Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительное изучение репарирущей активности альбумин-билирубинового конъюгата и нековалентного альбумин-билирубинового комплекса при токсическом повреждении печени и ее регенерации.

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное изучение репарирущей активности альбумин-билирубинового конъюгата и нековалентного альбумин-билирубинового комплекса при токсическом повреждении печени и ее регенерации."

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИЙ РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. Н.И.ПИРОГОВА

На правах рукописи О 7 УДК 616.36-003.93/082/:616.36-003.93-092

ПОПОВ Андрей Александрович

Сравнительное изучение репарирувдей активности альбумин-билирубинового конъшгата и нековалентного альбумин-Оширубинового комплекса при токсическом повреждении печени и ее регенерации.

03.00.04 - биологическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994

Работа выполнена в Российском государственном медицинском университете им. Н.И.Пирогова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Бачманова Галина Ивановна.

Официальные оппоненты: доктор биологических, наук, профессор Савина Марина Ивановна, доктор биологических наук, профессор Карякин Александр Вадимович

Ведущая организация: Институт питания РАМН.

Защита состоится .............. 1994 г.

в ... часов на заседании специализированного Ученого Совета К 084.14.05 РГМУ им. Н.И.Пирогова по адресу: 117437, Москва, ул.Островитянова, I.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РШУ им.Н.И.Пирогова.

Автореферат разослан .............. 1994 г.

Ученый секретарь специализированного Ученого Совета, кандидат медицинских наук,

доцент Клушина Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Состояния, при которых наблюдается массивное поражение печеночной ткани, сопровождающееся глубоким угнетением метаболических процессов и, соответственно, нарушением функций всего организма, часто встречаются в современной медицине. Причины их могут быть различны: обширная травма, удаление значительных участков печеночной ткани при массивных резекциях, развитие острых некрозов вследствие ишемии или токсических поражений органа. Последние стоят на одном из первых мест по своей клинической значимости вследствие тяжести поражения печени и распространенности. Летальность при подобных состояниях, особенно при развитии острой печеночной недостаточности и печеночной кош, остается на чрезвычайно высоком уровне и достигает 70-90% (Губский Ю.А.,1989). Современные методы лечения (в/в инфузии, обменное переливание крови, гемодиализ, гемосорбция, лимфосорбция и др.), направленные на дето-ксикацию организма и улучшение функции пораженной печени, не всегда эффективны, поскольку не влияют на одно из начальных звеньев патогенеза заболевания, а именно - снижение количества функционирующих гепатоцитов.

Вместе с тем, в подавляющем большинстве случаев изменения в печеночной ткани не носят необратимый характер. В основе этой обратимости лежит способность печени выполнять свои функции по поддержанию гомеостаза минимальным объемом функционирующей паренхимы, а также восстанавливать утраченную массу гепатоцитов при определенных благоприятных условиях.

Перспективным направлением в терапии состояний, сопровождающихся потерей значительных участков функционирующей паренхимы пе-

чени, является использование природных факторов роста печени или их искусственных аналогов для ускорения репаративной регенерации печени.

Однако, до сих пор исследования в данной области были ограничены рамками эксперимента, поскольку использовались полуочищенные факторы роста (Сванадзе Н.Л.,1984, Francavilla A.et al.,1986, Zhigiang Y. et al.,1990). Использование индивидуальных веществ -промоторов пролиферативной активности гепатоцитов в большой степени ограничивается сложностью и высокой стоимостью их получения.

Необходимость поиска новых соединений, обладающих способностью эффективно стимулировать репарацию печеночной ткани при ее поражении определяет актуальность использования с этой целью синтезированных аналогов одного из факторов роста печени, обнаруживаемого у животных и человека и являющегося альбумин-бшщрубино-вым комплексом (Diaz-Gil J.J. et al.,1987, 1989). Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилась оценка репариругацей активности альбумин-билирубинового комплекса при токсическом поражении печени крыс и возможности разработки на его основе препаратов для лечения заболеваний печени.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Синтезировать ковалентный и нековалентный комплексы билирубина с сывороточным альбумином животных и человека.

2. Оценить активность биосинтеза ДНК и белка у крыс после 30% ГЭ под влиянием препаратов альбумин-билирубинового комплекса.

3. Изучить влияние препаратов альбумин-билирубинового компле-

кса на микросомальную монооксигеназную систему печени крыс при токсическом поражении печени, вызванном четыреххлористым углеродом.

4. Оценить действие препаратов альбумин-билирубинового комплекса на активность сывороточных ферментов у крыс при токсическом поражении печени, вызванном четыреххлористым углеродом.

5. Исследовать участие препаратов альбумин-билирубинового комплекса в процессах биосинтеза ДНК и репарации повреждений ДНК в печени крыс при токсическом поражении печени, вызванном четыреххлористым углеродом.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Научная новизна работы заключается в том, что впервые проведено сравнительное изучение репарируыцей активности полученных в лабораторных условиях аналогов природного фактора роста печени -нековалентного альбумин-билирубинового комплекса и альбумин-би-лирубинового конъюгата. Выявлена зависимость репарируюцей активности от вида связывания альбумина и билирубина в комплексе. Впервые показано, что препарат нековалентного альбумин-билирубинового комплекса при однократном в/в введении способствовал репарации поврежденных мембран и восстановлению состава и функциональной активности ферментов монооксигеназной системы микросом печени у крыс с токсическим гепатитом, индуцированным четыреххлористым углеродом. Показано, что введение препарата крысам приводило к эффективной репарации однонитевых разрывов в ДНК, вызванных действием гепатотоксина.

Результаты исследований, полученные в работе, являются экспериментальным обоснованием для разработки лекарственного препарата на основе альбумин-билирубинового комплекса для лечения за-

Оолеваний печени.

Апробация работы. Результаты проведенных иследований и положения диссертации докладывались и обсуждались на совместных научно-практических конференциях кафедры биохимии МВФ РГМУ им. Н.И.Шро-гова и лабораторий Института биомедицинской химии РАМН (Москва, 1992, 1993) и на 7-й международной конференции "Цитохром Р-450: биохимия и биофизика" (Москва, 1992).

Публикации. По теме дисертации опубликовано 4 печатные работы. Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на ... страницах машинописного текста и состоит из введения, аналитического обзора литературы, методического раздела, главы, содержащей изложение результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего ... источников. Работа содержит 5 таблиц и 13 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I.Материалы и методы исследования.

Работа выполнена на 825 белых беспородных крысах-самцах массой 100-120 г. В качестве экспериментальной модели использовалась модель острого токсического гепатита, вызванного введением гепа-тотоксина четыреххлористого углерода. CCI^ вводили животным вну-трибршшшо в дозе 0,2 мл/100 г массы однократно.

В экспериментах in vitro забой животных производили через 24 ч после введения гепатотоксина.

В экспериментах in vivo терапевтический эффект препаратов альбумин-билирубинового комплекса оценивали после в/в введения препаратов по двум различным схемам. На первом этапе работы ис-

пользовали схему, ранее применявшуюся в нашей лаборатории для оценки терапевтической эффективности фосфолипидннх препаратов при остром токсическом гепатите (Bachmanova Q.I. et al.,1989, Li V.S. et al.,1992). Препараты вводили в/в через 24, 48 и 72 ч после отравления СС14 в дозах 0.8, 8, 40 и 80 мкг на 100 г массы тела, их эффективность оценивали через 24 ч после последнего введения препаратов. На втором этапе работы препараты вводили в/в однократно через 18 ч после отравления, их эффективность оценивали через 64 ч после введения гепатотоксина.

Для оценки стимуляции препаратами АБ комплекса ДНК- и белок-синтезирующей активности в регенерирующей печени использовали модель частичной гепатэктомии по Хиггинсу и Андерсону (1931) с удалением 30% паренхимы печени. Препараты вводили в/в сразу после проведения резекции и их эффект оценивали через 24 ч после операции.

В работе использовали фракцию микросом печени крыс (Карузина и др., 1979). Содержание цитохромов Р-450 и Ь5 измеряли спектро-фотометрически по методу Omura, Sato (1964). Инактивацию цитохро-ма Р-450 в микросомах определяли путем регистрации спектров поглощения гемопротеина по дифференциальной схеме после восстановления дитионитом и пропускания СО. Запись спектров проводили через каждые 4 мин в течение 20 мин при 37°С (Бачманова и др., 1981).

Скорость NADPH-зависимого и-деметилирования диметиланилина и n-гидроксилирования анилина определяли по количеству образовавшегося формальдегида и п-аминофенола, соответственно (Арчаков, Карузина, 1973). Измерение активностей NADFH-цитохром с редуктазы и ПАШ-феррицианид редуктазы проводили по методу Philips and Lang-

don (1962). Содержание бежа определяли по методу Lowry (1951).

Выделение ДНК гомогената и фракции ядер печени проводили по методу Ц&шдта и Тангаузера (1945), количество ДНК в пробе рассчитывали согласно Спирину (1958). Определение истинных одиночных разрывов ДНК проводили методом центрифугирования в градиенте плотности нейтральной сахарозы в условиях высокой ионной силы (Farzaneh et al., 1982, Дурдыева и др.,1987).

Для определения уровня биосинтеза тотальной ДНК за 2 ч до забоя животным вводили ^-тимидин (удельная активность 62 мКи/ммоль) из расчета 50 мкКи на 100 г массы тела. Радиоактивность образцов измеряли на жидкостном сцинтилляционном счетчике "1219 Raokbeta" (Швеция). Равномерность захвата "^Н-тимидина гепа-тоцитами в контрольной и опытных группах животных контролировалась по радиоактивности в кислоторастворимой фракции гомогената печени.

Раздельное изучение уровней репаративного и репликативного биосинтеза ДНК проводили с использованием кофеина (ингибирует ре-паративный синтез, вычленяя репликативный (Fridlos Р. et al., 1978)) и оксимочевины (ингибирует репликативный синтез, вычленяя репаративный (Smith с.A. et al.,1976)). Кофеин вводили внутрибрю-пшнно в дозе 0,25 мг на 100 г массы тела за 60 мин до введения 14С-тимидина, оксимочевину- в дозе 10 мг на 100 г массы тела за 20 мин до введения 14С-тимидина. 14С-тимидин вводили внутрибрю-шинно в дозе 40 мкКи на 100 г массы тела животного за 2 ч до забоя. Дальнейшее определение уровней репликативного и репаративного биосинтеза ДНК проводили, как описано для определения уровня биосинтеза тотальной ДНК.

Для определения уровня биосинтеза бежа за 10 мин до забоя

животным вводили 14С-фенилаланин в дозе 50 мкКи на 100 г массы тела. Печень извлекали, гомогенизировали и осаждали белок гомоге-нат.а 10% ТХУ, осадок наносили на миллипоровые фильтры, кислото-растворимые меченые соединения удаляли промыванием 5% ТХУ. Фильтры помещали в систему РРО-РОРОР-толуол и радиоактивность проб измеряли на жидкостном сцинтилляционном счетчике "Rackbeta 1219" (Швеция).

Активности аланиновой (АЛТ) и аспарагиновой (ACT) аминотран-сфераз и щелочной фосфатазы сыворотки крови крыс определяли с помощью диагностического набора фирмы "Boehringer Marmgheim" (ФРГ) на автоанализаторе ГР-900 фирмы "Labsystem" (Финляндия).

Комплексы билирубина с крысиным или бычьим сывороточными альбуминами получали по методу Woolley и Hunter (1970).

Получение альбумин-билирубиновых комплексов на основе человеческого плацентарного сывороточного альбумина (ЧПСА) производили следующим образом. На колонку (1,5x30 см) с сефадексом G-25, уравновешенную водой, наносили 5 мл 20% раствора коммерческого препарата ЧПСА и элшровали водой со скоростью 10 мл/ч, контролируя выход белка по поглощению при 280 нм. В результате выделяли 2 фракции белкового пика: фракцию А объемом 7 мл (светло-желтая) и фракцию Б объемом 3 мл (бесцветная). Фракцию А использовали в дальнейшей работе. Фракцию А (5 мл) разбавляли водой до 20 мл и доводили рН до 4,7 с помощью 2 н hoi. к полученному раствору добавляли 35 мг билирубина, а затем при постоянном перемешивании в течение I ч при 20°С 40 мг 1-этил-3-(3- диметиламинопропил)карбо-диимида (ЭДК) порциями по 3-4 мг, поддерживая рН 4,7 с помощью 2 н Hci, и оставляли на 20 ч при 37°С при постоянном перемешивании. Смесь центрифугировали в течение 10 мин при 12000 g для удаления

несвязавшегося билирубина и супернатант переносили на колонку (40x2 см) с тойоперлом ГО-55 (fine), уравновешенную водой. Элюи-рование водой осуществлялось со скоростью 10 мл/ч. В результате получали 3 фракции - окрашенную (желто-зеленого цвета), содержащую преимущественно АБк, бесцветную, содержащую немодифицирован-ный альбумин, и темно-зеленую, содержащую не связанный с белком окисленный билирубин. Получение нековалентного альбумин-билирубинового комплекса проводили аналогично предыдущему эксперименту, но без ЭДК. В результате получали 2 белковые фракции: окрашенную, содержащую АБн/к и бесцветную, содержащую немодифици-рованный альбумин, а также окрашенную в темно- зеленый цвет фракцию, содержащую несвязавшийся с белком окисленный билирубин. Полученные препараты АБ комплексов лиофилизировали и хранили при 4°С. Перед употреблением препараты растворяли в дистиллированной

воде и определяли концентрацию ЧПСА, используя коэффициент экс-т ч,

тинции E2QQ= 5,5 (Beaven G.H. et al.,1974).

Статистическая обработка данных проводилась методом вариационной статистики с использованием критерия Стыадента.

2.Основные результаты исследования g их обсуждение.

На первом этапе работы нами была исследована репарирувдая активность нековалентных комплексов билирубина с крысиным (АБ/КСА) и бычьим (АБ/БСА) сывороточными альбуминами. Показано, что АБ/КСА не только увеличивает включение ^С-фенилаланина в белки печени и %-тимидина в ДНК ядер клеток печени при частичной гепатэктомии, но и способствует стабилизации мембран эндоплазма-тического ретикулума в печени крыс с токсическим гепатитом. На

данном этапе была определена эффективная доза, выбран путь введения (в/в) и выявлена возможность стимуляции регенерации печени у крыс после частичной гепатэктомии (ЧГЭ) не только комплексом на основе сингенного (крысиного), но и аллогенного (бычьего) альбумина, что позволило нам перейти ко второму этапу работы: изучению репарирувдей активности комплексов на основе человеческого плацентарного сывороточного альбумина . Выбор ЧПСА в качестве основы для получения нековалентного АБ комплекса (АБн/к) и АБ конъюгата (АБк) обоснован тем, что ЧПСА разрешен к применению в клинической практике и выпускается рядом предприятий службы крови страны.

Исследовалось влияние препаратов АБ комплекса на скорость инактивации цитохрома Р-450 в микросомах, поврежденных СС14, с использованием различного молярного соотношения препарата и цитохрома ( от 1:1 до 100:1 ). Результаты исследования приведены на рис. I. Как видно из рисунков, при изменении соотношения АБ/Р-450 (моль/моль) от I до 100 не наблюдалось сколько-нибудь заметного влияния АБ комплексов на инактивацию гемопротеина, что свидетельствует о том, что препараты не способны непосредственно стабилизировать микросомальный цитохром Р-450.

Исследовалось влияние препаратов АБ комплекса на скорость инактивации микросомального цитохрома Р-450 печени крыс с токсическим гепатитом, вызванным СС14. Результаты исследования приведены на рис.2. Отравление СС14 приводило к переходу значительной части Р-450 в его неактивную форму, Р-420 , и быстрой инактивации оставшегося Р-450. Введение препаратов АБ комплексов значительно снижало степень перехода Р-450 в неактивную форму и замедляло инактивацию Р-450, при этом наибольший эффект оказывал АБн/к.

Поскольку инактивация цитохрома Р-450 связана с нарушением

ДЛ<ш_чп/нмаль Р-+60

/нмоль Р-450

Т" в 12 1'в 20

Время шадгбаша^ мин — • — I —0—2 -1--3 — П— *

Я а 12 1в Время ннс^бАцни, шш

---X —(¡—г--1—3 —О —4

Рис Л. Инактивация цитохрома Р-450 в микросомах печени крыс с острым токсическим гепатитом при добавлении в инкубационную смесь препаратов АБк (А) и АБн/к (Б).

Токсический гепатит вызывали в/б введением СС14 в дозе 0,2 мл на 100 г массы тела, препараты микросом получали через 24 ч после отравления.

Инкубационная смесь содержала 0,33 нмоль цитохрома Р-450 в I мл 100 мМ трис-Н01 буфера, рН 7,4. Микросомы предварительно инкубировались с препаратом АБ комплекса при различном молярном соотношении препарата и гемопротеина в течение 30 мин при 25°С. Дифференциальные спектры восстановленного дитионитом СО-комплекса цитохрома Р-450 регистрировали при 37°С в течение 20 мин с интервалом 4 мин. 1-МКС-СС14; 2-МКС-СС14 + 0,33 нмоль/мл АБ; 3- МКС-СС14 + 3,3 НМОЛЬ/МЛ АБ; 4-МКС-СС14 + 33 нмоль/мл АБ.

-0.0

Рис.2. Инактивация цитохрома Р-450 микросом печени крыс, отравленных СС14 и получавших препараты АБк и АБн/к . Токсический гепатит вызывали в/0 введением 001^ в дозе 0,2 мл на 100 г массы тела. Препараты АБк или АБн/к вводили в/в в дозе 80 мкг на 100 г массы тела через 18 ч после отравления, препараты микросом получали через 64 ч после отравления.

Инкубационная смесь содержала 0,33 нмоль цитохрома Р-450 в I мл 100 мМ трис-Н01 буфера, рН 7,4. Дифференциальные спектры восстановленного дитионитом СО-комплекса цитохрома Р-450 регистрировали при 37°С в течение 20 мин с интервалом 4 мин. 1-МКС-С014; 2-МКС-СС14+АБк; 3-МКС-СС14+АБн/к; 4-МКС-Контроль.

структуры мембран эндоплазматического ретикулума печени и повреждением апофврмента продуктами горекисного окисления липидов и вы-сокореакционноспособными метаболитами четыреххлористого углерода, уменьшение степени перехода гемопротеина в неактивную форму и замедление его инактивации в микросомах печени крыс, получавших препараты АБн/к , по-видимому, связано с восстановлением структуры мембран микросом и стабилизацией цитохрома Р-450 в мембране.

Исследовали влияние препаратов АБ комплексов на удельное содержание и функциональную активность ферментов монооксигеназной

системы микросом печени крыс с токсическим гепатитом. Препараты АБ комплексов вводили внутривенно в дозе 80 мкг на 100 г массы тела через 18 ч после отравления. Через 64 ч после отравления животных забивали и получали микросомальную фракцию печени. Определяли содержание бежа, цитохромов Р-450 и ь5, а также активности НАДН-феррицианид- и НАДФН-цитохром с редуктаз, ДМА-Ы-деметилазы и А-п-гидроксилазы. Результаты экспериментов представлены в таблицах 1-3. Отравление крыс СС14 приводило к значительному падению удельного содержания цитохромов Р-450 и ь5 в микросомах печени (на 44 и 36^6, соответственно) (табл.1). Введение АБн/к практически возвратило указанные показатели к уровню интактных животных, тогда как АБк не оказал заметного влияния на удельное содер-

Таблица I.

Удельное содержание цитохромов Р-450 и ь5 микросом печени крыс, отравленных и получавших препараты АБ комплексов (нмоль х мг-1 белка микросом).

Компонент Контроль СС14 СС1,+АБк 4 СС1,+АБн/к 4

микросом п=Ю п=10 п=10 п=11

Цитохром 0,79±0,06 0,44±0,06 0,53±0,07 ** 0,77±0,09

Р-450 100% 56« 67% 97%

Цитохром ** 0,59±0,06 0,38±0,04 0,43±0,03 * 0,52±0,04

Ь5 10056 64/8 73% 88%

*р<0,02, ** р<0,01, *** р<0,001 по отношению к показателям у крыс с острым токсическим гепатитом, не получавшим препараты АБ комплексов.

жание микросомальных гемопротеинов. У отравленных животных резко снижались (в пересчете на мг белка) активности НАДН-феррицианид редуктазы и НАДФН-цитохром с редуктазы (табл.2). После введения АБ н/к активности исследованных ферментов возвращались к контрольному уровню (101 и 98%, соответственно); некоторое повышение показателей в группе получавших АБк не было статистически достоверным.

Таблица 2.

Активность НАДФН-цитохром с редуктазы ( мкмоль х мин-1 х мг-1 белка микросом) и НАДН-феррицианид редуктазы ( мкмоль х мин-1 х мг-1 белка микросом) в микросомах печени крыс, отравленных СС14 и получавших препараты АБ комплексов.

Фермент Контроль С014 СС1.+АБК 4 СС14+АБн/к

п=Ю П=10 п=10 п=11

**# *

НАДФН-ФП 0,311 0,188 0,263 0,314

±0,026 ±0,020 ±0,058 ±0,039

100% 60% 85% 101%

** *

НАДН-ФП 3,97±0,37 2,36±0,32 2,74±0,36 3,89±0,43

100% 59% 69% 98%

*р<0,02, **р<0,01, **#р<0,002 по отношению к показателям у крыс с острым токсическим гепатитом, не получавшим препараты АБ комплексов.

Мы наблюдали резкое снижение активностей ДМА-ы-деметилазы и анилин-гг-гидроксилазы (на 60 и 48%, соответственно) у животных, отравленных СС14 (таСл.З). Введение АБн/к приводило к значительному повышению активности ДМА-н-деметилазы по сравнению с группой отравленных животных, не получавших препараты (на 117 и 80%, соответственно), небольшое повышение (на 42$) этого показателя в

груше животных, получавших АБк, не было статистически достоверным. Введение АБн/к приводило к выраженному повышению активности анилин-п-гидроксилазы микросом печени крыс, отравленных СС14 (на 130% по сравнению с группой отравленных животных, не получавших препараты), введение АБк было значительно менее эффективным. Дан-

Таблица 3.

Скорость НАДФН-зависимого окисления диметиланилина и анилина в микросомах печени крыс, отравленных СС14 и получавших препараты АБ комплексов ( рассчитано в нмоль продукта х мин-1 х мг-1 белка микросом.

Субстрат Контроль СС14 СС14+АБк СС14+АБН/К

п=Ю п=8 п=10 п=11

Диметил- 5,33*** 2,12 3,02 4,61*

анилин ± 0,53 ± 0,26 ± 0,71 ± 0,86

10035 40% 57% 86%

** *

Анилин 0,71 0,37 0,48 0,85

± 0,07 ± 0,05 ± 0,13 ± 0,17

100« 52$ 68% 120%

*р<0,05, ♦*р<0,01, ***р<0,001 по отношению к показателям у крыс с острым токсическим гепатитом, не получавшим препараты АБ комплексов.

ные, полученные при анализе эффектов нековалентного АБ комплекса на удельное содержание и активность ферментов монооксигеназной системы микросом печени крыс при отравлении четыреххлористым углеродом позволяют предполагать, что происходит быстрая замена по-

врежденных молекул ферментов на белковые компоненты микросомаль-ной моноокоигеназной системы, образованные 4е novo.

Токсический гепатит, вызываемый cci4, сопрововдается повреждением мембранных систем' гепатоцитов. Об этом свидетельствуют изменения показателей монооксигеназной системы печени крыс и выраженная гиперфёрментемия, отражающая нарушение целостности плазматической мембраны гепатоцитов. Представляло интерес изучить влияние исследуемых препаратов на активность некоторых ферментов сыворотки крови для оценки степени токсического повреждения клеток печени cci4 и эффективности применяемой терапии. С этой целью были выбраны ферменты: аспарагиновая (ACT) и аланиновая (AJIT) аминотрансферазы и щелочная фосфатаза (Щ£>). Данные по влиянию препаратов на активность ферментов сыворотки крови крыс с острым токсическим гепатитом представлены на рис.3. Видно, что остров поражение печени СС14 сопровождается резким повышением уровней ACT и АЛТ и умеренным повышением уровня ЩФ, что отражает нарушение целостности мембранных структур клеток печени и уровень вну-трипеченочного холестаза. Введение АБн/к существенно и в равной степени снизило ферментемию, в то время как введение АВк не повлияло на показатели активностей сывороточных ферментов.

Возможны несколько способов восстановления структурно-функционального состояния микросомальной мембраны при повреждении печени гепатотоксинами. К ним можно отнести блокирование активности некоторых ферментных систем, участвующих в усугублении прямого повреждающего действия гепатотропных ядов - фосфолипаз и гид-ролаз, блокирование ионных каналов, через которые в клетку поступают Na+ и Са2+, изменяющие внутриклеточный гомеостаз и, наконец, стимуляция экспрессии генов, кодирующих белки и нуклеопротеины,

* К IWHl'pVAV

ИИ Контроль РДССЦ ЩЩсСЦ+АБк [Щ СС14+АБя/к

Рис.3. Уровень ферментов сыворотки крови у крыс, отравленных CG1¿ и получавших препараты АБ комплексов.

Токсический гепатит вызывали в/б введением СС14 в дозе 0,2 мл на 100 г массы тела. Препараты АБк, АБн/к вводили в/в однократно через 18 ч после отравления в дозе 80 мкг на юо г массы тела, сыворотку крови получали через 64 ч после отравления.

необходимые для скорейшей коррекции происшедших в клетках повреждений. Кроме того, необходима замена поврежденных и инактивиро-ванных ферментов, то есть быстрая наработка их de novo, что предполагает возможность полноценного энергетического обеспечения этого процесса. По-видимому, по крайней мере часть этих внутриклеточных процессов будет зависеть от состояния генетического аппарата клетки, который, в свою очередь также подвержен свободно-радикальной атаке метаболитов С014 и нуздается в элиминации повреждений (Sipes I.G., Gandilíi A.J., 1982.). Для оценки возможного вклада в эффект препаратов воздействия на генетический аппарат клеток печени нами проведены исследования влияния АБ комплексов на биосинтез ДНК и некоторые показатели активности системы репарации ДНК у крыс при поражении печени четыреххлористым углеродом.

У отравленных животных наблюдался высокий уровень включения ^-тимидина в ДНК ядер печени, составивший 460% по отношению к контролю (интактше животные). Этот показатель в группах, получавших АБк или АБн/к составил, соответственно, 414 и 462% по отношению к группе интактных животных, уровень биосинтеза ДНК у которых принят за 100% . Достаточно высокий уровень синтеза ДНК свидетельствует о массивном поражении печеночной ткани при сохранении способности ее к репарации полученных повреждений. Как известно, суммарный синтез ДНК определяется, в основном, двумя разновидностями синтеза ДНК: репликативным, или синтезом ДНК de novo, и репаративным, или внеплановым, отражающим репарацию повреведенных молекул ДНК (Жеребченко П.Д., Савич А.В.,1978).

Известно, что при отравлении cci4 повреждаются не только мембраны эндоплазматического ретикулума, но и структурные компоненты генетического аппарата клетки, в том числе сама ДНК (Sipes 1.0., Gandilfi A.J.,1982, Zimmermann H.J.,19S2). Нами проведено изучение влияния препаратов АБ комплекса на активность системы репарации поврежденной ДНК при токсическом гепатите, вызванном СС14. В качестве показателя, косвенно отражающего активность системы репарации ДНК, использовали соотношение прироста репаратив-ного и репликативного биосинтеза ДНК в ядрах печени у крыс, отравленных cci4. Результаты экспериментов с ингибированием репликативного биосинтеза оксимочевиной и ингибированием репаративного биосинтеза кофеином показали, что соотношение прироста репаративного и репликативного биосинтеза ДНК у крыс с острым токсическим гепатитом относительно уровней биосинтеза ДНК у интактных животных изменяется в зависимости от того, какой препарат они получали (рис.4). Так, равномерное увеличение обоих видов биосинтеза

ДНК отмечено у отравленных животных, не получавших никаких препаратов или получавших АБк. В то же время в группе животных, получавших АБн/к, хорошо заметно увеличение прироста репаративного биосинтеза ДНК по сравнению с репликативным. Полученные данные свидетельствуют о том, что стимуляция репарации ДНК в ядрах клеток печени отравленных животных была выражена в большей степени у крыс, получавших АБн/к.

Liil Рюартшви* сшя &Ш 1*<иккатмявШ1 авт

Рис.4. Влияние АБк и АБн/к на репаративный и репликативный биосинтез ДНК в ядрах клеток печени крыс с токсическим гепатитом, вызванным cci^.

СС14 вводили в/б в дозе 0,2 мл на 100 г массы тела. Црепараты АБк, АБн/к вводили в/в однократно в дозе 80 мкг на 100 г массы тела через 18 ч после отравления. Репаративный или репликативный биосинтез ДНК оценивали через 64 ч после отравления по включению 14С-тимидина в ДНК ядер клеток печени после в/б введения оксимочевины или кофеина, соответственно.

Для прямого определения повреждения вторичной структуры ДНК типа одиночных разрывов мы использовали метод центрифугирования в градиенте плотности нейтральной сахарозы в условиях высокой ионной силы в модификации Э.Д.Дурдыевой и соавт. Известно, что при

воздействии повреждающими агентами в молекуле ДНК образуется множество одиночных разрывов, что приводит к исчезновению суперспи-рализованной конформации ДНК и проявляется в минимальной седимен-тационной подвижности нуклеоида (Дурдыева Э.Д. и др., 1987). На рис.5 показаны профили седиментации в градиенте плотности сахарозы ДНК из клеток печени крыс с токсическим гепатитом и контрольных животных. У крыс, отравленных пик седиментации ДНК значительно сдвинут вправо, в сторону более легких фракций градиента плотности сахарозы (Ш8-23) по сравнению с пиком , определяемым у интактных животных (фракция Ш4), что свидетельствует о том, что

% от оДдея рцнмикмюсги

X от оОвгея раджаптаносш

э & г I 11 » la i, i, si са и номер (джкош --1--Контроль — • — CCI ^

1 3 В Т 1 11 11 11 IT II 11 и и

номер фршзшм -CCi4 +-АБК —СС14 +АБм/г

Рис.5.Профили седиментации ДНК ядер из клеток печени крыс, отравленных СС14 и получавших препараты АБ комплексов.

СС14 вводили в/б в дозе 0,2 мл на 100 г массы тела. Препараты АБк, АБн/к вводили в/в однократно в дозе 80 мкг/100 г массы тела через 18 ч после отравления. Ядра печеночных клеток выделяли через 64 ч после отравления. Фракционирование ДНК проводили в 5-20% градиенте нейтральной сахарозы в условиях высокой ионной силы.

вся ДНК находится в сильно поврежденном, релаксированном состоянии вследствие множественных одиночных разрывов в ней (рис.5,А).

Пик профиля седиментации ДНК в груше животных, отравленных СС14 и получавших АБк, располагается во фракциях 21-22 (совпадает с профилем отравленных животных, не получавших препараты), что говорит об отсутствии стимуляции репарации ДНК в этой груше животных (рис.5,). Профиль седиментации в груше отравленных животных, получавших АБн/к возвращается к контрольному (пик во фракциях 14-15), что свидетельствует о практически полной репарации ДНК.

Таким образом, наряду с высоким уровнем биосинтеза ДНК во всех грушах отравленных животных, нами выявлено усиление процессов репарации повреждений ДНК типа одиночных разрывов, индуцируемых СС14 в груше животных, получавших АВн/к, что может быть связано как с наличием более высокого уровня ферментов репарации, так и с изменениями системы регуляции активности этих ферментов.

Эффект препаратов АБ комплексов на биосинтез белка и ДНК после 30% ГЭ оказался сходным для каждого препарата (рис.6). В сравнении с группой гепатэктомированных животных, не получавших препараты, введение АБк приводило к падению уровня биосинтеза белка (рис.6,А) и ДНК (рис.6,Б), а введение АБн/к увеличивало эти показатели в среднем на 60%. Противоположно направленное воздействие препаратов, вероятно обусловлено различным характером связи между альбумином и билирубином в испытуемых АБ комплексах, отражающемся в их конформациях.

Сравнение полученных показателей с данными аналогичных экспериментов, полученными на первом этапе работы, показало, что в условиях ЧГЭ нековалентный комплекс с билирубином на основе ЧПСА менее эффективен как в отношении биосинтеза белка, так и биосинтеза ДНК по сравнению с подобным комплексом на основе КСА. Можно

Рис.6. Влияние препаратов АБк, АБн/к на биосинтез белка и ДНК

в печени крыс после 30% ЧГЭ. Препараты АЕк, АБн/к вводили в/в в дозе 80 мкг/100 г массы тела сразу после выполнения резекции печени. Биосинтез бежа оценивали по включению 14С-фенилаланина в белки клеток печени, биосинтез ДНК оценивали по включению 14С-тимидина в ДНК ядер клеток печени через 24 ч после ЧГЭ.

предположить, что указанные различия в эффективности препаратов обусловлены различиями в связывании низкомолекулярных лигандов альбуминами, полученными из сыворотки крови разных видов животных (РапзеЬзЬайат М.И. а1.,1992).

Результаты изучения выживаемости животных при остром токсическом гепатите, вызванном СС14, приведены в табл.4.

Таблица 4.

Выживаемость животных при остром токсическом гепатите.

Группа животных 0.гепатит п=10 0.гепатит + АБк п=Ю 0.гепатит + АБн/к п=П

Выживаемость, % 52 ± 4 65 ± 5 56 ± 4

Мы не выявили достоверных различий в выживаемости в грушах животных, получавших испытываемые препараты по сравнению с группой животных, не получавших эти препараты. Вероятно, введение препаратов на высоте проявлений повреждающего действия СС14 способствовало ускорению репаративных процессов в организме тех животных, которые выживали к моменту введения препаратов, но было не в состоянии купировать необратимые последствия интоксикации у животных, проявляющих повышенную индивидуальную чувствительность к СС14-

ВЫВОДЫ:

1. Анализ репарирущей активности различных ковалентных и не-ковалентных комплексов билирубина и сывороточных альбуминов животных и человека показал, что нековалентные АБ комплексы способны стимулировать репаративную регенерацию печени независимо от природы альбумина, входящего в состав комплекса. АБ коныогат обладал значительно менее выраженным действием.

2. Нековалентный АБ комплекс на основе ЧПСА при однократном внутривенном введении крысам с острым токсическим гепатитом, индуцированным СС14, стабилизирует цитохром Р-450 в мембранах эн-доплазматического ретикулума печени, восстанавливает удельное содержание и функциональную активность ферментов микросомальной мо-нооксигеназной системы печени и способствует снижению уровня АСТ, АЛТ и ЩФ в сыворотке крови.

3. Нековалентный АБ комплекс на основе ЧПСА при однократном внутривенном введении стимулирует синтез ДНК в гепатоцитах и репарацию однонитевых разрывов ядерной ДНК печени крыс, отравленных

cci4, а также биосинтез ДНК и бежа в печени крыс, подвергнутых 30% гепатэктомии.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Influenoe of albumin-bilirubin complexes on the liver microsomal monooxygenase system and DNA synthesis in rats with CCl^-induced hepatitis. / A.A.Popov, 7.S.Li, Y.Kh.Mitina, B.A.Klyashchitskii, O.Yu.Abakumova, L.M.Fedorova, and G.I.Bachma-nova //Cytoohrome P-450: biochemistry and biophysics. Proo. of the 7-th International Conference. A.I.Archakov, G.I.Bachmanova, eds. - INCO-TNC, Joint Stock Co.,Moscow - 1992 - P. 611-613.

2. Elaboration and testing of a phospholipid preparation for the reparation of liver cell membranes injured by raembranotoxio agents. / Y.S.Li, G.I.Bachmanova, A.A.Popov, J.-Ch.Hager, R.J.H.Niemann and K.-J.Gundermann // Там же, P. 561-563.

3. The influence of albumin-bilirubin complexes on the liver microsomal monooxygenase system in rats with COl^-induced hepatitis. / A.A.Popov, Y.S.Li, Y.Kh.Mitina, B.A.Klyashchitskii // 7-th International Conference "Biochemistry and biophysics of cytochrome P-450; structure and function, biotechnological and ecological aspects". Abstracts. - 1992 - P.124.

4. Elaboration and testing of a phospholipid preparations for the reparation of liver cell membranes injured by membranotoxio agents. / Y.S.Li, G.I.Bachmanova, A.A.Popov, J.-Ch.Hager, R.J.H.Niemann and K.-J.Gundermann // Там же, P. 115-