Превращение полициклических ароматических углеводородов бактериями

Бабошин, Михаил Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Превращение полициклических ароматических углеводородов бактериями
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Превращение полициклических ароматических углеводородов бактериями"

На правах рукописи

;

Бабошин Михаил Александрович

ПРЕВРАЩЕНИЕ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ БАКТЕРИЯМИ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино 2007

VI V

003161975

Работа выполнена в лаборатории энзиматической деградации органических соединений Института биохимии и физиологии микроорганизмов им Г К Скрябина РАН и Путинском государственном университете

Научный руководитель

Заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Л А Головлева

Официальные оппоненты

доктор биологических наук МВ Донова,

кандидат биологических наук Л В Лысак

Ведущая организация

Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН

Защита состоится 11 мая 2007 г в 14 часов 00 мин на заседании Диссертационного совета Д 002 121 01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им Г К Скрябина РАН по адресу 142290, Московская область, г Пущино, проспект Науки, 5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им Г К Скрябина РАН

Автореферат разослан "/0"___2007 г

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

В М Вагабов

Актуальность проблемы. Полицикляческие ароматические углеводороды (ПАУ) образуются в неспецифических процессах деструкции различных органических веществ при высоких температурах, например, при лесных пожарах, коксовании угля С развитием промышленности, когда к природным источникам ПАУ прибавились антропогенные (сжигание топлива, проливы нефти и каменноугольных продуктов), возникла проблема загрязнения окружающей среды этими токсичными веществами Присутствием ПАУ в биосфере на протяжении всей истории органической эволюции нашей планеты обусловлено существование живых организмов, способных к использованию ПАУ в качестве источника энергии для жизнедеятельности Это бактерии различной систематической принадлежности. В настоящее время ПАУ-деградирующие бактерии интенсивно изучаются в связи с разработкой технологий детоксикации промышленных отходов и биоремедиации загрязненных почв, донных осадков и грунтовых вод Особое внимание уделяется выделению и исследованию штаммов, способных к деградации так называемых высокомолекулярных ПАУ, молекулы которых содержат больше трех ароматических колец Высокомолекулярные ПАУ более устойчивы к биодеградации, чем ПАУ с меньшей молекулярной массой, и число известных бактерий, способных их окислять, существенно меньше Многие высокомолекулярные ПАУ оказывают мутагенное и канцерогенное воздействие на человека и животных, в связи с чем их концентрация в окружающей среде является объектом постоянного мониторинга Биоремедиация считается наиболее перспективным методом очистки почвы и других сред от ПАУ С другой стороны, многие живые организмы, осуществляют относительно "неглубокие" превращения молекул ПАУ (трансформация), часто без непосредственного использования ПАУ в качестве источника энергии для роста Трансформация ПАУ имеет большое значение для функционирования микробных сообществ. Поскольку превращение ПАУ бактериями в большинстве случаев отличается от реакций химического окисления ПАУ, бактериальное окисление ПАУ может использоваться для получения соединений, трудно доступных химическим путем Таким образом, изучение бактерий-деструкторов ПАУ актуально, во-первых, с точки зрения разработки методов биоремедиации и, во-вторых, для получения веществ, труднодоступных химическим путем

Состояние проблемы. Известно, что главную роль в деградации ПАУ в загрязненных почвах играют аэробные бактерии Среди них имеются представители десятков родов (Juhasz et Naidu, 2000) Количество выделенных штаммов и систематическое разнообразие бактерий, способных к деградации высокомолекулярных ПАУ, значительно меньше (Kanaly et Harayama, 2000) Для ряда высокомолекулярных ПАУ не известно ни одного штамма, способного к их использованию в качестве единственного источника углерода и энергии, но есть штаммы, осуществляющие деградацию данных ПАУ в соокислительных условиях Задача выделения и исследования новых штаммов-деструкторов высокомолекулярных ПАУ является по-прежнему актуальной (Но et al, 2000, Bastiaens et al, 2000, Wilhson, 2004, Lopez et al, 2005)

Наибольший прогресс достигнут в описании метаболических путей деградации ПАУ Описанные ранее пути метаболизма фенантрена (Evans et al, 1965, Kiyohara et al, 1976), антрацена (Evans et al, 1965), аценафтена и аценафтилена (Schocken et Gibson, 1984), флуорена (Gnfoll et al, 1994, Trenz et al, 1994, Casellas et al, 1997), флуорантена (Weissenfels et al, 1991, Kelley et al, 1993) и пирена (Heitkamp et al, 1988) впоследствии находили подтверждение при изучении других штаммов и уточнялись Ряд модификаций ранее известных метаболических путей и альтернативные метаболические пути обнаружены относительно недавно (Rehmann et al, 2001, Story et al, 2001, Vila et al, 2001, van Herwijnen et al, 2003, Lopez et al, 2006, Keurn et al, 2006, Poonthngpun et al, 2006 и др), это свидетельствует о том, что исследование бактериального метаболизма ПАУ еще не завершено Другим стимулом для описания новых метаболических путей

является выделение новых штаммов, способных к деградации устойчивых высокомолекулярных ПАУ, метаболизм которых прежде не изучали (Wilhson, 2004) Гораздо меньше известно о влиянии различных условий на конверсию ПАУ микроорганизмами Есть данные о влиянии на скорость бактериальной деградации ПАУ следующих факторов одновременного потребления культурой другого органического субстрата (Kanaly et al, 2002), ингибирования продуктами конверсии ПАУ (Casellas el al, 1998, Kazunga el Aitken, 2000), перекрестной индукции (Molina et al, 1999), конкурентного ингибирования другими ПАУ (Stnngfellow el Aitken, 1995), ограниченной доступности ПАУ для микроорганизмов (Johnsen et al, 2005) Важным условием, влияющим на конверсию ПАУ конкретным микроорганизмом, является присутствие в экосистеме других микроорганизмов, которые могут изменять концентрации субстратов, продуктов и других веществ в среде Исследований по конверсии ПАУ смешанными культурами известного состава выполнено мало (Casellas et al, 1998, Bouchez et al, 1999, Boonchan et al, 2000)

В большинстве работ по изучению конверсии ПАУ бактериями объектом является чистая культура, растущая на среде с одним ПАУ в качестве единственного источника углерода и энергии, т е в условиях, резко отличающихся от условий в естественной среде (например, в почве), где наблюдается ограниченная биодоступность субстрата, наличие многих ПАУ и разнообразных микроорганизмов, нестабильность физических и химических параметров (Johnsen et al, 2005) С другой стороны, процессы в почве слишком сложны для анализа, поэтому решением проблемы могла бы стать разработка методов культивирования, лучше моделирующих естественные условия

В некоторых работах предприняты попытки кинетического анализа конверсии ПАУ бактериями (Stnngfellow et Aitken, 1995, Wick et al, 2001, Lotfabad et Gray, 2002) Учитывая, что кинетические исследования необходимы для понимания механизма изучаемых процессов, такого рода работ выполнено недостаточно

Много публикаций по деградации ПАУ бактериями появилось уже во время выполнения данной работы Были более детально описаны пути метаболизма ПАУ относительно малой молекулярной массы (Moody et al, 2001, van Herwijnen et al, 2003, Keum et al, 2006, Poonthngpun et al, 2006), флуорантена (Rehmann et al, 2001, Stoiy et al, 2001, López et al, 2006), пирена (Vila et al, 2001) и ПАУ большей молекулярной массы (Moody et al, 2004, Moody et al, 2005) Выделен целый ряд штаммов, осуществляющих деградацию высокомолекулярных ПАУ (Rehmann et al, 2001, Vila et al, 2001, Dean-Ross et al, 2002, Bogan et a!, 2003, Dandie et al, 2004, Habe et al, 2004, Sho et al, 2004, Willison, 2004, Zhang et al, 2004) Изучалась биодоступность ПАУ (García-Junco et al, 2001, Kanaly et al, 2002, Wick et al, 2002, Miyata et al, 2004, Vacca et al, 2005) Проводились эксперименты по биодеградации сложных смесей ПАУ (Dean-Ross et al, 2002, Lotfabad et Gray, 2002, McLellan et al, 2002) и биоремедиации (Ramírez et al, 2001, Enksson et al, 2003, Harper et al, 2005, Hickey et al, 2007)

Цель и задачи исследования. Цель работы - поиск в коллекции и выделение из природных образцов штаммов бактерий, обладающих способностью к превращению широкого спектра ПАУ (в том числе высокомолекулярных ПАУ), и изучение биоконверсии ПАУ данными штаммами

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи

- отбор из лабораторной коллекции, а также выделение из загрязненных почв и донных осадков штаммов бактерий, способных к трансформации и полной деградации ПАУ,

- идентификация продуктов биоконверсии ПАУ новыми и ранее выделенными бактериальными штаммами, установление путей метаболизма ПАУ,

- качественное и количественное описание влияния различных факторов на конверсию ПАУ исследуемыми культурами,

- изучение биоконверсии иитермедиатов метаболизма ПАУ

Научная новизна работы. Выделены из природных образцов и охарактеризованы 3 новых штамма бактерий, способных к конверсии широкого спектра ПАУ Arthrobacter sp КЗ, способный к быстрой деградации фенантрена в высоких концентрациях, Sphingomonas sp Mar-ЗЗ, осуществляющий конверсию нафталина, фенантрена, антрацена, флуорена, аценафтепа, флуорантена, пирена и бензо[а]антрацена, Mycobacterium sp Mar-59, растущий в минеральной среде с фенантреном или пиреном, и осуществляющий конверсию ряда ПАУ в соокислительных условиях В качестве продуктов бактериального окисления флуорена впервые идентифицированы инданонкетоуксусная кислота, 2-гидроксифлуоренон и 2,7-дигидроксифлуорен Показано, что соотношение концентраций двух главных продуктов конверсии флуорена штаммом Rhodococcus rhodochrous 172 -флуоренола и флуоренона - четко зависит от удельной скорости роста биомассы, предложено объяснение наблюдаемого эффекта Исследовано потребление 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты штаммом Arthrobacter sp КЗ, показано, что добавление субстрата в растущую культуру вызывает лаг-фазу роста только в случае, если исходная концентрация субстрата в среде не была насыщающей Установлено, что процессы превращения фенантрена и антрацена в 1 -гидрокси-2-нафтойную и З-гидрокси-2-нафтойную кислоты соответственно культурой Sphingomonas sp Mar-ЗЗ являются высокоселективными реакциями, и описан метод получения продуктов в препаративных количествах Показано, что накопительные культуры, а также штамм Sphingomonas sp Mar-ЗЗ, способны осуществлять превращение широкого спектра ПАУ (в том числе высокомолекулярных) при культивировании в среде с экстрактом каменноугольного пека. Практическая значимость. Выделенные штаммы могут быть использованы для биоремедиации почв и промышленных отходов нефтеперерабатывающих и коксохимических производств, загрязненных высокомолекулярными, особо устойчивыми ПАУ Штамм Sphingomonas sp Mar-ЗЗ представляет наибольший интерес, поскольку осуществляет деградацию широкого спектра ПАУ, в том числе в среде с экстрактом каменноугольного пека. Выделенные штаммы интересны также с точки зрения производства ценных соединений, трудно доступных химическим синтезом (например, гидроксипроизводных фенантрена, перспективных для применения в медицине) Полученные накопительные культуры, эффективные в отношении деградации высокомолекулярных ПАУ могут быть использованы для выделения новых штаммов-деструкторов Предложенная методика культивирования в среде с экстрактом каменноугольного пека может применяться для поддержания накопительных культур и в качестве тест-системы для исследования биоконверсни высокомолекулярных ПАУ Разработанные методы кинетического анализа могут применяться для анализа реакций биоконверсии независимо от объекта исследования

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на ежегодных сессиях научных работ ИБФМ РАН (Пущино, 2002, 2003, 2004, 2005, 2006), конференциях молодых ученых (Пущино, 2002, 2003, 2005, 2006), на международных конференциях "Наука-бизнес-образование" (Пущино, 2005) и "Проблемы биодеструкщш техногенных загрязнителей окружающей среды" (Саратов, 2005)

Публикации. Основное содержание работы изложено в 4 статьях и 6 тезисах Объем и структура работы. Диссертация изложена на 98 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, и списка литературы, включающего 163 источника Работа содержит 8 таблиц и 45 рисунков

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовались штаммы Rhodococcus rhodochrous 172, Я opacus 4а, А opacus 557, R-rhodnu 135 и Pseudomonas fluorescens 26k, отобранные из коллекции деструкторов ксенобиотиков лаборатории энзиматической деградации органических соединений по способности к превращению ПАУ, а также 3 новых штамма (Arthrobacter sp КЗ,

Sphmgomonas sp Маг-33 и Mycobacterium sp Mar-59), выделенные нами при выполнении данной работы

Для создания накопительных культур были использованы образцы почв и донных осадков, длительно загрязняемых полиароматическими углеводородами Штамм Arthrobacter sp КЗ идентифицирован по характерному изменению формы клеток в ходе развития периодической культуры и другим признакам, указанным в определителе Бердаси (Bergey' s Manual ofsystemaüc bactenology, 1986)

Штаммы Sphmgomonas sp Маг-33 и Mycobacterium sp Mar-59 идентифицированы на основании данных анализа нуклеогидной последоватечьности гена 16S рРНК Культивирование проводилось на качалке (29 "С, 120 оборотов в минуту) в колбах объемом 7S0 мл, содержащих 100 мл культурадьной жидкости

Для поддержания накопительных культур, а также исследования биоконверсии ПАУ выделенными штаммами, применялось культивирование в среде с экстрактом каменноугольного пека. Суммарное потребления экстракта пека накопительными культурами оценивали путем измерения химического потребления кислорода (ХПК) неполярного экстракта культурадьной жидкости

ПАУ и продукты их метаболизма экстрагировали из культурадьной жидкости этил ацетатом Количественное определение содержания ПАУ и некоторых метаболитов в экстрактах осуществляли методом газо-жидкостной хроматографии на хроматографе Pye Unicam с пламенно-ионизационным детектором, колонкой 3% SE-30 на хромосорбе G-AW-DMSC 1 5м х 2мм, а также на хроматографе с масс-спектрометрической детекцией HP-GCD System (Hewlett-Packard, USA), снабженном колонкой НР-5 (30м х 0 25мм, толщина плевки 0 25 мкм)

Спектрофотометрический анализ на приборе Sbimadzu UV 160 в ряде случаев был использован в качестве вспомогательного метода для идентификации метаболитов Кроме того, УФ-спекгрофотометрия культурадьной жидкости применялась при изучении трансформации флуоренола и флуоренона штаммом Rhodococcus rhodochrous 172 и при исследовании потребления 1 -гидрокси-2-нафтойной кислоты штаммом Arthrobacter sp КЗ

Тонкослойная хроматография экстрактов использовалась для проверки штаммов на способность к трансформации ПАУ, а также для препаративного выделения метаболитов ТСХ проводилась на пластинках «Merck» с силикагелем в системе растворителей бензол -диоксан - уксусная кислота (в соотношении 90 10 1 по объему) Для разделения веществ, оставшихся на старте, пластинку элюировали еще раз - смссью бензол - диоксан - уксусная кислота (в соотношении 90 10 10 по объему)

С целью получения более летучих производных продукты биоконверсии ПАУ метилировали диаэометаном, либо санировали М-метил-К-трифторапетамидом Вещества идентифицировали методом масс-спектрометрии на приборе Finnigan МАТ 8430 при энергии ионизации 70 эВ с прямым вводом пробы в область ионизации Спектры ПМР были получены на Bruker DPX-400NMR-cneKTpoMeipe при 400 131962МН Образцы растворяли в 0 5 мл дейтер ироваяно го ацетонитрила

Для оценки концентрации биомассы находили разность светопоглощения культурадьной жидкости при длине волны 540 им до и после осаждения клеток центрифугированием Концентрацию сухой биомассы находили гравиметрически (Методы общей бактериологии, 1984) Экономический коэффициент оценивали по угловому коэффициенту графика в координатах (S0,Xa ), где S0 - исходная концентрация субстрата,

- конечная концентрация биомассы В работе использованы общепринятые методы формальной кинетики Оценка максимальной удельной скорости роста биомассы рт проводилась в полулогарифмических координатах (Перт, 1978) Анализ двусторонней реакции окисления флуоренола штаммом R rhodochrous 172 осуществлен в координатах обратимой реакции первого порядка [1пС"-1п(С°°- С)] от г для продукта и [In(С0 - С°) - 1п(С

-С™)] от г для субстрата (Эмануэль, Кнорре, 1985) Асимптотические значения концентраций Сфол и С фон, те такие, которые установились бы при бесконечно длительной инкубации, находили с помощью подгонки (Шмид, Сапунов, 1985), с точностью до 5% Оценка субстратной константы потребления 1-гцдрокси-2-нафтойной кислоты культурой Arthrobacter sp КЗ произведена методом Фостера-Ниманна (Келети, 1990) Для устранения эффекта ускорения реакции биоконверсии, связанного с ростом биомассы, переменную времени / в кинетическом уравнении заменяли на переменную

г ff = 0

экспозиции т = I Xdt, с начальным условием -! При известном законе роста

[г = 0

экспозицию вычисляли аналитически Например, в случае экспоненциального роста

г = — (е1" -1) Когда закон роста был неизвестен, экспозицию вычисляли путем f

численного интегрирования- г(Гу) = +Xl)(tl -fM). Анализ данных по

2 м

биоконверсии проводили в координатах (г, 5), при этом угловой коэффициент касательной к кинетической кривой в любой точке равен удельной скорости потребления субстрата Вычисления и построение графиков производились в программе Excel Для оценки доверительных интервалов использовалось /-распределение с доверительной вероятностью р- 0 95 (Дерффель, 1994)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Штаммы-деструкторы ПАУ, отобранные из лабораторной коллекции и выделенные из природных образцов.

Скрининг 46 штаммов из лабораторной коллекции деструкторов ксенобиотиков с помощью анализа культур альной жидкости методом ТСХ позволил отобрать 5 штаммов, способных к превращению ПАУ Rhodococcus rhodochrous 172, R opacus 4a, R opacus 557, Rrhodnii 135 и Pseudomonas fluorescens 26k

Из образцов почв и донных отложений, длительно загрязняемых полиароматическими соединениями, выделены еще 3 штамма-деструктора ПАУ Arthrobacter sp КЗ, Sphmgomonas sp Mar-33 и Mycobacterium sp Mar-59

Штамм КЗ отнесен к роду Arthrobacter sp по определителю бактерий Берджи Для штамма Маг-33 была определена нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК длиной 1376 нуклеотидов Поиск в GenBank с помощью программы BLASTn выявил близкое родство штамма с представителями рода Sphmgomonas Филогенетическое древо (рис. 1) показывает родство штамма Маг-33 по отношению к типовым штаммам ближайших видов данного рода Штамм Маг-33 объединяется в единый кластер с типовыми штаммами видов S cloaceae, S chbrophenolicum, S herbicidovorans и S yanoikuyae, имея наибольший уровень сходства нуклеотидных последовательностей с S cloaceae — 97 0%. Нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК штамма Sphingomonas sp Маг-33 записана в GenBank под номером EF128173 Штамм сдан на хранение в ВКМ под номером VKM В-2434

Была определена нуклеотидная последовательность (600 но) гена 16S рРНК штамма Маг-59 Поиск в GenBank с помощью программы BLAST показал 99% сходство нуклеотидной последовательности 16S рРНК штамма Маг-59 с 16S рРНК типового штамма Mycobacterium gilvum Нуклеотидная последовательность пггамма Mycobacterium sp Mar-59 записана в GenBank под номером EF128172 Штамм сдан на хранение в ВКМ под номером VKM В-2435

8£

Рис. 1. Бескорневое филогенетическое древо представителей рода БрЫ^отопаз, показывающее положение штамма Маг-33

6' ню'

П.

чц. с;

\ /ичЛиЛл опт | -Ш(м::53) Л МотерЬтоЬапи (Х87161) \ сЬасаш (4В(М'Ш9> Ьркпцтютя чр Маг-ЗЗ

'-.V мттЬпас (ШЫ45)

-4 ттс/тЦВОгиП)

-Л вЛаат-а (Ш6И6)

'-9 />«и«ик>Мм<ГЗШ7)

-Л тпсгоооКаМм (1)1372})

ИЮ|-Л, иу*«1таФ1ШЪ

'—X агвтпспспапЛЧ01%)

ПН! I-Рогр!птсЬачсг ттпгашпп (1.017$*)

'-ЛпШег /и;»«» <1)12699)

---2\ июпютим МФМХАВДШ!)

ЯЬоЛеЬасИг сартЫт (1116-128)

Превращение флуорена бактериями рода Ююйососсиь.

Выделены и идентифицированы продукты окисления флуорена штаммами рода Шхойососси% (Я гИоЖзсИгоих 172, Я орасш 4а, Л орасш 557 и ЯгИосЫй 135), таблица I Предложена схема превращения флуорена данными штаммами (рис. 2)

Таблица 1. Продукты окисления флуорена родококками

ТА Я/» тех Вещество Характеристические пики в масс-спектре, т/г (%)

1 0 62 флуоренол М* 182(90), 181(100), 165(18), 153(32), 152(66), 151(18), 127(3), 126(5)^76(11)

2 0 75 флуоренон М" 180(100), 152(41), 151(18), 150(12), 126(3), 76(8)

3 066 2-гидроксифлуоренон М*196(100),168(23),140(17), 139(51)

4 063 2-гидроксифлуорен М* 182(100), 181(68), 165(14), 153(23), 152(43), 151(13), 127(2), 126(3), 76(14)

5 0 35 2,7-дигидроксифлуорен М* 198(100), 197(35), 181(18), 169(14), 168(9), 152(7), 141(10), 139(16), 115(10)

6 0 35 о-(1 -инданон)-кетоуксусная кислота 204(40), 186(40), 145(80), 131(100), 115(55), 103(27), 91(34), 77(24)

7 040 2-формил-1 -инданон М* 158(95), 130(34), 129(84), 128(25), 115(100), 89(10)

8 0 40 1-инданон КГ 132(100), 131(33), 104(83), 103(41), 102(9), 78(31), 77(30), 51(22)

9 0 32 3,4-дигидрокумарин М* 148(100), 147(42), 119(36), 105(54), 91(48), 77(37)

Структура 2-гидроксифлуорена, 2,7-дигидроксифлуорена и 3,4-дигидрокумарина подтверждена методом спектроскопии ПМР

•сно

Рис. 2 Схема превращения флуорена штаммом

Rhodococcus rhodochrous 172 (пути А,В,С), а также штаммами A opacus 4а, А opacus 557 и Rrhodnti 135 (путь D)

штаммом

Цифра соответствует номеру соединения в таблице 1

Штаммы A opacus 4а, R opacus 557 и Rrhodmi 135 осуществляют гидроксилирование молекулы флуорена в положениях 2 и 7

Особенностью превращения флуорена штаммом A rhodochrous 172 является наличие трех метаболических путей окисления исходного субстрата

1) трансформации в 2-гидроксифлуорен,

2) пути, начинающегося с окисления метиленовой группы флуорена с образованием флуоренола, флуоренона и 2-гидроксифлуоренона,

3) расщепления ароматического кольца с образованием производных индана Ияданоикего уксусная кислота, 2-гидроксифлуоренок и 2,7-дигидроксифлуорен идентифицированы в качестве продуктов бактериального окисления флуорена впервые

Кометаболнзм флуорена штаммом Rhodococcus rhodochrous 172.

Штамм Rhodococcus rhodochrous 172 был выбран для дальнейшего изучения, поскольку проявил способность к осуществлению наиболее разнообразных реакций трансформации и деградации флуорена среди четырех исследованных штаммов родококков В минеральной среде, содержащей глюкозу, фруктозу, малат калия, пропионат натрия, сукцинат калия, лактат кальция или сахарозу штамм Rhodococcus rhodochrous 172 растет экспоненциально с удельной скоростью 0 20, 0 20, 0 19, 0 18, 0 13, 0 09 и 0 05 ч"1 соответственно В жидкой минеральной среде с флуореном по данным турбидиметрии штамм не растет При культивировании в минеральной среде, содержащей флуорен и один из вышеназванных ростовых субстратов, наблюдалась биоконверсия флуорена,

проявляющаяся в убывании концентрации флуорена и появлении продуктов, отсутствовавших в стерильном контроле (данные ТСХ) Из всех исследованных ростовых субстратов только рост культуры на сахарозе приводил к конверсии флуорена в концентрации 100 мг/л и выше При использовании сахарозы в качестве косубстрата высокая скорость превращения флуорена наблюдалась в широком диапазоне начальных концентраций сахарозы Если начальная концентрация сахарозы была достаточна, происходило полное удаление флуорена из культуральной жидкости Биоконверсия флуорена при использовании сахарозы в качестве косубстрата отличалась быстрым накоплением в среде соединений, поглощающих в видимой области спектра

Трансформация флуореволй и флуоренона штаммом R. rhodochrous 172.

Флуоренол (ФОЛ) и флуоренон (ФОН) являются одними из главных метаболитов флуорена Трансформация ФОЛ и ФОН штаммом Я rhodochrous 172 представляет собой двустороннюю (обратимую либо циклическую) биокаталитическую реакцию Процесс подчиняется уравнению обратимой реакции первого порядка как в опытах с нерастущей биомассой, так и для растущей культуры (при условии устранения эффекта ускорения реакции, связанного с увеличением концентрации биомассы) Выявлена четкая положительная корреляция между соотношением стационарных концентраций ФОН/ФОЛ и удельной скоростью роста (рис. 3) При росте на субстратах, дающих низкую скорость роста (сахароза, лактат), пара ФОН/ФОЛ в значительной степени окислена, а при росте на высокоэффективных ростовых субстратах (глюкоза, фруктоза, пропионат) - почти полностью восстановлена Полагая, что пара ФОН/ФОЛ в наших экспериментах играет роль редокс-индикатора, мы пришли к выводу, что рост с высокой удельной скоростью сопровождается накоплением восстановительных эквивалентов в клетках Я rhodochrous 172 Полученный результат свидетельствует о том, что верхний предел скорости роста Я rhodochrous 172 определяется реакцией, в которой происходит потребление восстановительных эквивалентов Дисбаланс обмена веществ, наблюдаемый при росте на высокоэффективных ростовых субстратах, вероятно, связан с экологической стратегией родококков (олиготрофия) Следует также отметить, что наиболее эффективным косубстратом окисления флуорена штаммом Я rhodochrous 172 оказалась сахароза -наименее эффективный ростовой субстрат, которому соответствует минимальная восстановленностъ пары ФОН/ФОЛ Это наблюдение является аргументом в пользу того, что активность культуры в отношении окисления ПАУ зависит от редокс-потенциала в соответствующей ферментной системе

Удельная старость роста {¡u} 1Ñ

¡1= 0 2266F ООНW

системы ФОН/ФОЛ и удельной скоростью роста Я rhodochrous 172

Рис.3

Соответствие между восстановленностью

ВосстансвЛбннссть сист*иы ФОН/ФОЛ (Р'Сфо^С'юл+С'дан)}

Ростоаые субстраты

1-сахароза

2-лактат

3-сукцшаг

4-пропионат

5-фруктоза,

6- глюкоза

Q fmm Q 2$ 05 0 75

Превращение бактериями фенантрена и антрацена.

Штаммы Rhodococcus rhodnit 135 и Pseudomonas fluorescens 26К, отобранные из коллекции, а также Arthrobacter sp КЗ, выделенный из промышленных сточных вод, способны к превращению фенантрена и антрацена Выделены и идентифицированы метаболиты фенантрена и антрацена (таблица 2), и предложена схема превращения фенантрена и антрацена данными штаммами (рве. 4,5)

Таблица 2. Хроматографические и масс-спектрометрические характеристики метаболитов фенантрена и антрацена.

Jft Вещество Характеристические пики в масс-спектре, m/z (%) ÄysTCX

1 антрахинон N1*208(96), 180(100), 152(83), 151(43) 0 35

2 2,3-дигадроксилафталин М* 160(100), 144(40), 131(60), 128(20), 120(20), 115(40), 91(40) 0 31

3 З-гидрокси-2-нафтойная кислота М* 188(35), 189(4), 171(10), 170(90) 143(1 IX 142(100), 115(23), 114(84), 113(30) 040

4 3,4-дигидро-6,7-бензокумарин М* 198(100), 170(30), 156(80), 128(40), 115(100) 0 31

5 3(2-гидроксинафт-3-ил)-пропионовая кислота* М* 230(52), 231(8), 199(24), 198(100), 171(15), 170(62), 157(27), 156(25), 142(16), 141(28), 128(52), 115(25) 0 68

6 4-(2-гидроксинафт-3-ил)-бутановая кислота* М* 244(15), 172(12), 171(100), 170(12), 143(45), 142(20), 141(13), 115(22) 0 80

7 фталевзя кислота* М* 194(14), 163(100), 164(13), 135(22), 120(6), 104(6), 103(4), 92(8), 76(12), 59(9) 067

8 34) -карбохсинафт-2-ил)-пропионовая кислота М* 244(64), 245(9), 199(22), 198(73Х 170(47), 157(56), 156(100), 141(25), 129(31), 128(70), 115(27) 0 40

9 3-( 1 -карбоксинафт-2 -и л)-пропионовая кислота* М+ 272(100), 273(17), 213(20), 195(25), 181(35), 170(28), 157(93), 156(62), 141(32), 129(31), 128(64), 115(28) 0 70

10 3-(1 -гидроксинафт-2-нл}-пропионовая кислота М* 216(43), 199(13), 198(76), 170(98), 169(24), 156(100), 141(30), 129(24), 128(68), 127(59), 115(24) 0 55

11 4-(2-гидр<жсинафг-3-ил)-бутановая кислота М* 230(30), 212(40), 184(100) 0 55

12 1 -гидрокси-2-нафтойная кислота М* 188(35), 189(3), 171(13), 170(100), 142(15), 116, 115(61), 114(11) 0 37

13 3,4-дигидро-7,8-бензо кумарин М* 198(100), 170(30), 156(80), 128(40), 115(100) 031

14 2-нафтол VT* 144(100), 145(11), 136(3), 137(4), 116(10), 115(40), 89(7), 63(5) 040

15 7,8-бензокумарин М* 196(84), 168(100), 139(50), 140(18), 113(5) 0 70

16 3-гидроксифенантрен КГ 194(100), 165(38), 139(4) 0 65

17 3,4-дигидрокси-3,4-дигидрофенантрен М* 212(45), 194,166(72), 165(100), 140(26) 027

18 6,7-бензокумарин М+196(100), 168(35), 139(38) 0 70

19 гидроксифенилбугеновая кислота* М* 234(20), 203(100), 174(30), 121(10) 0 52

♦Анализ проводился после метилирования

Структура 3-гидроксифенантрена, 3,4-дигндрокси-3,4-дигидрофенангрена и 3,4-дигидро-7,8-бензокумарина подтверждена методом спектроскопии ПМР

Рис. 4. Схема превращения

фенантрена штаммами

Rhodococcus rhodmi 135 (А),

Pseudomonas fluorescens 26К

(В) и Arthrobacter sp КЗ (С)

1) З-гвдроюеифенантрен,

2) 3,4-дигидрокси-3,4-дигидрофенантрен,

3) 7,8-беизокумарин,

4) 3-(1-карбоксинафг-2-ил)-пропиоиовая кислота,

5) 3,4-дигидро-7,8-

бензокумарин,

6) 3-(1 -гидроксинафт-2-ил)-пропионовая кислота,

7) 1 -гидрокси-2-нафтойная кислота,

8) фталевая кислота

.соон

Рис. 5. Схема превращения 1 антрацена штаммами

Pseudomonas fluorescens 26К и Arthrobacter sy КЗ

1) антрахинон,

2) 6,7-бензо кумарин,

3) 3,4-дигидро-6,7-бензокумарин,

4) 4-(2-гидроксинафт-3-ил)-бутановая кислота,

5) 3(2-гидроксинафт-3-ил)-пропионовая кислота,

6) З-гидрокси-2-нафтойная кислота,

7) 2,3-дигидроксинафталия

Штаммы Pseudomonas fluorescens 26К и Arthrobacter sp КЗ осуществляли весьма глубокую деградацию молекул фенантрена и антрацена, сопровождающуюся разрывом по крайней мере одного ароматического кольца, З-Гидроксифенантрен был единственным обнаруженным нами продуктом конверсии фенантрена штаммом Rhodococcus rhodmi 135, подобного рода селективные реакции биоконверсии потенциально интересны с точки зрения получения продуктов

Деградация фенантрена штаммом АпЬтоЬа&ет зр. КЗ

Для дальнейшего изучения был отобран штамм АпкгоЬааег 5р КЗ, поскольку проявил способность к конверсии фенантрена в наибольших концентрациях Являясь ауксотрофом по Ь-метионину, АгхИгоЬааег зр КЗ способен к росту в минеральной среде с глюкозой, сахарозой или сукцинатом только в присутствии Ь-метиошша, экономический коэффициент по Ь-метионину составляет около 70 При инкубации в минеральной среде с метионнном в отсутствие других органических субстратов роста не наблюдается При культивировании исследуемого штамма в минеральной среде, содержащей фенантрен н метионин (20 мг/л), происходило полное и весьма быстрое превращение до 1 г/л фенантрена, сопровождаемое ростом культуры (рис. 6А) Выход биомассы пропорционален потребленной концентрации фенантрена (рис. 6Б), следовательно, фенантрен использовался культурой в качестве единственного источника углерода и энергии, экономический коэффициент по фенантрену 0 34 ± 0 05

Х-0,3«22{8о-« + 0,018г

О ОД 1

У4*И» <H<<WTIMH4 ($о- г л

в|>еич <упп

Рис.6 А. Рост культуры АпЬ-оЬааег ар КЗ (темные точки) и потребление фенантрена (светлые точки) в минеральной среде, содержащей Ь-метиоиин (20 мг/л) и фенантрен в следующих концентрациях 1 - 0 25 г/л, 2 - 0 5 г/л, 3 - 0 75 г/л, 4 - 1 г/л

Б. Эти же данные в координатах убыль фенвнтрена - концентрация биомассы

Потребление 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты культурой АПкгоЬа&ег в р. КЗ

Штамм АпИгоЬааег вр КЗ способен к использованию 1Г2НК в качестве единственного источника углерода и энергии При инкубации в минеральной среде, содержащей 1Г2НК и Ь-метионин, кулыура росла экспоненциально = 0 08± 0 02ч"1), потребление 1Г2НК культурой АпкгоЬас1ег ер КЗ не сопровождалось накоплением каких-либо продуктов, поглощающих в УФ-области спектра

Хотя рассматриваемый субстрат не проявлял токсического эффекта в ходе роста периодической культуры, добавление 1Г2НК в культуральную жидкость, взятую из проточной культуры, вызывало временную остановку роста Продолжительность лаг-фазы была прямо пропорциональна количеству добавленного субстрата, а коэффициент пропорциональности между скачком 1Г2НК и продолжительностью лаг-фазы уменьшался с возрастанием стационарной концентрации субстрата в проточной культуре, из которой была взята культуральная жидкость для эксперимента (рис. 7)

Рис. 7. Зависимость лаг-фазы роста от скачка концентрации 1Г2НК при следующих стационарных концентрациях 1Г2НК в проточной культуре (мкМ)

1- 3 77,2- 5 44,3- 6 02, 4- 13 00

Скачок конц*нтраци1| 1Г2НК{Л5) чМ

Сопоставление интервала стационарных концентраций 1Г2НК в проточной культуре, на

котором происходит резкое снижение с субстратной константой К$ потребления

1Г2НК культурой АпИгоЬааег ер КЗ показало, что резкое снижение ~ происходит при

значениях концентрации 1Г2НК, близких к субстратной константе Таким образом, культура Аг[ИгоЬас1ег эр КЗ, не насыщенная субстратом, чувствительна к резкому повышению концентрации субстрата в среде, а насыщенная субстратом культура устойчива к скачку концентрации 1Г2НК

Деградация ПАУ накопительными культурами, поддерживаемыми в среде с экстрактом каменноугольного пека.

Оценка суммарного потребления экстракта пека по снижению ХПК неполярного экстракта культуральной жидкости (рис. 8А), а также оценка конверсии отдельных фракций экстракта пека с помощью газо-жидкостной хроматографии (рис. 8Б), показали различную эффективность накопительных культур в отношении конверсии ПАУ Различия накопительных культур по эффективности потребления экстракта пека определялись разной способностью к деградации высокомолекулярных ПАУ На основании оценки эффективности потребления экстракта пека для дальнейшей работы была отобрана накопительная культура №7 При инкубации накопительной культуры №7 в минеральной среде с экстрактом пека (0 4 г/л) в течение месяца наблюдалась полная конверсия полиароматических соединений с относительно малой молекулярной массой (карбазола, фенантрена, антрацена, флуорантена и пирена) и существенная убыль ПАУ с более высокой молекулярной массой, остаточные концентрации бензо[а]анграцена, хризена, бензо[6]флуорантена, бензо[л]пирена по сравнению со стерильным контролем составляли в среднем 16,13,30 и 35 % соответственно

Опт во

1 минь-тенне и

ШЛ. %

1 4 6

8 9

г 1 !

| 1 1 1 1

Рис 8

А Уменьшение ХПК неполярного экстракта культуральной жидкости по сравнению со стерильным контролем (%) при инкубации накопительных культур в минеральной среде с экстрактом пека (0 4 г/л) в течение 30 дней

Цифры на диаграмме соответствуют номерам накопительных культур Результат хорошо воспроизводится при последовательных пересевах накопительных культур относительная погрешность не более 15 % (р=0 95)

Б Результаты газовой хроматогрфии экстрактов культуральной жидкости накопительных культур после инкубации в минеральной среде с экстрактом пека (0 4 г/л) в течение 30 дней а - стерильный контроль,

б - посредственная накопительная культура (№8), в - наилучшая накопительная культура (№7)

Сигнал

детектора

от и адиишш

5 6

Время анализа

\шн\ ты

20 Время акалтш

\шн\ ты

20 Время анализа

IП1Ю ты

Хроматогаммы получены при использовании насадочной колонки Пики обозначенные цифрами содержат следующие основные компоненты 1- фенантрея и антрацен 2- флуорантен 3- пирен 4- бензо[я]антрацен н чризен 5- бензо[Л]флуорантен 6- беюо[«]аирен

Конверсия полиароматических соединений штаммом Sphmgomonas sp. Mar-33.

Штамм Sphmgomonas sp Mar-33, выделенный из отобранной накопительной культуры №7, осуществлял полную конверсию аценафтена (1 т/л), флуорантена (01 г/л), фенантрена (0 4 г/л) и антрацена (0 08 г/л) при инкубации в минеральной среде с витамином В12 и соответствующим ПАУ (рнс. 9, 10), нафталин в этих условиях также подвергался окислению Конверсия флуорантена, фенантрена и антрацена сопровождалась небольшим накоплением биомассы (увеличение мутности культуральной жидкости составляло ~0 05 оптических единиц) При инкубации в минеральной среде с аценафтеном наблюдалась конверсия высоких концентраций субстрата и более интенсивный рост (рнс. 10), экспоненциальный рост свидетельствовал об отсутствии влияния осложняющих факторов (икгибирования продуктами, ограниченной биодосгупности субстрата и т п), экономический коэффициент составил 0 30±0 04

Рис. 9. Конверсия флуорантена, фенантрена и антрацена штаммом Вркт^топаз Бр Маг-33 в минеральной среде с соответствующим ПАУ и добавкой витамина В,г (0 5 мкг/л) убывание концентрации флуорантена (1) и кривая роста культуры (2), убывание концентрации фенантрена (3) и антрацена (4), и накопление 1-гидрокси-2-нафгойной кислоты (5) и З-гидрокси-2-нафтойной кислоты (6) в процессе конверсии фенантрена и антрацена, соответственно

О 100 200 300 400

время, чзсы

т 06

Рнс. 10. Динамика

концентрации аценафтена (1) и мутности культуральной жидкости (2) при инкубации штамма врЫщотопав 5р Маг-33 в минеральной среде с аценафтеном и добавкой витамина Вп (0 5 мкг/л)

20 40 60

время, часы

Были идентифицированы продукты метаболизма ПАУ штаммом ЗрИг^отогт 5р Маг-33 (таблица 3) и предложена схема превращения ПАУ данным штаммом (рис. 11) Продуктами окисления фенантрена и антрацена штаммом 8ркт%отогш Бр Маг-33 были 1-гидрокси-2-нафтойная кислота и З-гидроксн-2-нафтойная кислота соответственно, причем превращение фенантрена и антрацена в гидроксинафтойные кислоты осуществлялось практически количественно (рис. 9)

В соокислительных условиях (при росте в среде с флуорантеном, флуореном или ацетатом) штамм БрЫ^отопа* ер Маг-33 осуществлял конверсию пирена, беязо[л]антрацена, флуорена, карбазола и дибензотиофена. Биоконверсия флуорена не ограничивалась окислением метиленовой группы, образующийся флуоренон подвергался дальнейшему превращению

Таблица 3. Продукты конверсии ПАУ штаммом Зркткотопах ер Маг-33

Субстрат Продукт Идентификация

нафталин салициловая кислота УФ-спектр (в фосфатном буфере) идентичен УФ-спектру стандартного образца максимумы при -210, -235 и -300 нм (рН 2) Три изосбестические точки при кислотно-основном титровании -228,-258 и-298 нм

фенантрен 1 -гидрокси-2-нафтойная кислота Данные масс-спектрометрии* М+188(35), 189(3), 171(13), 170(100), 142(15), 115(61), 114(11) УФ-спектр идентичен УФ-спектру стандартного образца

антрацен З-гидрокси-2-нафтойная кислота Данные масс-спектрометрии* М+188(35), 189(4), 171(10), 170(90) 143(11), 142(100), 115(23), 114(84), 113(30) УФ-спектр идентичен УФ-спектру стандартного образца

флуорантен 2-гидроксиаценафтен-1-карбоновая кислота Данные масс-спектрометрии*1 М"' 214(44), 196(100), 168(22), 140(54), 139(61), 115(13)

нафталевая кислота Данные масс-спектрометрии (в виде ангидрида) М* 198(55), 170(19), 154(100), 126(97)

аценафтен нафталевая кислота Данные масс-спектрометрии (в виде димэтилового эфира нафталевой кислоты) М* 244(39), 213(100), 185(27), 170(35), 154(11), 126(16), 114(19)

3-гидроксифталевая кислота Данные масс-спектрометрии (в виде диметилового эфира 3-метоксифталевой кислоты)* М+224(19), 193(100), 165(6), 163(8), 161(13), 150(12), 134(9), 120(15)

флуорен флуоренон УФ-спектр идентичен УФ-спектру стандартного образца Характеристики подвижности при ТСХ и ГЖХ также совпадают с таковыми для флуоренона.

1-гидроксифлуоренон** Данные масс-спектрометрии М4" 196(100), 168(34), 139(31), 113(6), 98(9), 84(7)

2-гидроксифлуоренон** Даяяые масс-спектрометрии М* 196(100), 168(6), 139(20), 113, 98, 84(7)

•При фрагментации молекулярного иона наблюдается орто-эффект

♦ ♦Указано наиболее вероятное положение гидроксигруппы в гидроксифлуореяонах на основании данных масс-спектрометрии, структура требует подтверждения другими методами

соон

дальнейшая ■ деградация

, дальнейшая деградация

Рис. 11. Схема превращения нафталина, антрацена, фенантрена, флуорантена, аценафтена и флуорена штаммом 5'рЫщотопаз Бр Маг-33

1- салициловая кислота, 2- З-гидрокси-2-нафтойная кислота, 3- 1 -гидрокси-2-нафтойная кислота, 4- 2-гидроксиаценафтен-1 -карбоновая кислота, 5- нафталевая кислота, 6- 3-гидроксифталевая кислота, 7- флуоренон, 8- гидроксифлуоренон (смесь двух изомеров)

Конверсия ПА У штаммом Mycobacterium sp. Mar-59.

Из отобранной накопительной культуры №7 выделен пггамм Mycobacterium sp Mar-59, способный к деградации пирена При инкубации Mycobacterium sp Mar-59 в минеральной среде с пиреном либо фенаэтреном наблюдалась конверсия субстрата, сопровождаемая ростом культуры (рис. 12) Культура способна удалять из среды до 1 г/л пирена и свыше 1 г/л фенантрена. Экономический коэффициент в обоих случаях составляет 0 52-0 57 Идентифицированы метаболиты (таблица 4) и предложена схема превращения пирена штаммом Mycobacterium sp Mar-59 (рис. 13) При росте штамма яа среде с фенаэтреном около Хоо субстрата окислялось в дифеновую кислоту, которая не подвергалась дальнейшей конверсии При росте на среде с пиреном штамм способен к конверсии флуорена, антрацена, флуорантена и бензо[а]антрацена, причем потребление пирена в присутствии флуорена или флуорантена сильно угнетается

Рис. 12. Деградация фенашрена (1) и пирена (2), и рост МусоЪааепит ер Маг-59 при инкубации в среде с фенантреном (3) и пиреном (4) в качестве единственного источника углерода и энергии

е-

О 100 200 300 400 500 600 700 время, часы

Таблица 4. Продукты конверсии фенантрена и пирена штаммом Mycobacterium sp Mar-59

Субстрат Продукт Характеристические пеки в масс-спектре метилированного производного, mil (%) Характеристические пики в масс-спектре ТМв-производного, /я/г(%)

Фенангрен 2,2'-дифеновая кислота М+270(3), 239(1), 211(100), 196(17), 180(15), 168(11), 152(29), 139(23), 126(4) но

Пиреи феиантрен-4,5-дикарбоновая кислота М* 294(6), 263(1), 235(100), 220(58), 204(8), 192(17), 176(18), 163(30),150(8) М+410(<1), 395(1), 293(100), 277(3), 235(5), 220(4), 176(7), 147(23), 73(98)

Пирен Метаболит I М* 300(45), 269(30), 241(100), 226(63),198(23), 182(25), 169(20) М" 416(10), 401(13), 327(3), 299(100), 241(5), 225(13), 182(6), 147(61), 73(97)

Пирен фенантрен-4-карбоновая кислота М* 236(85), 205(89), 177(96), 176(100), 163(15), 151(35) н о

Пирен фталевая кислота но М+310(1),295(12), 221(6), 193(2), 163(4), 147(100), 73(40)

„К,:,.] дальнейшая деградация

Рис. 13 Метаболизм пирена штаммом Mycobacterium sp Mar-59

Заключение. В настоящей работе изучалась биоконверсия ПАУ бактериальными культурами как при использовании в качестве единственного источника углерода и энергии, так и в (»окислительных условиях Показано влияние на изучаемый процесс ингибирования продуктами и ограниченной биодоступности субстрата Предложен способ культивирования накопительных культур в среде с экстрактом каменноугольного пека, а также критерии для оценки эффективности потребления ПАУ накопительными культурами Выделены и охарактеризованы 3 новых пггамма бактерий, способные к превращению широкого спектра ПАУ, в том числе высокомолекулярных Исследована биоконверсия ПАУ в составе экстракта пека отдельными штаммами по сравнению с накопительной культурой, из которой они были выделены Идентифицировано более 40 продуктов бактериального метаболизма ПАУ и предложены пути превращения ПАУ исследуемыми штаммами Большое внимание уделено изучению биоконверсии интермедиатов метаболизма ПАУ исследуемыми штаммами Обнаружено, что стационарное состояние двусторонней реакции трансформации флуоренола в флуоренон штаммом КИснЗососсиз гИос1оскгои& 172 определяется удельной скоростью роста биомассы, что, в свою очередь, коррелирует со способностью культуры к окислению флуорена Исследование потребления 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты штаммом АпкгоЬаЫег ер КЗ показало, что, хотя данный субстрат не проявляет никакого токсического эффекта в отношении культуры, растущей при насыщающих концентрациях субстрата в среде, при концентрациях субстрата ниже субстратной константы даже небольшой скачок концентрации субстрата вызывает временную остановку роста, продолжительность которой пропорциональна величине скачка Можно предположить, что обнаруженные закономерности не являются исключениями, относящимися лишь к использованным в настоящей работе микроорганизмам я веществам, а имеют более общее значение Из четырех исследованных штаммов ЗрЫ^отопаз ер Маг-33 представляется наиболее перспективным для практического применения, поскольку осуществляет конверсию наиболее широкого спектра полиароматических соединений, в том числе в составе экстракта каменноугольного пека, заслуживает внимания также селективное превращение фенантрена и антрацена в соответствующие гидроксинафтойные кислоты данным штаммом Следует, однако, отметить, что при культивировании на среде с экстрактом пека БрЫщотопах ер Маг-33 проявил существенно меньшую способность х конверсии высокомолекулярных ПАУ по сравнению с накопительной культурой, из которой данный штамм был выделен (рис. 14) Продолжением настоящей работы могло бы стать получение микробного сообщества известного состава, более полно, чем ВрИт^отопах ер Маг-33, воспроизводящего биоконверсию ПАУ накопительной культурой

100 во во до -20 о

100 ео во ■

40 ■

го -о

100 ао -

ео -

20 -

-Ш

12Э45вТвИ

123456789

1 2 3 * 5 6 71

Рис. 14 Сравнение конверсии полиароматических соединений экстракта пека штаммами Mycobacterium sp Mar-59 (А) и Sphmgomonas sp Маг-33 (В), а также исходной накопительной культурой (С) 1- фенантрен, 2- антрацен, 3- карбазол, 4- флуорантен, 5- пирен. 6- бензо[а]антрацен 7- хризен, 8- бензо[й]флуорантен, 9- бензо[а]пирен Культуры инкубировали в течение месяца в среде с экстрактом пека (0 4 г/л) На рисунке показаны остаточные концентрации ПАУ по сравнению со стерильным контролем (%)

ВЫВОДЫ

1 Путем скрининга лабораторной коллекции бактерий отобрано S штаммов, способных к превращению ПАУ (Rhodococcus rhodochrous 172, R opacus 4a, R. opacus 557, Rrhodnn 135 и Pseudomonas fluorescens 26k) Еще 3 штамма-деструктора ПАУ (Arthrobacter sp КЗ, Sphingomonas sp Маг-33 и Mycobacterium sp Mar-59) выделены из природных образцов

2 Изучена конверсия флуорена родококками Штаммы R opacus 4а, R opacus 557 и Rrhodnn 135 осуществляют гидрокснлирование молекулы флуорена в положениях 2 и 7 Метаболизм флуорена пггаммом R. rhodochrous 172 протекает одновременно по трем путям происходит окисление метиленовой группы субстрата с образованием флуоренола н флуоренона, гидрокснлирование в положении 2, и расщепление одного из ароматических колец с образованием производных индана Наиболее эффективным косубстратом окисления флуорена штаммом R rhodochrous 172 из ряда испытанных источников углерода и энергии является сахароза, будучи наименее эффективным ростовым субстратом

3 Окисление флуоренола в флуоренон культурой Rhodococcus rhodochrous 172 является двусторонней реакцией, подчиняющейся кинетике обратимой реакции первого порядка. Между восстановленностыо системы флуоренон/флуоренол и удельной скоростью роста биомассы наблюдается четкое соответствие при росте на субстратах, дающих низкую скорость роста (сахароза, лактат), пара флуоренон/флуоренол в значительной степени окислена, а при росте на высокоэффективных ростовых субстратах (глюкоза, фруктоза, пропионат) - почти полностью восстановлена. Сделано предположение о том, что верхний предел скорости роста культуры ограничивается скоростью реакции, в которой происходит потребление восстановительных эквивалентов

4 Исследована бактериальная конверсия фенантрена и антрацена Штамм Rrhodnn 135 осуществляет трансформацию фенангрена в 3-гидроксифенантрен Деградация фенантрена и антрацена штаммами Pseudomonas fluorescens 26К и Arthrobacter sp КЗ сопровождается расщеплением ароматических колец молекулы субстрата Arthrobacter sp КЗ способен к полной конверсии фенантрена в концентрации до 1 г/л

5 Исследовано потребление 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты штаммом Arthrobacter sp КЗ Показано, что резкое увеличение концентрации субстрата в проточной культуре вызывает лаг-фазу роста только в случае, если исходная концентрация субстрата в среде не была насыщающей

6 Штамм Sphingomonas sp Маг-33 способен к использованию нафталина, фенантрена, антрацена, флуорантена и аценафтена в качестве единственного источника углерода и энергии, и осуществляет конверсию пирена, бензо[о]антрацена, флуорена, карбазола и дибензотиофена в соокислительных условиях Фенантрен и антрацен количественно окисляются в 1-гидрокси-2-нафтойную и З-гидрокси-2-нафтойную кислоты соответственно, деградация флуорантена и аценафтена протекает через нафталевую и 3-гидроксифталевую кислоты. Штамм способен к конверсии фенантрена, антрацена, флуорантена и карбазола в составе экстракта каменноугольного пека

7 Штамм Mycobacterium sp Mar-59 использует фенантрен и пирен в качестве единственного источника углерода и энергии, осуществляя полную конверсию данных ПАУ в концентрации до 1 г/л В соокислительных условиях штамм способен к конверсии флуорена, антрацена, флуорантена и бензо[я]антрацена

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1 Бабошин М А, Финкелылтейн 3 И, Головлева Л А Кометаболизм флуорена культурами Rhodococcus rhodochrous и Pseudomonas ßuorescens Микробиология 2003 т 72 № 2 стр 194-198

2 Финкелылтейн 3И, Баскунов БП , Головлев ЕЛ , Вервут Ж, Ритьенс ИМСМ, Бабошин М А , Головлева Л А Превращение флуорена бактериями рода Rhodococcus Микробиология 2003 т 72 №6 crp 746-751

3 Бабошин М А, Головлева Л А Зависимость относительного значения окислительно-восстановительного потенциала в клетках Rhodococcus rhodochrous от скорости роста культуры Микробиология 2005 т74 №1 стр 135-136

4 Бабошин М А , Баскунов Б П , Финкелылтейн 3 И , Головлев Е Л, Головлева Л А Микробная трансформация фенантрена и антрацена Микробиология 2005 т 74 №3 стр 357-364

5 Бабошин М А Кометаболизм флуорена бактериями родов Rhodococcus и Pseudomonas Биология - наука XXI века 6-я Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 20-24 мая 2002 года) Сборник тезисов тЗ стр 9

6 Бабошин М А , Финкельпггейн 3 И, Баскунов Б П , Головлев Е Л, Головлева Л А Трансформация флуорена культурой Rhodococcus rhodochrous 172 Биология - наука XXI века, 7-я Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 14 - 18 апреля 2003 года) Сборник тезисов, стр 263

7 Бабошин МА Деградация высокомолекулярных полиароматических углеводородов накопительными культурами Биология - наука XXI века. 9-я Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 18-22 апреля 2005 года) Сборник тезисов стр 182

8 Бабошин М А Получение культур микроорганизмов, разрушающих высокомолекулярные полициклические ароматические углеводороды. Наука-бизнес-образование 2-я Международная конференция (Пущино, 10-13 мая 2005 года) Сборник тезисов стр 125-126

9 Бабошин М А, Головлева Л А Накопительные культуры, растущие на экстракте каменноугольного пека. Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды Международная конференция (Саратов, 14-16 сентября 2005 года) Сборник тезисов стр 8

10 Бабошин М А, Головлева Л А Штаммы-деструкторы флуорангена и пирена Биология -наука XXI века 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 17-21 апреля 2006 года) Сборник тезисов стр 181

Благодарности.

Автор искренне благодарит своего научного руководителя проф Л А Головлеву Автор также выражает признательность к б н 3 И Финкелыптейн, у которой он многому научился, к б и ВЫ Акимову - за идентификацию штаммов путем анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК, Б П Баскунову - за идентификацию метаболитов методом масс-спектрометрии, доктору Вервуту (J Vervoot) из Университета Вагенингена (Нидерланды) - за идентификацию метаболитов методом спектроскопии ПМР, а также доктору Хану (Shahamat U Khan) - за предоставление возможности работать в течение двух месяцев в университете Джорджа Мейсона (США)

Принято к исполнению 6 04 2007 Исполнено 9 04 2007

Заказ № 12 Тираж 100 экз

«Фотон-век», г Пущино, ул Институгская-3, тел 73-94-32 beornot@rambler ru http //photon-vek narod ш

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бабошин, Михаил Александрович

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика полициклических ароматических углеводородов.

1.2. Микроорганизмы, осуществляющие биодеградацию и биотрансформацию полиароматических углеводородов.

1.3. Пути аэробного метаболизма полиароматических углеводородов бактериями.

1.4. Условия, влияющие на биоконверсию ПАУ микроорганизмами.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Превращение полициклических ароматических углеводородов бактериями"

Актуальность проблемы. Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) образуются в неспецифических процессах деструкции различных органических веществ при высоких температурах, например, при лесных пожарах, коксовании угля. С развитием промышленности, когда к природным источникам ПАУ прибавились антропогенные (сжигание топлива, проливы нефти и каменноугольных продуктов), возникла проблема загрязнения окружающей среды этими токсичными веществами. Присутствием ПАУ в биосфере на протяжении всей истории органической эволюции нашей планеты обусловлено существование живых организмов, способных к использованию ПАУ в качестве источника энергии для жизнедеятельности. Это бактерии различной •• систематической'принадлежности. В настоящее время ПАУ-деградирующие бактерии интенсивно изучаются в связи с разработкой технологий детоксикации промышленных отходов и биоремедиации загрязненных почв, донных осадков и грунтовых вод. Особое внимание уделяется выделению и исследованию штаммов, способных к деградации так называемых высокомолекулярных ПАУ, молекулы которых содержат больше трех ароматических колец. Высокомолекулярные ПАУ более устойчивы к биодеградации, чем ПАУ с меньшей молекулярной массой, и число известных бактерий, способных их окислять, существенно меньше. Многие высокомолекулярные ПАУ оказывают мутагенное и канцерогенное воздействие на человека и животных, в связи с чем их концентрация в окружающей среде является объектом постоянного мониторинга. Биоремедиация считается наиболее перспективным методом очистки почвы и других сред от ПАУ.

С другой стороны, многие живые организмы, осуществляют относительно "неглубокие" превращения молекул ПАУ (трансформация), часто без непосредственного использования ПАУ в качестве источника энергии для роста. Трансформация ПАУ имеет большое значение для функционирования микробных сообществ. Поскольку превращение ПАУ бактериями в большинстве случаев отличается от реакций химического окисления ПАУ, бактериальное окисление ПАУ может использоваться для получения соединений, трудно доступных химическим путем.

Таким образом, изучение бактерий-деструкторов ПАУ актуально, во-первых, с точки зрения разработки методов биоремедиации и, во-вторых, для получения веществ, • труднодоступных химическим путем. Состояние проблемы. Известно, что главную роль в деградации ПАУ в загрязненных почвах играют аэробные бактерии. Среди них имеются представители десятков родов

Juhasz et Naidu, 2000). Количество выделенных штаммов и систематическое разнообразие бактерий, способных к деградации высокомолекулярных ПАУ, значительно меньше (Kanaly et Harayama, 2000). Для ряда высокомолекулярных ПАУ не известно ни одного штамма, способнрго к их использованию в качестве единственного источника углерода и энергии, но есть штаммы, осуществляющие деградацию данных ПАУ в соокислительных условиях. Задача выделения и исследования новых штаммов-деструкторов высокомолекулярных ПАУ является по-прежнему актуальной (Но et al., 2000; Bastiaens et al, 2000; Willison, 2004; Lopez et al, 2005). Наибольший прогресс достигнут в описании метаболических путей деградации ПАУ. Описанные ранее пути метаболизма фенантрена (Evans et al, 1965; Kiyohara et al., 1976), антрацена (Evans et al., 1965), аценафтена и аценафтилена (Schocken et Gibson, 1984), флуорена (Grifoll et al, 1994; Trenz et al., 1994; Casellas et al., 1997), флуорантена (Weissenfels et al., 1991; Kelley et al., 1993) и пирена (Heitkamp et al., 1988) впоследствии находили подтверждение при изучении других штаммов и уточнялись. Ряд модификаций ранее известных метаболических путей и альтернативные метаболические пути обнаружены относительно недавно (Rehmann et al., 2001; Story et al., 2001; Vila et al., 2001; van Herwijnen et al, 2003; Lopez et al, 2006; Keum et al, 2006; Poonthrigpun et al, 2006 и др.), это свидетельствует о том, что исследование бактериального метаболизма ПАУ еще не завершено. Другим стимулом для описания новых метаболических путей является выделение новых штаммов, способных к деградации устойчивых высокомолекулярных ПАУ, метаболизм которых прежде не изучали (Willison, 2004). Гораздо меньше известно о влиянии различных условий на конверсию ПАУ микроорганизмами. Есть данные о влиянии на скорость бактериальной деградации ПАУ следующих факторов: одновременного потребления культурой другого органического субстрата (Kanaly et al., 2002), ингибирования продуктами конверсии ПАУ (Casellas et al, 1998; Kazunga et Aitken, 2000), перекрестной индукции (Molina et al, 1999), конкурентного ингибирования другими ПАУ (Stringfellow et Aitken, 1995), ограниченной доступности ПАУ для микроорганизмов (Johnsen et al, 2005). Важным условием, влияющим на конверсию ПАУ конкретным микроорганизмом, является присутствие в экосистеме других микроорганизмов, которые могут изменять концентрации субстратов, продуктов и других веществ в среде. Исследований по конверсии ПАУ смешанными культурами известного состава выполнено мало (Casellas et al, 1998; Bouchez et al, 1999; Boonchan et al, 2000). В большинстве работ по изучению конверсии ПАУ бактериями объектом является чистая культура, растущая на среде с одним ПАУ в качестве единственного источника углерода и энергии, т.е. в условиях, резко отличающихся от условий в естественной среде (например, в почве), где наблюдается ограниченная биодоступность субстрата, наличие многих ПАУ и разнообразных микроорганизмов, нестабильность физических и химических параметров (Johnsen et al, 2005). С другой стороны, процессы в почве слишком сложны для анализа, поэтому решением проблемы могла бы стать разработка методов культивирования, лучше моделирующих естественные условия. В некоторых работах предприняты попытки кинетического анализа конверсии ПАУ бактериями (Stringfellow et Aitken, 1995; Wick et al, 2001; Lotfabad et Gray, 2002). Учитывая, что кинетические исследования необходимы для понимания механизма изучаемых процессов, такого рода работ выполнено недостаточно. Много публикаций по деградации ПАУ бактериями появилось уже во время выполнения данной работы. Были более детально описаны пути метаболизма ПАУ относительно малой молекулярной массы (Moody et al., 2001; van Herwijnen et al., 2003; Keum et al., 2006; Poonthrigpun et al., 2006), флуорантена (Rehmann et al., 2001; Story et al., 2001; Lopez et al, 2006), пирена (Vila et al., 2001) и ПАУ большей молекулярной массы (Moody et al., 2004; Moody et al, 2005). Выделен целый ряд штаммов, осуществляющих деградацию высокомолекулярных ПАУ (Rehmann et al., 2001; Vila et al, 2001; Dean-Ross et al, 2002; Bogan et al, 2003; Dandie et al, 2004; Habe et al, 2004; Sho et al, 2004; Willison, 2004; Zhang et al, 2004). Изучалась биодоступность ПАУ (Garcfa-Junco et al, 2001; Kanaly et al, 2002; Wick et al, 2002; Miyata et al, 2004; Vacca et al, 2005). Проводились эксперименты по биодеградации сложных смесей ПАУ (Dean-Ross et al, 2002; Lotfabad et Gray, 2002; McLellan et al, 2002) и биоремедиации (Ramirez et al, 2001; Eriksson et al, 2003; Harper et al, 2005; Hickey et al, 2007).

Цель и задачи исследования.

Цель работы - поиск в коллекции и выделение из природных образцов штаммов бактерий, обладающих способностью к превращению широкого спектра ПАУ (в том числе высокомолекулярных ПАУ), и изучение биоконверсии ПАУ данными штаммами. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

- отбор из лабораторной коллекции, а также выделение из загрязненных почв и донных осадков штаммов бактерий, способных к трансформации и полной деградации ПАУ;

- идентификация продуктов биоконверсии ПАУ новыми и ранее выделенными бактериальными штаммами; установление путей метаболизма ПАУ;

-'качественное и количественное описание влияния различных факторов на конверсию ПАУ исследуемыми культурами;

- изучение биоконверсии интермедиатов метаболизма ПАУ.

Научная новизна работы. Выделены из природных образцов и охарактеризованы

3 новых штамма бактерий, способных к конверсии широкого спектра ПАУ: Arthrobacter sp. КЗ, способный к быстрой деградации фенантрена в высоких концентрациях; Sphingomonas sp. Mar-ЗЗ, осуществляющий конверсию нафталина, фенантрена, антрацена, флуорена, аценафтена, флуорантена, пирена и бензо[а]антрацена; Mycobacterium sp. Mar-59, растущий в минеральной среде с фенантреном или пиреном, и осуществляющий конверсию ряда ПАУ в соокислительных условиях. В качестве продуктов бактериального окисления флуорена впервые идентифицированы инданонкетоуксусная кислота, 2-гидроксифлуоренон и 2,7-дигидроксифлуорен. Показано, что соотношение концентраций двух главных продуктов конверсии флуорена штаммом Rhodococcus rhodochrous 172 -флуоренола и флуоренона - четко зависит от удельной скорости роста биомассы; предложено объяснение наблюдаемого эффекта. Исследовано потребление 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты штаммом Arthrobacier sp. КЗ; показано, что добавление субстрата в растущую культуру вызывает лаг-фазу роста только в случае, если исходная концентрация субстрата в среде не была насыщающей. Установлено, что процессы превращения фенантрена и антрацена в 1-гидрокси-2-нафтойную и З-гидрокси-2-нафтойную кислоты соответственно культурой Sphingomonas sp. Mar-ЗЗ являются высокоселективными реакциями, и описан метод получения продуктов в препаративных количествах. Показано, что накопительные культуры, а также штамм Sphingomonas sp. Mar-ЗЗ, способны осуществлять превращение широкого спектра ПАУ (в том числе высокомолекулярных) при культивировании в среде с экстрактом каменноугольного пека. Практическая значимость. Выделенные штаммы могут быть использованы для биоремедиации почв и промышленных отходов нефтеперерабатывающих и коксохимических производств, загрязненных высокомолекулярными, особо устойчивыми ПАУ. Штамм Sphingomonas sp. Mar-ЗЗ представляет наибольший интерес, поскольку осуществляет деградацию широкого спектра ПАУ, в том числе в среде с экстрактом каменноугольного пека. Выделенные штаммы интересны также с точки зрения производства ценных соединений, трудно доступных химическим синтезом (например, гидроксипроизводных фенантрена, перспективных для применения в медицине). Полученные накопительные культуры, эффективные в отношении деградации высокомолекулярных ПАУ, могут быть использованы для выделения новых штаммов-деструкторов. Предложенная методика культивирования в среде с экстрактом каменноугольного пека может применяться для поддержания накопительных культур и в качестве тест-системы для исследования биоконверсии высокомолекулярных ПАУ. Разработанные методы кинетического анализа могут применяться для анализа реакций биоконверсии независимо от объекта исследования.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Бабошин, Михаил Александрович

ВЫВОДЫ

1. Путем скрининга лабораторной коллекции бактерий отобрано 5 штаммов, способных к превращению ПАУ {Rhodococcus rhodochrous 172, R. opacus 4a, R. opacus 557, R.rhodnii 135 и Pseudomonas fluorescens 26k). Еще 3 штамма-деструктора ПАУ (Arthrobacter sp. КЗ, Sphingomonas sp. Mar-33 и Mycobacterium sp. Mar-59) выделены из природных образцов.

2. Изучена конверсия флуорена родококками. Штаммы R. opacus 4а, R. opacus 557 и R.rhodnii 135 осуществляют гидроксилирование молекулы флуорена в положениях 2 и 7. Метаболизм флуорена штаммом R. rhodochrous 172 протекает одновременно по трем путям: происходит окисление метиленовой группы субстрата с образованием флуоренола и флуоренона, гидроксилирование в положении 2, и расщепление одного из ароматических колец с образованием производных индана. Наиболее эффективным косубстратом окисления флуорена штаммом R. rhodochrous 172 из ряда испытанных источников углерода и энергии является сахароза, будучи наименее эффективным ростовым субстратом.

3. Окисление флуоренола в флуоренон культурой Rhodococcus rhodochrous 172 является двусторонней реакцией, подчиняющейся кинетике обратимой реакции первого порядка. Между восстановленностью системы флуоренон/флуоренол и удельной скоростью роста биомассы наблюдается четкое соответствие: при росте на субстратах, дающих низкую скорость роста (сахароза, лактат), пара флуоренон/флуоренол в значительной степени окислена, а при росте на высокоэффективных ростовых субстратах (глюкоза, фруктоза, пропионат) - почти полностью восстановлена. Сделано предположение о том, что верхний предел скорости роста культуры ограничивается скоростью реакции, в которой происходит потребление восстановительных эквивалентов.

4. Исследована бактериальная конверсия фенантрена и антрацена. Штамм R.rhodnii 135 осуществляет трансформацию фенантрена в 3-гидроксифенантрен. Деградация фенантрена и антрацена штаммами Pseudomonas fluorescens 26К и Arthrobacter sp. КЗ сопровождается расщеплением ароматических колец молекулы субстрата. Arthrobacter sp. КЗ способен к полной конверсии фенантрена в концентрации до 1 г/л.

5. Исследовано потребление 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты штаммом Arthrobacter sp. КЗ. Показано, что резкое увеличение концентрации субстрата в проточной культуре вызывает лаг-фазу роста только в случае, если исходная концентрация субстрата в среде не была насыщающей.

6. Штамм Sphingomonas sp. Mar-33 способен к использованию нафталина, фенантрена, антрацена, флуорантена и аценафтена в качестве единственного источника углерода и энергии, и осуществляет конверсию пирена, бензо[а]антрацена, флуорена, карбазола и дибензотиофена в соокислительных условиях. Фенантрен и антрацен количественно окисляются в ' 1-гидрокси-2-нафтойную и З-гидрокси-2-нафтойную кислоты соответственно; деградация флуорантена и аценафтена протекает через нафталевую и 3-гидроксифталевую кислоты. Штамм способен к конверсии фенантрена, антрацена, флуорантена и карбазола в составе экстракта каменноугольного пека.

7. Штамм Mycobacterium sp. Маг-59 использует фенантрен и пирен в качестве единственного источника углерода и энергии, осуществляя полную конверсию данных ПАУ в концентрации до 1 г/л. В соокислительных условиях штамм способен к конверсии флуорена, антрацена, флуорантена и бензо [о]антрацена.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе изучалась биоконверсия ПАУ бактериальными культурами как при использовании в качестве единственного источника углерода и энергии, так и в соокислительных условиях. Показано влияние на изучаемый процесс ингибирования продуктами и ограниченной биодоступности субстрата. Предложен способ культивирования накопительных культур в среде с экстрактом каменноугольного пека, а также критерии для оценки эффективности потребления ПАУ накопительными культурами. Выделены и охарактеризованы 3 новых штамма бактерий, способные к превращению широкого спектра ПАУ, в том числе высокомолекулярных. Исследована биоконверсия ПАУ в составе экстракта пека отдельными штаммами по сравнению с накопительной культурой, из которой они были выделены. Идентифицировано более 40 продуктов бактериального метаболизма ПАУ и предложены пути превращения ПАУ исследуемыми штаммами.

Большое внимание уделено изучению биоконверсии интермедиатов метаболизма ПАУ исследуемыми штаммами. Обнаружено, что стационарное состояние двусторонней реакции трансформации флуоренола в флуоренон штаммом Rhodococcus rhodochrous 172 определяется удельной скоростью роста биомассы, что, в свою очередь, коррелирует со способностью культуры к окислению флуорена. Исследование потребления 1 -гидрокси-2-нафтойной кислоты штаммом Arthrobacter sp. КЗ показало, что, хотя данный субстрат не проявляет никакого токсического эффекта в отношении культуры, растущей при насыщающих концентрациях субстрата в среде, при концентрациях субстрата ниже субстратной константы даже небольшой скачок концентрации субстрата вызывает временную остановку роста, продолжительность которой пропорциональна величине скачка. Можно предположить, что обнаруженные закономерности не являются исключениями, относящимися лишь к использованным в настоящей работе микроорганизмам и веществам, а имеют более общее значение.

Из четырех исследованных штаммов Sphingomonas sp. Mar-ЗЗ представляется наиболее перспективным для практического применения, поскольку осуществляет конверсию наиболее широкого спектра полиароматических соединений, в том числе в составе экстракта каменноугольного пека; заслуживает внимания также селективное превращение фенантрена и антрацена в соответствующие гидроксинафтойные кислоты данным штаммом. Следует, однако, отметить, что при культивировании на среде с экстрактом пека Sphingomonas sp. Mar-ЗЗ проявил существенно меньшую способность к конверсии высокомолекулярных ПАУ по сравнению с накопительной культурой, из которой данный штамм был выделен (рис. 3.38). Продолжением настоящей работы могло бы стать получение микробного сообщества известного состава, более полно, чем Sphingomonas sp. Mar-33, воспроизводящего биоконверсию ПАУ накопительной культурой.

100 80 60 40 J

20 о □

123456789

100 80 60 40 J — 20 О и В

123456789

100 80 60 40 20

1 23456789

Рис. 3.38. Сравнение конверсии полиароматических соединений экстракта пека штаммами Mycobacterium sp. Маг-59 (А) и Sphingomonas sp. Mar-33 (В), а также исходной накопительной культурой (С).

1- фенантрен; 2- антрацен; 3- карбазол; 4- флуорантен; 5- пирен; 6- бензо[а]антрацен; 7-хризен; 8- бензо[£]флуорантен; 9- бензо[я]пирен.

Культуры инкубировали в течение месяца в среде с экстрактом пека (0.4 г/л). На рисунке показаны остаточные концентрации ПАУ по сравнению со стерильным контролем (%).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бабошин, Михаил Александрович, Пущино

1. Бернштейн И.Я., Каминский Ю.А. 1986. Спектрофотометрический анализ в органической химии. JI.: Химия. 198 с.

2. Варфоломеев С.Д., Калюжный С.В. 1990. Биотехнология: кинетические основы микробиологических процессов. М.: Высшая школа. 296 с.

3. Гачок В.П. 1987. Странные аттракторы в биохимических системах. В кн.: Современные проблемы биокинетики. М.: Издательство Московского университета, стр. 78-118.

4. Гоголева Т.Я., Шустиков В.И. 1992. Химия и технология переработки каменноугольной смолы. М.: Металлургия. 256 с.

5. Дерффель К. 1994. Статистика в аналитической химии. М.: Мир. 270 с.

6. Ерошина Н.В., Головлев Е.Л., Скрябин Г.К. 1977. Динамика пиридиннуклеотидных коферментов в клетках Nocardia. Изв. АН СССР сер. биологическая. № 1. стр. 8289.

7. Карасевич Ю.Н. 1982. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения. М.: Наука. 142 с.

8. Келети Т. 1990. Основы ферментативной кинетики. М.: Мир. 350 с.

9. Клар Э. 1971. Полициклические углеводороды (в 2 томах). М.: Мир. 910 с.

10. Кульский JI.A., Левченко Т.М., Петрова М.В. 1976. Химия и микробиология воды. Практикум. К.: Вища школа. 116 с.

11. Методы общей бактериологии, (под ред. Ф. Герхарда и др.) М.: Мир, 1984. т.З. стр. 234.

12. Мишустин Е.Н., Заварзин Г.А., 1976. Экология микроорганизмов и биосферные заповедники. В сб. «Материалы советско-американского симпозиума по биосферным заповедникам», ч. 2. стр. 205-215.

13. Перт С. Дж. 1978. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир. 331 с.

14. Привалов В.Е., Хлопкова Л.И., Папков Г.И. 1976. Анализ сточных вод коксохимических заводов. М.: Металлургия. 120 с.

15. Ровинский Ф.Я. и др. 1988. Фоновый мониторинг полициклических ароматических углеводородов. Л.: Гидрометеоиздат. 233 с.

16. Селифонов С.А., Слепенькин А.В., Аданин В.М., Гречкина Г.М., Старовойтов И.И. 1993. Катаболизм аценафтена штаммами Alcaligenes eutrophus и Alcaligenes paradoxus. Микробиология, т. 62. с. 120-128.

17. Скрябин Г.К., Головлева Л.А., Головлев Е.Л. 1978. Кометаболизм: биологический смысл феномена. Пущино. 17 с.

18. Унифицированные методы анализа вод. (под ред. Ю.Ю. Лурье) 1971. М.: Химия. 375 с.

19. Шенталь Р. 1971. Канцерогенное действие полициклических ароматических углеводородов и некоторых других веществ. В кн. Клар Э. Полициклические углеводороды. М.: Мир. Т.1. стр. 138-163.

20. Шмид Р., Сапунов В.Н. 1985. Неформальная кинетика. В поисках путей химических реакций. М.: Мир. 264 с.

21. Эмануэль Н.М., Кнорре Д.Г. 1984. Курс химической кинетики. М.: Высшая школа. 463 с.

22. Ascon-Cabrera М., Lebeault J.-M. 1993. Selection of xenobiotic-degrading microorganisms in a biphasic aqueousorganic system. Appl. Environ. Microbiol. V. 59. p. 1717-1724.

23. Bamforth S.M., Singleton I. 2005. Bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons: current knowledge and future directions. Review. J. Chem. Technol. Biotechnol. V. 80. p. 723-736.

24. Bastiaens L., Springael D., Wattiau P., Harms H., deWachter R., Werachtert H., Diels L. 2000. Isolation of adherent polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH)-degrading bacteria using PAH-sorbing carriers. Appl. Environ. Microbiol. V.66. p. 1834-1843.

25. Bateman J. N., Speer В., Feduik L., Hartline R. A. 1986. Naphthalene association and uptake in Pseudomonasputida. J. Bacteriol. V.166. p. 155-161.

26. Bedessem M.E., Swoboda-Colberg N.G., Colberg P.J.S. 1997. Naphthalene mineralization coupled to sulfate reduction in aquifer-derived enrichments. FEMS Microbiol. Lett. V. 152. p. 213-218.

27. Bergey's Manual of systematic bacteriology. P. H. Sh. Sneath, N.S. Mair, M.E. Sharpe, J.G. Halt Eds, Williams and Wilkins, Baltimor, London, Los Angeles, Sydney. 1986. V.2. P.1289-1301.

28. Bezalel L., Hadar Y., Cerniglia C.E. 1996. Mineralization of polycyclic aromatic hydrocarbons by the white-rot fungus Pleurotus oslreatus. Appl. Environ. Microbiol. V. 62. p. 292-295.

29. Bodour A.A., Wang J.-M., Brusseau M.L., Maier R.M. 2003. Temporal change in culturable phenanthrene degraders in response to long-term exposure to phenanthrene in a soil column system. Environmental Microbiology. V. 5 p. 888-895.

30. Bogan B.W., Lamar R.T., Hammel K. 1996. Fluorene oxidation in vivo by Phanerochaete chrysosporium and in vitro during manganese peroxidase-dependent lipid peroxidation. Appl. Environ. Microbiol. V. 62. p. 1788-1792.

31. Boldrin В., Tiehn A., Fritzsche C. 1993. Degradation of phenanthrene, fluorene, fluoranthene and pyrene by a Mycobacterium sp. Appl. Environ. Microbiol. V. 59. p. 1927-1930.

32. Boonchan S., Britz M.L., Stanley G.A. 1998. Surfactant-enhanced biodegradation of high molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons by Stenotrophomonas maltophilia. Biotechnol. Bioeng. V.59. p. 482-494.

33. Boonchan S., Britz M.L., Stanley G.A. 2000. Degradation and mineralization of high-molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons by defined fungal-bacterial cocultures. Appl. Environ. Microbiol. V. 66. p. 1007-1019.

34. Bosma T.N.P., Middeldorp P.J.M., Schraa G., Zehnder A. 1997. Mass transfer limitation of biotransformation: quantifying bioavailability. Environ. Sci. Technol. V. 31. p. 248252.

35. Bossert I.D., Bartha R. 1986. Structure biodegradability relationships of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil. Bull. Environ. Contam. Toxicol. V.37. p.490-495.

36. Bottger E.C., Kirschner P., Springer В., Zumfit W. 1997. Mycobacteria degrading polycyclic aromatic hydrocarbons. Int. J. Syst. Bacteriol. V.47. p. 247.

37. Bouchez M., Blanchet D., Vandecasteele J.P. 1995. Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by pure strains and defined strain associations: inhibition phenomena and cometabolism. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 43.156-164.

38. Bouchez M., Blanchet D., Bardin V., Haeseler F., Vandecasteele J.P. 1999. Efficiency of defined strains and of soil consortia in the biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH)'mixtures. Biodegradation V. 10. p. 429-435.

39. Boyd D.R., Sharma N.D., Allen C.C.R. 2001. Aromatic dioxygenases: molecular biocatalysis and applications. Current Opinion in Biotechnology V. 12. p. 564-573.

40. Bressler D.C., Fedorak P.M. 2000. Bacterial metabolism of fluorene, dibenzofuran, dibenzothiophene, and carbazole. Canadian journal of microbiology. V.46. p. 397-409.

41. Bury S. J., Miller C. A. 1993. Effect of micellar solubilization on biodegradation rates of hydrocarbons. Environ. Sci. Technol. V.27. p. 104-110.

42. Casellas M., Grifoll M., Sebate J., Solanas A.M. 1997. New metabolites in the degradation of fluorene by Arthrobacter sp. strain F101. Appl. Environ. Microbiol. V. 63. p. 819-826.

43. Casellas M., Grifoll M., Sebate J., Solanas A.M. 1998. Isolation and characterization of a fluorenone-degrading bacterial strain and its role in synergistic degradation of fluorene by a consortium. Can. J. Microbiol. V. 44. p. 734-742.

44. Cerniglia C.E. 1984. Microbial metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons. Adv. Appl. Microbiol. V.30. p. 31-71.

45. Cerniglia C.E. 1992. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons. Biodegradation V.3. p. 351-368.

46. Chen S.-H., Aitken M.D. 1999. Salicylate stimulates the degradation of high-molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons by Pseudomonas saccharophila PI5. Environ. Sci. Technol. V. 33. p. 435-439.

47. Churchill S.A., Harper J.P., Churchill P.F. 1999. Isolation and characterization of a Mycobacterium species capable of degrading three- and four-ring aromatic and aliphatic hydrocarbons. Appl. Environ. Microbiol. V.65. p. 549-552.

48. Coates J. D„ Woodward J., Allen J., Philip P., Lovley D. R. 1997. Anaerobic degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons and alkanes in petroleum-contaminated marine harbor sediments. Appl. Environ. Microbiol. V.63. p. 3589-3593.

49. Conn H.J., Darrow M.A. 1935. Characteristics of certain bacteria belonging to the autochtonous microflora of soil. Soil Science. V. 39. p.95-110.

50. Crabtree В., Newsholme E.A. 1987. A systematic approach to describing and analyzing metabolic control systems. Trends Biochem. Sci. V.12. p. 4-12.

51. Dagher F„ Deziel E., Lirette P., Paquette G., Bisaillon J.-G., Villemur R. 1997. Comparative study of five polycyclic aromatic hydrocarbon degrading bacterial strains isolated from contaminated soils. Can. J. Microbiol. V.46.,p. 368-377.

52. Dean-Ross D., Moody J., Cerniglia C.E. 2002. Utilization of mixtures of polycyclic aromatic hydrocarbons by bacteria isolated from contaminated sediment. FEMS Microbiology Ecology V. 41. p. 1-7.

53. Desai J.D., Banat I.M. 1997. Microbial production of surfactants and their commercial potential. Microbiology and Molecular Biology Reviews. V. 61. p. 47-64.

54. Enzyme nomenclature. 1992: Recommendations of Nomenclature comm. of the Intern, union of biochemistry and mol. biology on nomenclature and classification of enzymes. San Diego etc.: Acad press.

55. Freeman D.J., Cattel F.C.R. 1990. Woodburning as a source of atmospheric polycyclic aromatic hydrocarbons. Environmental science and technology. V. 24. p.1581-1585.

56. Evans W.C., Fernley H.N., Griffits E. 1965. Oxidative metabolism of phenanthrene and anthracene by soil Pseudomonads. Biochem. J. V.98. P.819-831.

57. Garcia-Junco M., de Olmedo E., Ortega-Calvo J.-J. 2001. Bioavailability of solid and non-aqueous phase liquid (NAPL)-dissolved phenanthrene to the biosurfactant-producing bacterium Pseudomonas aeruginosa 19S. J. Environ. Microbiol. V. 3. p.561-569.

58. Govindaswami M, Feldhake D.J., Kinkle B.K., Mindell D.P., Loper J.C. 1995. Phylogenetic comparison of two polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading mycobacteria. Appl. Environ. Microbiol. V.61. p.3221-3226.

59. Greenberg A., Elarack F., Harkov R., Lioy P., Daisey J. 1985. Polycyclic aromatic hydrocarbons in New Jersey: a comparison of winter and summer concentrations over a 2-year period. Atmospheric Environment. V. 19. p. 1325-1339.

60. Grifoll M., Casellas M., Bajona J.M., Solanas A.M. 1992. Isolation and characterization of a fluorene-degrading bacterium: identification of ring-oxidation and ring-fission products. Appl. Environ. Microbiol. V. 58. p. 2910-2917.

61. Grifoll M., Selifonov S.A., Chapman P.J. 1994. Evidence for a novel pathway in the degradation of fluorene by Pseudomonas sp. strain F274. Appl. Environ. Microbiol. V. 60. p. 2438-2449.

62. Grifoll M., Selifonov S.A., Gatlin C.V., Chapman P.J. 1995. Actions of a versatile fluorene-degrading bacterial isolate on polycylic aromatic hydrocarbons. Appl. Environ. Microbiol. V.61. p. 3711-3723.

63. Grosser, R. J., D. Warshawsky, and J. R. Vestal. 1991. Indigenous and enhanced mineralization of pyrene, benzoa.pyrene, and carbazole in soils. Appl. Environ. Microbiol. V.57. p. 3462-3469.

64. Guthrie E.A., Pfaender F.K. 1998. Reduced pyrene bioavailability in microbially active soil. Environmental Science and Technology. V.32. p. 501-508.

65. Habe H., Kanemitsu M., Nomura M., Takemura Т., Iwata K., Nojiri H., Yamane H., Omori T. 2004. Isolation and characterization of alcaliphilic bacterium utilizing pyrene as a carbon source. Journal of Bioscience and Bioengineering. V. 98. p. 306-308.

66. Habe H., Omori T. 2003. Genetics of polycyclic aromatic hydrocarbon metabolism in diverse aerobic bacteria. Biosci. Biotechnol. Biochem. V. 67. p. 225-243.

67. Haeseler F., Blanchet D., Druelle V., Werner P., Vandecasteele J.-P. 1999. Analytical characterization of contaminated soils from former manufactured gas plants. Environmental Science & Technology. V. 33. p.825-830,

68. Harper J.P., Churchill P.F., Lokey-Flippo L., Lalor M.M. 2005. Effect of Mycobacterium sp. Strain CHI and Mycobacterium sp. Strain CH2 on the degradation of four-ring creosote compounds. Journal of Environmental Science and Health. V.40. p. 493-507.

69. Heitkamp M. A., Freeman J. P., Miller D. W., Cerniglia С. E. 1988. Pyrene degradation by a Mycobacterium sp.: identification of ring oxidation and ring fission products. Appl. Environ. Microbiol. V. 54. p. 2556-2565.

70. Heitkamp M. A., Cerniglia С. E. 1989. Polycyclic aromatic hydrocarbon degradation by a Mycobacterium sp. in microcosms containing sediment and water from a pristine ecosystem. Appl. Environ. Microbiol V.55. p. 1968-1973.

71. Hickey A.M., Gordon L., Dobson A.D.W., Kelly C.T., Doyle E.M. 2007. Effect of surfactants on fluoranthene degradation by Pseudomonas alcaligenes PA-10. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 74. p. 851-856.

72. Ho Y., Jackson M., Yang Y., Mueller J. G., Pritchard P. H. 2000. Characterization of fluoranthene- and pyrene-degrading bacteria isolated from РАН-contaminated soils and sediments. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. V. 24. p. 100-112.

73. Juhasz A. L., Britz M. L., Stanley G. A. 1997. Degradation of fluoranthene, pyrene, benztf.anthracene and dibenzffl,h]anthracene by Burkholderia cepacia. J. Appl. Microbiol. V. 83. p. 189-198.

74. Juhasz A.L., Naidu R. 2000. Bioremediation of high molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons: a review of microbial degradation of benzoa.pyrene. International Biodeterioration and Biodegradation. V. 45. p. 57-88.

75. Johnsen A.R., Wick L.Y., Harms H. 2005. Principles of microbial РАН-degradation in soil. Environmental Pollution V. 133. p.71-84.

76. Jones K.C., Stratford J.A., Waterhouse K.S., Vogt N.B. 1989. Organic contaminants in Welsh soil: polynuclear aromatic hydrocarbons. Environmental science and technology. V. 23.p.540-550.

77. Kanaly R. A., Harayama S., Watanabe K. 2002. Rhodanobacter sp. strain BPC1 in a benzoa.pyrene-mineralizing bacterial consortium. Appl. Environ. Microbiol. V. 68. p. 5826-5833.

78. Kanaly R. A., Harayama S. 2000. Biodegradation of high-molecularweightpolycyclic aromatic hydrocarbons by bacteria. J. Bacteriol. V. 182. p. 2059-2067.

79. Kastner M., Breuer-Jammali M., Mahro B. 1994. Enumeration and characterization of the soil microflora from hydrocarboncontaminated soil sites able to mineralize polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH). Appl. Microbiol. Biotechnol. V.41. p. 267-273.

80. Kazunga C., Aitken M.D. 2000. Products of incomplete metabolism of pyrene by polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria. Appl. Environ. Microbiol. V. 66. p. 1917-1922.

81. Keck J., Sims R.C., Coover M. 1989. Evidence for cooxidation of polynuclear aromatic hydrocarbons in soil. Water Res. V. 23. p. 1467-1476.

82. Kelley I., Freeman J. P., Evans F. E., Cerniglia С. E. 1991. Identification of a carboxylic acid metabolite from the catabolism of fluoranthene by a Mycobacterium sp. Appl. Environ. Microbiol. V.57. p. 636-641.

83. Kelley, I., J. P. Freeman, and С. E. Cerniglia. 1991a. Identification of metabolites from the degradation of naphthalene by a Mycobacterium sp. Biodegradation V.l. p. 283-290.

84. Kelley I., Freeman J. P., Evans F. E., Cerniglia С. E. 1993. Identification of metabolites from the degradation of fluoranthene by Mycobacterium sp. strain PYR-1. Appl. Environ. Microbiol. V. 59 p. 800-806.

85. Kelley I., Cerniglia С. E. 1995. Degradation of a mixture of high-molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons by a Mycobacterium strain PYR-1. J. Soil Contam. V. 4. p. 77-91.

86. Keum Y.-S., Seo J.-S., Hu Y., Li Q.X. 2006. Degradation pathways of phenanthrene by Sinorhizobium sp. C4. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 71. p. 935-941.

87. Kiyohara H., Nagao К., Nomi R. 1976. Degradation of phenanthrene through o-phthalic acid by an Aeromonas sp. Agric. Biol. Chem. V. 40. p. 1075-1082.

88. Kiyohara H., Nagao K., Yana K. 1982. Rapid screen for bacteria degrading water-insoluble, solid hydrocarbons on agar plates. Appl. Environ. Microbiol. V.43 p. 454-457. .

89. Koch A.L. 1990. Dissolution the crucial process in many aspects of the biology of bacteria. Adv. Microb. Ecol. V.l 1, p. 37-69.

90. Komatsu Т., Omori Т., Kodama T. 1993. Microbial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons acenaphthene and acenaphthylene by a pure bacterial culture. Biosci. Biotech. Biochem. V. 57. p. 864-865.

91. Lopez Z., Vila J., Grifoll M. 2005. Metabolism of fluoranthene by mycobacterial strains isolated by'their ability to grow in fluoranthene or pyrene. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. V. 32. p.455-464.

92. Lopez Z., Vila J., Minguillon C., Grifoll M. 2006. Metabolism of fluoranthene by Mycobacterium sp. strain API. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 70. p. 747-756.

93. Lotfabad S.K., Gray M.R. 2002. Kinetics of biodegradation of mixtures of polycyclic aromatic hydrocarbons. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 60. p. 361-365.

94. Marx R. В., Aitken M. D. 2000. Bacterial chemotaxis enhances naphthalene degradation in a heterogenous aqueous system. Environ. Sci. Technol. V.34. p. 3379-3383.

95. McLellan S.L., Warshawsky D., Shann J.R. 2002. The effect of polycyclic aromatic hydrocarbons on the degradation of benzoa.pyrene by Mycobacterium sp. Strain RJGII-135. Environmental Toxicology and Chemistry. V.21. p.253-259.

96. McNally D.L., Mihelcic J.R., Lueking D.R. 1998. Biodegradation of three- and four-ring polycyclic aromatic hydrocarbons under aerobic and denitrifying conditions. Environ. Sci. Technol. V. 32. p. 2633-2639.

97. Mihelcic J. R., Luthy R. G. 1988. Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbon compounds under various redox conditions in soil-water systems. Appl. Environ. Microbiol. V. 54. p. 1182-1187.

98. Miyata N., Iwahori K., Foght J.M., Gray M.R. 2004. Saturable, energy-dependent uptake of phenanthrene in aqueous phase by Mycobacterium sp. Strain RJGII-135. Appl. Environ. Microbiol. V. 70. p. 363-369.

99. Molina M., Araujo R., Hodson R.E. 1999. Cross-induction of pyrene and phenanthrene in a Mycobacterium sp. isolated from polycyclic aromatic hydrocarbon contaminated river sediments. Canadian Journal of Microbiology. V. 45. p. 520-529.

100. Monna L., Omori Т., Kodama T. 1993. Microbial degradation of dibenzofuran, fluorene and dibenzo-p-dioxin by Staphylococcus auriculans DBF 63. Appl. Environ. Microbiol. V. 59. p. 285-289.

101. Moody J.D., Freeman J.P., Doerge D.R., Cerniglia C.E. 2001. Degradation of phenanthrene and anthracene by cell suspension of Mycobacterium sp. strain PYR-1. Appl. Environ. Microbiol. V.67. p. 1476-1483.

102. Moody J.D., Freeman J.P., Fu P.P., Cerniglia C.E. 2004. Degradation of benzoa.pyrene by Mycobacterium vanbaalenii PYR-1. Appl. Environ. Microbiol. V.70. p. 340-345.

103. Moody J.D., Freeman J.P., Cerniglia C.E. 2005. Degradation of benzoa.anthracene by Mycobacterium vanbaalenii PYR-1. Biodegradation. V. 16. p. 513-526.

104. Mueller J, P Chapman and P Pritchard. 1989. Creosote-contaminated sites. Environ Sci Technol V. 23. p. 1197-1200.

105. Mueller J.G., Chapman P.J., Blattmann B.O., Pritchard P.H. 1990. Isolation and characterization of a fluoranthene-utilizing strain of Pseudomonas paucimobilis. Appl. Environ. Microbiol. V. 56. p. 1079-1086.

106. Mueller J., Devereux R., Santavy D., Lantz S., Willis S. Pritchard P. 1997. Phylogenetic and physiological comparisons of РАН-degrading bacteria from geographically diverse soils. Antonie Leeuwenhoek V. 71. p. 329-343.

107. Parales R.E., Bruce N.C., Schmid A., Wackett L.P. 2002. Biodegradation, Biotransformation, and Biocatalysis (B3). Minireview. Appl. Environ. Microbiol. V. 68. p. 4699-4709.

108. Parales R.E., Lee K., Resnick S.M., Jiang H., Lessner D.J., Gibson D.T. 2000. Substrate specificity of naphthalene dioxygenase: effect of specific amino acids at the active site of the enzyme. J. Bacteriol. V. 182. p. 1641-1649.

109. Perry J.J. 1979. Microbial cooxidations involving hydrocarbons. Microbiol. Rev. V. 43. p. 59-72.

110. Pothuluri J.V., Freeman J.P., Evans F.E., Cerniglia C.E. 1993. Biotransformation of fluorene by the fungus Cunninghamella elegans. Adv. Appl. Microbiol. V. 59. p. 19771980.

111. Ramirez N., Cutright Т., Lu-Kwang Ju. 2001. Pyrene biodegradation in aqueous solutions and soil slurries by Mycobacterium PYR-1 and enriched consortium. Chemosphere. V. 44. p. 1079-1086.

112. Rehmann K., Noll H.P., Steinberg C.E.W., Kettrup A.A. 1998. Pyrene degradation by Mycobacterium sp. strain KR2. Chemosphere V. 36. p. 2977-2992.

113. Rehmann K., Hertkorn N., Kettrup A. A. 2001. Fluoranthene metabolism in Mycobacterium sp. strain KR20: identity of pathway intermediates during degradation and growth. Microbiology. V.147. p. 2783-2794.

114. Resnick S.M., Gibson D.T. 1996. Regio- and stereospecific oxidation of fluorene, dibenzofuran and dibenzothiophene by naphtalene dioxygenase from Pseudomonas sp. strain NCIB 9816-4. Appl. Environ. Microbiol. V. 62. p. 4073-4080.

115. Resnick S.M., Lee K., Gibson D.T. 1996a. Diverse reactions catalized by naphtalene dioxygenase from Pseudomonas sp. strain NCIB 9816. J. Ind. Microbiol. V.17. p. 438457.

116. Rockne K.J., Chee-Sanford J.C., Sandford R.A., Hedlund B.P., Staley J.T. 2000. Anaerobic 'naphthalene degradation by microbial pure cultures under nitrate reducing conditions. Appl. Environ. Microbiol. V. 66. p. 1595-1601.

117. Samanta S.K., Chakrabarti A.K, Jain R.K. 1999. Degradation of phenanthrene by different bacteria: evidence for novel transformation sequences involving the formation of 1-naphthol. Appl. Microbiol. Biotechnol. V.53. p. 98-107.

118. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 2nd edition.

119. Schocken M.J., Gibson D.T. 1984. Bacterial oxidation of the polycyclic aromatic hydrocarbons acenaphthene and acenaphthylene. Appl. Environ. Microbiol. V. 48. p. 1016.

120. Selifonov S.A.,- Grifoll M., Eaton R.W., Chapman P.J. 1996. Oxidation of naphthenoaromatic and methyl-substituted aromatic compounds by naphthalene 1,2-dioxygenase. Appl. Environ. Microbiol. V. 62. p. 507-514.ч

121. Sepic E., Bricelj M., Leskovsek H. 1998. Degradation of fluoranthene by Pasteurella sp. IFA and Mycobacterium sp. PYR1: isolation and identi/Ecation of metabolites. J. Appl. Microbiol. V. 85. p. 746-754.

122. Shi Т., Fredrickson J.K., Balkwill D.L. 2001. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by Sphingomonas strains isolated from the terrestrial subsurface. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. V. 26. p. 283-289.

123. Sho M., Hamel C., Greer C.W. 2004. Two distinct gene clusters encode pyrene degradation in Mycobacterium sp. strain S65. FEMS Microbiology Ecology V. 48 p. 209-220.

124. Smith M.R. 1990. The biodegradation of aromatic hydrocarbons by bacteria. Biodegradation V.l. p. 191-206.

125. Stringfellow W.T., Aitken M.D. 1995. Competitive metabolism of naphthalene, methylnaphthalene and fluorene by phenanthrene-degrading pseudomonads. Appl. Environ. Microbiol. V. 61. p. 357-362.

126. Sutherland J. В., Freeman J. P., Selby A. L., Fu P. P., Miller D. W., Cerniglia С. E. 1990. Stereoselective formation of a K-region dihydrodiol from phenanthrene by Streptomycesflavovirens. Arch. Microbiol. V.154. p. 260-266.

127. Thibault S. L., Anderson M., Frankenberger W.T. 1996. Influence of surfactants on pyrene desorption and degradation in soils. Appl. Environ. Microbiol. V. 61. p. 283-287.

128. Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.l 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. V. 22. p. 4673-4680.

129. Tiehm A., Stieber M., Werner P., Frimmel F.H., 1997. Surfactant-enhanced mobilisation and biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in manufactured gas plant soil. Environmental Science and Technology V.31. p. 2570-2576.

130. Trenz S.P., Engesser K.H., Fisher P., Knackmuss H. 1994. Degradation of fluorene by Brevibacterium sp. strain DPO 1361: a novel C-C bond cleavage mechanism via 1,10-dihydroxyfluorene-9-on. J. Bacteriol. V. 176. p. 789-795.

131. Vacca D.J., Bleam W.F., Hickey W.J. 2005. Isolation of soil bacteria adapted to degrade humic acid-sorbed phenanthrene. Appl. Environ. Microbiol. V.71. p. 3797-3805.

132. Volkering F., Breure A.M., van Andel J.G., Rulkens W.H. 1995. Influence of nonionic surfactants on bioavailability and biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons. Appl. Environ. Microbiol. V. 61. p. 1699-1705.

133. Volkering F., Breure A.M., Sterkenburg A., van Andel J.G. 1992. Microbial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons: effect of substrate availability on bacterial growth kinetics. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 36. p. 548-552.

134. Walter U., Beyer M., Klein J., Rehm H.-J. 1991. Degradation of pyrene by Rhodococcus sp. UW1. Appl. Microbiol. Biotechnol. V.34. p. 671-676.

135. Wang R.F., Cao W.W., Cerniglia C.E. 1995. Phylogenetic analysis of polycyclic aromatic hydrocarbon degrading mycobacteria. FEMS Microbiol. Lett. V. 130. p.75.

136. Weissenfels W.D., Beyer M., Klein J., Rehm H.J. 1991. Microbial metabolism of fluoranthene: isolation and identification of ring fission products. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 34. p. 528-535.

137. Weissenfels W.D., Klewer H., Landhoff J. 1992. Adsorption of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) by soil particles: influence on biodegradability and biotoxicity. Applied Microbiology and Biotechnology V.36. p. 689-696.

138. Whitman, В. E., D. R. Lueking, and J. R. Mihelcic. 1998. Naphthalene uptake by a Pseudomonas jluorescens isolate. Can. J. Microbiol. V.44. p. 1086-1093.

139. Willison J.C. 2004. Isolation and characterization of a novel sphingomonad capable of growth with chrysene as sole carbon and energy source. FEMS Microbiology Letters V. 241. p. 143-150.

140. Willumsen P. A., Karlson U., Prichard P. H. 1998. Response of fuoranthene-degrading bacteria to surfactants. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 50. p. 475-483.

141. Yamada К., Horiguchi S., Takahashi J. 1965. Studies on the utilization of hydrocarbons by microorganisms. Agric. Biol. Chem. V.29. p. 943-948.

142. Ye D., Siddiqi M., Maccubbin A., Kumar S., Sikka H. 1996. Degradation of polynuclear aromatic hydrocarbons by Sphingomonas paucimobilis. Environ. Sci. Technol. V.30. p. 136-142.

143. Yongblood W.W., Blumer M. 1975. Polycyclic aromatic hydrocarbons in the environment: homologous series in soils and recent marine sediments. Geochimica et Cosmochimica Acta. V. 39. p. 1303-1314.

144. Zhang H., Kallimanis A., Koukkou A.I., Drainas C. 2004. Isolation and characterization of novel bacteria degrading polycyclic aromatic hydrocarbons from polluted Greek soils. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 65. p. 124-131.

Информация о работе

Бабошин, Михаил Александрович
кандидата биологических наук
Пущино, 2007
ВАК 03.00.07

Диссертация

Превращение полициклических ароматических углеводородов бактериями - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Превращение полициклических ароматических углеводородов бактериями ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Превращение полициклических ароматических углеводородов бактериями"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бабошин, Михаил Александрович

Введение Диссертация по биологии, на тему "Превращение полициклических ароматических углеводородов бактериями"

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Бабошин, Михаил Александрович

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бабошин, Михаил Александрович, Пущино

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Превращение полициклических ароматических углеводородов бактериями
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология