Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Повреждение мембран эндоплазматического ретикулума печени при гелиотриновых гепатитах и репарация их фосфолипидными препаратами

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Повреждение мембран эндоплазматического ретикулума печени при гелиотриновых гепатитах и репарация их фосфолипидными препаратами"

/и/

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР ВТОРОЙ МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ имени Н. И. ПИРОГОВА

На правах рукописи О . УДК 616.36—002 :616—003.9.001.42

АРИПОВ Абдумалик Нигматович

ПОВРЕЖДЕНИЕ МЕМБРАН ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО

РЕТИКУЛУМА ПЕЧЕНИ ПРИ ГЕЛИОТРИНОВЫХ ГЕПАТИТАХ И РЕПАРАЦИЯ ИХ ФОСФОЛИПИДНЫМИ

(03.00.04 — биологическая химия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва — 1989

17110880

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте педиатрии Минздрава УзССР и 2-ом Московском ордена Ленина Государственном медицинском институте им. Н. И. Пи-рогова.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор ТАТАРИНОВ Ю. С.; доктор медицинских наук, профессор ХВАТОВ В. Б.; доктор медицинских наук, профессор БАКАНОВ М. И.

Ведущее учреждение — Институт питания АМН СССР.

Защита диссертации состоится « » 1989 г.

в часов на заседании специализированного Совета

Д 084.14.03 2-го МОЛГМИ им. Н. И. Пирогова по адресу: Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке 2-го МОЛГМИ им. Н. И. Пирогова.

Автореферат разослан « » 1989 г.

Ученый секретарь специализированного Совета

доктор медицинских наук, профессор КАЛИНИНА Л. В.

i .; , i ощля характеристика работы

Актуальность проблемы. Дальнейшее совершенствование профилактики, диагностика, терапии я реабилитации «Зольных возможно только при расширений представления об особенностях токсического поражения печеночной паренхимы.

Формирование представления об основных механизмах патогенеза токсических поранений печени, исходя из современных кощепций общей патологии возможно только с учетом данных современной мем-браяологии. В мембранах эндошгаз.матйчеомго ретикулума меток печени локализована монооксигеназнак ферментная система, участвующая в окислении многих низкоколекуляршх неполярных соединений зкдоганнего и экзогенного происхождения, ооущестшдацая ряд био~ синтетических реакций а обеспечив-^щоя детоисицируодута фунгцап печени (Арчаков А.И., 1975; Sato , Omra , 197В). Основным компонентом этой системы является цитогром Р-450. '.'огко предцолодаь, что токсический эффект геляотрина, как и многих других соединений опосредован образованием его ре акционносп.о со бных метаболитов (Савин И,Г. И др., ХЭ83; "faíU , 1984; Ortiz da I.'cntallan о , 1284} ifetersen Lado , 1904; Ssdell , Dallas , 1984; Finar , IS32), которые сами no себе или стимулируя процессы перекясиого окисления лчпидов.вызывают поврелденио мембран эндоплазматического ре-тикулумз печени и их фергдентшх систем (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972; Савин и.г. и др., 1983; Елюгер А.Ф., Майорз А.Я., 1981; МсСау at al. t IS34; InsalBgn-Sundlwra . 1985; Slater ■ ot c.'i1987), что влечет за собоЛ нарушение бвосиятетичзской и детонсякационной функции печей.

Исключительно важная роль дишишого бислоя в поддержании -структурной целостности и функциональной активности биологических мембран предопределяет значение цовревдекм бислоя в развитии заболевания. В связи с этим, выяснение молекулярных механизмов структурло-фуккцианалъннх нарушений мембран эндошшзматического ретикулума, установление роли монооксигенавной система печени и липидных компонентов мембран в этом процессе даст возмонность научно обосновать нрныенение терапевтических средств для коррекции этих повреждений.

К настоящему времени мозхио ыу.еяить несколько способов защити биомембран от различных цовр<ядеккй. Одним иэ перспективных подходов х решения этой задачи является применение фосфслчвидоа (Ейчмгнсвэ Г.И. и'др., 1982; ОртекСзрг Э.А., 19133; Вслдгьслз И. 5.

вдр., 1986; Бородин Б.Л., АрчаковЛ.И., 1386; ВасЬтоаоуа а!. , 1988). Стабилизирующее действие фосфодишдоз да ферментные системы , встроенные в биологические мембраны, представляет интерес как с биохимической, так и с медицинской точки зрения. Тем не менее. исследования по выяснении механизма репарирувдего действия фосфо-липидов на поврелдешше биологические мембраны не получили разви-. тая и в настоящее время интенсивно разрабатывается лишь проблема использования фосфолипидов как транспортной формы лекарств (Чазов Е.И., 1981; ТОрчилин В.И. и др., 1982; Смирнов В.Н., 2984; si.it. Тош , 1980; Сгес1ог1еа1а . ¿Ц1аоп , 1982).

Таким образом, ведущее место, занимаемое нарушением мембранных структур клетки в патогенезе заболеваний печени, регуляторная роль дипидного бислоя мембран, важность корригирующего воздействия на мембраны, свидетельствует об актуальности исследований ли-пидного и ферментного состава мембран при повреждениях печени и процессах восстановления.

Даль и задачи работы. Целью настоящей работы явилось вменение роли повръадения мембран эндонлааматичесхого ретикулума в мо-яоонсигенызной системы печени в развитии острых и хронических токсических гелиотриновых гепатитов и обоснование необходимости фосфоляпидной терапии для репарации поврежденных клеточных мембран печени. Поставленная цель предопределила реаеаяе следящих шшфетных радач:

- исследовать влияние гелиотрина на функциональную активность в ферментный состав мембран эвдошшзматического реищудума;

- исследовать взаимодействие гелиотрина с ¡шяевым ферментда моноокс7геназЕой систеыь; - штохромом Р-450;

- изучить состояние лшщдных компонентов мембран эндоплазма- \ тического ретикулума печени при гелиотриновых интоксикациях;

•• исследовать белокевнтезируацую функцию печени при токси-ческах гепатитах;

- исследовать влияние фосфолвлидвых препаратов, полученных из различных источников, на инактивацав изолированного очищенного цитохрома Р-450;

- исследовать влияние фосфолигздных препаратов, зН-со единений и антиоксидантов на скорость инахгивацзи цитохрома Р-450 в микрог.сизх печени крыс, получавших гелвотрин;

- исследовать влияние фосфолипвдзыг препаратов на активность и содержание ферментов ыонооксигеназной системы печени крыс, а также липидных компонентов иикросодохьвых мембран при остром и

хроническом гелиотрияовых гепатитах;

- исслепвать влияние экдистена на белсксинте зирупцую функции печени крыс при зшедепии его в водном растворе и в составе фосфолипидного препарата;

- исследовать влияние фосфолипядчых препаратов на активность ферментов в сызоротхе крови и показатели липвдного обмена при остром и хроническом гслпотриповнх гепатитах.

На учтя новизна. Е результате проведенных исследований получены дашше о роли повреждения внутриклеточных мембран в развитии токсических гепатитов н^ различных моделях, Выявленние при атом нарупения тесно связана с изменением активности ферментов микросоглчлмгсй системы печени.

Нл осове про:-ед'- ;шлх исследований расширены представления о токсикологических свойствах алкалоида гелиотрпна, повреждещвго мембраны гяпатоцитов, в результате чен> снижается активность мо-ноокссгепазной системы, белокевнтезлрующоя способность, а также отмечается гиперферментеиия. Показано, что дестабилизация липвд-ных компонентов мембран вследствие активации процессов переписного окисления является одной из основных причин повреждения гена-тоцитов при отравлении гелиотрином. Отменено повышение содержания устойчивых к окислению фосфолипидов за счет уменьшения неваевден-еости ацильннх остатков фосфолипидов мембран. При исследовании фосфолипидного состава поврежденных гелиотрином мембран микросом выявлено, что наибольшему изменению подвергается фракции фосфа-тидилхолина, фосфатвдшшяозитола, содержание сфингомиелина увеличивается.

Показана возможность использования фосфатидилхолкна, выделенного из семян хлопчатника, в реперативннх процессах на уровне клеточных мембран, установлена эффективность комбинации фосфата-лилхолина с глицирраайвовой кислотой. Препарат, содержащий фос-фатидилхолин хлопчатника и натриевую соль глицирризвновой кисло-: ты, является наиболее эффективным. Введение его экспериментальным животным на фоне токсического гепатита способствует восстановле- -' кпв структуры и функции поврежденных мембран гепатоцитов, на что" указывает увеличение активности копоокевгеяазней система аечонн и снижение уровня гиперферментемии в сыворотка кровп.

Показано, что применение экдистена способствует нормализации Оелоксинтетвческих процессов в патологически измененной печени, причем эффективность действия более вырчзенз прч введения '

его в комплексе с фосфолшщдпым препаратом.

Результаты проведенных исследований могут быть взяты за основу оря разработке и испытании в клинике фоофолишуцшх препаратов для реконструкции позревдеяных мембран гелатоцитов, г таняе для ц&яенацравленной доставки препаратов, воздействующих на нарушенные функции печени (эццистев к другие).

Научно-практическая зяачиуость. На основании проведенных исследований раскрыта роль .ищущих и ферментных компонентов мембран эидоплазматической с^тв в патогенезе острых и хронических поражений печени, делается вывод о необходимости целенаправленного воздействия на состояние кеибран фосфолшцдЕыла црепара-таии. Проведено исследование влияния антисксвдантов, зН-соеди-веяи2 г комбинации с фос^сллшушныи препаратам на функциональную активность микросоиалиш ^ ь^.мбрап печени крыс с гелиотрипоьои интоксикацией. Выявлено, что наиболее выраженным репарирующлы эффектом обладал фосфатвдилхолин хлопчатника. Добавление глицар-.риаиновой кислоты усиливало действие препарата. Выявлено, что экдистен обладает высокой анаболической активностью, ч*о позволяет рекомендовать его для стимуляции биосантетичсскпг. процессов при заболеваниях печени.

Положения, выносимые кааап'иту:

1. В основе механизма повреждения ыеыбран эядоплазматическо-IX) ротнкулуыа щи гелиотринэвой интоксикации лекит окисление ге- -лиотрпна на цитохроие Р-450, Продуктыокисления стимулирует пете-кисноз окисление лшшдов, что вызывает повреадение фосфолиавдно-го бислоя меыбран, приводящее к их деструкции с последупдош нарушениями белоксантезирудцей и детоксицируицей функции печени.

2. Досфодипаднне препараты. антиоксдданта. 5 Н-со единения оказывает репарирутщзе действие на поврежденные меабраны эндо-шшзиатичестого ретикулука печени. Применение фоофолппадашх препаратов способствует восстановлению липддных и ферментных компонентов мембран, повредденных при острой и хронической интоксикации гелнотраяом. Включение глицирризииовой кислоты, в состав фос-фолипидного препарата из фосфитидилхолинз хлопчатника, усиливает эффективность препарата.

3. Экдистен оказывает стимулирующее действие в спстеыо бссклеточного синтеза белка, введение его в комплексе с фосфати-дидхелкном хлопчатника с глициррязиновой кислотой /сшивает терапевтический аффект.

Апробация работы. Основные положения диссертации обсуэдались на Ученом Совете Узбекского научно-исследовательского института педиатрии МЗ УзССР, на Всесоюзном симпозиуме "Цитохром P-45Q. Структура и функции" (Минск, 1982), на Бсосовзной конференции ' гепатологов (Рига, 1983), на И съезде детских врачей Казахстана (Караганда, 1984), на Всесоюзном биохимическом съезде (Москва, 1985), на Всесоюзном симпозиуме "Цитохром P-45Q и охрана внутренней среды человека" (Москва, 1985), на Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, IS85), па Всесоюзном симпозиума по медицинской зн-зимодогки (Махачкала, 1986), на 1-ой конференции биохимиков Узбекистана (Ташкент, 1986), на 1У конференции биохимиков Средней Азии и Казахстана (Ашхабад, IS8G), на Всесоюзной конференция "Цитохром Р-450 и охрана внутренней среды человека" (Еозорибарск,. I9B7), на Ш съезде детских врачей Узбекистана (Ташкент, 1908), на 1У съезде физиологов Узбекистана (Ташкент, 1988).

Публикации. По тема диссертаций опубликовано 32 печатгшэ работы. Получено I авторское свидетельство. Составлена 3 методических рекомендаций.

Структура и объем работа. Диссертация изложена на 313 страницах машинописи, включая 92 таблица, 25 рисунков. Список цитируем^ литература содержит источников.

(ХЩЕРКАНИЕ РАБОТЫ

I. Материалы и метсдн исследования

В работе в качестве экспериментальны- животных использованы белые беспородные крисы~самгш о исходным весом 100-120 г. Иссаш-дозания проводились также на клиническом материале - крови детей больных хроническим гепатитом, полученном из клиники ВИИ педиатрии МЗ УзОСР.

Острый токсический гепатит вызывали одноразовый подкожным введением красам гелиотрина в доге 30 мг/IOG г массы. Забой производили через 3, 6, 12, 24, 72 часов поело введения алкалоида. Хронический токсический гепатит вызывали по схеме Абдуллаева (1975), вводя ¡3? раствор гелиотрина подкожно в убывающей дозе: 10, 7, 5 мг на 100 г массы в теченле трех r-дель. СС14 вводили внутрибршкнао в дозе 0,1 мл на IX1 г массы однократно. Лечение фосфолипиднымк препаратами проводим е течэние 3 и 7 дней при остром гепатите, 7 и 14 дней при хроническом.

Печень яявотных перфузнровали, измельчали, а затем гомогенизировали в среде выделения, содержащей 1,15$ КС1 и 5 мМ трпс-НС1 буфер, рН-7,4 в соотношении 1:3 (масса/обьем).

Выделение цзтохрома Р-450 (подфракцдя ЛМ2) из шкросоы печени кроликов, индуцированных фенобарбиталом, проводилось по методу Нарузпной и др. (1979). Очищенные препараты цитохрсма Р-450 (ЯМ2) с удельным содсрганием 17-13 нмояь/мг белка были лсбззно предоставлены препаративной группой учебно-исследовательского комплекса кафедры биохимии Оракщт макросом печени крыс выделяли ез гомогената печени бедах крнс-саыппв методом дифференциального центрифугирования; скорость НАДФН-зависимого /V-димз-тшшроваппя дпметшганилнна и п-гидроксилировашш анилина определяли по количеству образовавшегося Формальдегида и п-амзнофэнола, соответственно (Арчаков А.И., Карузина И.И., 1973).

О-диметилирование н-нитрозолз определяли по скорости образования п-нитрофенола ( Нхс^ег е1 е1. , 1977). Инактиваша цитохрсма Р-450 определяли путем регистрации спектров поглощения гемопротепна со дифференциальной схеме после восстановления ди-тионктом и пропускании СО. Запись проводили через каждые 2-3 мин на спектрофотометре дпхпоо ш (США) и Нх-еасЬ1-557 (Япония). (Бачманова Г.И. и др., 1981). В качестве показателе уровня инак- . тивацкя использовали д ¿420-450 33 Расчете яа I нмоль гемонротеи-иа. Время полуинактивацп:! -¡.¡-г) цитохрома Р-450 - время, за которое ^ ^420-450 Д°стагает половины от исходного урогня. Точка на осп ординат соответствует количеству цитохрома Р-450, I:сходно присутствуете?'у в препарате макросом или очищенного фермента. Выделение полир:-босом и клеточного сока из печени крыс проводили но И8Т0ДУ Ье Ню е% а1. (1963) В модификации

(1971). Для получения липосом использовали смесь кнкросомалышх фосфолипидов, выделенных из кшсросом печени крыс, фосфатидилхо-лан хлопчатника,. полученный в КХРВ АН УзССР, фосфатидилхолш соевых бобоз фяркы "Ка-иегоогш Смесь фосфатцдилхолнна с натриевой СОЛЬЮ ГЛИЦИррИЗИЕОВОЙ кислоты готовили с помогцьэ ультразвуковой обработки Еа дезинтеграторе ¡ее Боахргер 150з. Эффектвз~ нссть действия фосфолипэдных препаратов сравнивали с действием препарата эссенциаче (фирма ПеПвгсапп ), используемого для . лечения заболеваний печени.

Скорость перекисного окисления липидов определяли по накопление иалолевого дгальдегида используя в качестве проокоидантов

ПАД4Н или аскорбат (Владимиров D.A., Арча ков А.И., 1972). Определение конвоированных диенов в липидах микросомалъной фракции . печени и сыворотке крови проводили после растворения липвдов в метаноле с последующим измерением оптической плотности.

Общие фосфолипиды в ыикросомах печени и сыворотке крови определяли по содержанию в них неорганического фосфора. Разделение фосфолипидов проводили методом двумерной тонкослойной хроматографии ( laginara at al. , 1973). Определение жврнокислотного состава фосфолипидов проводили по методу В.ЗЛошаша, И.П.Садовнико-еой (1971) на хроматографе "Хром-4" (ЧССР).

Ссдертагпе белка определяли по методу Лоури и др. ( et'ei., 1951). Содержание цитохромов Р-450 и Ъд определяли по ••ртоду Спит Sito (1?Я2). Измерение активности НАДФН-феррициа-1'зд и 1ЩШ-патохрем-с-рсдуктаз. проводили по методу Dallnor (1963).

Активность фруктозо-1-фосфаталздолазы в сыворотке крови определяли по методу Шапиро в модификации Д.М.Брагинского (Колб В.Г., Камышников B.C., 1982). Активность аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, щелочной фосфатазы и / -глютаыилтранспеп-тидазы определяли, используя тест-наборы фирмы "Лабсистем" на биохимическом анализаторе ФП-901 (Финляндия). Определение гисти-дазы и урокининазы проводили по методу таьог и Kehisr (IS85) в модификации С.Р.Мэрдашева и В.А.Буробина (1957), глютаматдегпдро-гедазы - по методу scmidt (I9G3), НАД-зависшюй ыалатдегздроге-назы - по методу Kursmitzu (1968), содержание АТФ определяли с ПОМОЩЬЮ наборов фирмы Boehringor Ma nnhe ia (ФЕТ).

Результаты статистически обработаны методом вариационной статистики с применением.параметрического критерия Стьвдента (fi.B. Монцевичюте-Эрангене, 1964).

2. Результаты исследования и обсуждение

2.1.I. Динамика изменения содержания цитохромов Р-450,

bg и ективьости редуктаг в микросомах печени . •

крыс при острой гелиотриковой интоксикации

Для характеристики состояния мембран эвдоплазматического рэ-тикулума при гелиотриновой интоксикации, их функциональной активности необходимо било изучать изменение выбранных параметров го времени. С этой целью белым крысам-самцам подкожно одноразово вводили гелиотрин в дозе 30 мг/100 : массы и хиьотных забивали

через 3, 6, 12, 24, 48, 72 часа. В препаратах микросом определяли содержание цптохрома Р-450 и цктохрома ъ^.

В результате экспериментов било обнаружено следующее: введение гелиотриаа через о часа приводит к увеличение содержания пвтохромз Р-450 {приблизительно на 40?), содержание датохрома Ь д в вто время не изменяется (рис. I).

Затем, на Солее поздних сроках (12-72 часа), наблвдается резкое падение содержания цптохрома Р-450. Особенно значительный оно вабивдалось после 24-чассвого отравления гелЕотриком, где уровень его составлял 35$ ст контрольного. На этих же сроках содержание нятохромз ъ5 оставалось почти такое же, как г. в контрольных препаратах (рис. I).

Исследовались также активности флгвинсодсрхгцпх ферментов цепей переноса электронов мембран микросом: НАДСК- с КАДН-специ-фичяых редуктаз. Активность НАДН-феррицианвд редуктезы п НАД4Н--цптохром-с-редуктагы измеряли в препаратах макросом печека крыс через 24 часа после введения геллетрана, т.е. в момент макенкаль^ кого повреждения цктохрома Р-450. Отмечено уменьшение ьх активно-отя на 25-30?. ■ /

Следовательно, введение гелиотргна животным вызывает изменение содержания не только цптохроиа Р-450 - мочевого фермента гидроксилированЕя, но к снижение активности редузстйз, начальных компонентов электрон-дереносящах систем «шфосомальной мембраны.

и) Принятие сокращения: ГТ - гслиотрал, ГК - глширризиковая кислота; Ш - шкросош: К-ЫК - контрольное шхросомы; ГТ-UK - ми«-кросомы печени крас, получавших гелиотркн; Фд-ШС -цикросош, поврежденные фосфодипазой А; ОГ-МК - микросош печени крыс с острым гепатиток; OCI4-RSK -микросоыы печени кркс, получавших ССЦ: СМФ - смесь микроеомальяых фосфолипидсв: Ш - фоофолипк-да; Jafe - изолированный очищенный.цвтохрок Р-450; ОГ - острый гепатит; ФХхд - фосфатидшшшш хлопчатника; ФХхл+ГК - фоофа-тидилхолее хлопчатника с добавлением соли глицирразиновой кислоты: ФБ - фенобарбитал; С5-МК - микросокы печени крко, получав-лях Фенобарбитал; ФХс - соевый фос&этидклхолпн фирмы "Наттер-манн"; Ф-1-ФА _ фруктозо-1-фосфетальдолаза; а -ГШ - { -гло-таыилтранспептидага; УР - уроканвказа; АТ& - аденезинтрифос-форная кислота; П! - гистидаза; X3I - холестерин; ВДГ - малат-дегидрогеказе; АЛТ - еланииамияотрансфераза: АСт - аспартатами-нотранейерага; В® - щелочная фоейатаза; НАДай-Ш - НАДш-спеш-фичнкй фловоптмтеин; КАДН-4П - НАДН-специфгчкнй флавспротеин; ГОД - аерекисное окисление липидов: 41 - фосфолглид; ШГ - хронический персистируощий гепатит; ХАТ - хронический активный гепзтьт; ЛФХ - лизофосфатидвлхолин: CMS - сфингомиелин; ФЭ -фосфгтидзлэтеноламан.

4 В 72 ЧАС

Рис. I. Содержание цитохромов Р-450 (I) и (2) в микросомах печени крыс после введения гелиотрина.

2.1.2. Оксигеназная активность мембран макросом печени крыс, отравленных гелвотрином

В качестве показателей функционального состояния микросо-мальных мембран измерялись скорости ШЦЩ-зависимого окисления четырех субстратов конооксвгеназной систеш: диметиданилина и аминопирина ( и-диметилазная активность), п-нитроанпзола (0-деалкалазная активность), анилина (п-гидроксилазная активность). Исследование их проводили через 24 часа после введения животным гелиотрина.

Полученные результаты свидетельствует о резком снижении ок-сигеказной активности мембран эндоплазматического ретикулума печени 1табл. I). В мякросомах печени существует более 10 псдфранций дитохрома Р-450 ( Ьч , ^Yest , 1383). В связи с этим представлялось важным выяснить - является ли действие гелиотрина в отношении отдельных его форм специфичным или имеет место неспецифическое разрушение всех подфракций гемопротеида. Для решения этих вопросов активности гидроксилазгах систем оценивали, рассчитывая ее па нмоль цитохрома Р-450.. Рззультать- расчета показали, что в микросомах печени крыс, отравленных гелиотрином, происходит избирательное снижение НАДФН-згзисикых О-деалкилазной и п-ги-яроксилазной активностей цитохрома Р-450. Скорость окисления и-

Таблица I

Влияние гедиотрина на скорость НАДФН-зависимого окисления субстратов монооксигеназной системы в микросомах ценени крыс (рассчитано в нмолях образовавшегося продукта в мин"1 на мг белка (I) или на нмоль цитохрома Р-450 (2) )

Препараты !Диметиланилин | Аминопирия !п-нитроани-

микросом I_!_1зол_

! ? ! О ! т ! о ! т ГТ

! а ! * ! -1 !

Анилин

г

Контроль 7,2 &,5 .6,9 6,3 1,2 1,1 0,83 0,80 ±0,1 ¿0,1 ±0,1 ±0,1 ±0,1 ±0,02 ±0,02 ±0!02

Опыт 2,5 6,3 .2,2 ^5,7 0,2 Д),56 0,15 0,40

±0,2 ±0,1 ±0,1 ±0,1 ±0,05 ±0,05 ±0,03 ±0|03

Р < 0,001 >0,05 <0,001 >0,05 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001

п-нитроанизола и анилина составляла 5С$ от таковой в контрольных препаратах микросом печени, н- деметилазпая активность при таком способе расчета в опытных препаратах микрссом не изменялась. Эти результаты можно объяснить, предположив, что гелиотрин вызывает инактивации определенных подфракций цитохрома Р-450, т.е. его действие специфично.

2.1.3. Перекисное окисление липидов макросом печени крыс при острой геллотриновой интоксикации

В михросог.шсД фракции печени наряду с оксигеназными реакциями протекают :: реакции нерехшсного окислены липидов (ПОЛ). Стимуляция ПОЛ может быть одним из ведущих механизмов повреждения бпомембран, В связи с этим одной из задач исследования явилось изучение активности систем ПОД Б микросомах печени крыс при ге-лиотриновой интоксикации.

Сравнительное исследование скорости образования ыалонового диальдэгвдэ у подопытных и контрольных животных обнаружило резкое ее увеличение при отравлении гелиотрином. При этом, имело место стимулирование ПОЛ как в ферментной НАЕФП-зависимой системе в 2 раза, так и в неферментной - аскорбат-зависимой системе в 3 разе. Паблвдается увеличение содержания конъюгированных диенов.

Таким образом, активация ПОЛ в мембранах микросом печени г:ис при острей интоксикации может быть одним из механизмов пов-р-;1х..2ния :.:е/.;бран экдоплазматического ретикулук. и локализованной

ч

О

хз

я

г

I

о

1.6. 1.2 О в ал г

L.

Г'. П11 з '^oi.ar. печени ::рыс через 24 часа после ELe^jau;; г—:/отрина (средние из 8 опытов)

I - НАДФН-зависикое II - Аскорбат-завнсимое

Ш - контроль □ - ошт

в них оксигеназной системы, содержащей штохром Р-450.

2.1.4. Влияние гелиотринз на лппидный состав мпкросомалышх мембран печени крыс

При исследовании соотношения фосфолипвдннх фракций в мембранах микросом печени яивотных при острой гелиотриновой интоксикации выявлено, что наибольшему изменении подверглись лизофосфатп-далхолиа (б среднем повышение на 75%) и фосфатидилхолип (понижается ва 20£). Таким образом, под влиянием гелиотрина увеличивается содерзание лизофосфатидилхолина - токсичного продукта распада фосфолишщов, вызыващего деструкции мембран.

Важное значение дня функционирования микросомальной системы., гкдроксшшрования имеет зирнохислотный состав фосфолшшдов мембран. Анализ содераания кислот с различным числом двойных связей < показывает, что в перзуи очередь перекпсноиу окнслепли подвер- " ' гаются полкненасыщеяные'жирные кислоты; такне кап арахядоновая (20:4) п лпнолевая (18:2). Причем арахидсновая кислота исчезает больше чем паполовглу, лтагалсГпал несколько коньке. Повышенное содсргяяпв пз0!»т:!?!гпчх rnp.'u-z кяогот сохраняется на всех сроках

т, "¡' Т^**!';;" ~'Г!\'iT'i ;" 'У'^ЧГН'О У- ~ '".'ГО—

кислотном составе нзбледаются после введения алкалоида. Происходит увеличение насыщенных гшркых кислот с короткой и средней углеводородной цепью, таких как ляуриновая (12:0), миристиновая (15:0) в 4 раза.

На основании данных о фосфолипидном состзве макросом печени п о степени кенасыщенности отдельных фосфолипидов рассчитан коэффициент ненасыщенности фосфолипданогс бислоя шнфосом. Выявлено, что этот коэффициент после введения гелиотрина уменьшается.

• Одновременно с уменьшением ненпсьаценности нлрных кислот фос-фолшвдшх компонентов мембран, вследствие церекисного окисления, продукты ПОЛ оказывают поврегдащее действие ва белковые молекулы, окисляя 5Н-1"рушш апофермента и образуя поперечные ссшвки кевду белками (Владимиров O.A., Арча ков А.И., 1972).:

Таким образом, в механизме токсического действия гелаот^а; определенную роль могут м-рать реакции его окисления, катализируемые цитохромом Р-450. В них образуются актнъяые интермедиаты, усилизаодзе ПОЗ, повреждающие эмоалазматическую сеть, нарушая в вей синтез белка и фосфолипидов и разрудаодие цитохром Р-450. *

2.1.5. Связывание гелиотрина с цитохромом Р-450

Поврегдащее действие многих токсических соединений проявляются вследствие их активации в ыонооксигеназной системе печени. Это предполохеаие послухшло предпосылкой к тому, чтобы выяснить, является ли повреждение мембран эвдоплазматического ретикудука печена к их ферментных систем результатом действия самого гелио-трина или продуктов его окисления.

_ С этой целью проводилось исследование возмоякости связывания хдатохрома Р-450 микроссм печени крыс с алкалоидом. Спектральные свойства комплекса цитохром Р-450 с гелиотринсы типичны для субстратов I типа с максимумом поглощения при 384 нм и минимумом поглощения при 418 ем (рис. 3).

Количественная оценка связывания гелиотрнла показывает, что ой обладает очень.высоким средством к гекопротеину (рис. 4).

Ks -хопстанта диссоциации комплекса гемопротеЕН-субстрат, равняется 35 мкМ, что сравнимо с константами связывания других, суостратов .1 типа.

Олролелйние скорости поглощения кислорода ыозБадгла э-.чяють, что гелиотрин окбзывазт такоо не атт^ич^г"- пс-Сс^п; ис о-".;'- -ленив НАЧС-Й, как н типичны?, олбетраг с •• ф<>> -и;;. ■

Рпс. 3. Связывание гелиотрпна (I) и аминодирина (2) (субстрата I типа) с снтохромом 3-450 макросом печени крыс

Рис. 4. Зависимость величины спектральных изменений (л лзь4_4Х8^ от конязяграпии гелзотрпна при связывании с цптохромзм Р-450

тилоншшк, что является подтверждением возможности его окисления в мембранах эвдошизматического ретикулума.

. Таблица 2

Влияние гелиотрина и диметиланалина на скорость поглощения кислорода в присутствии НЛДФН в микросомах, выделенных из печени контрольных и отравленных гелиотрином крыс (средние из 6 опытов)

Условия опыта ! j нмоль 0£ х мин--1' х мт"*-1 белка

I 1 I мМ НАД® ! I кМ НАДФН + ! I мМ НАШ + !0.I5 мМ гелиотшн!3 мМ диметиланилип

Контроль Опыт Р 6,2^0,2 4,6+0,1 < 0,05 0,2*0,1 3,7+0,1 5,3¿0,I 5,6+0,1 <0,05 ^OTOOI

Таким образом, можно сделать заключение , что гелиотрин взаимодействует с цитохромом Р-450, образуя фермент - субстратный комплекс. Продукты окисления гелиотрина стимулируют реакции нере-"кисвого окисления липидов. Это, в свою очередь, сопровождается повреждением мембран макросом печени 1фыс и инактивацией цитохрома Р-450.

2.1.6. Инактивация цитохроыа Р-450 в микросомах печени крыс при отравлении гелиотрином

Правильность выдвинутого выше предположения была подтверждена в исследованиях по изучению влияния гелиотрина на.скорость инактивации восстановленного цитохрома F-450 в микросоыах нечени 1фыс. Оказалось, что при отравлении животных гелиотрином, в микросомах печени наблэдается увеличение скорости инактивации цитохрома Р-450,.что обусловлено, по-видимому, стимулирующим действием продуктов метаболизма на реакции ПОЛ мембран макросом. Кроме того, отчетливо видно из сравнения начальных величга & л420-450// нмоль гемопротеина, что инактивация цитохрома Р-450 имеет место и in vivo Б печени хивотных, отравленных гелиотрином (рис. 5). У отравленных гшвотных эта величина, характеризующая состояние цитохрома Р-450, в 1,5-2,4 раза выше ло сравнении с контрольными предаратагд.

Рис. 5. Инактивация цитохрома Р-450 ыикросом печени крыс, получавших гелпотрзн.

Инкубационная с.\;ссь содержала I шоль цптсхромз Р-450 в I мл 100 мМ трлс-HCI буфера рН 7,5. Дифференциальные спектра регистрировала при 37°С б течедг.е 30 мин. . I - К-'сК; 2 - ГТ-ГЖ.

2.1.7. Влияние гелиотрикз на белоксинтезирутацуп систему печени крыс

Одной из систем в первую очередь подверженных влиянию различного вида гепатотоксинов является процессы биосинтеза белка. В связи с этим, задачей нашего исследования явилось выяснение влияния гелиотриновой интоксикации на систему биосинтеза белка.

Как показали результаты исследования, через 24 часа после введения гелиотрина, включение радиоактивной метки -4С-а:.шко-хислот во вновь синтезируемые полипептщщ резко снижается с 21000 Емп/мин'мг белка до 10000 имп/мин-мг белка, что составляет 48$ от исходного уровня. Возможной причиной снижения активности белоксинтезирущей система печени является: нарушение связи пиля-рибосом с мембранами ээдоплг:>;.1:.тичесг.ог^ ретикулума. Нельзя исключать также прямое, поврегдзш,ее действие гелиотрина или его метаболитов на полкрибосомглыше комплексы клеток печена.

2.2. Поиск соединений, способствующих репарации поврежденных мембран эвдодлазматического ретикулума печени

Па основании приведенного экспериментального материала можно сказать, что в основе молекулярных механизмов гепатотоксичес-кого действия гелиотрина лежит повреждение мембран эндоплазмати-ческого ретикулума, вызванное продуктами перекисного окисления липидов мембран, образование которых стимулируется в результате окисления гелиотрина в НАДФН-цитохром Р-450 зависимой монооксиге-назной системе. При этом повреадается и сам цитохром Р-450, что отрекается на обвдй детоксицврутацей функции печени и па процессах метаоодизыа эндогенных субстратов.

В связи с этим, перед нами встала проблема поиска соединений, препятствупцих инактивации цитохрома Р-450 и восстанавливающих его способность участвовать в процессах детоксикации и превращении эндогенных субстратов.

Так как в результате стимулирования процессов перекисного окисления в мембранах эндоплазматического ретикулума имеет место повреждение как липздного компонента мембран, так в белкового, наш была предпринята попытка предотвратить поврекдение мембран эндоплазматического ретикулума гелиотрином с помощью зп-соеди-неыий, антиоксидантоз и фосфолнплдов.

2.2.1. Влияние с Я-соедпяеяий л -токоферола яа инактивации цитохрома Р-450 в у.икросомах печени крыс, получавших гедиотрнг

Результаты исследования влияния SH-соединенпЁ и анткоксидан- ' tob (cj -токоферола) на скорость инактивации ццтохроиа Р-450 показала, что инактивация цитохромг: Р-450 была наименьшей, если к суспензии микросом печени крыс, стравленных гелиотрияом, был добавлен 6 мМ глутатион или I ь4Л дптиотрейтол. I мМ унитиол также оказывал защитный эффект, не в ыгньыей степени.

Выраженное защитное действие '¿-половых соединений замедлякэдее инактивацию цчтохрома Р-450, свидетельствует о том, что э процессе окислительной активации геллотрпка образуется ьисокоахтивные соединения, разрушающие цитохром Р-450 вследствие взаимодействия с сульфгидрильяыми группами геиюпротеина.

2.2.. 2. Влияние фосфолшгадных препаратов на инактивацию изолированного очищенного цитохрема Р-450

На основании того, что фосфолипиды обладают свойством замедлять скорость инактивации СО-восстановлеяного комплекса (Ар-чаков А.И., I9S3; Бачманова Г.К., 1983; Beohoanova et al. , 1988) в настоящей работе была поставлена задача исследовать влияние различных фосфолипидов с целью выбора наиболее эффективного препарата, т.е. препарата, оказывающего кг;"более выграненный защитный эффект на моксоксигзназную §8».?ексну>5 систему, и фсефолипвд-ный состав мембран. В работе било исследовано действие смеси ми-кросомалытых фосфолпцндов 1С.®). Основанием для исследования данного фосфолипида послужил тот факт, что CLS формпруст природное окружение цитохрома ?—150, поэтом/ целесообразно сравнивать ее' стабилизирующее действие с действием, других фосфолпшдншс препаратов. Исследовалось стабилизирующее действие следующих фосфо-лкпидов: а) фосфатидилхолина (ФХхл) из хлопчатника. Данннй фос-фолигшдшй препарат получен из деиевого отечественного сырья, производство его экономично; б) соевого фосфатидилхолина фирмы "Еаттераян" (ФХс). босфшиппд лзляется составной частью коммерческого препарата "Эссенциале", дороко используемого при лечении заболеваний печени; в) препарата, содержащего ФХхл и натриевую соль глицирризиновей кислоты (ОХхЛгГК). Использование натриевой соли глицирризиновой кислоты в кг^стве добавки к СХхч, связано с тем, что она обляпает малой токсичностью, выраз-еиним злт::ск-'.п-

дантным действие?/, и является мягким природным детергентом. Предполагалось, что эти свойства будут способствовать повышении эффективности действия ФХхл и увеличивать стабильность препарата; г) коммерческого препарата эссенциале (фирма "Наттерманн").

Кроме тох'о, было исследовано действие фссфолипидного препарата ОХхл+ГК с добавлением в него анаболика эвдистена. Комбинированное введение препаратов с различными механизмами действия на биомембраны и белоксинтезирутацую систему печени монет вызвать усиление реферативных процессов в пораженной печени.

Результаты по исследованию инактивапчи СО-восстановленного комплекса изолированного цитохрома Р-450 в присутствии фосфоли-плдкых препаратов представлены в рис. 6.

Видно, что инактивация изолированного цитохрома Р-450 замедлялась в присутствии всех фосфолипидных препаратов, за исключением эссенциале, который уже в момент добавления инактивировал питохром Р-450. Это монет быть следствием присутствия в нем продуктов окисления фосфолидвдов и детергентов, производных желчных кислот.

Наиболее выраяешшм защитным эффектом обладала СМФ; соевый фосфатидилхолин (ФХс) оказывал меньший эффект, чем СМФ, ФХхл и 'ФХхл»-ГК. Препарат ФХзин-ГК вызывал замедление скорости инактивации цитохрома Р-450, сравнимое с действием СМФ. Время полуинактивации "гемопротепна составляло 8 мин и 10 мин соответственно.

Таким образом, на основании полученных результатов можно заключить, что ОХхл оказывает более выраженное стабилизирующее действие на цито>фом Р-450, чем ФХс. Эффективность его действия увеличивается в присутствии ГК и становится сравнимой с действием СМФ.

2.2.3. Влияние фосфолипидных препаратов на микросомы печени крыс, поврежденные фосфолидазой А2

Поврезденпл мембран фосшолипазой монет способствовать выяснению роли липддов в функционировании мембранных белков, и в частности, цитохрома Р-450 ( и Usan , Dal Ine г , 1975).

Гидролиз мшфосомэльных фосфолипидов (на 80-90$) под действием фосфолипазы А приводит к конверсии цитохрома Р-450 в неактивную форму Р-420 ( я Ileon , Oailner , 1975). Этот эффект связан с накоплением в мембране больших количеств продуктов гидролиза - свободных гарных кислот и лизофосфолипидсв, обладапцих яеспь-цифическим детергентным действием (Di Augustine , Poots , 1969;

Рис. 6. Влияние фосфолидидных препаратов на инактивации изолированного цитохрома Р-450 (ЛМ2). Инкубационная смесь содержала I нмоль изолирован- -яого цитохрома Р-450 (ЛМ2) в I ил 100 мШ трис-НС1 буфера рН 7,5. Регистрацию проводили при ЭоРс в течение 20 мин. Фосфолипиды добавляли из расчета. I мг на I нмоль цитохрома Р-450.

I - ЛМ2; ?. - ЛМ2»ФХхл; 3 - ДОЗДХхл+ГК; 4 - ЛМг»эссенциале;

5 - ЛМ2+СМФ; 6 - ЛЫ2+ФХс; 7 - ЛЧ2*ПС.

Са-Ьег , НзШоая , 1971).

При измерении скорости перехода восстановленной активной формы цитохрома Р-450 в неактивную - Р-420 сказалось, что при добавлении фосфолипазы А в ыпкрссог.сах печени наблюдается резкое увеличение скорости инактивации цитсхрома Р-450.

На рис. 7 представлены результаты исследования скорости инактивации цитохрома Р-450 б яшфосомах печени крыс, позрввденних фосфоляпазой А, с последующей шшубацпей их с фосфолшшдншш препаратами в соотношении I глг фосфагкдклхолина на 0,3 ы.'.сль цато-хрома Р-450.

Как видно из рас. 7, наиболее выраженным репарнрукцим действием обладали ФХхл+ГК и препарат ФХс. 3 присутствии эссенцнале скорость инактивации цитохрома Р-450 резко увеличивалась, т.е. он проявлял поврег-дпщее действие.

Таким образом, фосфолсякак^е препарата ОХхл+ГК и ФХс стабилизируют цитохром Р-450» Добавление их к поврсяденным мембранам сникает скорость глшкгкзелш гсдюпротевдо, способствует восстановлению мпкросомальннх мембран.

2.2.4. Влияние фосфолнпидкых препаратов на скорость инактивации цитохрома Р-450 б :,ыкросо(.йх печени крас, лолучовжх СС14, гелиотрш» и фенобарбитал

Ранее было показано, что рэ всех изученных фоофолипадшта препаратов наибольшем защитил.", действием .на очищенный цитохром Р-450 (ЛМ2) обладал ФХхл+ГК.

Для подтверждения полученных результатов необходимо было исследовать ре.парлрующук.. способность фосфолппшишх препаратов иа других моделях поранения мембран печени.

Для решения данной задачи были выбраны трк модолв па&рехдодо мембран печени: .модели острого токсического гепатита, отравление гелиотрином и а такяе лекарственное отравление фенобарбита-

лом.

В первых двух случаях иа имеем дело с мембранами, в которых гак содержание цитохрома Р-450, так и его гидроксилазная активность снижены, а в последнем - эти показатели резко отличаются от контрольных в сторону увеличения. Тем не менее, во всех случаях найяадается повышение скорости инактивации цитохрома Р-450, что указывает на нарушение лишщного матржеа мембран, белок-липиддых взаимодействий, фосфолипидного микроозфухения гемопротеина..

Рис.7. Влияние фосфолнпаднкх препаратов на инактивации цято-хрома Р-450 шнрссом печени крыс, повревдеяных фссфо-липазой А.

Инкубационная смесь содержала 0,3 нмоль Р-450 в I ыл трис KCl буфера pH 7,4. Дифференциальные спектры регистрировали при 37°С в течение 20 мин. Микросош предварительно инкубировали с фос-фолипздными препаратами из расчета I мг за 0,3 нмоль цвтохроиа Р-450 в течение 60 мин при 4°С.

I - К-МК; 2 - ФА-МК (микросс-.ш, позрезденные фосфо.тапззой А); 3 - ФА-МК».ОХхл*ГК; 4 - СА-'Л^ОХс; 5 - <&А-МКгЭЗсенциале.

Как видно из рис. S, инактивация цитохро.ча Р-450 при введении CCI^, гелиотрина и фенобарбптала идет намного быстрее, чем в контроле. jjpei.iH аолукноктивачли цитохрома Р-450 составляет 7 мин при поракеыш СС14,"5 мин при гелиотриновом поражение, 8 мин - при индукции фенобарбиталом, в контроле - 30 мин.

Шкросомы, выделенные из аеченл крас, получавших гелиотрин и фенооарбитал, инкубировал!; с разными дозами фосфолипвдов, от I до 6 мг босфолипида на I нмоль цитохрома Р-450 (рис. 9, 10). Наибольшее защитное действие наблюдается при дозе о мг фосфатвдил-холина на I ямоль цитохрома Р-450. Увеличение дезы фосфолипида до 6 мг на I нмоль Р-450 не приводило к более выраженному замедлению инактивации.

В дальнейших экспериментах было использовано соотношение 5 мг фосфолипида на 1 нмоль цитохрома Р-450.

Для сравнительного изучения действия фосфолипидных препаратов in vitro ш исследовали инактивацию цитохрома Р-450 микро-сом печени крыс- с добавлением препаратов фосфатидилхолина из хлопчатника, соевого фосфатидилхолина, фосфатидилхолина из хлопчатника с ГК.

Результаты по сравнительному изучению действия препаратов фосфолипвдов на инактивацию цитохрома Р-450 в фенобарбитальшх микросомах представлены на рис. II.

Установлено, что самое резкое замедление скорости инактивации цитохрома Р-450 имело место после инкубации ФБ-микросом с ФХхл+ГК, время полуинактивацш; составляет 22,5 мин. Препараты ОХс, ФХхл и СМФ имели меньший эффект и время полуинактивации колебалось от II до 15 мин. Таким образом, наибольшим защитным эффектом обладал препарат £>Ххл+ГК.

Сравнительное исследование репарирувдего действия фосфолипид-пих препаратов на мембраны поврежденных СС14 макросом печени крыс в опытах in vitro показало, что наиболее эффективным такие является смесь ФХхл+ГК. Результаты исследования представлены на рис. 12. Скорость инактивации цитсхрска Р-450 в микросома?: печени, аовреадешшх при инкубации их с ОХхя+ГК снижается Ос— .тро, в два раза. Введение эссенцпале в среду инкубации резко ¿т.елпчявзпо скорость инактивации гскопротешш.

При исследовании скорости инактивации цитохрома Р-450 ГТ-у;нфссо\; также кабдкдалоеь защитное действие фосфолипидных дрена; :ов ¿рис. 13).

- Ol

о in

'Г

iL

•т

<

<3

- ОЗ

- Il

8.

Инаптивацпл пвтохрога Р—Í50 глпфосом печенл крыс, получаЕпзх фенобарбитал, СС1^, гелиотран.

I - K-f.CC; 2 - ОВ-МК; 3 - СС14-ИХ; 4 - ГЗМЛК.

Рис. 9. Инактивация цитохрома Р-450 микросом печени крыс, получавших фенобарбитал и инкубированных с различными дозами лшосом из смеси микросомальных фосфоляпддов. Инкубационная смесь содержала I нмоль цитохрома Р-450 в I мл 100 мМ трис-НС1 буфера рН 7,5. Микросомы предварительно инкубировали с липосомами в течение I часа при 4°С. Дифференциальные спектры регистрировала при 37°С в течение 30 мин. I - К-МК; 2 - ФБ4Щ-1 мг ФЛ/1 нмоль цитохрома Р-450; 3 - ФБ-МК*2 мг ФЛ/ямоль Р-450; 4 - ФБ-М&-4 мг ФЛ/ямоль Р-450; 5 -ФБ-МК*5 мг ФЛ/нмоль Р-450; 6 - ФБ-МК*6 мг ФЛ/нмоль Р-450.

с <

02

04

Об

-. OB

-. 1

-.12

ЗО

Рзс. 10. Инактивация цитохрома Р-450 ."литроссм печени крыс, получавсзх фенобарбитал и инкубированных с различными дозами фзсфатвдалхоллна из хлопчатника. Инкубационная смесь содернала I нмоль цптохрока Р—450 в I мл 100 ¡.'Л трис-HCI буфера рБ 7,5. Гдкросомы предварительно инкубировали с липосомамп в течение I часа"

при

4°С.

Дидаерсягсгэлькыэ спектры регистрировали прп

37°С в течепие 30 мин. I - К-ИК; 2 - СБ-i.'KfrI от ОЛ/нмоль Р-450; 3 - ФГ-ШЬЯ иг Ш нмоль Р-450; 4 - ФБ-.'.К+З от СЛ/имоль Р-450; 5 - «B-.TrUS мг ОЛ/пголь Р-450; 6 - ЭБ-И&6 от ОЛД-.'оль Р-450.

о

Рис. II. Влияние фосфолипиддых препаратов на инактивацию ци-тохрома Р-450 макросом печени крыс, получавших фенобарбитал.

Ипкуоациоппая смесь содержала I нколь цитохрома Р-450 ■ в I мл 100 мГ.1 тркс-НС1 буфера рН 7,5. Дифференциальные спектры регистрировали при 37°С в течение 30 мин. Шкросомы предварительно инкубировали с фосфолипида-ми из расчета 5 кг на I нмоль цитохрома Р-450 в течение 60 мин при 4°С. I - ФБ-МК; 2 - ФБ-МК* ФХхл; 3 - ФБ-МК*ФХхл*ГК; 4 - ФБ-МК* эссен-циале; 5 - ФБ-МК*СМФ; 6 - ФБ-МК*МК*ФХс; 7 - ФБ-МК*ГК.

Рис. 12. Влияние фосфолипидных препаратов па инактивации Р-450 микросом печени крыс, получавших СС14. Инкубационная смесь содержала 0,3 нмоль Р-450 в I мл трис HCl буфера рП 7,4. Дифференциальные спектры ре- , гистрировали при 37°С в течение 20 мин. Микросомы • предварительно инкубировали с фосфолипидными препаратами из расчета I от на 0,3 нмоль цитохрома Р-450 в течение 60 (линут яри 4°С.

I - К-МК; 2 - CCI^-MK; 3 - СС14-гШФХхл*ГК; 4 - СС14-4Щ.ФХс;

5 - CCI.-MKt-эссенциале.

-Л

о 2

02

ОА

Ов

ОВ

- I Г

-- 12?

—I—

12

1в

за

Г;:с. 13. Влияние босфолипщцшх препаратов на инактивацию цитохрома Р-450 микроссм печени крыс, получавших гелкотрнн. Инкубациоштя смесь содерт>ала I нмоль цитохрома Р-450 в X шх 100 кМ трпс-ЕС1 буфера рН 7,5. Дифференциальные спектры регистрировали грч 37°С в течение 30 мин. ' {ликросомы предварительно инкубировали с фссфолипида-ми из расчета Г- мг на I ¡моль цитохрома Р-450 в течение 60 млн при 4°С.

I - К-МК; 2 - ПЧЖ; 3 - ГГ-ГЩСХхл; 4 - ГТ-ШиФХхл+ГК;

ГТ-!.К»-зесенцкале; 6 - ПЧЛм-СЖ; 7 - ГГ-М]»ФХс

Наиболее значительным действием, как и в случав очищенного изолированного цигохрома Р-450 в исследованиях с фосфолипазой А, СС14 - макросом и ФБ-микросом, обладал препарат ФХхл+ПС, время полуинактивации било наибольшим и равнялось 26,5 мин. Значительно меньшим эффектом обладали СМФ, ФХс, время полуинактивации 9-12 мин. Препарат ФХхл был более эффективным, чем СМФ, ФХс, но не достигал уровня ФХхл+ГК.

Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать следующее заключение. Исследуемые фосфолипидные препараты ' стабилизируют изолированный очищенный цитохром Р-450. Добавление их к поврезщешшм СС14, гелиотрином и фенобарбиталом мембранам микросом сопрововдается замедлением инактивации гемопротеина, что свидетельствует о взаимодействия микросом и фосфолипидов, что приводит к стабилизации липидного матрикса мембран и цитохрома Р-450. Наиболее эффективным был препарат ФХхл+ГК.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности репарации поврежденных мембран микросом фосфатидилхолином хлбпчатника с глицарризиновой кислотой и соевым фосфатидилхолином при острых и хронических гелиотриновых гепатитах.

2.3. Репарация мембран микросом фосфолипидннми препаратами Нри остром токсическом гепатите

2.3.1. Содержание гемопротеинов и активность редуктаз в препаратах микросом, выделенных из печени крыс, получавших гелиотрян и фосфолипидные препараты

Обнаруженный стабилизирупций эффект исследуемых фосфолппад-ных препаратов на цитохром Р-450 в изолированном очищенном состоянии и в составе поврежденных мембран микросом in vitro послужил основанием для исследования их действия in vivo

Результаты измерения содержания цитохромов Р-450, hj и активности редуктаз в контрольных препаратах микросом и в препаратах микросом, выделенных из печени нивотных с острым гепатитом и после введения фосфолипидных препаратов в течение 3-х дней представлены в табл. 3.

Как отмечалось ранее, развитие острого токсического гепатита сопровождается снижением удельного содержания цитохрома Р-450 на 55$ и содержания цитоярома b s - на 25$ по сравнению с контролем. Активность НАДН-феррицианид-редуктазы^и НАДФН-цдтохром-с-редуктазы снижается на 41*^ и 43$, соответственно. После введения

Таблица 3

Влияние введения фосфолипидных препаратов (3 для) на содержание цитохромов Р-450 л ь^ (.ихохь/шГ1 белка) и активность редуктаз (мкыоль х мин"1 ыг-1 белка) в ки-иросоыах печени крыс с острым гепатитом

Условия опыта ! Цитохром ! Р-450 ! ! Цитохром ! Ь5 !НАШй1-цито- !хром-с-редук-!таза ШАДП-ферри-!цианид !редуктаза

Контроль 1,00*0,07 0,56+0,04 0,087+0,006 3,56+0,25

10® юся 1002

Острый 0,45*0,03 0,43^0,03 0,053*0,004 2.13+0,17

гепатит 452 11% . 61% 602

Т + ФХхл 0,69*0,05 0,42г0,04 0,066+0,005 2,67+0,21

Ж ~ 75% 762 752

+ ФХхл* 0,70*0,05 0,45*0,04 0,070*0,004 2,80+0,023

111 ш 802 802 ~ 812

Эссенциале 0,53*0,04 0,39*0,03 0,060*0,003 2,54*0,92

53? 702 70^ 712

фосфолипидных препаратов ФХхл п ©Ххл+ГК отмечалось повышение содержания цитохрома Р-450 и активности редуктаз в среднем на 15-202. Менее эффективно было действие эссенциале (табл. 3).

Следовательно, введение фосфолипидных.препаратов способствует репарции мембран эцдоплазматичёского ретикулуиа, стабилизируя содержание гемопротеинов и активность редуктаз, т.е. они воздействуют как на начальные, так г. на конечные участки микросо-калышх редокс-систем.

Исследование скорости инактивации цитохрома Р-450 в микросомах печени крыс с острым гепатитом и последующим введением фос-фолкнпдных препаратов выявило резкое ее замедление в препаратах кпвросом, получавших ФХхл и ФХхл+ГК. Введение эссенциале также приводило к некоторому замедлению инактивации, но эффект этого препарата бил гораздо ыенызим (рис. 14).

Для оценки функционального состояния мембран макросом печени крыс определяли скорость НАДСН-зависимого окисления трех субстратов: диметиланилина, ц-нитроанизола и анилина. Результаты исследования отображены на рис. 15.

Развитие острого гепатита сопровождалось ладепяем скорости

12

-. OB

Рпс. 14. Инактивация цитохром Р-450 в микросомэх печена крпс, отразлсшшх гелнотр^яом к получаьпшя фосфо-лппидк в течение 3 дней.

Остргй гепатит гязнюлп введением 30 кг гелиотрлна на ЮС г насей, фосфолиппдние препарата вводил: в/з (20 t:r на 100 г .тасглг) в течение 3 дней. Мнкрооо:ш кщелял:: так описано з? раздело "Материала в методу41. Инактивации цитохромг. Р-450 регистрировали при 37°С в течение 30 мин.

I - К-Ж; 2 - ОГ-МК; 3 - 0Г-М1+0Ххл; 4 - ОГ-КМХхльГК;

5 - ОГ-Шб-эссенциэле.

MrfH

м Б

5

А -3 -

гЬ

+

м* 1Ш

| 0.8

а

0.4

02 -

1 2 3 4 5

А

гЪ

+

гН

гЬ

-Ь

1 2 3 л 5

Б

1 ои 0.8 -0.6 04

о.г

гЬ

пН

гЬ

41

1 2 3 4 5

В

Рис. 15. Влияние фосфолиппдных препаратов на скорость НАДОН-зависимого окисления диыетилашишна (А), • анилина (Б), п-нитроанизола (С) в микросомах печени крыс с острым гелиотриновым гепатитом. I - контроль; 2 - ОГ; 3 - ОГ+ФХхл; 4 - ОГ+ОХхл+ГК; 5 - ОГ+эссенциале.

окисления всех трех субстратов Введение (КхлТК в течение 3-х дней дриводлт к покмеяи» окисления дЕхегслшвиззь на ЕЗ/. н-нитроаннзола на 116^ и анилина - 7$. Эсеенциаде оказывал менее выраженное терапевтическое действие.

Репарирусщее действие фосфашшдишс преиарзтов на избраны макросом било обнаружено и б исследованиях, проведенных на модели гепатита, вызванного СС1^ (рис. 16).

2.3.2. Влияние фоофолигниши" пу-паратс:; линииныи состав мембран квкросс.м печени крыс с сотри:.: гепатитом

Основываясь ча дзнннх, приведенных ренбо о то:.;, что повреждение клеток исченн протечет, в керзуо очередь, через актива-цко ПОЛ била поставлена задаче последовать влг-яние фосйолииндных препаратов на ПОЛ в цккроссшх печени ирис с острой интоксикацией. Результаты исследования отображена на рис. 17

Как вето из рисунки, острая интоксикация гелистринсм сопровождалась повышение:.; пак БДДСН-з&зкскзох'о, таи н аскорбат-за-висимогс окисления лнпндов. "ведение ФХхл+ГК в течение 7 дне;: окгокало содержание "Л Л на 32$ и 41® ссответстзе'шо. Наименее ви-рпг.еяо защитное тишине препярата ^сссздизда». О р-зпзркруокем действии фоКолнпндннх препаратов свидетельствует и понижение содержания конъюгированнын диенов в жннросожзх печен:: крыс.

Прл исследовании фосфсянпндного состава выявлено, что при ■сведении гсяяотряна содержание »|о;:-гатид«лхолина снижалось на |[.оефзтндилзтанслй:.и:на '¡а 10,2, содержание сфн:л'е:..нслнна и лазофос-фатнднянолина повышалось лз Зби и 112р соответственно. Введение С-Ххя оказывало нормалвзунчкй эффект на $осфолпп?дннй состав ми-кросом. Добавление к фоефатнднлнолнну хлопчатника глицирризииО" гон кислоты усиливало защитное действие препарата. Пекее вырааен-гжл было влияние зссекциале. : .

Анализ гиркоккслоткого состава фосфатидилиолпна показал, что введение всех фосфолипидных препаратовповышало содержание „ * ненасыщенных :.н;рных кислот, повышался индекс ненаешценпоети.

Так;::,: образом, при введен'»;:: фосфолипидных препаратов крысам с острим гелиотрлновым гепатитом наблэдалась тенденция к нормализации липидного состава мембран кпкросом. Наиболее выраненичй оффект отмечен при введении Фл/ЛеГК.

Рис. 16. Инактивация цитохроыа Р-450 ыикросом печени вдыс, отравленных СС1^ и получавших фосфолипидные препараты в течение 3 дней.

Инкубационная сыесь содержала 0,3 вдоль Р-450 в I мл трис НС1 буфере, рН - 7,4. Дифференциальные спектры регистрировали при 37°С в течение 20 мин. I - К-МК; 2 - 0Г-СС14-МК; 3 - ОГ-СС^-ШЬФХх^ГК; 4 - СГ-СС14-ШиФХс; 5 - 0Г-СС1.-Щ^эссенциале.

03

3 02

O i

о

Ш

гЬ

гЬ

Н-

гЬ

12 3 4

(11 чэ

ЬН 03

Ьз

S

ог -:-

d Q i О

h rh

ГП

rh

rh

3 4 5

Рис. 17. Ешшше фосфолиаидшх препаратов на перекиеное окисление липидов в микросомах печени крыс с острым гелиотриновкм гепатитом

А - НАД'Ш-завискмое ПОЛ Б - Аскорбат-зависимое ПОЛ

I - контроль; 2 - ОГ; 3 - ОГ+эссеяциале; 4 - ОГ+ФХхл; 5 - ОГ+ФХхл+ГК.

2.3.3. Стимуляция белоксинтезируацей системы печени крас препаратом экдгстея

Как было выявлено, введение фосфолипидных препаратов оказывало репарирующее действие на лгпидные компоненты мембран микрс-сом. Однако полного восстановления меморзн не происходило. По всей видимости, усиление терапевтического действия следует искать в комплексном воздействии фосфатгдилхолина, восстанавливающего структуру мембран и соединений, способных активировать белокспн-тезирующута систему клеток печени.

Опытами in viti'o доказана способность экдистена стимулировать биосшттетические процессы. Очередным этапом явилось испытание препарата in vivo .

В эксперимент воата три группы подопытных животных. Первая -- извотше с острой гелиотриновсй интоксикацией, которым вводили экдистен в дозе 20 мг/IOO г масса. Вторая, группа - стравленные янвотшо, которым вводила экдистен совместно с фосфолипидким nps-даратом ОХхя+ГК. Третьей группе подопытных животных крыс е2о;м;.,:

фосфатидшгсолин хлопчатника с глицпрризиновой кислотой.

Репарирутацее действие смеси ФХхл*ГК на биосинтез белка в печени невелико (рис. 16).

01

10 ггосо | и

i íñooo I

Ц косо |

'a, 1DOOG !

S 50D0 4

| гзаа L

rfi

3 4 5

. Рис. 18. Влияние экдистена на включение *4С-аминокислот в бесхлетсчной системе синтеза белка полисомами печени при остром токсическом гепатите ( vivo ).

I - контроль; 2 - ОГ; 3 - ОГ+эвдистзн; 4 - ОГ+ФХхл+ГК;

5 - ОГ+ФХххн-ГК+экдистен.

Введение экдистена крысам с острым гепатитом приводит к заметному биосинте-тических процессов. Введение его в составе ФХхлгГК усиливает действие препарата, нормализуя биосинтетический процесс.

2.4. Репарация мембран эндоплазу-атического ретикулуу.а печени фосфолипчдными препаратами при хроническом гепатите, вызванном введением гвлиотрина

Развитие хронического гелиотринового гепатита, как и в случае острого гепатита, сопровождается снижением удельного содержания цитох^ома Р-450 с I,09*G,08 нмоль«кг~^ белка до 0,82+0,0? пмоль-мг~~ белка, что составляет 75$ от контрольного значения. После 7-дневного введения фосфолипидных препаратов ФХхл и ФХхл+ГК содержание цитохрома Р-450 повышалось до 0,95*0,08 ныоль'иг"* белка и 0,Й2*0,07 нмоль-мг"'1 белка, соответственно. Содержание ни то хрома ъ 5 повышалось на 32JS при введении ФХхл и на 30$ при введении ФХхл+ГК. Менее эффективно было влияние эссенцкале.

Исследование активности НАД-феррицзашщ редуктязы и НАДФН-

+

цитохром-с-редуктазы показало, что хроническая интоксикация снижает их активность. Введение ФХхл и ФХхл+ГК в течение 7 дней поЕышало активность редуктазы. Более длительное введение фосфо-липидных препаратов (14 дней) способствовало дальнейшей нормализации содержания и активности компонентов монооксигеназной системы.

Из четырех исследуемых компонентов монооксигеназной системы мембран эндоплазматическсго ретикулума печени наибольшему изменению при хронической интоксикации гелиотрином подвергается цито-хром Р-450. Введение фосфолипидных препаратов способствовало восстановлению содержания гемопротеинов и активности редуктаз. Наиболее выргзешшм терапевтическим эффектои.обяадал ФХхл+ГК.

"рп определении скорости 1ОДФН-зависимого окисления трех у .чонсоксигонь чой системы эндоплазматическсго ретикулума

печени отмечено, что хроническая интоксикация гелиотрином сопровождалась снижением скорости окисления даметиланилина (на 27%), анилина (на 30$) и п-нитроанлзола (на '¿7%). Введение фосфолипидных препаратов в течение 7 дней повышало скорость окисления всех субстратов (табл. 4).

Таблица 4

Скорость НАДФН-зависимого окисления даметиланилина, анилина, п-ннтроанизола микросом печени крыс с хроническим гепатитом после 7-дневного введения фосфолипидных препаратов (рассчитано в нмолях образовавшегося продукта в мин х мг белка)

Субстраты окисления

•! Контроль Иронический! •! • !гепатит Г

! 1 !

ФосДолипидные препараты

ФХхл

!

ФХхл+ГК } эссенциале

Дчметил- 6,4+0,3 4,7+0,2 4,6+0,3 5,4+0,4 4,8ь0,3

анилин <о7оо1 соТоо1 <0,001 < о7оо1

Р2 >0,05 >0,05 >0,05

Анилин 0,61+0,06 0,43+0,03 0,48+0,04 0,61+0,05 0,45+0,04 •

СО,001 <0,001 >0,05 <0,001

Р2 >0,05 <Г 0,001 >0,05

п-нитро- 0,70+0,05 0,44+0,03 0,52+0,03 0,53+0,05 0,36+0,04

акизол Р1 <0,001 ^0,01 <0,01 <0,001

Р2 >0,05 >0,05 >0',05

Более длительное введение фосфолппвдных препаратов оказывало более выраженное ре.иарирущее действие на скорость НАДФН-зависи-мого омолодил.

Результаты г.зследокаяяя вшитая фосфолилкдных препаратов на процессы ПОЛ при хроническом поранении печени показало повышение как ПМФН-зависимого (.на 32$), так и аскорбат-ззвнсимого (на 27$) перею'.спого окисления лигшдов по отношении к контрольным кикросо-ыам. На 85$ повышалось ссдерканг.е коньпгпровзнннх диенов. "-дневное- введение ФХхл, ФХхл+ГК к эссзнцкало гашяало содержание продуктов НАДФН-ПОЛ. Содержание конькг/ровашшх диенов после введения ФХхл также спккалось. Длительное введение препаратов (14 дней) усиливало действие ёосфолипидных препаратов.

При хроническом гепатите отмечается таг-ке изменение соотношения липидных компонентов м^крС'Сомал1.кг:-: ае."бран. При хроническом гепатите, вызванном гелг-отргном, ::/сЫЕен:.с 38?! ЛйЗофэсфатгдЕлхслкна. Содерлшие фос;;)ат::;;г.'.::с.ч.•-■.ось ;га 17$. Менее значительные изменения прст'рпек.'.от щр&кы&д фосфат:;-дили.тезита, фосфатидмлэтаноломика. Сг.чр.;зние лизофосфатидплхолп-на после 7-дневного введения оссенциале снижалось на 13$, ФХхл -- на 38$, ФХхл+ГК - на 42$. Содержание фосфатидилхолина повышалось. - 2-недельное введение фосфолипэдов почти полностью нормализует фосфолипидный состав кикросомальяых мембран печени крыс.

Длительное введение гелиотрина значительно изменяет жирно-кислотный состав фосфолишщов. Наибольшее изменение в фосфатидил-холиновой фракции претерпевает арэхидоновая кислота (20:4) - снижается, с 23,4+1,1$ до 1.1,7+1,1$, появляется миристиновая кислота. Выявлены изменения .в кирнокислотном составе сфингомиелина и лизо-фссфатидилхолина.

Введение фосфолипвдов нормализовало кирнокислотный состав фосфатидилхолина. Ненасыщенность фосфолипидного бислоя возросла преимущественно за счет повышения содержания полиеновых жирных кислот. Наиболее эффективными были ФХхл и ФХХЛ4-ГК.

Таким образом, при хроническом гепатите, вызванном гелиотри-ном, изменяется состав липидных компонентов микросомальных мембран. Фосфоляииднке препараты: ФХхл, ФХхл+ГК, эссенциале стабилизируют фосфсшншдный состав микросомальных мембран, стимулируя процессы репарации микросомальных мембран. Более выраженным эффектом обладал ФХхлсГК.

ранее было показано, что при поранениях печени повреждаются

не только липидные компоненты мембран, но и белоксиптетичес-кая функция печени. Очередной задачей наших исследований явилась по-шма стимуляции биссинтетических процессов в печени крыс с хроническим гелкотрипсьым гепатитом. Анаболический эффект препарата скдистена был ранее доказан в опытах in vivo при остром гепатите. При хроническом гепатите применение окдистена такке способствовало увеличении скорости включения *4С-амшюкйслот в бескле-точпой системе синтеза белка нолисомами печени. Действие препарата усиливалось при совместном введении его с фосфатидилхолином.

2,5. Биохимическая характеристика крови экспериментальных давотзых при гелиотшяс.вых гепатитах и в процессе лечения

Поранение печени сопровоздаьтся изменением биохимических показателей крови, з частности ферментов, что имеет болъиое значение как для диагностики болезней печени, так а для оценки тяяеети патологического процесса и эффективности применяемой терапии.

Ранее были приведены данные о состоянии микросомзлыюй монооксигеназной системы печени крыс при гелиотриновых гепатитах, об изменениях в липидном составе мембран и активности белокспнтезз-рувщего аппарата. Результаты наглядно показали, что исследуемые фосфолнпидные препараты оказывав? ре парирующее действие на мембранную много/сомпояеятнуто систему овдоплазматаческого ретикулума. Представляло интерес выявить влияние фосфолипидпых препаратов на биохимические показатели в плазме крови, отранаицие течение патологических процессов в печени.

Е группе .гивотных с острой гелиотриновой интоксикацией отмечается выраженная гиперферментемии. Активность АЛТ и ACT повыиека в 3,5 и 1,3 раза соответственно, щелочной фосфатазы - на 6С$. Более чем з 10 раз повышается активность фруктозо-1-фссфатальдо-лазы, в 2,5 раза активность Ш, í'-ГВТ, в 2 раза - TP, в 3,4 раза - Г.ЩГ-КАД. При хронической гелиотршшей интоксикации оэтде-чены изменения, аналогичные наблюдаемым при остром гепатите, однако степень гиперферкентемии несколько нияе. Следовательно, повреждения кикроссмальной системы печени коррелируют с изменениями активности ферментов в сыворотке крови. При сравоттельном изучении ФХхл, ФХхл+ГК, зссенциале ползало, что наибольшее терапезтичес-кор действие оказывает ФХхл+ГК. рдение фосфолипидного препарата, содержащего экдиетеп, усиливало эффект фосфатидилхолнна.

Таким образом, фосфолишщше препараты, оказывая стабилизирующее влияние на мембранные структуры клеток печени крыс с экспериментальным гепатитом, вызывают снижение активности ферментов в крови животных. Препараты ФХхл и ФХхл^ГК оказались более эффективными по сравнению с эссеяциале.

2.6. Биохимическая характеристика крови детей больных хроническим гепатитом

Диагноз хронического гепатита у детей ставился на основании всестороннего клинико-лабораторного исследования и данных ультразвуковой эхографии печени. В процессе комплексного лабораторного обследования больных хроническими гепатитами использовали показатели: активность ферментов АЛТ, ACT, ЩФ, Ф-1ФА, Ш, УР, НАД-ЗДГ, ¿¡"-ГШ, содержание билирубина, мочевины, протеинограмму, белково-осадочные пробы и концентрацию АТФ. Для характеристики функдао-нального состояния гепатоцитов был определен комплекс липидных показателей, включающий общие липиды, холестерин, триглицервды, общие фосфолипиды, фосфолипидный состав, жирнокислотный,состав и ПОЛ. Все болыше по проводимому лечению были разделены на 2 группы;

. 1-ая группа получала симптоматическое лечение, 2-ая наряду с симптоматической терапией получала фосфолипидный препарат эссеяциале.

; При развитии хронического персистируидего гепатита обнаруживаются незначительные изменения в крови. Отмечена гиперферменте-мия, ссдераан-е общего белка снижено на 23$. наблвдается умеренная гипергаммаглобулинемия и снижение'содержания альбуминов с 44!? до 282, содержание АТФ снижается на 272 по отношению к контрольной группе. Количество общего холестерина увеличивается на 572, триглицеридов более чем в 2,5 раза, общие фосфолипиды снижаются на 312.

Более выраженные изменения отмечаются в группе детей, больных хроническим активным гепатитом. В стадии обострения во всех случаях выявлена высокая степень гиперферментемии, диспротеинешия, гипербилирубинемия. Содержание общих липидов увеличивается на 332. общего холестерина на 822, триглицеридов на 1702. Общие фосфолипиды снижаются.

При исследовании фосфолипидного состава выявлено снижение содержания ФХ и повышение ЛФХ и сфингомиелива. Увеличивается ПОЛ, субстратом для которого служат полиненасыщенные жирные кислоты. Одновременно увеличивается содержание насыщенных жирных кислот,

Те блица 5

Показатели лкпидного обмена в сыворотке крови детей, больных хроническим активным

гепатитом

¡Тпказатели с коротка :■ -с ¿.а

Бальные ХАТ

При поступлении !---!

I симптоматическое !с применением эссен-! _!_ _!цззте_ •

| Контроль

. лпнцдц

Ч /-

:.■¡.история . - .ллъ/л

Григлицеридц гл- оль/л

5,6+0,Зхх

3,3+0,2** г.бьр.з*3™

5,^0,4 3,1±0,3(хет)

3,3^0,3 1»5нИ0,1хгг

4,%0,4

4,3+0,3 1,%.0,15цас

4,2+0,3 2,8+0,2

5,2+0,5 0,9+0,1

I

х - Р < 0,05; хх -Р< 0,01; ххх - Р< 0,001

х - достоверность по отношении к группе здоровых детей, (х)- по отношении к показателям при поступлении.

преимущественно за счет миристиковой, пентадекаповой и пальмитиновой кислот и снижается количество ненасыщенных (линолевой к арахидояовой) кислот, т.е. наблюдается дефицит незаменимых вирных кислот.

Клинико-биохимическле исследования, проведенные в динамике лечения детей, больных хроническим гепатитом дали возможность установить, что наибольший терапевтический аффект получен в группе детей, леченных с применением фосфолипидлогр препарата осседциа-яв (табл. 5).

Существенно изменялся состав индивидуальных фосфолипидов в сыворотке крови, повысилось количество фосфатвдилхолияа, снижено содержание сфингомиелила п фосфатидилэтанолаыина. Состав жирных кислот изменялся незначительно. Анализ результатов комплексной терапии показал, что наиболее перспективным в устранении мембранных повреждений являются фосфолппидные ир^и-.ряти.

ВЫВОДЫ

1. В основе механизма повреждения мембран эндоплазматическо-го ретикулума при гелиотриновой интоксикации лежит окисление ге-лиотрина на цитохроме Р-450. Продукты окисления стимулируют пере-киспое окисление липидов, что вызывает повреждение фосфолипвдного бислея мембран, приводящее к их деструкции с последующими нарушениями белоксинтезирупдсй и детоксакацнонной функций печени.

2. Острая и хроническая интоксикация гелиотрином вызывает резкое падение содержания цитохрома Р-450, снижение активности монооксигеназной системы, изменение соотношения липздкых компонентов мембран, угнетение белоксинтезируицей функции печени.

3. Инактивация изолированного очищенного цитохрома Р-450 замедляется в присутствии фосфолиаидпых препаратов: смеси микро-сомальяых фосфоляпндов, фссфатидиихсшша сои, фосфатидцлхолняа хлопчатника и смеси фосфатидылхолина хлопчатника с глицирр^зино-вой кислотой.

4. Установлено, что фосфолидздные препараты способствуют репарации повренденных мембран микросом vitro , Па ЗТ0 указывает замедление инактивации цитохрома Р-450 в их присутствии в мембранах микросом печени крыс, получавших СС14, гелиотрпн и фенобарбитал,' а также в мембранах контрольных микросом, обработанных фосфолипазой А. Наибольшим репарируицим действием обладала смесь фосфатидилхолина хлопчатника с глицирризиновой кислотой. Эссен-циале не обладал репарярупцкм эффектом 1л vitro к ияактивировал изолированный питохром Р-450 и гемопротегч в составе мембран макросом.

5. Введение фосфатидилхолина -/лоячатника и фссфзтидилхолшш хлопчатника с глицирризиновой кислотой экспериментальным аивотяшл способствовало усилению рспаративных процессов в микросомалышх мембранах, поврежденных прл острой и хронической гелиотриновой интоксикации.

S. Введение фосфслипндннх препаратов животным с гелаотряноЕым поражением нормализует фосфолипидиый а жирнохислотпый состав ми-кросомальных мембран.

7. Экдкстея обладает выражеш-.сй анаболической активностью, Что выражается в увеличении скорос.'Ц включения ^С-аыинокислот ро вновь синтезируеше цодипепты- в бесклеточнсй системе полисом.

Введение эндистена в составе фосфатидилхолина хлопчатника с гли-цирризяновой кислотой усиливает терапевтический эффект фосфоли- . пидного препарата.

8. Введение животным с острым и хроническим гелиотриновым гепатитом фосфолипидных препаратов ФХхл и ФХ +ГК вызывало снижение уровня гиперферментемии, способствовало нормализации ли-пидного состава сыворотки крови. Эссенциале проявлял менее выраженное терапевтическое действие.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Арипоь А.Н., Оесенко Л.М. Влияние ц-АМ5 на гктивность № (НАД) в сыворотке и органах крыс при хроническом токсическом гепатите //Вопросы детской пульмонологии. - Ташкент, 1930.-0.98-101»

2. Арипов А.Н., Фесенко Л.М. Зависимость НДДО-зависимых деги-дрогеназ в печени и сыворотке крови крыс в процессе развития хронического токсического гепатита // Сборник "Механизмы патологических процесссв. - Ташкент, 1982. - С. 21-23.

3. Арилов А.Н., Оесекко Л.М. ларактеристика активности некоторых ферментов энергетического обмена в процессе развития хронического токсического гепатита. Клеточные основы приспособительных процессов. - Ташкент, 1982. - С. 12-14.

4. Арпсов А.Н. Исследование некоторых метаболических процессов пепс-ни в дгдамнке :-азЕптня экспериментального хронического г^лиотрикорого renai::та // Острые и хронические заболевания гепато-билиарной система у де:ей. - Ташкент, 1982. - С. 52-54.

: 5. Арипов А.Н., Абдулхаев Ш.У. Влияние клофибрата на состояние перекпсного окисления липйдоь мембран эндоплазматического ретикулума печени крыс при хроническом гедвотринозоы гепатите // Острые и хронические заболевания гепатобилиарноА системы у детей. - Ташкент, 1982 - С. 126.

6. Арипов А.Е., Савин И.Г., Карузина И.И., Еирнов Г.Ф. Взаи-¡«адэйсгвпе гедпотрина с гдатотромом F-450 микросом печени крыс. Цитохром Р-450. Структура в функции. - Минск, 1982. - С. 87.

7. Ферментная диагностика вирусного гепатита у детей. Методические рекомендации (Арипов А.Н. и др.). - Тг::кент, 1980. -

С. 1-Х.

8. Лабораторная диагностика хронических заболеваний печени у детей. Методические рекомендации. (Арипов А.Н. и др.). - Ташкент, 1933. - С. I-I4.

9. Арипов А.Н., Саван И.Г. Влияние гзлиотрина на содержание •' . цятохромов Р-450 и в микросомах печенп крыс // Сборник Механизмы патологических процессов". - ТашкеЕТ,1983. - С. 17-18. .'

10. Савин К.Г., Бачманова Г.И., Арипов А.Н. и др. Влияние гелвотряка на систему микро сомального окисления печени крыс // Вопросы медицинской химии. - 1983. - В I. - С. 43-52,

11. Арипов А.Н., весенко Л.М., Савин И.Г. Окислительнс-восстановительнне процессы в гепатоцитах печени при острой rej¿zo-триновой интоксикации // Медицинский журнал Узбекистана. 1933. --- S 6. - С. 72-7С.

12. Арипов Л.Н., Фесенко Л.М. Активность некоторых ферментов в сыворотке 1фови и ткани печени при экспериментальном хроническом гепатите // Сборник "Актуальные вопросы педиатрии". - Ташкент, 1978. - С. 44-47.

13. Фесснко Л.М., Арипов А.Н. Активпость некоторых митохон-дрпалышх ферментов при экспериментальном поражении печени //. Сборник "Механизмы патологических процессов". - Ташкент, 1983. -

е. 8-и.

■ 24. Арипов A.B., Саван И,Г. Инактивация цитохрома Р-450 в микросомах печени крыс при отравлении гелиотрином // Сборник "Экспериментальные и клинические аспекты патофизиологии г,ис?еыы пищеварения". - Ташкент, 1985,

15. Арипов А.Н., Фесенко Л.М. Функциональные сдвиги в печени при экспериментальном хроническим гепатите и их корре1:цкя цкто-хремом // Сборник "Экспериментальные и клинические аспекты патофизиология системы пищеварения. - Ташкент, 1985.

16. Бачманова Г.И., Халилов Э.И., Исамухамедов А., АрипоЕ А.Н., Каримов М.Щ. Влияние фосфолипвдов на инактивацию цитохоома Р-450 в мшфосомах печени 1фыс // Всесоюзная конферзнция Цитохром Р-450 и охрана внутренней среды человека". - М., 1935. - С. 44.

17. Канаева И.П., Скоцелкс Е.Д., Арипов А.Н., Каримов" И.Ш. Активность и содержание компонентов микросомальной система печени крыс при хроническом отравлении гелиотрином // Всесоюзная конференция "Цитохром Р-450 и охрана внутренней среды человека". Москва, 1985. - С. 104.

19. Арипов А.Н., Савин И.Г. Исследование активности систем перекисного окисления липидов микросом печепи крыс при отравлении гелиотрином // Вопросы совершенствования спец. детской гастрозп-тер. Службы г.Самарканд, 1984. - С. 23-24.

19. Махмудов О.С., Кадаров Б.А., Арипов А.Н. Ферментная характеристика некоторых структурно-функциональных нарушения печени при хроническом гепатите у детей // Всесоюзная конференция гепатоло-гов. Рига, 1933. . ■ , "

20. Арапов А.Н., Фесенко Л.Ы., Савин И.Г., Паевская Л.А. Опенка функционального состояния печени по данным энтгологическсго исследования крови у детей, больных хроническим гепатитом // Материалы Ш съезда детских врачей Казахстана. - ^йрагавда, 1964. - С. IGS.

21. Киязов Д.М., Арипсв А.Б. Эффективность применения д\:ет с различным содержанием жиров для реабилитации дет-.й, больных хроническим гепатитом // Сборник "Вопроси гедико-социальной здшп-

тещ:и v. реабилитации и педиатрии". - Ташкент, 1985. - С. 75-77.

22. Арнпов Л.П., Лбдулхаев Ш.У., Исамухамедов А.Ш. Жирнокис-лотпый состав фосфолппндов эндоплазкэтичзского ретикулума и состояние переписного окисления лппвдов до и после введения фосфоли-пидного препарата "Эссенциале" у кркс с гелкотриновым гепаткто:л // 1у конференция биохимиков Средней Азии а Казахстана. - Ашхабад ISG6. - С. 46-17.

23. Арппоз А.П., Абдулхаев Я.У., Абдугафурова М.А. Изменений • активности индикаторных ферментов и состояние перекпеного окисления и липидпого обмена у неполовозрелых крыс при остром гелпо-триновом гепатите // Паучпо-практичоокгя конференция республики по совершенствования специализированной медицинской помощи детям, Ташкент, 10-20 линя I9SS г. - С. 95-96.

24. Арипов А.Н., Фесенко Л.М., Каримов М.Ш., Савин Н.Г. Исследование действия фосфолиппдннх препаратов при гелиотриновом, поражении печени з ыакросомах // Всесоюзный сьезд биохимиков. -Киев, 1905.

25. Абдулхаев Ш.У., Иванов В.И., Арипоз А.Н. Роль процессов перекпеного окисления ллппдов биомембран в патогенезе хронического гепатита /./ I конференция биохимиков Узбекистана. - Ташкент, 1286 i, - С. 16-19.

25. Езчманога Г.К., Панаева И.П., Каримов М.Ш., Скоцеляс Е.Д., Арипоз А.П., Арчякоз А.И. Репарация поврзндеышх мембран макросом печен;! я их 'Ьерментпых систем с помощьи фосфоладцдов // Всесоюзной симпозиум по :.:едад2нской эязимологиа. - Москва, 1955. - С. 43.

27. Bachnsneva O.I-.,Kí3naeva I.P.,Xarino/ ü.jSkO'fcaeluaa 5., Ssvin I.jAripcv A.,Arcbakov A., Iafluance of holictrine apon rot. Livor nicroaonal conoorygeaasa ayate»// Syupoalun drug'cstaboli-zing ensyna ayotes. Abstracts. Sofia, 13ES. - 27.

23. Арипоз А.Н., Абдулхаев Ш.У,, Каримов М.Ш. Влияние экзогенных фосфэлпплдов на структурно-функциональное состояние мембран эндоплазг.гатического рзтпкулума // "Цитохром Р-450". - Новосибирск, 1957. - С. 127.

29, Ли B.C., Каримов lid., Ардпов А.П. п др. Исследование влияния фосфолпппдшх препаратов на инактивацию цитохрома Р-4СЧЗ // "Цятохром Р-450". - Новосибирск, ISS7. - С. 14-х.

30. Оесепго Л.И., Арипов А.Н. Изменение активности некоторых ферментов трикарбонового цикла в печой¿ неполовозрелых крыс при

острой интоксикации // Болезни печени у детей. - Ташкент, IS87. -С. 46-49.

31. Махмудов О.С., Фесенко Л.Ы., Кадыров Б.А., Аркпов А.Н. Кяинико-экспериментальная оценка энергетического обмена в печени при хроническом гепатите // Медицинский журнал Узбекистана. -1938. - й 6. - С. 27-30.

32. Арипов А.Н., АСдулхаев Ш.У., Фесенко Л.И., Кадыров Б.А. Состояние липидного обмена в сыворотке 1фози детей больных хроническим гепатитом // Тезисы докладов Ш съезда детских врачей Узбекистана. - Ташкент, Х988. - С. 306-307.

33. Арипов А.Н., Фесенко Л.М., Кадыров Б.А. и др. Способ репарации клеточных мембран печени фосфолишщными препаратами // Тезисы научных сообщений 1У съезда физиологов Узбекистана. -Ташкент, IS88. - С. 6-7.

34. Арипов А.Н. Состояние монооксигеназной системы печени при токсическом гелиотриновом гепатите // Патофизиологические аспекты патологии печени. - Ташкент, 1988. - С. 15-19.

35. Унифицированные метода диагностики я биохимические критерии выздоровления при хронических гепатитах у детей. Методические рекомендации (Арипов A.B. и др.). - Ташкент, 1989. - С.1-35.

Автор считает своим припиши долгом выразить глубокую благодарность научным консультантам члеп-корреспопденту АМН СССР, ирофессору А.И.Арчакову п доктору медицинских наук, профессору Т.А.Даиипову за помощь в выборе научного направления п постоянное внимание к работе, а также сотрудникам НИИ ФШ НЗ РСССР, НИИ педиатр-" НЗ УзССР, кафедры биохимии МШ 2-го МОЕМ! им.Н.И.Пирогова и ЯХРВ АН УзССР д.б.н. Г.И.Бачмановой, к.б.н. Н.П.КанаевоЯ, н.б.н. З.Д.Скоцеляс, к.м.н. Б.А.Каднрову, д.х.н. А.И.Глущенковой, к.х.н. А.Ш..'.самухамсдову и др., принявшим участке в проведении совместных исследований.