых sosk-трофореграмм (Гальченко, Нестеров, 1081), анализа жирнокис-лотяых и фосфолипидных спектров (Андреев с соавт., 1977¡Гальченко, 1978; Андреев и Гальченко, 1979; Андреев с соазт., Ï9E0). Полученные результаты свидетельствует о правомерности класси£<икациопкых положений, предложенных Виттенбари с коллегами (VThittanbury et.el,, 1970, 1975, 1976, 1979). Точное пшяровяыие культур требует применения я серологачеожго подхода,

Результаты проведенных экологических исследований под -

т&ерсдают возможность использования спедафгчвсгсого а чувствительного ивцупололинесцентлого метола ддя ивдшсация ыетано-трофов в природных образцах яра определении валового состава популяции иетаногрофов в различных экосистешх.

еиводи '

I. Разработана схема гикериадуадзадаи животных антигенными комплексами цетанотрофяых бактерий. Получены ишуннке сыворотки к 32 шт£№1гц меганотрофов, - охарактеризованы иммунологические свойства исследованных щтаишов. :

а. На ковдекщса частых культурметанотрофов, вшшчаиц«й .представителей.5 родов и 12 видов показано, что подученные иммунные ■ сыворотки обладают частичной етяммоеоЙ. {в-чявлены се— ротиш), строгой вжовоЯ к неотчетливо вараяенной родовой специфичностью. . ■ .

Данные серодиагностики подтвеЕВДахтг основные положения классификационной системы Яаттенбари с коллегами,

^ . 3, Установлено» что представители I и П групп облигат-ных' ивтшотрофтх бактерий серологически яе родственны. Изученные роды метанотрофов серологически татске обособлены.

3. Показана возможность' использования непрямого иымуио-ф^уоресиентного метода для экспресс-определения видового состава. иетааотрофов в накопительных культурах а природных образцах.

Чувствительность и специфичность иммунологических методов позволили использовать эта методы в таксономии, а такке при изучении акологаи ыетанотрофов.

Основные результаты работы. Л.В.БезруковоЭ представлены в ал едущих пуйлдкациях;

I.Кондратенко Г.П., Нпкоденко Ю.И., Безрукова Л.В., Мишин В.В.,-Гальченко В.Ф. Антигенные свойства и ашуногеиность ряда ыетзнокнслязодих бактерий. Тезисы 71 съезда Всесоюзного микробиологического общества, Рига; с.98, 1980. 2* Кондратенко Г.П.» Еаколенка Ю.И., Безрукова Л.'З., Нестеров А.И., и Гальчеяко В.Ф. Идентификация, метанотро<£шх бактеряЗ методом иммувофкуоресценции. 'Микробиология, 50, 320-325, 2901. .

З.Безрукова Л. В., Еиколенко Ю.И., Нестеров-Л. И., Гаиьченко ВЛ.» Яаааов И.В. Сравнительный серологический анализ мета-■.па^рсфбсс бактерий, Микробиология, 52, Щ, 600-606, 1983.

.-^■^о ^¿.из.В4 г. Зак. 4199Р ТиЬ- 125 экз. Уч.изд.л.-I.С ' . Отпечатано на ротапринте в ОНТИ НЦБИ