Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Потенциал-зависимые свойства и структура стафилотоксинового канала в ВЛМ

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Потенциал-зависимые свойства и структура стафилотоксинового канала в ВЛМ"



на tipassx руксляои

ШАЛ*ЭА2ЙЙЗЬВ 03СЙСТ2А й СТРУКТУРА с7Л':йЛ}токс;с-г:Есго ШАЛА В ВЛ& •

клh >13* у -í о tí с т "3 по h и 1 гхт'л

забота выполнена в Институте фибиляогии АН УаСС?

Научный руководитель: доктор йво&зпг»скй/ наук Краскдьниксг С. В.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук К. ¡1 Куку^'.И5 '

кандидат наук

У. 3.

Ведущая организация: йнсткту? едтодогий АН СССР

Згскта состоится: " риьео^а. 1У1-Э~з час.

не. ааседаний специализированного Совета К 1Е. 01.01 г.о ваз'-.е диссертаций ка соискание учс-кой степени кандидата каук дри Институте Физиологии й!-УеО'Р;Тапке:;:, улица Нияаоьа 1.)

С диссертацией можо сЕкаок-у.тьсЕ с сиОдксть::-Института Физиологии АН У&ССГ.

Автореферат разослан "И" Мхл^/^Л. -.....г.

Ученьй секретарь " У/у/1 ^

специализированного Совет,¿7/-' Ул доктор Оисхсгкздских нат^/ХУ^^ В. А. Ходзиаматсь

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность теш ■ В настоящее время не вызывает сомнения, что специфические транспортные системы - ионные каналы, определяют и принимают непосредственное участие в процессах рецепции, генерации и передачи нервного импульса и многих других. 3 исследовании этих систем в природных мембранах наибольшие успехи лог-, тигнуты с помошью метода локального отведения тока

(patch-cla.mp), который показал реальность существования ионных каналов и выявил ранее неизвестные стороны их функционирования (Neher , Sakman, 1976; Бреместовский с соавт. , 1985): Содружество ме.»ду электрофизиологией, молекулярной биологией, г-гнноя ин-лэнерией привело к впечатляющим успехам в изучении строения ионных каналов, выяснении взаимосвязи между параметрами каналов и структуры образующих их белков и установлении зависимости функционирования каналов от липидного состава мембран. Однако, несмотря на все эти успехи, еще до конца не ясны ни физико-химические основы управления функционированием ионных каналов, rat размах структурных перестроек каналов при: их переходах между проводящими и непроводящими состояниями. Широкие возможности для получения ответа на эти вопросы предоставляют различные модельные системы, одной из которых является бислойная липидная мембрана (БЛМ). модифицированная белками. В настоящее время известно довольно большое число белков, способных образовывать ионные каналы в БЛМ. Для многих из них уже известен аминокислотный состав и первичная структура, что позволяет создавать адекватные математические и структурные модели образуемых ими ионных каналов .

3 последние годы исследованию свойств каналов, формируемых зтафилотоксином (CT) в природных и модельных мембранах уделяется кристальное внимание. Это связано не только с важностью CT, как основного Фактора патогенности S. aureus, но и с тем, что образу-

rti'j им иоккые каналы в липкдных биглсях является одной из ьесь-» удачных моделей ионных каналов, сукестукаих в 6иомем£рзна>:. рель у задачи вселеддвввдк.

Z&SI& диссертационной раооты явилось изучение строен»;, по-•. ^цкал-зависимости функционировал)« С»-каналов и изшиекиь структуры канала, происходящих при его переходах мезду еостсяки--'.яг.. 2ля достихэюш поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучение свойств СТ-канадов в симметричных и асимметричных 2Ж

С. Исследование потенциад-аавксимого стационарного распределения СТ-калалов по состояниям к кинетики их переходов между состояниями б широком диапазоне экспериментальных условия.

3. Определение возможных структурно-объемных'изменений какала при его переходах между состояниям).

Научная новизна и практическая ценность работы. Обосновывается асимметричное расположение СТ-какала относительно плоскости липидного Оислоя.

Выявлена множественность ■потенциал-индуцируемых малопрово-дяда: состояний CT-каналов.

Обнаружена возможность запоминания информации в такой простой модельной системе, как модифицированная стафплстсксином ЪШ. что несомненно полезно в поникании сложных процессов, связанных с обработкой кнформаши и явлениям,! кратковременного запоминания 2 живых системах , а также при создании г. будушем биозлектсонных устройств.

IIa примере CI-канала расраоотан подход, пезвеля'стй количественно оценивать изменения эффективного радиуса ионных гашв-дов в ЕЛМ при их переходе в мазопроводяаие состояния.

Обнаружение, что потенциал-зависимая кинетика перехода "-каналов в малопроводяже состояния рамедляется с ростом со-

дзрзаная з ЗШ холзстешм .

Установлешз. что потенциал- зш&^роганиш переход ст_-канала открытого -з мялогтрсзоллпие состояния сопоозс::аззется чегна-•-•лтзлькымй. язмепегля'П!' внутреннего сб'ьема канальной структуры.

Золгнзщдав лан:--э углубляют экгшя о структуре ионкнх каналов и в» изменениях поп потеншгя-йндуйароважгых перехода казался иеяду состояний».*

апрс&вдюя ра^-отц. ¡-'атериалы зк-.4рташш докладывались т: Р Огззде ¿¡злолсгоз Узбекистана (Тапкент, ■ 1988!, Еоэ .сжзкш тл.\тсг,иууах ''Яскзкэ каналы '.в биологических. мембранах" (Хаоа-лаг. 1033,1989') и ча лгггяом семинаре Института физиологии ЛИ УзООР.

Публикация. результатов исследования. По материадэм ¿шссео-тации опубликовано б печатных- раоо--*

структура и обтям диссерта-'йи.' , Зйссертаиая .иалаяяна на '._'5 отсан;щах машнописного' текста я состоит, иа введения. глаз, знлзсчавгзпсобзор литературных -данных, описания «етояов к использован:-» млтеокзлсз, изложения а обсуждения получение результатов, зыдодсз л елиека цитированной лэтэоатт?;«,- соззлтаасг-: ¿9 нашэнспааая ла руссам и 88 на иностранных языках.- Диссертация содерлгг сесть таблиц и 50 рисункаь.

ССИЕГЯЛК'Е ШЮСЕРТЛШ^ ММ2Я»ГЫ И !®ХС2Ы ИСС.13 -ГСВАК1; 3 рабстз иопсльзовшиг азьфа-токс.га 5са2пу\сооооиз 'С?) любезно -с^зсстазгзйаьа локтевой '/.. 2. глитзгт • 2еЬг1п5У>г*л, . дополнительно с;£ис«н«кй всзячогагавяоп лзог--легсгра-,&жуощ:сзксГ: з агарсзпоу гел?э'(р1 ¡3,3-5 , с.г г . ;{со:.<атогра$ич-есг?й «юсткз ^ссфалагалхолин (Ж аз -личного «алгкг ! '.тосггатиддлаерлн СйЗ) из мозга бнкз, тетсриэ получала по у.?те -

, оякеаяага Еейгал„со;юн о соозт. (¿981); зсдес7?гйн 31<гза): до1.'5зг;!Г'?агл!Я2зля (ПЗГ) со сродная ;ш<?куллокол .-етсо:'.-

- с -

• Ла): 400 И Г.С-ТО (Scnjchardr, Mur.cn«n): 1C0C (Austrank >reparate); 1E0C, 2000, 4000 (Lopa Chemo); декстрак 15000 -ÍjXO (Icoa Спех;л'.: оотагхнь'й роактивь.' OeSK отечественного гроиЕво^тва rpaaan«! "004", ""ЯЧ" или "43;''."

¿с-ру/роваки^ ВЛМ и и.ч,у--пенке их электрически/; у.арап е-

I5fc¿oí!i;i;c- дх^щщые мембраны (ЕЗД формировали при тегтера-

ту;.2 + i С° двука способам-к : по метолу Мш.-.ери (HueHelft, а:. ,156?) яз 2 Z раствора дйпига ъ н-октан» СО,22 чс.03

ukí'Ci?) я по методу Монтада-Мюллера (Montal. Mueller, 1972) путем сведения конденсированных • я;акдных монослоев (0,75+0,03

i.üvp/cvf:). Омьшаюлле мембрану растворы непрерывно перемешивались о помсеьк Магниткой мевавки. "В "цис" отсек ячейки добавлялся СТ. "Траке"-отсек являлся виртуальной землей, и относительно него указан знак потенциала. Ток принят положительным при движении катионов б этот стоек.

Электрические параметры мембран .измеряли в режиме фиксации /¡отгибала с помоаью изготовленных б лаборатории (на базе микросхем К284УД1А; К544УД1А;) электрометрических усилителей с сопротивлением обратной связи 1Моы - ЮГом в зависимости от условий эксперимента. Время установления "виртуального нуля" на входе электрометрического усилителя в ответ на ступенчатое изменение аалаваемогс потенциала, составляло обычно не более 30 же. В работе использована стандартные хлорсеребрянные электроды сВМЬ'2, которые соединялись с измерительной ячейкой агаровыми мостика««, содержащими l М KCl. •

Смену растворов с в отсеках экспериментальной ячейки осуществлял;; с помодью спаренных сприцев. Изменение ионного состава, pH раствора и концентраций неэлектролитов с о£*кх стсре-. бислоя по : ходу эксперимента • юс:;талос}. ?ак*е njTek» ев<-;к.йс

небольших лгобходкмых лснцеятрирсгалкьх. .-.тлтхсроз. Есгд

специально и« укааанс, то среда сояергсгг 100 мМ КС', - мМ -трисоэи;'; ^угЬер.

''йглсн-акиэнп/ет кзбйратрлгшс-гь ВЛМ оц-гкивааа но '«олам -.в рекоса татлснэв которые-, с учетом зхтжыгл псион э рчст-зар-з, рассчитывали :о лдевуйзаа' "(срчулз-. •

где « • потенциал нулевого тска .г.и наляу.а ганиен!--:?.--

или соли ; Е., и 50 - те.:онт:1чгс!С!в Нер:!стсво:~.''- ::>.••: »нииалы глл

■"ттоиоз к анионов ссо'гзо'Г:;-^гчгс.

Осмотическое 'заале-'.'".- р^ст-^ргг» лзыо.ч-пли л лог/с.щ.'о ра Смка -и-01.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОЕСУГСЗНЙЕ.

1. ПРОВС^УОСТЬ И СЕЛЕКТЛЕНОСТЬ СТ-КАНАЛ02 2 С;3&2Т:';Г5НС-■ ГО Л АСИММЕТРИЧНОГО СОСТАВА.

:;ри цзученки стругаурно-фулкщйнальиых вэаинсстногеилЗ мел-цу стафилотоксиновым ионным каналом а лишшш бислоем, мы лс-пользовали слевукаие четыре типа ВЖ • $Х Сиио/трлЕО -, СС( цис/транс); 30 (цис)/ЗХ (тзанс); «X (аяс)/СС Гтраас).

Устгнозденно, что при рН б зольтамперные характеристика (ЕАХ) -СТ-каналов сувествеккс зависела- от состава и строений 5ЛЫ. Так в мембранах из ФХ ЕАХ критически липеДны и симметрична (К - ?чех/1-юс " '¡•,01+0,03). тегда как «С-'мембрааах они нелинейны и резка асимметричны (К - 0,53^0,06; рис. 1 Д.Б). Появление ас'/ида.егри.и с?-канала, по-виаимому. обусловлено различным влиянием отрицательного потенциала поверхности Х-мембран на изо- -л трансустье канала. ■ Использование асимметричных БГл! позволило прояснить эту проблему.

Установлено, что а БЛ4, ияе-мснослса которой сформирован ч? 'С лс)/'5Х(тпанс)),. БЛ.< С?-козлов им««л* 5ссму\ Сзяакто ч ил зх-кл4 (рис. 1Е; ;•' - ' слаасзательнс.цис-

о-ФХСшиМгракс)

«-ссм/иссцю •

- Í>X( ICIO I / *CÍ TpOJIf •;

UpAi

ID - ЦРА-

-40 1 "IZO -40

: у /„ел yS\ S i i V (tó)

122 40 i20

Г-10

Uo

Рис. 1. ¿¡сльт-амперные. характеристики СТ-канадо* ь EBt различного : состава. '

устье канала (со, стороны лобавки каналоформера')- удалено от по-.верхности мембраны и поэтому.слабо подвер'женс влиянию' ее 'варя-

дое.

3 системе 2Щ оде)/СС(транс) ' форма-ВАХ была близка к той, которая" подучена на симметричны?: ЗС-ЕШ (рис. ¿E; К - 0,48+0-, 02).. Это означает, что- транс-устье существенно С лига расположено к поверхности бислоя»" и, следовательно, влияние "транс-юнослоя мембраны ответственно,. в основном,' ва асимметрию форш ВАХ Cí-каналов в ©> мембранах.

Ранее/ при исследовании СТ-каналов, было установлено, что большой вклад в определение его свойств, вносят несущие заряд ио-ногешше группы белка-какалофзрмера, в поле которых проникавшие ионы распределяются по закону- Еольцмана (Krasiinikov, Sabirov, 1989). .Логично бьшо бы предположить, что влияние" ионогенных групп полярных головок лилидле мембран осуаосгиляется теу. жз путем. эзо можно проверить, уменьшая дальнодействие варядов повышение« ионной силы раствора. К дейгтгктелл'"с сило ейцаруженно,

чю увеличение аг.тиакос'гн KCl поизодяло линеаризации и симметризация ЗАХ СТ-какалов в ВЛМ асимметричного состава (рис. 2).

Изучение зависимости ан;юк-катпоннсй сэ дэктиа-ности С'Г-:салалс2 активности KCl зьявилс ряг интересных закономерное- • гея. Так сказалось, тге-любой асимметрии inc-;ся лозьшйнке концентрации ЧС1 только з одном из отсеков экспериментальной ячейки уысньяалс анисн-катионную избирательность «налов (t ^определяемое по ■эормуде 1. стрешилось к эначзкнх ).S.) Причем при исцольасзшши ¿Х-биелоев ваодюдаеаь© из^яеник 31сда перекоса катионов на зависели от тего, с ¡езлзл стороны ло-илаяась концентрация KCl (рис. ЗА). В случае .та 4С-к«'<брэд при •дентичиых градиентах KCl чзрез £51, значения ti( яолучааик? по:»: эедичение активности KCl с иис-стсроны мембраны , зеегта по-йь-али величины, подучае>»>е при /золичении активности KCl с траке-торокы (рис. 35). На асик'гтснчяых Зислоях повышение з.-тглзнсстп С1 з икс-отсека приползло к изменениям кстосие з с по г 4W аиО/ОХС гране) о«:л Злизли к полученным на -ЕС-уемСсанах. э т-л ремя как з с ист оме- -Яй дис > / ЗСС трлн.: >. tf оазис-зло с? нЛисчлс г и . как и а злтаг : рис. ¿2, Г..

Таким сссазсм, лол..-''еш;ыо результаты прлж тс,

:о цас-устьг сг-каилга л з.-.л сто я сслее удаленным от псзег.хиост:! ¡мбоакц и слабее псдзерлэис влияния рзспсложанаых ла huä заря-■з 'о опааконик: : Используя оазоаботпнпнй л аа-

0.7

°" икс) тгкке :•

3 0.3 1.3

?ис. 2 Зависим:?!» -es :«:;«••} асимштгяи £«х 07-каналов ? Р/м ю'лмчетт.ичнеге осстава о-" лчт-г-'-

од; t+

о,:

£Х(щгс}/(грв;:с)

i .As^* ОД J

О, Б t~ «XlWC)/(транс)

0,3 -

\

0,1 j

o 200 <iCÜ 600 i),Ь - 4

O 200

3u eco

О Б- t í>X((;.iC)/iCltí>;^;c) +

0,3 -j

O

0,3 -

0,1 -

с/' Л dgf*-

0

¡seo 4ao eco Акп<2:изсгь КС1,кИ

o ZOO 400 600 Лктйагюать KCi, «M

Рис. 5 Зависимость селегстивяости J&ffii различного состава, моди-флцкроьаннь'х СТ, от активности KCi.

Обз&начекия: Увеличение активности КС1 в дкс-стсеке (о), и ь транс-отсеке .

sef. лаборатории диффуаконный формализм описания транспорта ионов через .С?-как&2 (íírasJIniícov,Sabirov 1989), нами было олределен-.ко, что "цис-вход'С?-канала удален от поверхности БЛМ на 3-4 ны, .тогда как транс-вход выступает лишь на 0,5 км.

ПОТЕНЦИАЛ- ЗАВИСИМОЕ ЕИШИОЯЙРОВЙЕЙЕ СТ-КАНАЛОВ. ■ Z. : 'ИССЛЕДОВАНИЕ TOffiETJtKM 1ШЮИВШИ к «СГЙВЩК СТ - КАНА-

лоь в 1М'. »13 «осФАТК31Лло::::ал ..

Jipi: исследование кинетики инактивации (переход СТ-канала но открытого в закрытые .состояния) .к активации (обратный переход! попользовали в :БЛМ ".из ФХ-'проводимость .которых достигала равно-веской величины при +5м2. Ступенчато увеличивая фиксирсваиньй потенциал мы -наблюдали первоначальное увеличение протекакглегс черев мембрану'Тока, который затем начинал уменькатьо.я, вол-.;::-.тьме 'перехода каналов :в малолроведяке ("закрытое") состояние, «остигая черег некоторое .время, стационарного -значения. Sro

личина зависела от фиксированного потенциала и /слозин ооедц. Минимальная стационарная прозолямооть биолоя .чаблададагь ;:ск потенциалах > I 301 мВ, и обусловлена, очевидно, прсгсгкмсстчс СТ-каналоз в "закрытых" состояниях , следовательно С7-:-зкалы о этих состояниях правильней называть аакшрозозагзши. "ели конечная зелич;ша фиксированного ка мембране потенциала с-дла б-льоге ¿0 мВ, то ДЕУхэкспоненциальнал кинетика. спала прсасд^мост;; чаб-тздалась, гак правило, на всем исследованном диапазоне о":т. Гречем. постоянные времени релаксаций (ц.и,) одноналразленнс и*»?-

V -1

'МГ

б -

го

—г— 40

1

2 -О -

1.2'

$

1 д 5 , .л Л

ПчИ'

- 4

ч

4 5 5 ? рН среда

Рис, 4. Ззвисимссть постоянных времени релаксаций от аК среда (А,5) и концентрации холестерина в !*>«врансоСрз-' эуикэм растворе- 1.3) при рН-4. Обозначения: <£} -'Т<;

(с)-1Г„ ;'Сзет..:ке е:гмзолы

ЕЛИ сформированы .то ч^тсду Мюллера, темные- глентала л ера.

60

о ^

О

СозосаЕакмв хплестерям /£)

лпсь np:; сдвкг-л г.-", сое;:;.: . dkj. -4;.. I.. ,. Само налпчи-, нависла: jt/ ззэ-ьае1: на учас:..;е консгеннг:: rr.vn;: ; дел-?:-:;:;; еел;:чик1: энеееетп^океео саоъег-е тх,у. ■'- ■■^szj-л у.ь открытого в мо-допг^л.одялие o "столки;.

установлено гакмг, что лггголккае времен;; обеих sk?¡:.-:-.ент ь&е;:голи с? содержания холестерина в биолое. однако, влияние Езлесгеркка наблюдалось только при Фиксации отрицательных и-увеличкзаясеь с .ростом ссотнсаэния X.V5X е мембра-Kcctpdsjxuei.: ргстгоре (рис. 4.L). Это естественно связано с асим-уетричным расположением СТ-каналов -в мембране и указывает как йа р^ллпчке -от; уктуркых перестроек какал:. при различном к&псавлении век: с; а нелрздгннести электрического поля через оислой, так и на í -xí::;:mcc:í гтих процессов от псдвихности хлрнокиолотны;-: цепей zco;c;:,'S.rjizi, модулируемой холестерином.

Z-'r. дгученик кинетики потенциал-зависимой активации СТ-ка-калсз, ;;х предварительно "закрывал;;" фиксацией- па мембране :го-ст 50 дс 103 мВ. После достик&кю ЕШ нового равновесного значения проводимости мембрану кратковременно (0,05 -ЮС д'полясксовзли до нуля мБ, что вкгыьало увеличение срэтекаю-z¿to чсье» ЕЛ>: тока с после дчпкцгг? редаксациёй ere г. стациояарно-;/у (рис. 5Д.) Заветна;; актиь&ц;« С7-гл-ноясв кегягдалгг:

:,>¿ при длительности дел.л^окгуллегс куглтгсе ~ С.-Х ко, что

K-.'.i ь&вкгки деполпркзации пркьсдил. :: закономерному рлоту количества етксызакжхоя каналог.. Иаькгимссть илкойого Еначекия тс-.согого стгета от длительности гепслг.рвгукс'.го импулг с а Скль не кскетокиа (ргс. ). Такая "акпааакоанай" крпьак удсыетвори-оел-но аппроксимировалась суммой трех сггозксп'-ног-циал! г.ых пре-лессов не sce-w исследованном диапазоне фикекру-.ч-лл: пстекциа-.е?. концентраций сел.; и рН. Причем лрсп-ш.-»-«- „глиьоцп;: оо

к 1-

5 - р -»

00 «Я

I—пг

Ш Ш и

«г-••

йзи

ОКВ"1

0,07 0,7 7

Длительность импульсов в мс.

20

т

8

16 ыг.

2М 4С0 Ш) 10СО

Длкгслыясть Кйяуг&есш в ас.

?;:с. ь Типичные токовые ответы ка деполяризующие импульсы ГА) и зависимость пиковых значений токов от длительности песвих импульс об (Б) при рК5. БЛМ сформированы по методу Монтала-Ь&ллера иг смеси ОХ/лЯ (1/1 по весу).

тавалиоь сильно разнесенными и варьировали в передела': 0,075-0,21 мс для первого, !,7Р-7,4 мс для второго и 50-3-50 мс

т* ГГ ОТ",-,* - ТрОИ®

с. я гдшйшнкБ мосйкзгзеанног. с: глк.

Одним к? капСолее интересных явлении. оРнаруяэккым при >т

друг га д:угсм лепслягкзукЕя; кмлухьсов •сдина.'сс^г:- дл:п:сл:

г.тслелясий импульс •. гг.лот' 6 -£У, .пкпок* ?кзчени? гг.г-. кх-._>е:\-Ч!"«;- чоди^гдированиук мэмЭраку тока закономерно :>уе;:гот-,-."-.: 6л. подчеркнуть, что величина тгкевог:; ответа - С.

г.;од-:кгах с:' «аксимал' но Еогмо.теего) ?а?-исела только от пеглдкг-: :. имлугьез, не не от гр^жутк»» времени «ед.ту ик-пуль-

100 с

2кА

Длительность ютульса 0.6 мс.

- ■ •, 1 ! Гм 1-Г

••и»- : ■ : ' ;

'ЛЛ-:Т-тСг!:« ИЗ '.'гИ■}}'■,т ТОКОЛМг .

с-гиь лелоллслчуп.а'Х л,'.т."Г.ьсо ■. ■'■чвпоимсст:)

~/г иом^ра л;г:оляри-имп/л^.л лично 'Л длитель-

;р«да: £¡3 -1'Х мМ >101; 3 -:М КС1,ргЗ

40 20 -

о -

6° 1 «ЧУ^УУ ; \

-10

о,-о.б

\ * - I. ■; >*■• ! Й 20 Л

;

5 7 у»са( и

сами. Восстановление исходного состояния системы ("стирание") достигалось деполяризацией БЛМ до нуля мВ в течение 1-2 сек.

Детальное изучение этого феномена показало, что способность "считать" импульса начинает проявляться уже при длительности деполяризующих импу^сов примерно 0,06 мс и сохраняется вплоть до 20 мс. Этот эффект проявлялся при любом знаке фиксируемого потенциала (з диапазоне.от 50 до ЮОмв), при всех использованных величинах рН (рН-4-о),' и концентрация КС! (0,ЫМ) (рис. 6Б.В.).

Совокупность данных. • полученных нами при изучении процессов /н 1кт;!1гаики и активации 07-каналов, молы Сыть о^гяснена о ;:о-¡О'дьгс кинетической схему, а которой каналы из одного открытого-,:ри ¿ихсоц/и на мембране большого потенциала М". л^гехоонт .-< ралли'Шле. не связанна? прямо с ^руг лру-

0

го!.«., малспрсвогяике (бакьыпкЛ, состояния о сосгввгс?ьуш:мк чениями кокета;!"' с'хисстпи иььмх. •' К . с"" сгос:г.-> :>.•

К" ■ . Закрыто'

;

: - у '-■<!; -*Ч • < | ка

(якрыго т^Г^гкруяКЗ)

с: г: г

'2

! ^

Аналке екзгекы- кинетических уравнений, описывавших ¿ту схему состояний показал, что для списания экспериментальных данных Еахно выполнение нескольких условий. Зо-первых, необходимо чтобы константы скорости перехода '-оп-глката (4)" были близки друг к другу при всех использованных условиях эксперимента Зо-вторых, при больших потенциалах константы скоростей перехода каналов в закрытые состояния 1,2.3 Дол-тды быть много больше констант скоростей перехода каналов в открытое состояние, а при ОмВ намного меньсе. И, наконец, требуется, чтобы при ОмВ константы скоростей переходов каналов из закрытых состояний 1,2.3 в открытое, были существенно разлишш, т.е. К_,> К.« > К_0 . Тогда

серия депилярнгуслих импульсов с длительностью порядке 1/К_. -

1 /К.г- буде- приводить к постепенному перераспр--деление как а

лев ме:+ду закрытыми ссст сепиями в направлении увели-к ни? су.", "закрыто! 3;". При этом токовый ответ на какдк.': следует::', импульс Судет меньше предыдущего вплсто до дссти.>.ения равенства ексрсс-тей выхода каналов из различных закрытых состояний.

2. 2 ЛА1К0ЙАРЙЫБ ЗОЛЬТ-А!£2РНЬЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕМБРАН СО-ДЕРНАЫХ БОЛЬШОЕ КОЛИЧЕСТВО СТ-КАНАЛОВ.

Лля получения стационарных ¿зрезоу-эгаи) ВАХ модифицированной лтафнлстокснаом- 5ЛМ нами предварительно фиксировался потен-

- 1С -

циал разный + 100 мЗ. После достижения нового, меньшего по величине стационарного ."значения протекающего через &Ш тока, выбранный потенциал линейно уменьшался со скоростью 0,5 мВ/с.

■герма так-'./, стационарных ВАХ напоминала хараетеристики аоэ-'укасд кэибран и ¿{¡¿ела участки с "отрицательно" наклоном, что лаиболеэ зыраяеко при кислых рН (рис.УА.). Зависимость относительного из >«е нения интегральной прозодимссти бислся от потенииа-,;а тле¿2. сигмеигную форму (рис. 7Б.) с максимумом на оси потенциалов лрлизн нуля мБ. Причем, местоположение максимума на оси готенциалсв не сдвигалось леи десятикратном различие з конпент-л-ояикайЕИХ ионов разделяемых мембраной б отсеках зкепеои-•■еятальной ячеики , летя з такси системе имелся значительный тсч

Ц-45) -40

Рис. 7. Стационарные ВАХ мембран, содержащих большое количество СТ-ка-налов (А) а зависимость стационарной проводимости БЛЙ (б,,, в 7. от Б .)

> га*

от потенциала (3). ВЛМ сформированы по методу Монтала- Мнллэра из снеси ЪХ/ХД ЯЛ'по В-»С7>

40 .1» У{

..«-. нулевок потенциале. Уго уоеааарт в ток, что С;-каналы «».»к.;-» • генанаж-. ь. не токо-чувстъитьдьвы (Ъ&яыйх.Ул-и

эксперименталььс, полученные стационарны-: .и:.и ■

:.\;;^льиоааниых рн хсэзао списывались еледутая«

5 .•"г£г.1п С ел131:"'-Ш1Г.Э Л»'-\'с3 С: 1.

те Еу - проводимость" мембраны при данном потенциале (V); г - минимальная и максимальная проводимость мембраны; \'0 -

-отекшал полузффекта; 0 - коэффициент отра«а«Еий крутизну потенциал-зависимости.

Зависимости параметров из уравнения 2, от рН среды и концентрации, соли -при' различных направлениях вектора напряженности электрического поля показаны на ркс. 8. Их анализ _, указывает на существенные различия между закрытыми состояниями СТ-канала, в вторые он переходит -при фиксации на шмбране положительных к отрицательны?: потенциалов. Детализация этого-была достигнута в экспериментах со сдвигом рН только, в одном отсек» ячейки .

Установлеьо, что начиная с рН-7, поникшие рН'в цио-стсёк;. ячейки, ускоряло релаксации .тока практически. липь в ответ на ступенчатое увеличение отрицательного потенциала. При заккслечш. в транс-отсеке ситуация быта противоположной - устарение села'-: сацкй тока наблюдалось при положительных знаках снксиозванког^ потенпкала. аавиоимости 'паоаметр-ов С. бпп, У^ от •рЕ'ыапеаянас

их зависимость от'рН б симметричных условиях, для этих га спа;:-:-. потенциалов' (рис. 8). Поскольку, при уменьшении рН в икс- отее:« происходит Преимущественно изменение зарядов ионогенкыг. групп цкс-входа в канал, а при зачислении б транс-отсеке - тралс-вхс-да, становится очевидным, что при фиксации отрицательного потенциала на мембране происходит структурная перестройка СТ-канала со стороны пио-входа, а при фиксации полого-тельного потенциала -со стороны транс-гхода .

80-

<30-« ' /

/У-> 40

30 --1 ■■

3

1 -1

(Ко/кГ)

;-1-Г

60 --!

Л)

ао-,

у 'у

с,г

Г

4 К 5 7

4 5 б 7 рН среди

Г-ис. 1. Зав;;с'лус.:гь' параметров стационарных БАХ (уравнение 2) от рН среды. Верхний ряд - фиксшш на ЬПМ пслолигедьныл, нихний - отрицательных потенциалов. обозначения: о - симметричные и Д- аси»1метричные по рН условия. В последнем случае рН изменяли в цис-отсека пои отрицательных и э транс при положительных потс-ншахах. рН среды в противоположном отсеке 7.

Л- «Ише)/«0(тхв»с) О - •*( «рс) /(траие}

Л

я

/

<УХ)

Л~*Х(цж:)/«С(тракс) О —«Хшс)/(транс)

60

20

I-т--—I—

120 -80 -40

~1—-

О У{ ыВ)

120 -ао -40 о

■ 1'лвиоимость стационарной проаодимости а 7. о,. „) ,г о от Скксигсз-чнн*-

О

Со структурной перестройкой свяьано и игнгиегя» сел.•ггп^-когтв ОТ-кан&да при его neptxoде в калспрс.ь-олг.Езк cor.c-iv.i-: Так, потенциал кулевого токе. Д-~г; малоггополлйга . оото.-нг-. •'. -;-.: кала, оыл еваччгкяьяо кекьье, чем у :•' -

слтикоатном гралкснге- HCl сост&ьлял f>* й ! , '•'- ¿t

-ß кЬ 2ü +0, 'Л.') ссотгетсп-акс.

Сулественнце изменения форма стационарны.-: ЕАУ. оРларукен.: в 5ЛМ асимметричного строекнл (Й-У-К, £С/Ол;рис. 9;, что счло :ва?ано с наличием в этих ьнутри«шбрскнсгз ¡¡с-ля, дейотвке которого на CT-каналы алгебраически суммируется с действием ср,::--сируемого потенциала. Следовательно потенниах-чувствителлК'л'; "сенсор напряжения" О какала находится непосредственно в гидрофобной зове мембраны.

3. структурные перестройки ст-канала при его переходах между состояниями.

В работе Zi nimer fcerc and Par?e?iar> (1935.) -бкл предлог;: метод измерения изменений внутреннего объема канала, основанный на использование непрсникакакх вгутрь канала, полимерных молекул. Суааость метода заключается в определение разницы ь .геличигс ра-fc-ты, необходимой для перехода канала из закрытого в открытое состояние ь обычном водно-солевое растворе и в растворе, в котори:: дслоликте-лько внесен кепролккзк^й в какал неэлектролит. L качестве последнего оОкчп:. :м::сл1 зукт полкмерк Осльссй молеку-ллрксЯ мгоеь .

Гримение этот полхог не ка';лвдали значительна кг>ме.-'е:-:иЯ i- рормо стационарных ЬАХ, при из'ьточнсм осмотическом лавлллт

?МСГ' н/м", cos даваема:-! Декотрапом 20000: При этом рассчитанные

изменения объема канала составляли всего 3 i 2 HW3, Эта величина -.ркСлизительнс на порядок меньяе объема водной поры открытого СТ.

п

нмч, рассчитанного из его геометрических параметров

vr - 1.2нМ, i - 105Ш'

Такт образом, структурные перестройки, происходящие при переходах между состояния},м СТ-канала изменяют его селективность и хает локальный характер. Однако, осталось неясным - меняется ли при зтом эффективный.радиус водкой поры канала. Для ответа на этот вопрос мы использовали модификации разработанного з Hanoi; .'лаборатории иетода измерения ралцг/са ионных каналов, основанного на .-сравнение проводимости каналов в растворах разлишгьдс не эле к, • -олигсз. В^'Яакз неэлектролитов зависело от рал»?роз их молекул. Гаи молекулы неэлектролитов, гидродинамический радиус, ■•хторы.-; .значительно ыоиьаэ 3¡í<toктявного радиуса видной носы канала, про-•икали з нее л уменьшали проводимость СТ-каналов пропорционально .•неньеваив электропроводности водного раствора. С увеличением cachaca молекул нвзлекгрелитоз их вяшккв-аа проводимость каналов .•"..,аньзалосв и при превшении гидродинамического радиуса мола:?,*.- над радиусом.водной поры каната пракгячзски исчезало . üo-'ользуз этот метод ш определит, что радиус. ОТ-каяала приблизительно равен 1,2ны (рис. ЮА.Эта величина близка сцепке з<£фзктиваого " радиуса водных пор, индуцированных CI эритроцитах человека (.1,25-1.4нм ; Krasilnikov st al., 1983), и sopoEo согласуется с электронно-микроскопическими .дакшсы U.23K«; Olofsson et al., 15383). Если при переходе СТ-канала ьадзпровоавде состояния происходят иэкэнение эф&лгтизного радиуса канала» зависимость их проводимости от гидродинамического радиуса шзэку£ неэлектролитов будет несколько шюй. Ксслоду-газксииость относительных изменений проводимости далолрозодякпд состояний СГ-казала под действие« неэлектролитов, йоркиров<т>- :: ца ссстыггсгаузсавге каианещгд проводимоегя - открытого панаш к-.. А?йс?2$пгельно оонагужак, 'tro эффективный радиус кисотхводаце. суглотпенна игкьзз, чзм 7 откритого ка;зла a coctüp.cí -

1 0,с ю-- i сие. ЮГ.). 1а.ч/.м сора&ом, при погбкцизл кйдуцирсг&йж;« переходе d-^-«г сгкскгсгэ сзстгенкк в уааокржайвдг, npcicxiiu: * о.-.. чем изменение ьдаъг.тивксго радиуса оеь Бпачптеги >.::/

изменении со^ема йодной поры какала.

ii90/1Qf)}

0,2 1,0 1,8 2,6 3,4 4,2 5,0 0,2 1,0 1,8 2,6

Гидродинамический раднуе неэлектролитов (нм)

Рис. 10 Влияние неэлектролитов на проводимость СТ-каналст. А- Зависимость проводимости CT-каналов и злектропрсгсд-ности ошвзюзгго БЛМ раствора (о) (в % от проводимости какалзв электропроводности 100 мМ раствора KCl) от гидросинзмическт-го радиуса не?лектрслитсв.

Н- Зависимость относительного изменения протекякллл"; LIM тока от гидродинамического радиуса неэлектролитов. и

т о к гон потенциале- 1С; мЕ (лее какалк cTitpiVT:.1, '¿-у.

и:с:;арн!л1 ток при SO vi; ; асе кануть: аалгыть;) Л" и л о ки в раствор лездектролнтов, соответственно.

выводы

1. Экспериментальные исследования свойств СТ-канала в бис-лоях асимметричного состава (фосфатидилсерин/фосфатидилхолин) позволили предложить модель его структурной организации, согласно которой со стороны добавки белка канал выступает за пределы мембраны на 3-4нм, а с противоположной - только на 0,5нм.

2. Показано, что потенциал-зависимый переход СТ-каналов а малспссзодяшие состояния является двух-экспоненциальным процессом, тогда как обратный переход ("активация") - трех-зкспсненци-алзн. Обнаружено, что кинетика "закрывания" канала более чувствительна к параметрам водной фазы (рН, ионная сила), но существенно (на порядки) медленнее, чем кинетика "открывания".

о. Обнаружен феномен вапоминания информации модельной ли-пидной мембраной,, содержащей бодьигае количество СТ-каналов. Предложена кинетическая схема с одним открытым и тремя-'четырьмя, несвязанными друг с другом прямо .закрытыми состояниями СТ-канала, объясняющая и количественно описывающая наблюдаемое явление.

4. На основании исследований кинетических и равновесных характеристик потенциал-зависимого функционирования СТ-канала при различных величинах рН, ионной силы среды и состава БЛМ показано, что потенциал-зависимые переходы СТ-канала между состояниями обеспечиваются структурными перестройками, которые в зависимости от направления вектора напряженности электрического по.чя через мембрану, затрагивают то один, то другой вход в канал.

5- Предложена и обоснована структурная модель потенциал-ин-дуцируемых перестроек СТ-канала, а которой уменьшение эффективного радиуса при его "закрывании" (с 1,3+0,1 нм до 0,6+0,3 им ) ке сопровождается значительными изменениями объема водкой поры. Сенсор напряжения СТ-канала локализован в гидрофобной зоне бис-

лог..

спкос* г.дг.г.т. сч^дсгевзнньос яо тем? двссрргвзш. '_. г'.раопльы-.ков о. I-. . Моргл-к Л. Г. .СсСкгов г.?.. It'P1;::?:^;--В. J- «Зарглога i-. L Ьлкл.чж рН соеоы на noTeKU»:as*&:-s:cif>c-'.> i«4t.>ui:*.OKKp:?aHKe стайилэтстеияегьж каналов » кислое. // Укр. Снохам, журнал. -1528- -Т. СО, Коб. - С. S3-6S. Крас иль ников О, £. , Мерзляк И Г. .Сабкров Р. 3. Структурно- $уил-циокальное взаимодействия кк-хду еоа^клотокснновим ионным каналом и мемСраксй. // Ценные каналы в биологических мембранах : Тгзкок докладов Всесоюзного симпозиума. - Кара-дат, 1S8S.-Пу-qiHO: С. 52.

о. Красильников О. Е., й?рзляк IL Г. Влияние холестерина на функционирование стафклстоксинозых каналов//Биофкаика. -195Э. -Т. 34, ВЫП. 5-0. 905-807. • '

4. Г.расйлънкков 0. В., Мерзляк П. Г. Сабиров Р. 3. кНсамбли ионньк какалсЕ, как материальная основа кратковременной памяти клеток. // Ионные каналы з биологических мембранах : тезисы дек-ладов Всесоюзного симпозиума.- Кара-дат, 1SSC. -Москва:С. 33 Мерзляк IL Г. Красильников 0. В.', Сгбиров Р. 3. Потенциал-индуцированный переход стафнлотоксинов^х каналов в мадспрсводялке состояния и радиус их водных пор. // Ионные какали в биологических мембрана: : Тсеисы до ¡»чалов Вгесокзиогс сглсойкума. -Г^оо-да~, iuOO. -Москва. С. о7.

. 0. v. Krasiimtev, F. С. Mere) ;ал, R. 2. Sao: rev от.о

Б. A. larhswkhanedov. ixrory is a property о: an :cn c:\ar,re r,col: Ion Channels F erred t-y Staphylcocscus Aureus

Alpna-Toxm. // Gen. Pr.vsiol. Sicpnys. -1690. -V. S,!io9. -P. СОЗ-иГ/J

//