Получение в E. coli, ренатурация и исследование внемембранных доменов холинорецепторов

Алексеев, Тимофей Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение в E. coli, ренатурация и исследование внемембранных доменов холинорецепторов
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение в E. coli, ренатурация и исследование внемембранных доменов холинорецепторов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. ШЕМЯКИНА и Ю.А. ОВЧИННИКОВА

на правах рукописи

Алексеев Тимофей Александрович

Получение в Е. coli, ренатурация и исследование внемембранных доменов холинорецепторов

03.00.03 -молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2005

Работа выполнена в Институте биоорганической химии

им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук

Научный руководитель: д.х.н., профессор Цетлин В.И.

Официальные оппоненты: д.б.н., профессор В.В. Месянжинов, д.б.н., профессор В. Л. Карпов.

Ведущая организация - Институт биологии гена РАН.

Защита диссертации состоится 2 февраля 2005 г. в 10 ч на заседании специализированного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук по адресу: 117997, ГСП-7, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета, д.х.н., профессор

В.А Несмеянов.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (АХР) являются лиганд-управляемыми ионными каналами и подразделяются на две основные группы: рецепторы мышечного типа и нейрональные. Сведения о пространственной организации всего класса АХР до недавнего времени основывались главным образом на данных криоэлектронной микроскопии АХР мышечного типа, выделяемого в значительных количествах из электрического органа ската Torpedo californica. Установлено, что субъединицы этого рецептора (две а- и по одной Р-, у- и 6-субъединице) образуют пентамерный комплекс, вдоль оси которого располагается пронизывающий мембрану ионный канал. Согласно существующим представлениям, каждая субъединица имеет экстрацеллюлярный домен, трансмембранный участок, а также цитоплазматический домен. К настоящему времени получена информация о форме трансмембранных фрагментов, выстилающих канал, а также об элементах вторичной и третичной структуры экстрацеллюлярного домена. Установление пространственной структуры более высокого разрешения с помощью рентгеноструктурного анализа (РСА) натолкнулось на трудности получения кристаллов цельного рецептора. В связи с этим представляется целесообразным провести детальный структурный анализ отдельных функциональных доменов АХР.

В экстрацеллюлярном домене АХР происходит связывание ацетилхолина, а также различных других агонистов и антагонистов. Следует отметить, что экстрацеллюлярные домены субъединиц (или их фрагменты) были достаточно давно получены с помощью гетерологичной экспрессии в Escherichia coli, как правило, в виде тел включения. Изучение пространственных и функциональных свойств этих белков требовало проведения их ренатурации. С помощью спектроскопии КД в ряде зарубежных лабораторий, а также в нашем институте была определена вторичная структура белков, отвечающих экстрацеллюлярному домену субъединиц мышечного АХР мыши и рецептора T.californica, изучено связывание этими доменами токсинов и моноклональных антител. При этом стала очевидной необходимость оптимизации условий сборки белка и предотвращения образования агрегатов при достижении достаточно высоких концентраций белка, при которых возможно изучение пространственной структуры методом РСА или ЯМР.

функционировании рецептора. Фосфорилирование внутриклеточного домена вызывает увеличение скорости десенситизации рецептора.

Цели и задачи работы. Основной целью исследований явилось экспрессия внемембранных (экстрацеллюлярных и цитоплазматических) доменов субъединиц никотинового ацетилхолинового рецептора в E.coli с последующей ренатурацией очищенных продуктов и изучением физико-химических свойств доменов. В качестве объектов исследования мы выбрали:

1. экстрацеллюлярный домен а-субъединицы АХР Т. californica. Рецептор Torpedo является наиболее исследованным объектом. Однако к началу нашей работы практически отсутствовала информация о пространственной структуре экстрацеллюлярного лиганд-связывающего домена. Кроме того, на этом объекте можно проверить условия ренатурации с помощью теста "функциональной активности" по связыванию классического блокатора - бунгаротокина;

2. разработанные условия ренатурации были использованы для получения фторсодержащего эктрацеллюлярного домена и изучения возможности применения

для контроля за процессом ренатурации и для изучения топографии лиганд-связывающих участков;

3. важной задачей работы являлась также экспрессия и ренатурация цитоплазматического домена субъединицы рецептора Torpedo с целью анализа вторичной структуры и проверки способности к фосфорилированию. Во всех описанных в литературе случаях цитоплазматические домены были получены в денатурированном состоянии.

4. экстрацеллюлярный домен al АХР из мышц человека. Против конформационно зависимых эпитопов в этом домене образуется бо'льшая часть аутоантител у больных миастенией (мышечная слабость). Мы планировали получить ренатурированные (или частично ренатурированные) формы этого домена и проверить, может ли соответствующий белок использоваться для определения уровня аутоантител у больных миастенией;

5. большое значение имеют и нейрональные АХР. В частности, аЛ АХР - один из наиболее представленных в мозгу АХР. Нарушения в функционировании этого типа рецептора сопровождают ряд нейродегенеративных заболеваний, таких, например, как болезнь Альцгеймера. Отличительной чертой субъединиц АХР является их способность образовывать пентамеры. Подобно рецептору Torpedo, <х7 АХР с высоким сродством связывает a-бунгаротоксин. Поэтому в рамках настоящей работы планировали экспрессировать в E.coli домен субъединицы и изучить его свойства;

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе выполнения данной диссертационной работы получены необходимые конструкции, осуществлена экспрессия всех перечисленных белков и найдены условия их ренатурации. При этом впервые получены лиганд-связывающие домены, содержащие атомы фтора. Для экстрацеллюлярного домена а-субъединицы Torpedo и цитоплазматического домена 5-субъединицы Torpedo впервые получены экспериментальные данные об их вторичной структуре. Найдены условия получения указанных доменов, а также лиганд-связывающего домена а.7 нейронального АХР, практически не содержащего высокомолекулярных агрегатов. Активность экстрацеллюлярных доменов Torpedo и

АХР крысы охарактеризована по связыванию нейротоксина, а для белка, соответствующего цитоплазматической петле субъединицы, показана способность фосфорилироваться по тем же остаткам, по которым фосфорилируется субъединица в составе интактного АХР. Практическое значение имеет обнаруженная способность полученного домена мышечного АХР детектировать аутоантитела в сыворотках больных миастенией.

Апробация полученных данных и публикации. Результаты настоящей работы представлены на чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 1996), Международном конгрессе по аналитической химии (Москва, 1997), 16 конференции Международного нейрохимического общества (Бостон, США, 1997), Международном конгрессе по ЯМР в белок-белковых и белок-ДНК взаимодействиях (Москва, 2000). По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературных данных, изложения полученных результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация содержит 102 страниц и включает 37 рисунков и 7 таблиц; список литературы насчитывает 222 наименования.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1.Экстрацеллюлярный фрагмента-субъединицы Torpedo californica: к(1-ЗД9) его мутант

Нами была сконструирована гибридная плазмида на основе вектора В него

по сайтам BamHI/HindIII клонировали участок кДНК, отвечающий аминокислотным остаткам 1-209 а-субъединицы Torpedo californica (ot(l-209)pQE). Для последующих ЯМР исследований белка сконструировали вектор, кодирующий мутантный белок. Замену остатка Тгр на Phe в 60-положении проводили методом ПЦР, используя в

качестве матрицы вектор a(l-209)pQE. Последовательности праймеров содержат

рестриктный сайт Clal (подчеркнуто) (5'-+3'):

GG CAG САА ТТТ АТС GAT GTG AGG СТТ CGC (прямой),

GCG AAG ССТ САС АТС GAT АААTTG CTG СС (обратный),

Праймеры содержат замены нуклеотидов: вместо триплета TGG, кодирующего Тгр60 находится последовательность ТТТ (Phe) (прямой праймер) и, соответственно, вместо ССА последовательность ААА (обратный праймер). В качестве фланкирующих использовали те же праймеры, что и для получения немутантного рекомбинантного белка. Полученный в результате ПЦР фрагмент ДНК лигировали в плазмидный вектор pQEjO по рестриктным сайтам BamHI/HindIII. Последовательности ДНК полученных клонированных фрагментов были определены по методу Сенгера.

Содержание целевого белка в клетках Е. coli после добавления индуктора (IPTG) было выше 70% (оценивали с помощью гель-элетрофореза). Белки находились в телах включения. Варьирование условий выращивания (температура, различные штаммы клеток, количество IPTG) не позволило получить белки в цитоплазме в водорастворимой форме. После очистки тел включений, растворения в 8М мочевине и очистки на Ni-NTA-агарозе в денатурирующих условиях получили белок а(1-209)) с чистотой более 90% (рис. 1). Для мутантного белка получили аналогичные результаты.

kDa 1 2 3 4

43- ШШ

Рис. 1. Гель-электрофорез рекомбинантных белков. 1 - белковые стандарты; 2 - клеточный лизат, содержащий целевой белок а(1-209); 3 -белок ct(l-209), выделенный афинной хроматографией на Ni-NTA-агарозе; 4 - мутантный белок [Trpé0Phe]-a(l-209), выделенный афинной хроматографией на Ni-NTA-агарозе;

По результатам масс-спектрометрии полученного домена <х(1-209), его масса (26087 Да) близка к теоретически рассчитанной (26076.85 Да). Для более детального подтверждения корректности первичной структуры белка его подвергли триптическому гидролизу с последующим определением масс полученных пептидов методом MALDI MS (табл. 1).

таблица 1

Результаты масс-спектрометрического анализа триптического гидролизата _белка а(1-209)_

пептид* аминокислотная последовательность** массы, Да

геор.рассчит. найденная

Г1 (-П)-(-Ю) МЯ 305.40 -

Г2 (-9)-6 SGHHHHHHTGSEHETR 1882.89 —

ГЗ 7-17 LVANLLENYNK 1290.48 1290.0

Г4 18-55 VIRPVEHHTHFVDITVGLQLIQLI 4389.04 -

NVDEVNQIVETNVR

Г5 56-57 LR 287.36 -

Г6 58-64 QQWIDVR 944.06 944.5

Т5+Т6 56-64 LRQQWIDVR 1213.40 1213.0

Г7 65-66 LR 287.36 -

Г6+Т7 58-66 QQWIDVRLR 1213.40 1213.0

Г8 67-76 WNPADYGGDC 1120.23 1120.0

Г9 76-77 К 146.19 -

Г8+Т9 67-77 WNPADYGGKK 1248.40 1248.0

ПО 78-79 IR 287.36 -

ГИ 80-107 LPSDDVWLPDLVLYNNADGDF 3159.57 3160.3

AIVHMTK

Т12 ¡08-115 LLLDYTGK 922.09 921.5

Т13 116-125 IMWTPPAIFK 1203.51 1203.8

Г14 126-145 SYCEnVTHFPFDQQNCTMK 2404.77 2405.0

Г15 146-155 LGIWTYDGTK 1153.30 1153.0

Т16 156-179 VSISPESDRPDLSTFMESGEW 2728.05 2728.1

VMK

Т17 180-182 DYR 452.47

П8 183-185 GWK 389.45

Г17+Т18 180-185 DYRGWK 823.91 823.4

Г19 86-205 HWVYYTCCPDTPYLDITYHK 2518.86 2519.0

ПО Ï06-209 IMQR 546.69 -

* Знаком '+' обозначены составные компоненты пептида частичного гидролиза. ** Нумерация аминокислотных остатков указана, начиная с ^концевого остатка субъединицы рецептора.

С помощью триптического гидролиза удалось подтвердить 63% белкового сиквенса. Из достаточно крупных пептидов, входящих в состав домена, не удалось обнаружить пептиды Т2 и Т4.

Сборку белка осуществляли следующим образом: после восстановления образца DTT в 8М мочевине проводили медленный ступенчатый диализ против понижающейся концентрации мочевины (8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0 М). В зависимости от начальной концентрации белка, наблюдалось в большей или меньшей степени образование осадка. После его удаления концентрация белка в растворе составляла около 0.5 мг/мл. В дальнейшем удавалось поднять ее до 5 мг/мл, используя для этих целей ультрафильтрацию.

В домене есть два дисульфида: между остатками Суз128-Суз142, которые имеются во всех субъединицах АХР, а также вицинальный дисульфид Суз192-Суз193, присутствующий только в <Х-субъединице мышечных и нейрональных АХР.

Замыкание дисульфидных связей проводили кислородом воздуха в водном буфере при +4 °С. В результате удалось провести корректное замыкание дисульфидов, что было подтверждено методом триптического гидролиза окисленного белка. Методом МЛЬЭ1 М8, обнаружили сигнал, отвечающий пептиду Н^УУТССРРТРУЬРПГНК (Т19) (рис. 2). Масса пептида Т19 соответствует форме с замкнутым дисульфидом. Достаточно высокая точность определения массы этого пептида подтверждается надежным определением массы близкого пептида Т16. Кроме виципального дисульфида экстрацеллюлярный домен имеет в своем составе еще одну дисульфидную связь, наличие которой подтверждается сигналом, отвечающим пептиду Т14. Интересно отметить, что массы пептидов Т14 и Т19 с замкнутыми дисульфидами примерно на 2 ед. меньше масс этих пептидов, полученных из восстановленного белка.

Рис. 2. МЛЬБ1 М$ анализ окисленного эктрацеллюлярного фрагмента а-субъединицы рецептора Т еак/отка а(1-209). Белок окисляли кислородом воздуха, после сборки методом медленного диализа, контроль окисления проводили методом Эллмана. Триптический гидролиз проводился для окисленного белка

Исследования с помощью ВЭЖХ показали, что белок в водном буфере (в отсутствие детергентов) присутствует в виде водорастворимых олигомерных форм. Как видно из данных гель-электрофореза в невосстанавливающих условиях (рис. 3, дорожка 3) белок присутствует в основном в виде мономерной формы, с небольшим количеством димерной, и еще меньшими количествами высокомолекулярных форм. Следовательно, в присутствии детерента (0.1% 8Э8) агрегация окисленного белка существенно уменьшается. Это позволяет сделать заключение о том, что в агрегационном процессе основную роль играют гидрофобные взаимодействия.

Склонность к образованию водорастворимых агрегатов была обнаружена и для мутанта а также для белка, содержащего атомы фтора в индольном

кольце триптофановых остатков.

Рис. 3. Гель-электрофорез рекомбинантного белка а(]-209), прошедшего сборку методом диализа с последующим окислением сульфгидрильных групп кислородом воздуха. 1 - белковые стандарты; 2, 3 - образец белка, восстановленного и невосстановленного перед нанесением на гель.

Опыты с использованием радиоактивно меченного а-бунгаротоксина (аВ^) показали, что домен сс(1-209),а также его м у тТаэ<Ю№ес-а^1»209ы в а ю т токсин с К^ —100 нМ. На рис. 4 приведена кривая связывания для а(1-209) в р-октилглюкозиде. С целью изучения лиганд-связывающих свойств белка а(1-209) и последующего сравнения полученных данных со связывающей способностью изолированной а-субъединицы мы исследовали ингибирование связывания аВ{^ декаметонием и ё-тубокурарином (рис. 5). В этих экспериментах получили значения ГС50 8 мМ для декаметония и 200 мкМ для ё-тубокурарина. Полученные значения оказались такого же порядка, что и у изолированной а-субъединицы нАХР. Однако, полученные нами данные свидетельствуют о связывании с довольно низким сродством, в отличие от взаимодействия с цельным рецептором. Следует отметить, что и в других лабораториях при работе с изолированной субъединицей, а также с белками, отвечающими полноразмерному экстрацеллюлярному домену субъединицы или их аналогам не удалось получить высокоэффективного связывания низкомолекулярных лигандов.

Рис. 4. Специфическое связывание [ю1]аВ||;1 с а(1-209) в присутствии 1% Р-октилглюкозида. Общая концентрация белка, растворенного в 50 мМ Трис-НС1, рН8.0, 1% р-октилглюкозид, составила 400 нМ. Неспецифическое связывание определяли в присутствии 100-кратного избытка по отношению к концентрации радиоактивного лиганда.

Рис. 5. Ингибирование специфического связывания [12!1]аВ^ с а(1-209) в присутствии декаметоний бромида (•) и d-тубокурарина (■). Концентрация белка в 50 мМ Трис-НС1, рН8.0 составила 3 мкМ. Неспецифическое связывание определяли в присутствии 100-кратного избытка аВ^ по отношению к концентрации радиоактивного лиганда.

Подобие полученного домена а(1-209) с нативным АХР проверяли с использованием конформационно-зависимых моноклональных антител (рис. 6). Данные антитела были получены проф. А. Винсент (Оксфорд) при использовании нативного рецептора. С а-субъединицей нативного АХР взаимодействовали только два моноклональных антитела: M2D11 и M4D11, в то время как с а(1-209) только M4D11. Антитела М2С2, и в меньшей степени М5В5, взаимодействуют с комплексом а( 1-209). Связывание этих антител является конформавционно-зависимым и направлено на аВ£1-связывающий сайт, который проявляет меньшую афинность к d-тубокурарину и другим лигандам. Антитела ингибируют связывание но не вызывают осаждение

а(1-209) при полном насыщении [,251]аВ^. Однако, в отличие от нативного АХР, а(1-209) имеет сайт связывания (отличный от аВ^-связывающего сайта), который взаимодействует с антителами, вызывая иммунопреципитацию комплекса

(рис. 6) и связывание антител с которым не ингибируется (данные не

приведены). Из этих опытов следует, что у домена есть общие черты в экспонировании поверхностных участков полипептидной цепи с нативным АХР, однако имеются и отличия.

Рис. б. Связывание моноклональных антител с доменом Иммунопрципитация комплекса

[,25Х](хВё1 - а(1-209) с моноклональными антителами против АХР в сравнении [ш1]аВр - АХР. Антитела М2С2 и М5В5Н направлены против токсин-связывающего участка АХР.

Таким образом, белок а(1'209) взаимодействует с нейротоксинами (аВ§1), с низкомолекулярными антагонистами ^-тубокурарин и декаметоний) и с антителами,

специфичными к Torpedo АХР. В итоге, несмотря на отмеченные выше отличия в эффективности взаимодействия с антагонистами и антителами, полученный домен может служить в качестве удобной модели для изучения экстрацеллюлярного участка а-субъединицы АХР.

Вторичную структуру белка а(1-209) исследовали с использованием оптических методов анализа. Расчет спектра КД с помощью программы CONTIN дал следующие значения: 32% а-спиралей, 50% Р-структур, 18% неупорядоченных структур. Приведенные данные были впервые получены для экстрацеллюлярного домена а-субъединицы Torpedo californica.

2. Фторсодержащие аналоги экстрацеллюлярного фрагмента а-субъединицы

Torpedo californica: а(1-209)F и его мутант [Trp60Phe]-a(l-209)F. Другим способом пространственной характеристики домена является метод ЯМР, в частности использование F в качестве метки. Учитывая важность триптофановых остатков в организации токсин-связывающего сайта, мы выбрали фторированное производное триптофана в качестве метки для

"f-ямр- исследований. Поскольку фтораминокислоты токсичны для клеток Е.соН, потребовался подбор штаммов и условий выращивания, которые позволили бы добиться компромисса между приемлемыми выходами биомассы и достаточно высокими уровнями включения остатков

В результате было найдено оптимальное количество добавляемого в среду (порядка 100 мкМ) и выбраны подходящие клетки (AD494), в которых выходы белка достигали ~ 60 мг/л культуры, а включение Tip(5F) в расчете на 8 остатков триптофана в доменах составляло ~ 50%. Степень включения фтора определяли тремя способами: масс-спектрометрический анализ пептидов, получаемых при триптическом гидролизе фторированного белка (рис. 7); анализ с помощью ВЭЖХ на обращенной фазе продуктов кислотного гидролиза фторированного белка в мягких условиях (триптофан практически не разрушается) или - с помощью

"F-ЯМР.

Триптический гидролиз проводили так же, как и для нефторированного белка. Сигналы, отвечающие всем восстановленным триптофан-содержащим пептидам с приростом массы на 18 ед. были обнаружены, кроме пептида Т18 (низкая мол. масса) и Т19(рис.7).

Для определения уровня включения остатков проводили кислотный

гидролиз a(l-209)F в условиях минимальной деструкции остатков триптофана (6 М НС1: ТФУ =1:2 (по объему), 165 °С, 20 мин). Полученный гидролизат анализировали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ.

масса-Да масса, Да

Рис. 7. Доказательство включения фтора в домен а(1-209)Р с помощью MALDI MS анализа триптического гидролизата восстановленного белка. Трипсинолиз проводили после проведения гель-электрофореза, с последующим анализом соответствующей полосы на геле. Включение фтора составляет более 50%. * - обозначены сигналы, отвечающие пептидам, содержащим атом фтора. На спектре б) видно небольшое количество модифицированного пептида (с окисленным метионином, Мг 2762.0 Да).

Фторированный и нефторированный домены были охарактеризованы также с помощью спектров флуоресценции. Для белка а(1-209) получили Ртах = 199 И Х.тах = 341.0 нм, а для белка а(1-209)Р - йпах = 174 и Хшах = 340.8 нм. Хтах практически совпадает у обоих доменов и смещена в коротковолновую область УФ-диапазона по сравнению с белком в денатурированном состоянии (Ялпах ~355 нм). Если триптофановые остатки были бы полностью внутри глобулы, то Хшах была бы ~ЗЗО нм. Следует отметить, что спектр белка в денатурированном состоянии практически совпадает со спектром свободного триптофана (условия экспонирования всех остатков триптофана в растворитель). Возможны два объяснения полученных спектральных характеристик: некоторые остатки триптофана находятся внутри глобулы (то есть, это указывает на, по крайней мере, частичную ренатурацию белков) или же часть их

экспонирована и контактирует с соседними молекулами белка в составе агрегатов, что также может приводить к наблюдаемому частичному экранированию.

В целом, спектры флуоресценции показали подобие фторированных и нефторированных доменов и их отличие от денатурированных форм.

"Р-ЯМР исследования*.

Характер "Б-ЯМР- спектра белка в 6 М мочевине и в ее отсутствии мало

меняется: оба спектра представляют собой широкий сигнал (полуширина 700 Гц), очевидно, являющийся суперпозицией сигналов от разных остатков в белке с

достаточно малой дисперсией химических сдвигов (~1.0 м.д.). На основании результатов гель-хроматографии образцов в водных средах можно предположить, что одной из причин широких сигналов является агрегация белка. В связи с этим представляло интерес снять спектры в присутствие детергентов.

Данные гель-хроматографии показали, что существенного снижения доли агрегатов можно добиться с помощью концентраций 8Э8, не превышающих 0.1%. Подобные концентрации не являются полностью денатурирующими. Это следует из

результатов, полученных в нашей лаборатории, а именно данных спектров КД в водных буферных растворах и в присутствии 0.2% для домена 1-209, не содержащего

атомов фтора, а также из литературных данных о том, что добавки небольших количеств

(~0.02%) к выделенной в денатурирующих условиях а-субъединице рецептора Т.саН/огпжа или к синтетическим фрагментам экстрацеллюлярного домена способствовали ренатурации и улучшению связывания бунгаротоксина. Поэтому казалось целесообразным снять спектр 19Р-ЯМР при концентрации В

присутствии 0.05% (рис. 8а) сигнал в спектре "Р-ЯМР становится более узким.

Представлялось целесообразным проверить возможность упрощения спектра при использовании мутантов, имеющих меньшее число остатков На рис. 86 приведен

спектр белка [Тгр60РЬе]-а(1-209)Р, который получен аналогично домену "дикого типа", т.е. выделен с помощью аффинной хроматографии на №-МТЛ-агарозе, а затем подвергнут восстановлению в денатурирующих условиях и последующему рефолдингу в присутствии 0.05% 8Э8. В этом спектре имеются отличия от спектра исходного белка, которые могут быть обусловлены как исчезновением сигнала остатка так и

снятием его возможного влияния на химические сдвиги сигналов других пространственно сближенных с ним остатков

* снятие спектров образцов проводили к.х.н. Т.А. Балашова и к.х.н. П.В. Дубовский

Спектры белков а(1-209)Р И [Тгр60РЬе]-а(1-209)Р в присутствии 2% SDS и меркаптоэтанола (рис. 9а, б), т.е. в условиях, когда эти белки, согласно данным электрофореза (рис. 1), находятся преимущественно в виде мономеров, сходны и состоят из четырех перекрывающихся сигналов. Регистрация спектров в одинаковых условиях позволила сравнить их интегральные интенсивности и получить дифференциальный спектр (рис. 9в). С учетом количества остатков триптофана в белке и в предположении равномерного включения фтора в разные остатки триптофана, можно полагать, что сигнал в спектре рис. 9в отвечает остатку

Рис. 8. Спектры "Р-ЯМР белков а(1-209)Р (а) и [Тгр60РЬе]-а(1-209)Р (б) после сборки в присутствии 0.05% SDS (50 мМ Трис-НС1, рН 8.0).

Рис. 9. Спектры "Р-ЯМР белков а(1-209)Р (о) и [Тгр60РЬе]-а(1-209)Р (б), снятые в присутствии 2% SDS и 100 мМ р-меркаптоэтанола. в) - разностный спектр б) и а). Химические сдвиги указаны относительно сигнала

Взаимодействие рекомбинантньгх экстрацеллюлярных доменов с а-нейротоксинами было проанализировано также методом с регистрацией как сигнала

трифторацетилированного производного кобратоксина, так и сигналов содержащего белка а(1-209)Р в свободном состоянии и в комплексе (рис. 10). Преимущество "Р-ЯМР-титрования по сравнению с радиолигандным анализом состоит в

отсутствии необходимости удалять промывками избыток токсина, что может приводить к

1.0

занижению определяемого числа центров связывания, если прочность комплекса недостаточно высока.

19г

Практически полное уширение сигнала Р трифторацетильной группы [СИзСО-Ьу823]-о-кобратоксина при соотношении токсин-домен 1:1 (рис. 106) и появление его вновь при соотношении 2:1 (рис. 10в) указывает на образование стехиометрического комплекса. Однако добавление одного эквивалента токсина (не трифторацетилированного) к раствору фторированного домена вызывало лишь очень небольшие изменения в области сигналов остатков белка (данные не

приведены).

Рис. 10. Спектр

кобратоксина в свободном виде (а) и в присутствии белка а(]-209)Рв соотношении (токсин-белок) 1:1 (б) и 2:1 (в) (приведена область сигналов группы). а): водный раствор токсина 0.3 мг/мл, химический сдвиг указан относительно (10"5 М); острый сигнал при 0.0 м.д. здесь и на спектрах б) и в) принадлежит следам противоионов СРзСОО' в токсине, лиофилизованном после ВЭЖХ в градиенте ацетонитрила в присутствии 0.1% СТзСООН.

(а)

J_;

0.5

0.0

-0,5 -1,0

М.Д.

-1,5

-2,0

3. Две формы экстрацеллюлярного домена а-субъединицы мышечного АХР

человека.

Плазмиды, кодирующие экстрацеллюлярный домен мышечного никотинового АХР человека были любезно предоставлены проф. А. Винсент (Институт молекулярной медицины, Оксфорд). Конструкция НЕ710 соответствует полноразмерному экстрацеллюлярному домену (остатки 1-209), HR710 - содержит Р3А экзон. Р3А экзон кодирует дополнительные 25 остатков, расположенных между 58 к 59 аминокислотными остатками экстрацеллюлярного домена.

Сборку доменов осуществляли тремя способами: медленный диализ растворенного белка в 8 М мочевине против водного буфера; быстрое разбавление восстановленного и денатурированного белка водным буфером в присутствии тетрадецилтриметиламмоний бромида и а-циклодекстрина; а также сборка на колонке с Ni-NTA-агарозой. Медленный диализ проводили как описано выше в случае с Окисление цистеиновых

остатков проводили кислородом воздуха. В методе, использующем тетрадецилтриметиаммонийбромид и циклодекстрин, окисление проводили кислородом воздуха в присутствии окисленного и восстановленного глутатионов.

Следует отметить, что при сборке с участием а-циклодекстрина белки получаются в очень низкой концентрации, что не позволило охарактеризовать их с помощью КД-спектроскопии. Во всех случаях получались водорастворимые агрегаты. Белки, полученные способом медленного диализа, охарактеризовали спектрами КД.

Рассчитанные величины для НЕ: 34% а-спиралей, 31% р-структур, 34% неупорядоченных структур. Для ИЯ: 39% а-спиралей, 25% Р-структур, 35% неупорядоченных структур. По сравнению с другими экстрацеллюлярными доменами, используемыми в этой работе данные белки имеют пониженное

содержание р-структур.

Белки, полученные с использованием различных способов сборки, были охарактеризованы методом флуоресценции (концентрация белка 0.15 мг/мл) (табл. 2).

таблица 2

Флуоресцентные данные образцов, полученных при разных способах рефолдинга.

метод сборки белок Fmax Хтах, нм

медленный диализ НЕ 8 342.2

HR 9 342.0

способ с участием а-циклодекстрина НЕ 26 341.5

HR 47 342.0

сборка на колонке с М-ЫТА-агарозой НЕ 137 342.4

HR 125 342.6

Следует отметить, что Хтах для мышечных доменов примерно такая же, что и у фторированных и нефторированных доменов Torpedo. При постоянстве Хтах можно наблюдать зависимость Fmax от способа сборки. Максимальная величина, которую можно получить при такой концентрации белка, составляет 250 (рассчитывается из предположения, что образец представляет собой раствор триптофана, с концентрацией соответствующей всем триптофановым остаткам в белке). Это соответствует условиям экспонирования всех триптофановых остатков в растворитель и отсутствию тушения сигналов (свободная аминокислота в растворе).

Результаты взаимодействия моноклональных антител с мышечными доменами, полученными при различных способах сборки, представлены на рис. 11. Моноклональные антитела mAb35 (предоставлены проф. Д. Линдстремом, Пенсильванский Университет, Филадельфия) являются конформационно зависимыми и распознают участок 67-76 (главную иммуногенную область в а-субъединице мышечного АХР).

Рис. 11. Связывание моноклональных антител (тАЬ35) с доменами НЕ 1) и Ж 2), полученными при разных условиях сборки: а) медленный диализ; б) сборка в присутствии тетрадецилтриметиламмоний бромида и циклодекстрина; в) сборка на колонке с №-ОТЛ-агарозой.

Наилучшие результаты были получены в случае сборки на колонке. Однако, наибольшей стабильностью при хранении отличались образцы, полученные с использованием тетрадецилтриметиаммонийбромида и СИ-циклодекстрина. Именно эти белки были предоставлены в НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН (проф. Б.М. Гехт, отделение миастении) для анализа уровня аутоантител.

В этой работе была показана принципиальная возможность детектирования аутоантител у больных, страдающих различными формами миастении. Был также проведен сравнительный анализ серии сывороток (полученных из НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН) с использованием домена и разработанного в нашей лабороатории метода ИФА и метода радиоиммунного анализа (выполненного в лаб. проф. А. Винсент в Институте молекулярной медицины, Оксфорд) (рис. 12). Следует отметить, что чувствительность ИФА метода является достаточно высокой, но радиоиммунный анализ дает более высокие различия между уровнями, определяемыми в контролях и у больных.

Рис. 12. Сравнительный анализ группы сывороток, полученных от больных и здоровых доноров: а) методом радиоиммунного анализа; б) методом ИФА с использованием мышечного экстрацеллюлярного домена домена а-субъединицы человека. В контрольную группу входили сыворотки как здоровых доноров, так и больных рассеянным склерозом и боковым амиотрофическим склерозом.

4. Экстрацеллюлярный фрагмен1х7-субъединицы крысы а7(7-208) и его мутант [CyslléSer, Cysl90Ser, Cysl91Ser]-a(l-209)

В предварительных опытах (выполненных к.х.н. А.Ф. Шевалье) при использовании различных векторов и условий выращивания клеток не удалось добиться значительной экспрессии фрагмента кДНК, эквивалентного полноразмерному экстрацеллюлярному домену <х7-субъединицы, включающему остатки 1-208. Поэтому была получена конструкция, кодирующая домен с укороченной N-концевой последовательностью, соответствующей фрагменту 7-208.

Для последующего изучения роли цистеиновых остатков в сборке белка сконструировали мутантную плазмиду. Замену остатка Cys на Ser в 116, 190, 191-положениях проводили методом ПЦР в два этапа (опыты выполнены совместно с к.х.н. Н Дергоусовой). На первой стадии получили фрагмент кДНК, отвечающий замене в а7-субъединице остатка Cys на Ser в 116 положении, используя для этих целей следующие мутагенные праймеры

GGG CAT AGC CAG ТАТ СТС (прямой), Cys 116Ser

GAG ATA CTG GCT ATG CCC (обратный).

На второй стадии, используя в качестве матрицы полученный ранее фрагмент кДНК, получили фрагмент кДНК, отвечающий замене в а7-субъединице остатка Cys на Ser в 190 и 191 положениях

ТС ТАТ GAG AGC ТСС ААА GAG СС (прямой), Cys 190,191 Ser GG СТС ТТТ GGA GCT CTC ATA GA (обратный).

Дальнейшие этапы клонирования были такими же, как описано ранее для получения мутанта Корректность полученной конструкции подтверждали

сиквенированием по методу Сентера.

В результате масс-спектрометрических исследований полученных доменов для белка а7(7-208) была получена масса 25410 Да. Теоретически рассчитанная величина составляет 25338.71 Да. В случае с мутантом, получили 25330 Да, при теоретически рассчитанной - 25290.51 Да. Как видно, экспериментально полученные массы находятся в ожидаемом диапазоне.

Особенностью а7-субъединицы является наличие свободной сульфгидрильной группы остатка Cys 116. Недавно в нашей лаборатории было показано, что эта сульфгидрильная группа способствует агрегации при сборке домена 1-208 в составе гибридного белка с GST, тогда как ее замена на Ser снижает степень агрегации. Мы хотели проверить, как отразится на способности к сборке и связыванию токсина удаление не только этой группы, но и остатков Cys 192 и Cys 193, образующих

вицинальный дисульфид. Следует отметить, что в раде работ было показано, что устранение этого вицинального дисульфида (по крайней мере в соответствующих синтетических фрагментах Ot-субъединицы или пептидах из комбинаторных библиотек) не устраняет способность к связыванию а-нейротоксинов.

Пептиды триптического гидролизата восстановленного экстрацеллюлярного домена субъединицы определяются методом MALDI MS труднее, чем в случае с доменом субъединицы Torpedo californica. Для белка а7(7-208) удалось подтвердить только 20% аминокислотной последовательности. Следует отметить, что замена трех цистеиновых остатков на сериновые значительно сказалась на возможности определения данным методом: для Cx7(7-208)Mut удалось подтвердить 60% аминокислотной последовательности.

Ренатурацию белка а7(7-208) и его мутанта проводили следующим способом. На первой стадии образцы восстанавливали 100 мМ DTT в 6М GuHCl или 8М мочевине. В обоих случаях белок в этих условиях присутствует в мономерной форме (здесь и далее контроль гель-хроматографией на Superdex-200 в буфере, в котором находится образец). При последующем диализе против водного буфера белок полностью выпадал в осадок, если был растворен в GuHCl, и частично - при использовании мочевины. То, что оставалось в растворе, соответствовало по хроматографическим свойствам белку в агрегированном состоянии. Для того чтобы узнать, при какой концентрации мочевины начинается агрегация, проводили ступенчатый диализ образца против понижающейся концентрации мочевины в присутствии DTT для предотвращения образования дисульфидных связей. Оказалось, что вплоть до 2М мочевины белок находится в мономерном состоянии, без присутствия каких-либо олигомерных форм (рис. 13, профиль а). Понижение концентрации мочевины до 1.5 М приводит к резкому переходу к олигомерному состоянию с незначительным содержания мономера и преобладанием высокомолекулярных агрегатов (рис. 13, профиль б). Снижение концентрации мочевины до 0 М приводит к образованию высокоагрегированных форм белка (профиль е).

Соотношение олигомерных и высокополимерных форм зависело от исходных концентраций белка в растворах, в которых проводили процесс сборки Так, использование повышенных концентраций белка (более 1 мг/мл) приводило к образованию исключительно высокополимерного агрегата, однако при концентрации белка 0.4 мг/мл удавалось получать пентамер, с большим или меньшим содержанием полимера.

Рис. 13. Гель-фильтрационный профиль на Superdex-200 белка Сс7(7-208), прошедшего медленный диализ против понижающейся концентрации мочевины в буфере, а) — 8-2 М, б) -1.5 М, в)-ОМ.

Нами было изучено влияние длительности диализа и ионной силы буфера на процесс сборки белка. В качестве буферного раствора использовали 20 мМ триС-НС), рН 8.0. Варьирование длительности диализа не оказывало существенного эффекта на ренатурацию, в то время как ионная сила имела важное значение. Так, при концентрации 200 мМ происходило полное осаждение белка. Исключение из диализного буфера

N0 привело к получению более стабильных результатов и повышению доли пентамерной формы на фоне полимера, то есть повышение ионной силы буфера приводит к агрегации.

Нами была также проверена возможность сборки домена на колонке с Ni-NTA-агарозой. На колонке можно имитировать большую степень разведения белка, для чего надо использовать такую концентрацию белка на носителе, при которой глобулы белка не будут контактировать друг с другом. При этом отпадает потребность в последующем концентрировании белка, если при посадке белка на колонку выбрали подходящую концентрацию белка. Можно контролировать скорость снижения концентрации мочевины, а также состав буфера. Единственным недостатком метода было то, что приходилось учитывать чувствительность носителя к восстанавливающим агентам и невозможность работы при их высоких концентрациях.

Контроль за образованием в процессе окисления олигомерных структур, связанных межмолекулярными дисульфидными связями, проводили с помощью гель-электрофореза в невосстанавливающих условиях. Оказалось, что на колонке в отсутствие кислорода в буфере белок сохраняет свои сульфгидрильные группы (контроль по реакции Эллмана) до момента снятия с носителя. Последующее окисление можно проводить после снятия с колонки или на самой колонке, пропуская через нее буфер, содержащий кислород воздуха. Мы проверили оба варианта. Следует отметить, что процесс окисления на колонке протекает достаточно медленно. Нам не удалось полностью окислить все

свободные сульфгидрильные группы (после 30 дней образец содержал ~0.75 SH / моль белка). По-видимому, наличие ионов никеля ингибировало этот процесс, или процесс образования правильно замкнутых дисульфидов протекает заметно медленнее, чем образование межмолекулярных цистеиновых мостиков (наблюдается для белка в свободном виде в растворе). Последнее предположение кажется более верным, так как белок склонен принимать конформацию, которая вызывает агрегацию и как следствие сближение цистеиновых остатков, принадлежащих различным молекулам белка.

Понижение концентрации мочевины на носителе осуществляли с помощью градиента различной длительности. В частности, был использован вариант, когда после снижения концентрации мочевины до 2 М, колонку оставляли в этом буфере на 16 ч. Имеющиеся литературные данные указывают на то, что в таких условиях уже может достаточно эффективно идти сворачивание различных белков, тогда как степень агрегации еще минимальна.

Опыты с использованием радиоактивно меченного aBgt показали, что домен а(7-208), а также его мутант a(7-208)Mut связывают токсин на нитроцеллюлозной мембране как в блоте, так и в доте.

Следующим шагом было использование различных неионных детергентов в процессе сборки белка. Нами были испробованы твин-20, Тритон Х-100, CHAPS и Р-октилглюкозид. Детергенты добавляли или вместе с имидазолом при элюировании целевого белка (в случае с Р-октилглюкозидом), или же детергент добавляли в буферный раствор сразу же при начале снижения концентрации мочевины. Из всех опробованных детергентов наилучшим оказался твин-20. В его присутствии удалось воспроизводимо получить белок в пентамерной форме, преобладающей при концентрации белка 0.05 мг/мл (рис. 14).

0,020 0.U15

о" 0.010 о

0.005 0,000

о ' 5 ¡о ¡5 ' 20 ' 25 0.1% твин-20.

МЛ

Изучение агрегатного состояния белка после ренатурации выявило, что со временем белок переходит в полимерное состояние. Сравнительный анализ образцов с помощью гель-электрофореза в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях

показал, что происходит полимеризация по цистеиновым остаткам, с образованием межмолекулярных дисульфидных связей. Следует отметить повышенную склонность данного белка к образованию дисульфидных связей (внутри- и межмолекулярных). При анализе триптических гидролизатов белков, которые не подвергли предварительному восстановлению, мы обнаружили пептиды, связанные между собой "правильными" дисульфидными связями.

Мы также попытались контролировать процесс окисления посредством подбора соответствующей редокс-системы. В качестве таковой использовали мсркаптоэтанол или смесь окисленного и восстановленного глутатионов. Для замедления скорости окисления реакционную смесь выдерживали при +4 °С. Выводом всех экспериментов является то, что белок со временем полимеризуется по цистеиновым остаткам (контроль с помощью электрофореза в невосстанавливающих условиях). Наличие избытка восстанавливающего агента лишь отодвигает данный процесс во времени, но не влияет на конечное состояние. В случае процесс образования межмолекулярных дисульфидных

связей шел особенно активно по сравнению с

Можно было полагать, что поскольку белок имеет нечетное число

цистеиновых остатков, то он в большей степени будет предрасположен к образованию межмолекулярных дисульфидных связей. Для проверки этого предположения было проведено контролируемое окисление мутантного белка, имеющего всего два цистеиновых остатка. Уменьшение числа остатков цистеина повлияло всего лишь на скорость образования полимерных структур.

Спектры КД обоих белков практически совпадают. Вид спектра предполагает наличие большого вклада Р-структур. Расчет спектров с помощью программы СОЭТШ дал следующие значения для а7(7-208): 14% а^спиралей, 51% Р-структур, 35% неупорядоченных структур; для а7(7-208)МШ: 11% а-спиралей, 52%Ртруктур, 37% неупорядоченных структур. Данный белок по сравнению с содержит

значительно меньше а-спиралей и более высокую долю неупорядоченных структур. Содержание структур в обоих белках практически одинаковое.

Интересно отметить, что по данным рентгеноструктурного анализа, ацетилхолин-связывающий белок из Lymneae stagnalis (который подобно а7 АХР представляет собой пснтамер), имеет схожую вторичную структуру: 8% а-спиралей, 12% Р-изгибов, 49% Р" складчатых листов, 31% неупорядоченных структур.

Данные флуоресценции для доменов (0.15 мг/мл), прошедших сборку на колонке в присутствие твина-20: для белка сс7(7-208) получили Fmax = 202 и tanax = 342.0 нм, а

для белка

Хтах а7(7-208) немного меньше по сравнению с a7(7-208)Mut. В целом можно сделать те же выводы, что и для домена а-субъединицы Torpedo: остатки триптофана частично экранированы внутри глобулы или часть их экспонирована и контактирует с соседними молекулами белка.

Для белка были проведены иммунохимические исследования. В первую

очередь следует отметить, что этот домен достаточно эффективно взаимодействует с аффинно-очищенными антителами, полученными против синтетического фрагмента 179190 С(7-субъединицы крысы (антитела предоставлены к.б.н. Скок М.В., Институт биохимии им. А.А. Палладина, Киев). Эти антитела направлены против основного токсин-связывающего участка субъединицы рецептора. Домен не

взаимодействует с антителами, полученными против синтетического фрагмента 43). По-видимому, указанный участок последовательности является экранированным в домене а7(7-208).

5. Цитоплазматический фрагмент 8-субъединицы Torpedo californica 8(313-455)

Нами была сконструирована гибридная плазмида на основе вектора рЕТ28. В него по сайту Nde I клонировали участок кДНК, отвечающий аминокислотным остаткам 313455 5-субъединицы Torpedo californica. Белок во время экспрессии получился в виде тел включения. Нами были испробованы различные способы сборки белка. Сборка на колонке с Ni-NTA-агарозой дала водорастворимые агрегаты. Удаление мочевины на гель-фильтрационной колонке Superdex-200 (уравновешенной буфером 50 мМ Трис-НС1, 150 мМ КС1, 10 мкМ EDTA, рН 7.5) привело к образованию димера (рис. 15). Образование мономерной формы белка в водном растворе можно было зафиксировать только при нанесении на колонку малых количеств белка (- 0.2 мг).

Рис. 15. Гель-фильтрационные профили на 8ирегёех-200 белка 5(313-455) в зависимости от количества нанесенного образца.

0 5 10 15 20 25

МЛ

Максимальная величина концентрации белка, получающегося в виде димера, которую удалось получить в этом буфере, составила 0.2-0.3 мг/мл. При таком способе сборки белка последний подвергался дополнительной очистке, и в результате получили практически гомогенный препарат.

Мы решили проверить способность полученного в водной среде белка фосфорилироваться с помощью РКА и тирозинкиназы.

Для работы вышеперечисленных ферментов требуется наличие в буфере ионов однако, добавление ионов магния к белку приводит к его немедленному осаждению. Чтобы избежать этого, мы использовали сульфобетаин (NDSB). Данное соединение не является детергентом и не ингибирует активности галактозидазы и фосфатазы. В этих условиях белок 5(313-455) остается водорастворимым в присутствии ГО мМ МёС]2.

Фосфорилирование проводили в стандартных условиях в присутствии 2 М NDSB-195/NDSB-201, 2-3 ед. РКА / мкг белка, а также [32Р]АТФ. По окончании реакции фосфорилированный белок выделяли методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. По данным MALDI TOF масс-спектрометрии, а также по данным анализа радиоактивности собранных фракций, включение составило 2.5 моль фосфатных групп на моль белка.

Аналогичную процедуру провели для тирозинкиназы. Максимальное включение фосфатных групп составило 0.3-0.5 моль на моль белка.

Локализацию фосфатных групп проводили путем расщепления белка с помощью трипсина и/или Glu-C эндопротеиназы. Полученные пептиды разделяли с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ и анализировали с помощью MALDI TOF масс-спектрометрии. Получили три радиоактивных пептида: один элюировался сразу после нанесения на колонку реакционнной смеси, два других - при ~14 и 16% ацетонитрила, соответственно. Во фракции собранной при 14% ацетонитрила обнаружили пептид с молекулярной массой 1242 Да, которая соответствует фрагменту RSSSVGYISK (аминокислотные остатки 359-368, 1084 Да). Анализ методом MALDI TOF масс-спектрометрии выявил две фосфатные группы в положениях Ser361 и Ser362. Во фракции собранной при 16% ацетонитрила обнаружили пептид с молекулярной массой 951 Да. Эта масса соответствует фрагменту GSHMHFR, включающем часть линкера (GSHM) и короткий ^концевой сегмент (HFR) цитоплазматической петли.

Масс-спектрометрический анализ пептидов, полученных при расщеплении с помощью Glu-C эндопротеиназы, подтвердил локализацию фосфатных групп в белке, фосфорилированном РКА.

Для локализации тирозинового сайта фосфорилирования, белок фосфорилировали Abl-протеинкиназой и затем расщепляли трипсином. Анализ пептидов обнаружил пик, соответствующий массе 545. Для его обнаружения использовали сканирование в мультиионном режиме. Этот сигнал соответствует бизарядному фосфорилированному пептиду AQEYFNK, содержащему Туг372, который фосфорилируется и в нативном рецепторе [220,221].

Спектры КД не выявили существенных различий в спектрах фосфорилированного и нефосфорилированного белка, что свидетельствует об отсутствии глобальных изменений во вторичной структуре белка.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны условия продукции в E.coli внеклеточного N-концевого и цитоплазматического доменов мышечных и нейрональных холинорецепторов, а также последующего получения ренатурированных водорастворимых форм, пригодных для спектральных и функциональных исследований.

2. Получен N-концевой лиганд-связывающий домен (остатки 1-209) а-субъединицы ацетилхолинового рецептора Torpedo californica, показано его взаимодействие с а-нейротоксинами и моноклональными антителами против интактного рецептора.

3. Путем выращивания клеток E.coli на среде с 5-фтортриптофаном получен домен 1-209 а-субъединицы Torpedo, в котором включение Trp(5F) составило 50%. Проведено частичное отнесение сигналов в спектре "F-ЯМР с использованием мутанта Тгр60РЬе. Показано, что "F-ЯМР является удобным методом контроля при оптимизации условий рефолдинга.

4. В виде растворимого олигомера получен цитоплазматический домен (остатки 313-455) 5-субъединицьг холинорецептора Torpedo californica и показана его способность фосфорилироваться протеинкиназой А. Установлено, что фосфорилирование не сопровождается существенными изменениями во вторичной структуре домена.

5. Для склонного к агрегации внеклеточного домена субъединицы нейронального холинорецептора крысы найдены условия рефолдинга, приводящие к растворимым олигомерным формам.

6. Получена экспрессия в E.coli различных форм N-концевого домена а-субъединицы мышечного холинорецептора человека и показана возможность использования этих белков для определения уровня аутоантител у больных миастенией.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. Tsetlin V., Shevalier A., Alexeev Т., Telyakova О., Utkin Yu., Vincent A., Beeson D., Methfessel С Purification of the acetylcholine receptor a-subunit domains expressed in E.coli. J. Neurochem. 1997. V.69. S121.

2. Кривошеин А.В., Куделина И.А., Алексеев Т.А., Шевалье А.Ф., Уткин Ю.Н., Цетлин

B.И. Вторичная структура фрагментов а-субъединицы ацетилхолинового рецептора Torpedo californica. Биоорган. химия. 1998. Т.24. N.12. С.930-932.

3. Alexeev Т., Krivoshein A., Shevalier A., Kudelina I., Telyakova О., Vincent A., Utkin Yu., Hucho F., Tsetlin V. Physicochemical and immunological studies of the N-terminal domain of the Torpedo acetylcholine receptor alpha-subunit expressed in Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 1999. V.259. P.310-319.

4. Алексеев Т.А., Дергоусова Н.И., Шибанова Е.Д., Азеева Е.А., Крюкова Е.В., Балашова Т.А., Дубовский П.В., Арсеньев А.С., Цетлин В.И. Получение в E.coli и "F-ЯМР исследование 5-фтортриптофансодержащего N-концевого домена а-субъединицы ацетилхолинового рецептора Torpedo californica. Биоорган, химия. 2003. Т.29, N.4.

C.384-390.

5. Kottwitz D., Kukhtina V., Dergousova N., Alexeev T, Utkin Yu, Tsetlin V. and Hucho F. Intracellular domains of the subunits of Torpedo and rat acetylcholine receptors -expression, purification and characterization. Protein Expression and Purification. 2004. V.38. N.2. P.237-247.

6. Utkin Yu., Shevalier A., Alexeev Т., Telyakova 0., Krivoshein A., Tsetlin V. Use of HPLC and mass-spectrometry for characterisation of genetically produced acetylcholine receptor domains. International Congress on Analytical Chemistry (Moscow, Russia, June 15-21, 1997). Abstracts, p.24.

7. Alexeev Т., Shevalier A., Dergousova N., Shibanova E., Azeeva E., Kryukova E., Balashova Т., Dubovsky P., Arseniev A. and Tsetlin V. Heterologously expressed functional domains as models for NMR analysis of membrane receptors. NMR in Protein-Protein and ProteinDNA Recognition (Moscow, Russia, 26 June - 2 July, 2000). Abstracts, p.26.

Принято к исполнению 22/12/2004 Исполнено 23/12/2004

Заказ № 526 Тираж: 100 экз.

0 0 0 «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095)318-40-68 www.autoreferat.ru

о,

г ♦

16 с Е Г7Л

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Алексеев, Тимофей Александрович

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Использование ЯМР спектроскопии на различных ядрах

1.2. Биосинтез белков, содержащих фтораминокислоты

1.3. I9F ЯМР исследования белков, содержащих остатки фторароматических аминокислот

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Экстрацеллюлярный фрагмент а-субъединицы Torpedo californica а(1 -209) и его мутант [Trp60Phe]-a( 1-209)

2.2. Фторсодержащие аналоги экстрацеллюлярного фрагмента а-субъединицы Torpedo californica a(l-209)F и его мутанта [Trp60Phe]-a(l-209)F

2.3. Две формы экстрацеллюлярного домена а-субъединицы мышечного АХР человека

2.4. Экстрацеллюлярный фрагмент а7-субъединицы крысы а7(7-208) и его мутант [Cysl 16Ser, Cysl90Ser, Cysl91Ser]-a(l-209)

2.5. Цитоплазматический фрагмент 6-субъединицы Torpedo californica 8(313-455)

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение в E. coli, ренатурация и исследование внемембранных доменов холинорецепторов"

Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы являются лиганд-управляемыми каналами и подразделяются на две основные группы: рецепторы мышечного типа и нейрональные. Выводы о пространственной организации всего класса АХР до недавнего времени в значительной мере основывались на данных криоэлектронной микроскопии АХР мышечного типа, выделяемого в значительных количествах из электрического органа ската Torpedo californica [1]. Установлено, что субъединицы этого рецептора (две а- и по одной р-, у- и 8- субъединице) образуют пентамерный комплекс, вдоль оси которого располагается пронизывающий мембрану ионный канал (см. обзор [2]). Согласно существующим представлениям, каждая субъединица имеет экстрацеллюлярный домен, трансмембранный участок, а также цитоплазматический домен. К настоящему времени получена информация о форме трансмембранных фрагментов, выстилающих канал, а также об элементах вторичной и третичной структуры экстрацеллюлярного домена. Установление пространственной структуры более высокого разрешения с помощью РСА натолкнулось на трудности получения кристаллов цельного рецептора. В связи с этим представляется целесообразным провести вначале детальный структурный анализ отдельных функциональных доменов АХР.

В экстрацеллюлярном домене АХР происходит связывание ацетилхолина, а также различных других агонистов и антагонистов. Следует отметить, что экстрацеллюлярный домен а-субъединиц (или их фрагменты) были достаточно давно получены с помощью гетерологичной экспрессии в Escherichia coli, как правило, в виде тел включения. Изучение пространственных и функциональных характеристик этих белков требовало проведения их ренатурации. С помощью спектроскопии КД в ряде зарубежных лабораторий, а также в нашем институте была определена вторичная структура белков, отвечающих экстрацеллюлярному домену а-субъединиц мышечного АХР мыши и рецептора Т. calif ornica, изучено ' связывание этими доменами токсинов и моноклональных антител. При этом стало очевидно проведения оптимизации условий сборки белка, предотвращения образования агрегатов при достижении достаточно высоких концентраций белка, при которых возможно изучение пространственной структуры методом РСА или ЯМР.

Каждая субъединица АХР содержит достаточно протяженную цитоплазматическую петлю (100-150 аминокислотных остатков) между третьим и четвертым трансмембранными фрагментами. Цитоплазматическая петля играет большую роль в функционировании рецептора. Фосфорилирование внутриклеточного домена вызывает увеличение скорости десенситизации рецептора.

В связи с этим, нами были поставлены задачи разработать условия экспрессии внемембранных (экстрацеллюлярных и цитоплазматических) доменов субъединиц никотинового ацетилхолинового рецептора с последующей ренатурацией очищенных продуктов и изучения физико-химических свойств доменов. В качестве объектов исследования мы выбрали экстрацеллюлярные домены мышечного АХР а-субъединиц Torpedo и человека, а также экстрацеллюлярного домена нейронального АХР крысы. Помимо этих доменов, мы исследовали также домен, отвечающий цитоплазматической петле 8-субъединицы Torpedo. Структура цитоплазматической петли 5-субъединицы до сих пор мало изучена, поэтому одной из задач этой работы является также экспрессия и ренатурация цитоплазматического домена 5-субъединицы рецептора Torpedo с целью анализа вторичной структуры и проверки способности к фосфорилированию.

Мы решили получить фторсодержащие белки для исследования возможности применения 19Р-ЯМР для контроля процесса ренатурации и для изучения топографии лиганд-связывающих участков. Эктрацеллюлярный домен al АХР из мышц человека попытались использовать для определения уровня аутоантител у больных миастенией.

Большое значение имеют и нейрональные АХР. В частности, а7 АХР - одна из наиболее представленных в мозгу АХР. Нарушения в функционировании этого типа рецептора сопровождают ряд нейродегенеративных заболеваний, таких, например, как болезнь Альцгеймера. Отличительной чертой а7-субъединиц АХР является их способность образовывать пентамеры. Подобно рецептору Torpedo, a7 АХР с высоким сродством связывает a-бунгаротокин. Поэтому в рамках настоящей работы планировали экспрессировать в E.coli домена а7-субъединицы и изучить его свойства.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1. Получение белков, содержащих фторированные ароматические аминокислоты, и их исследование методом 19F ЯМР спектроскопии

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Алексеев, Тимофей Александрович

ВЫВОДЫ

3. Путем выращивания клеток E.coli на среде с 5-фтортриптофаном получен домен 1-209 а-субъединицы Torpedo, в котором включение Trp(5F) составило 50%. Проведено частичное отнесение сигналов в спектре 19Р-ЯМР с использованием мутанта Trp60Phe. Показано, что |9Р-ЯМР является удобным методом контроля при оптимизации условий рефолдинга.

4. В виде растворимого олигомера получен цитоплазматический домен (остатки 313-455) 5-субъединицы холинорецептора Torpedo californica и показана его способность фосфорилироваться протеинкиназой А. Установлено, что фосфорилирование не сопровождается существенными изменениями во вторичной структуре домена.

5. Для склонного к агрегации внеклеточного домена а7-субъединицы нейронального холинорецептора крысы найдены условия рефолдинга, приводящие к растворимым олигомерным формам.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Суммируя полученные результаты, можно отметить целесообразность работы с доменами рецепторов. Конечно, на этом пути встречаются определенные трудности, особенно, агрегация белков. В случае "удачного" домена можно получить хорошие характеристики, например, информация о рецепторах цитокинов, ростовых факторов получена в основном при работе с экстрацеллюлярными доменами. Для G-зависимых белков много данных было получено при исследовании функций внутриклеточных петель, полученных гетерологической экспрессией.

Для экстрацеллюлярного домена a-субъединицы Torpedo californica. были получены удовлетворительные результаты по связыванию нейротоксинов и вытеснению низкомолекулярных лигандов. Менее успешные результаты в работе с доменом а7-субъединицы можно объяснить ее повышенной склонностью к агрегации. Наличие в литературе характеристик гомологичного ацетилхолин-связывающего белка позволило сопоставить полученные результаты для фрагмента а7-субъединицы.

Влияние природы белка на результат ренатурации хорошо видно из сопоставления а7(7-208) и 6(313-455). То, что оказалось приемлемым для цитоплазматической петли (КС1 в буфере) не подошло для а7(7-208), где основная масса белка выпадала на колонке, а то что выходило - соответствовало высокополимерной области (более 500000 Да).

Получение 6(313-455) в.водном буфере и не агрегированном состоянии сдело возможным проведение фосфорилирования; следовательно, белок, присутствующий в виде димера, несет на поверхности сайты фосфорилирования, доступные для протеинкиназ. Так, были локализованы сайты фосфорилирования: Ser 361 и Ser 362. Также зафиксировали фосфорилирование в лидерной последовательности белка. Фосфорилирование тирозинкиназой было менее эффективно.

Подобие КД-спектров фосфорилированной и нефосфорилированной форм свидетельствует, что фосфорилирование не вызвало глобальных изменений во вторичной структуре белка.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Клонирование кДНК, соответствующей N-концевому домену (аминокислотные остатки 1-209) а-субъединицы ацетилхолинового рецептора Т. californica.

1) Экстрацеллюлярный фрагмент а-субъединицы Torpedo californica а( 1-209)

Соответствующий фрагмент кДНК получали методом ПЦР, используя в качестве матрицы кДНК полноразмерной а-субъединицы. Для амплификации были использованы два олигонуклеотидных праймера (5'-»3'): АА AAA GGA ТСС GAA CAT GAA АСА CGT (прямой) AAA AAA AGC ТТА ACG CTG CAT GAT TTT (обратный).

Полученный в результате ПЦР фрагмент ДНК обрабатывали рестриктазами BamHVHindlU (сайты подчеркнуты) и лигировали в плазмидный вектор pQE30 (QIagen), обработанный соответствующими ферментами рестрикции. Полученной рекомбинантной плазмидой трансфецировали NovaBlue клетки, затем отбирали клоны, несущие искомую вставку, и полученной плазмидой (а(1-209) pQE) трансфецировали клетки AD494 и/или М15.

2) Экстрацеллюлярный фрагмент а7-субъединицы крысы а7(7-208) Соответствующий фрагмент кДНК получали методом ПЦР, используя в качестве матрицы кДНК полноразмерной а-субъединицы. Для амплификации были использованы два олигонуклеотидных праймера (5'—>3'):

AAA AAG GAT ССС CTG ТАС AAG GAG CTG AAA AAA AGC TTA TGT CCT ACG GCG CAT

Полученный в результате ПЦР фрагмент ДНК обрабатывали рестриктазами BamHl/Hindlll (сайты подчеркнуты) и лигировали в плазмидный вектор pQE31 (QIagen), обработанный соответствующими ферментами рестрикции. Полученной рекомбинантной плазмидой трансфецировали NovaBlue клетки, затем отбирали клоны, несущие искомую вставку, и полученной плазмидой (а7(7-208) pQE) трансфецировали клетки Ml 5.

Мутагенез.

1) Экстрацеллюлярный фрагмент а-субъединицы Torpedo californica а(1-209)

Замену остатка Тгр на Phe в 60-положении проводили методом ПЦР, используя в качестве матрицы вектор a(l-209)pQE. Последовательности мутагенных праймеров содержат рестриктный сайт С1а\ (подчеркнуто) (5'-»3'): GG CAG САА ТТТ АТС GAT GTG AGG СТТ CGC (прямой),

GCG AAG CCT CAC АТС GAT AAA TTG CTG CC (обратный).

Праймеры содержат замены нуклеотидов: вместо триплета TGG, кодирующего ТгрбО находится последовательность ТТТ (Phe) (прямой праймер) и, соответственно, вместо ССА последовательность AAA (обратный праймер). В качестве фланкирующих использовали те же праймеры, что и для получения немутантного рекомбинантного белка. Полученный в результате ПЦР фрагмент ДНК лигировали в плазмидный вектор pQE30 по рестриктным сайтам BamRUHindlll. Последовательности полученных клонированных фрагментов были определены по методу Сенгера. Клонирование и мутагенез проводили в клетках E.coli штамма NovaBlue.

2) Экстрацеллюлярный фрагмент а7-субъединицы крысы а7(7-208)

Замену остатка Cys на Ser в 116, 190, 191-положениях проводили методом ПЦР в два этапа. На первой стадии получили фрагмент кДНК, отвечающий замене в а7-субъеденице остатка Cys на Ser в 116 положении, используя для этих целей следующие мутагенные праймеры (5'—>3'): GGG CAT AGC CAG TAT CTC (прямой), GAG ATA CTG GCT ATG CCC (обратный).

Праймеры содержат замены нуклеотидов: вместо триплета TGC, кодирующего Cysl 16 находится последовательность AGC (Ser) (прямой праймер) и, соответственно, вместо GCA последовательность GCT (обратный праймер). В качестве фланкирующих использовали те же праймеры, что и для получения немутантного рекомбинантного белка.

На второй стадии, используя в качестве матрицы полученный ранее фрагмент кДНК, получили фрагмент кДНК, отвечающий замене в а7-субъеденице остатка Cys на Ser в 190 и 191 положениях, используя для этих целей следующие мутагенные праймеры (5'->3'):

ТС TAT GAG AGC ТСС AAA GAG СС (прямой), GG CTC ТТТ GGAGCTCTC ATA GA (обратный).

Праймеры содержат замены нуклеотидов: вместо двух триплетов TGCTGC, кодирующих Cysl90/191 находится последовательность AGCTCC (Ser) (прямой праймер) и, соответственно, вместо GCAGCA последовательность GGAGCT (обратный праймер). В результате, проведенных замен, появился сайт рестрикции SacI (подчеркнут). В качестве фланкирующих использовали те же праймеры, что и для получения немутантного рекомбинантного белка. Полученный в результате ПЦР фрагмент ДНК лигировали в плазмидный вектор pQE31 по рестриктным сайтам ВатЯУНтсПЕ.

Последовательности полученных клонированных фрагментов были определены по методу Сенгера. Клонирование и мутагенез проводили в клетках E.coli штамма NovaBlue.

Получение фторированных белков.

Клетки E.coli AD494, содержащие соответствующую рекомбинантную плазмиду, выращивали в среде LB до оптического плотности ОБбоо = 1. Полученную биомассу центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин и осадок два раза промывали средой М9. Клетки суспендировали в М9 до оптической плотности OD воо = 1, затем добавляли (из расчета на 200 мл клеточной суспензии) 20 мг 5Р-триптофана до конечной концентрацией 100 мкМ, 0.1 мг (100 мкл р-ра 1 мг/мл) биотина и тиамина. Выращивали 15 мин при 37°С, затем вносили IPTG до 0.2 мМ, и еще через 4 ч центрифугировали.

Выделение тел включения.

Осадок клеток, полученный при выращиваниии в 200 мл среды, суспендировали в 4 мл буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 1мМ EDTA), добавляли 1 мг лизоцима (100 мкл раствора 10 мг/мл), выдерживали 30 мин на льду, затем инкубировали 30 мин при 37°С с 4 мг дезоксихолевой кислоты (суспензия в 1 мл воды) и еще 10 мин с MgCb (конечная концентрация 20 мМ) и 20 мкг ДНК-азы. К полученной суспензии добавляли 20 мл буфера А1 (10 мМ Трис-HCl, рН 8.0) и обрабатывали ультразвуком (6 имп. по 20 с). Центрифугировали 10 мин при 10 000 об/мин и осадок промывали 20 мл буфера А1.

Аффинная хроматография на Ni-NTA-агарозе.

Отмытые тела включений (5 мг) растворяли в 10 мл буфера А2 (50 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 0.2М NaCl, 5 мМ имидазол, 8М мочевина) и наносили на 2 мл Ni-NTA-агарозы, уравновешенной в том же буфере. Промывали 10 мл буфера А2, а затем специфически связанный белок смывали ступенчато возрастающей концентрацией имидазола в буфере А2 (концентрацию имидазола повышали с шагом 20 мМ).

Ренатурация белка с помощью медленного диализа.

Раствор белка, после очистки на Ni-NTA-агарозе, обрабатывали 100 мМ DTT в течение ночи при комнатной температуре. Затем ступенчато диализовали образец против буфера A3 (50 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 1мМ EDTA), содержащего мочевину в следующих концентрациях: 7,6,5,4,3,2,1,0 М. Длительность каждой стадии составляла 2 ч.

Ренатурация белка с использованием тетрадецилтриметиаммонийбромида и а-циклодекстрина Г2111.

Раствор белка (10 мг/мл) в буфере А4 (50 мМ NaH2P04, рН 8.5, 6 М GuHCl) обрабатывали 30 мМ DTT в течение 24 ч при комнатной температуре. 5 мкл этого раствора добавляли, при быстром перемешивании, к 0.87 мл буфера, содержащего 143 мМ Трис-сульфат, рН 8.5, 1.43 мМ EDTA, 4 мМ GSH, 4 мМ GSSG, 4 мМ тетрадецилтриметиаммонийбромида. Через 10 мин добавили 0.375 мл 55 мМ а-циклодекстрина. Полученную смесь оставляли при 28 °С в течение ночи.

Ренатурация белков a(l-209)F и fTrp60Phe"|-a(l-209)F в присутствии SDS.

Образцы белков (1.0 мг/мл) в 5 мл буфера (50 мМ трис-HCl, рН 8.0) диализовали против 50 мМ Трис-HCl, рН 9.5, содержащего 8М мочевину, затем добавляли дитиотреит до конечной концентрации 100 мМ и инкубировали 10 ч при 20 °С. После этого раствор медленно по каплям при постоянном помешивании вносили в 50 мл 50 мМ Трис-НС1-буфера, рН 8.0, содержащего 0.05% SDS, и оставляли на 20 ч при 7°С. Раствор белка концентрировали ультрафильтрацией на мембране UM10 и затем подвергали диализу против 20 мМ трис-HCl, рН 8.0 с 0.05% SDS.

Аналитическая ВЭЖХ.

Обращенно-фазовую ВЭЖХ проводили на хроматографе System Gold (Beckman, Fullerton, USA), используя колонки Nucleosil 300-7 Protein PR и, Nucleosil 300-5 C4 MPN (4 X 125 мм, Macherey-Nagel, Duren, Germany) в градиенте ацетонитрила, содержащего 0.1% трифторуксусную кислоту.

Гельфильтрационную хроматографию проводили, используя Superdex-200 колонку (8 X 1000 мм, Pharmacia) в 20 мМ трис-HCl, рН 8.0 буфере. Наличие мочевины или детергентов в буфере оговаривается особо.

Определение концентрации белка.

Определение концентрации проводили двумя способами: а) окрашивание белков по методу Брэтфорда; б) поглощение при 280 нм, используя S280 60868 М ' см'1 для а(1-209) и a(l-209)F, е28о 16500 M'W1 для 5(313-455), е28о 43460 M"W для НЕ и HR, е28о 62760 М'см*1 для а7(7-208) и a7(7-208)Mut рассчитанные на основании аминокислотного состава белков.

Радиолигандный анализ взаимодействия экстрацеллюлярных доменов с а-нейротоксинами .

К растворам белков (концентрация 500 нМ) в 50 мМ Трис-НС1-буфере, рН 8.0 добавляли [l25I]aBgt в том же буфере до конечной концентрации 50-2000 нМ и инкубировали 1 ч при 30 °С. Растворы белка, которые содержали 0.05% SDS, перед проведением радиолигандного анализа разбавляли водным буфером так, что конечная концентрация SDS не превышала 0.001% и не оказывала влияния на связывание. Неспецифическое связывание определяли, добавлением в инкубационную смесь 1000-кратного избытка немеченного a-Bgt (Sigma). Далее смесь наносили на фильтры DE-81, которые затем промывали тем же буфером в присутствии 0.1% Triton Х-100, высушивали на воздухе и измеряли их радиоактивность на у-счетчике.

9Р-ЯМР-исследования.

Одномерные спектры 19Р-ЯМР получены на спектрометре Avance DRX 500 (Bruker, Германия) с рабочей частотой на ядрах фтора 470.56 МГц без развязки спин-спинового взаимодействия 19F-'H при температуре 30 С Для восстановления равновесного состояния системы ядерных спинов была использована задержка ~ di 2.0 с. Данные ЯМР обрабатывали с помощью стандартного программного обеспечения XWINNMR 2.6 (Bruker). Концентрации белков в растворах для снятия спектров лежали в диапазоне 1.53.5 мг/мл.

MALDI масс-спектрометрия.

Определение проводили на Reflex MALDI-TOF масс-спектрометре (Bruker, Bremen, Germany). Образцы белков переводили в 0.1 % TFA с помощью гельфильтрации на Sephadex-25. Для проведения триптического гидролиза образцы лиофилизировали и затем растворяли в буфере, содержащий трипсин, с последующей съемкой.

КД спектроскопия.

Съемку спектров проводили при 22 °С, используя спектрополяриметр Jasco Model J-500C (Japan Spectroscopic Co., Tokyo, Japan). Скорость сканирования составила 5 nm min"1, время отклика - 4 с и диапазон сканирования от 190 до 240 шп. Аппарат откалибровали с помощью (+)-10-камфорсульфоновой кислоты. Концентрация белков была в диапазоне от 0.2 до 1.5 мг/мл и длина кюветы 0.1 или 0.5 мм, в зависимости от концентрации белка. Вторичную структуру расчитывали на основании данных КД, используя программу CONTIN.

Электрофорез в SDS-ПААГ

Диск-электрофорез в вертикальных пластинках проводили в буферной системе Laemli на приборах Midget (LKB, Швеция) или SE600 (Hoefer Scientific Instruments, США) согласно рекомендациям изготовителей. Если не указано особо, то использовали восстанавливающие условия. Для всех белков использовали разделяющий гель, содержащий 10% акриламида и 1.5% бисакриламида. Белковые полосы окрашивали красителем Кумасси бриллиантовый голубой R-250.

Флуоресцентная спектроскопия

Спектры флуоресценции регистрировали на спектрофлюорометре модели MPF-3 (Hitachi Instruments, Япония). Спектральная ширина щели возбуждения составила 3 нм., щели испускания - 5 нм. Длина волны возбуждения - 292 нм.

Фосфорилирование.

Протеин-киназа А. К раствору белка (100 - 300 мкг/мл) в 50 мМ Трис-НС1-буфере, рН 7.4, содержащему 0.2 М КС1, 1.5-2 М 3-(1-пиридино)-1-пропан сульфонат (NDSB-201) (Calbiochem), 10 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ АТФ и следы [32Р]АТФ, добавляли 2-3 ед./мкг белка протеинкиназы А. Реакционную смесь инкубировали 70 ч при 30° С. Фосфорилированный белок выделяли на обращенно-фазовой колонке Vydac С]8 (4.6x250 мм) используя градиент ацетонитрила в воде (0.1% ТФА) от 5 to 45% в течение 40 мин. Полученную фракцию лиофилизировали и использовали в дальнейших исследованиях.

АЫ тирозинкиназа. К 400 мкл раствора белка (200 мкг/мл) в 50 мМ Трис-НС1-буфере, рН 7.5, 0.2 М КС1 добавили 1/10 по объему 10х АЫ буфера (поставляется с ферментом), 5 мМ АТФ и следы [32Р]АТФ, 500 ед. АЫ тирозинкиназы (New England Biolabs). Реакционную смесь инкубировали 120 ч при 30° С, с добавлением новой порции по 500 ед. АЫ каждые 24 ч. Дальнейшие шаги были идентичны описанным при использовании протеинкиназы А.

Локализация сайтов фосфорилирования.

Гидролиз трипсином. Белок растворяли в 0.1 М аммонийбикарбонатном буфере, содержащем 2.5 М NDSB-195 и добавляли трипсин (в весовом соотношении белок : фермент = 20 : 1) и инкубировали 5 ч при 37° С. Полученные пептиды выделяли на обращенно-фазовой колонке Vydac Cig (4.6x250 мм), используя градиент ацетонитрила в воде (0.1% ТФА) от 2 to 42% в течение 80 мин. Полученные фракции пептидов лиофилизировали и анализировали с помощью MALDI масс-спектрометрии.

Гидролиз эндопротеиназой Glu-C. К 120 мкг белка в 3.4 мл 50 мМ Трис-НС1-буфере, рН 7.5, 0.2 М КС1 добавили раствор Glu-C (12 мкг в 24 мкл). Инкубировали при 25° С в течение ночи. Выделение и анализ пептидов осуществляли как описано выше.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Алексеев, Тимофей Александрович, Москва

1. Miyazawa A., Fujiyoshi Y., Stowell M., Unwin N. Nicotinic acetylcholine receptor at 4.6 Aresolution: transverse tunnels in the channel wall. J. Mol. Biol. 1999. V.288. N.4. P.765-786.

2. Hucho F., Weise C. Ligand-gated ionchannels. Angew. Chem. Int. Ed. 2001. V.40. P.31003116.

3. Fielding L. NMR methods for the determination of protein-ligand dissociation constants.

4. Curr. Top. Med. Chem. 2003. V.3. N.l. P.39-53.

5. Gonet B. Solving problems fluorine 19F with NMR spectroscopy. Med. Sci. Monit. 2001.1. V.7. N.3. P.489-495.

6. Danielson M.A., Falke J.J. Use of 19F NMR to probe protein structure and conformationalchanges. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1996. V.25. P.163-195.

7. Oldfield E. Chemical shifts and three-dimensional protein structures. J. Biomol. NMR. 1995.1. V.5.N.3. P.217-225.

8. Gettins P.G. 1H- and 19F-NMR approaches to the study of the structure of proteins largerthan 25 kDa. Int. J. Biol. Macromol. 1994. V.16. N.5. P.227-235.

9. Frieden C., Hoeltzli S.D., Ropson I.J. NMR and protein folding: equilibrium and stoppedflow studies. Protein Sci. 1993. V.2. N.12. P.2007-2014.

10. Jenkins B.G. Detection of site-specific binding and co-binding of ligands to macromoleculesusing 19F NMR. Life Sci. 1991. V.48. N.13. P. 1227-1240.

11. Clore G.M., Gronenborn A.M. NMR structure determination of proteins and proteincomplexes larger than 20 kDa. Curr. Opin. Chem. Biol. 1998. V.2. N.5. P.564-570.

12. Kalbitzer H.R., Maeda K., Rosch A., Maeda Y., Geyer M., Beneicke W., Neidig K.P.,

13. Wittinghofer A. C-terminal structure and mobility of rabbit skeletal muscle light meromyosin as studied by one- and two-dimensional 1H NMR spectroscopy and X-ray small-angle scattering. Biochemistry. 1991. V.30. P.8083-8091.

14. Oswald R.E., Bogusky M.J., Bamberger M., Smith R.A.G. and Dobson C.M. Dynamics ofthe multidomain fibrinolytic protein urokinase from two-dimensional NMR. Nature. 1989. V.337. P.579-582.

15. Bogusky M.J., Dobson C.M. and Smith R.A. Reversible independent unfolding of thedomains of urokinase monitored by 1H NMR Biochemistry. 1989. V.28. P.6728-6735.

16. Nowak U.K., Li X., Teuten A.J., Smith R.A. and Dobson C.M. NMR studies of thedynamics of the multidomain protein urokinase-type plasminogen activator. Biochemistry. 1993. V.32. P.298-309.

17. Carrell R.W, Evans D.L. and Stein P.E. Mobile reactive centre of serpins and the control ofthrombosis. Nature. 1991. V.353. P.576-578.

18. Ni F., Konishi Y., Frazier R.B., Scheraga H.A. and Lord S.T High-resolution NMR studiesof fibrinogen-like peptides in solution: interaction of thrombin with residues 1-23 of the A alpha chain of human fibrinogen. Biochemistry. 1989. V.28. P.3082-3094.

19. Zheng Z., Ashton R.W., Ni F. and Scheraga H.A. Thrombin hydrolysis of an N-terminalpeptide from fibrinogen Lille: kinetic and NMR studies. Biochemistry. 1992. V.31. P.4426-4431.

20. Ni F., Ning Q., Jackson C.M. and Fenton J.W. Thrombin exosite for fibrinogen recognitionis partially accessible in prothrombin. J. Biol. Chem, 1993. V.268. P.16899-16902.

21. Ni F., Ripoll D.R., Martin P.D. and Edwards B.F. Solution structure of a platelet receptorpeptide bound to bovine alpha-thrombin. Biochemistry. 1992. V.31. P.11551-11557.

22. Ni F., Konishi Y. and Scheraga H.A. Thrombin-bound conformation of the C-terminalfragments of hirudin determined by transferred nuclear Overhauser effects. Biochemistry.1990. V.29. P.4479-4489.

23. Ni F., Ripoll D.R., Purisima E.O. Conformational stability of a thrombin-binding peptidederived from the hirudin C-terminus. Biochemistry. 1992. V.31. P.2545-2554.

24. Glaudemans C.P., Lerner L., Dares G.D., Kovfic P., Venable R. and Bax A. Significantconformational changes in an antigenic carbohydrate epitope upon binding to a monoclonal antibody. Biochemistry. 1990. V.29. P. 10906-10911.

25. Kim J.I., Nagano Т., Higuchi Т., Hirobe M., Shimada I. and Arata Y. // J. Am. Chem. Soc.1991. V.113. P.9392-9394.

26. Anglister J., Jacob C., Assulin O., Ast G., Pinker R. And Arnon R. NMR study of thecomplexes between a synthetic peptide derived from the В subunit of cholera toxin and three monoclonal antibodies against it. Biochemistry. 1988. V.27. P.717-724.

27. Gettins P. and Choay J. Examination, by lH-n.m.r. spectroscopy, of the binding of asynthetic, high-affinity heparin pentasaccharide to human antithrombin III. Carbohydr. Res. 1989. V.185. P.69-76.

28. Home A.P. and Gettins P. 1H NMR spectroscopic studies on the interactions betweenhuman plasma antithrombin III and defined low molecular weight heparin fragments. Biochemistry. 1992. V.31. P.2286-2294.

29. Anglister J., Frey T. and McConnell H.M. Distances of tyrosine residues from a spin-labelhapten in the combining site of a specific monoclonal antibody. Biochemistry. 1984. V.23. P.5372-5375.

30. Anglister J., Bond M.W., Frey Т., Leahy D., Levitt M., McConnell H.M., Rule G.S.,

31. Tomasello J., Whittaker M. Contribution of tryptophan residues to the combining site of a monoclonal anti dinitrophenyl spin-label antibody. Biochemistry. 1987. V.26. P.6058-6064.

32. Thanabal V., de Ropp J.S. and La Mar G.N. // J. Am. Chem. Soc. 1987. V. 109. P.75167525.

33. Thanabal V., de Ropp J.S. and La Mar G.N. // J. Am. Chem. Soc. 1987. V.109. P.265-272.

34. Thanabal V., de Ropp J.S. and La Mar G.N. // J. Am. Chem. Soc. 1988. V.l 10. P.30273035.

35. La Mar G.N., Hernandez G. and de Ropp J.S. H NMR investigation of the influence ofinteracting sites on the dynamics and thermodynamics of substrate and ligand binding to horseradish peroxidase. Biochemistry. 1992. V.31. P.9158-9168.

36. Li X., Smith R.A.G. and Dobson C.M. Sequential 1H NMR assignments and secondarystructure of the kringle domain from urokinase. Biochemistry. 1992. V.31. P.9562-9571.

37. Bokmah A.M., Jimenez-Barbero J. and Llinas M. 1H NMR characterization of theurokinase kringle module. Structural, but not functional, relatedness to homologous domains. J. Biol. Chem. 1993. V.268. P.13858-13868.

38. Nowak U.K., Cooper A., Saunders D., Smith R.A. and Dobson C.M. Unfolding studies ofthe protease domain of urokinase-type plasminogen activator: the existence of partly folded states and stable subdomains. Biochemistry. 1994. V.33. P.2951-2960.

39. Bax A., Grzesiek S. //Acc. Chem. Res. 1993. V.26. P. 131.

40. Clore G.M., Gronenbom A.M. Structures of larger proteins in solution: three- and fourdimensional heteronuclear NMR spectroscopy. Science. 1991. V.252. N.5011. P.1390-1399.

41. Fesik S.W., Zuiderweg E.P. Heteronuclear three-dimensional NMR spectroscopy ofisotopically labelled biological macromolecules. Quart. Rev. Biophys. 1990. V.23. N.2. P.97-131.

42. Wuthrich K. Protein structure determination in solution by nuclear magnetic resonancespectroscopy. Science. 1989. V.242. N.4887. P.45-50.

43. Gerig J.T. // FMR in Biochemistry. 1978. P.139-203.

44. Danielson M.A., Falke J.J. Fluorine NMR of proteins involved in chemotaxis. In

45. Encyclopedia of Nuclear Magnetic Resonance, ed. D.M. Grant, R.K. Harris. 1996. P.855-861.

46. Gerig J.T. Fluorine NMR of proteins. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 1994. V.26.1. P.293-370.

47. Gerig J.T. Fluorine nuclear magnetic resonance of fluorinated ligands. Methods Enzymol.1989. V.177. P.3-23.

48. Lian C., Le H., Montez В., Patterson J., Harrell S. Fluoine-19 nuclear magnetic resonancespectroscopic study of fluorophenylalanine- and flurortryptophan- labeled avian egg white lysozymes. Biochemistry. 1994. V.33. P.5238-5245.

49. Duewel H.S., Daub E., Robinson V., Honek J.F. Elucidation of solvent exposure, side-chainreactivity, and steric demands of the trifluoromethionine residue in a recombinant protein. Biochemistry. 2001. V.40. N.44. P.13167-13176.

50. Duewel H., Daub E., Robinson V., Honek J.F. Incorporation of trifluoromethionine into aphage lysozyme: implications and a new marker for use in protein 19F NMR. Biochemistry. 1997. V.36. N.ll. P.3404-3416.

51. Luck L.A., Falke J.J. 19F NMR studies of the D-galactose chemosensory receptor. 1. Sugarbinding yields a global structural change. Biochemistry. 1991. V.30. P.4248-4256.

52. Westhead E.W., Boyer P.D. The incorporation of o-fluorophenylalanine into some rabbitenzymes and other proteins. Biochim. Biophys. Acta. 1961. V.54. P.145-150.

53. Arseniev A.S., Kuryatov A.B., Tsetlin V.I., Bystrov V.F., Ivanov V.T., Ophchinnikov Y.A.19F NMR study of 5-fluorotryptophan-labeled bacteriorhodopsin. FEBS Lett. 1987. V.213. P.283-288.

54. Chaiken I.M., Freedman M.H., Lyerla J.R., Cohen J.S. Preparation and studies of 19Flabeled and enriched DC-labeled semisynthetic ribonuclease-S' analogues. J. Biol. Chem. 1973. V.248. P.884-891.

55. Danielson M.A., Biemann H.P., Koshland D.E., Falke J.J. Attractant- and disulfide-inducedconformational changes in the ligand binding domain of the chemotaxis aspartate receptor: a 19F NMR study. Biochemistry. 1994. V.33. N.20. P.6100-6109.

56. Drake S.K., Bourret R.B., Luck L.A., Simon M.I., Falke J.J. Activation of theposphosignaling protein CheY I. Analysis of the phosphorylated con formation by 19F NMR and protein engineering. J. Biol. Chem. 1993. V.268. N.18. P.13081-13088.

57. Gammon K.L., Smallcombe S.H., Richards J.H. Magnetic resonance studies of proteinsmall molecule interactions. Binding of N-trifluoroacetyl-D-(and L-)-jp-fluorophenylalanine to chymotrypsm. J. Am. Chem. Soc. 1972. V.94. P.4573-4580.

58. Gregory D.H., Gerig J.T. Structural effects of fluorine substitution in proteins. J. Сотр.

59. Chem. 1991. V.12. P.180-185.

60. Hull W.E., Sykes B.D. Fluorine 19 nuclear magnetic resonance study of fluorotyrosinealkaline phosphatase: the influence of zinc on protein structure and a conformation change induced by phosphate binding. Biochemistry. 1976. V.5. P.1535-1546.

61. Li E., Qian S.J., Nader L., Young C.C., Avignon A. Nuclear magnetic resonance studies of6.fluor-otryptophan-substituted rat cellular retinol-binding protein II produced in Escherichia con. J. Biol. Chem. 1989. V.264. P.17041-17048.

62. Lu P., Jarema M., Mosser K., Daniel W.E. Lac represser: 3-fluorotyrosine substitution fornuclear magnetic resonance studies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1976. V.73. P.3471-3475.

63. Mirmira R.G., Tager H.S. Disposition of the phenylalanine-B25 sidechain during insulinreceptor and insulin-insulin interactions. Biochemistry 1991. V.30. P.8222-8229.

64. Post J.F., Cottam P.F., Simplaceanu V., Ho C. Fluorine-19 nuclear magnetic resonancestudy of 5-fluorotryptophan-labeled histidine-binding protein J of Salmonella typhimurium. J. Mol. Biol. 1984. V.179. P.729-743.

65. Pratt E.A., Ho C. Incorporation of fluorotryptophans into proteins of Escherichia coli.

66. Biochemistry. 1975. V.14. N.13. P.3035-3040.

67. Rule G.S., Pratt E.A., Simplaceanu V., Ho C. Nuclear magnetic resonance and moleculargenetic studies of the membrane-bound D-lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Biochemistry. 1987. V.26. P.549-556.

68. Tanaka H., Osaka F., Ohashi M., Shiraki M., Munekata E. Substance-P analoguescontaining para-fluoro-L-phenylalanine. Chem. Lett. 1986. P.391-394.

69. Vine WH, Brueckner DA, Needleman P, Marshall GR. Synthesis, biological activity, and

70. F nuclear magnetic resonance spectra of angiotensin II analogs containing fluorine. Biochemistry. 1973. V.12. P. 1630-1637.

71. Wilson M.L., Dahlquist F.W. Membrane protein conformational change dependent on thehydrophobic environment. Biochemistry 1985. V.24. P.1920-1928.

72. Bovy P.R., Getman D.P., Matsoukas J.M., Moore G.J. Influence of polyfluorination of thephenylalanine ring of angiotensin II on conformation and biological activity. Biochim. Biophys. Acta. 1991. V.1079. P.23-28.

73. Taylor H.C., Richardson D.C., Richard son J.S., Wlodawer A., Komoriya A., Chaiken I.M.

74. Active conformation of an inactive semi-synthetic ribonuclease-S. J. Mol. Biol. 1981. V.149. P.3I3-317.

75. Pauling L. The Nature of the Chemical Bond. Ithaca: Cornell Univ. Press. 1960. P.644.

76. Wuttke D.S., Gray H.B., Fisher S.L., Imperaili B. Semisynthesis of bipyridyl-alaninecytochrome с mutants: novel proteins with enhanced electron transfer properties. J. Am. Chem. Soc. 1993. V.115. P.8455-8456.

77. Williams S.P., Fulton A.M., Brindle K.M. Estimation of the intracellular free ADPconcentration by 19F NMR studies of ferine-labeled yeast phosphoglycerate kinase in vivo. Biochemistry. 1993. V.32. P.4895-4902.

78. Gamcsik M.P., Gerig J.T., Swenson R.B. Fluorine-NMR studies of chimpanzeehemoglobin. Biochim. Biophys. Acta. 1986. V.874. P.372-374.

79. Liao Т.Н., Berlin K.D. The use of p-fluorobenzenesulfonyl chloride as a reagent for studiesof proteins by fluorine nuclear magnetic resonance. Anal. Biochem. 1985. V.148. N.2. P.365-375.

80. Thomas M.R., Boxer S.G. 19F NMR of trifluoroacetyl-labeled cysteine mutants ofmyoglobin: structural probes of nitric oxide bound to the H93G cavity mutant. Biochemistry. 2001. V.40. N.29. P.8588-8596.

81. Bouchard M., Pare C., Dutasta J.P., Chauvet J.P., Gicquaud C., Auger M. Interactionbetween G-actin and various types of liposomes: A 19F, 31P, and 2H nuclear magnetic resonance study. Biochemistry. 1998. V.37. N.9. P.3149-3155.

82. Heintz D., Капу H., Kalbitzer H.R. Mobility of the N-terminal segment of rabbit skeletalmuscle F-actin detected by 1H and 19F nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochemistry. 1996. V.35. N.39. P. 12686-12693.

83. Decatur S.M., DePillis G.D., Boxer S.G. Modulation of protein function by exogenousligands in protein cavities: CO binding to a myoglobin cavity mutant containing unnatural proximal ligands. Biochemistry. 1996. V.35. N.13. P.3925-3932.

84. Hayden P.J., Yang Y., Ward A.J., Dulik D.M., McCann D.J., Stevens J.L. Hayden PJ, Yang

85. Y, Ward AJ, Dulik DM, McCann DJ, Stevens JL Biochemistry. 1991. V.30. N.24. P.5935-5943.

86. Barden J. A., Phillips L. 19F NMR study of the myosin and tropomyosin binding sites onactin. Biochemistry. 1990. V.29. N.5. P.1348-1354.

87. Harris J.W., Anders M.W. The use of 19F NMR in the study of protein alkylation byfluorinated reactive intermediates. Adv. Exp. Med. Biol. 1991. V.283. P.735-738.

88. McGee W.A., Parkhurst L.J. A combined nuclear magnetic resonance and absorbancestopped-flow apparatus for biochemical studies. Anal. Biochem. 1990. V.189. N.2. P.267-273.

89. Knowles F.C. Application of 19F NMR spectroscopy to a study of carbon monoxidebinding to human hemoglobin modified at Cys-beta 93 with the S-trifluoroethyl residue. Arch. Biochem. Biophys. 1984. V.230. N.l. P.327-334.

90. Mehta V.D., Kulkarni P.V., Mason R.P., Constantinescu A., Antich P.P. Fluorinatedproteins as potential 19F magnetic resonance imaging and spectroscopy agents. Bioconjug. Chem. 1994. V.5. N.3. P.257-261.

91. Phillips L., Separovic F., Cornell B.A., Barden J.A., dos Remedios C.G. Actin dynamicsstudied by solid-state NMR spectroscopy. Eur. Biophys. J. 1991. V. 19. N.3. P. 147-155.

92. Adriaensens P., Box M.E., Martens H.J., Onkelinx E., Put J., Gelan J. Investigation ofprotein structure by means of 19F-NMR. A study of hen egg-white lysozyme. Eur. J. Biochem. 1988. V.177. N.2. P.383-394.

93. Loewen M.C., Klein-Seetharaman J., Getmanova E.V., Reeves P.J., Schwalbe H., Khorana

94. H.G. Solution 19F nuclear Overhauser effects in structural studies of the cytoplasmic domain of mammalian rhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V.98. N.9. P.4888-4892.

95. Pauley R J., Fredricks W.W., Smith O.H. Effect of tryptophan analogs on depression of the

96. Escherichia coli tryptophan operon by indole-3-propionic acid. J. Bacteriol. 1978. V.136. N.1.P.219-226.

97. Sykes B.D., Weiner J.H. Biosynthesis and 19F NMR characterisation of fluoroamino acidcontaining protein. 1979. P.171-196.

98. Wong C.Y., Eftink M.R. Incorporation of tryptophan analogues into staphylococcalnuclease, its V66W mutant, and Delta 137-149 fragment: spectroscopic studies. Biochemistry. 1998. V.37. N.25. P.8938-8946.

99. Hinds M.G., King R.W., Feeney J. 19F n.m.r. studies of conformational changesaccompanying cyclic AMP binding to 3-fluorophenylalanine-containing cyclic AMP receptor protein from Escherichia coli. Biochem. J. 1992. V.15. P.627-632.

100. Sixl F., King R.W., Bracken M., Feeney J. 19F-n.m.r. studies of ligand binding to 5fluorotryptophan- and 3-fluorotyrosine-containing cyclic AMP receptor protein from Escherichia coli. Biochem. J. 1990. V.266. N.2. P.545-552.

101. Eccleston J.F., Molloy D.P., Hinds M.G., King R.W., Feeney J. Conformational differencesbetween complexes of elongation factor Tu studied 19F-NMR spectroscopy. Eur. J. Biochem. 1993. V.218. N.3. P.1041-1047.

102. Yao Y.N., Zhang Q.S., Yan X.Z., Zhu G., Wang E.D. Substrate-induced conformationalchanges in Escherichia coli arginyl-tRNA synthetase observed by 19F NMR spectroscopy. FEBS Lett. 2003. V.547. N.l-3. P.197-200.

103. Campos-Olivas R., Aziz R., Helms G.L., Evans J.N., Gronenborn A.M. Placement of 19Finto the center of GB1: effects on structure and stability. FEBS Lett. 2002. V.517. N.l-3. P.55-60.

104. Hinds M.G., King R.W., Feeney J. 19F NMR evidence for interactions between the cAMP binding sites on the c-AMP receptor protein from E. coli. FEBS Lett. 1991. V.283. N.l. P.127-130.

105. Jose T.J., Conlan L.H., Dupureur C.M. Quantitative evaluation of metal ion binding to

106. PvuII restriction endonuclease. J. Biol. Inorg. Chem. 1999. V.4. N.6. P.814-823.

107. Luck L.A., Vance J.E., Connell T.M., London R.E. 19F NMR relaxation studies on 5fluorotryptophan- and tetradeutero-5-fluorotryptophan-labeled E. coli glucose/galactose receptor. J. Biomol. NMR. 1996. V.7. N.4. P.261-272.

108. Rozovsky S., Jogl G., Tong L., McDermott A.E. Solution-state NMR investigations of triosephosphate isomerase active site loop motion: ligand release in relation to active site loop dynamics. J. Mol. Biol. 2001. V.310. N.l. P.271-280.

109. Rozovsky S., McDermott A.E. The time scale of the catalytic loop motion in triosephosphate isomerase. J. Mol. Biol. 2001. V.310. N.l. P.259-270.

110. Careaga C.L., Falke J.J. Thermal motions of surface alpha-helices in the D-galactose chemosensory receptor. Detection by disulfide trapping. J. Mol. Biol. 1992. V.226. N.4. P.1219-1235.

111. Zhang Q.S., Shen L., Wang E.D., Wang Y.L. Biosynthesis and characterization of 4fluorotryptophan-labeled Escherichia coli arginyl-tRNA synthetase. J. Protein. Chem. 1999. V.18. N.2. P. 187-192.

112. Chervitz S.A., Falke J.J. Molecular mechanism of transmembrane signaling by the aspartate receptor: a model. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V.93. N.6. P.2545-2550.

113. Salopek-Sondi В., Luck L.A. 19F NMR study of the leucine-specific binding protein of Escherichia coli: mutagenesis and assignment of the 5-fluorotryptophan-labeled residues. Protein Eng. 2002. V.15. N.ll. P.855-859.

114. Luck L.A., Johnson C. Fluorescence and 19F NMR evidence that phenylalanine, 3-L-fluorophenylalanine and 4-L-fluorophenylalanine bind to the L-leucine specific receptor of Escherichia coli. Protein Sci. 2000. V.9. N.12. P.2573-2576.

115. Sun Z.Y., Truong H.T., Pratt E.A., Sutherland D.C., Kulig C.E., Homer R.J., Groetsch A.19F-NMR study of the membrane-binding region of D-lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Protein Sci. 1993. V.2. N.ll. P. 1938-1947.

116. Brown K. D. Maintenance and Exchange of the Aromatic Amino Acid Pool in Escherichia coli. J. Bacteriol. 1971. V. 106. N.l. P.70-81.

117. Whipp M.J., Pittard A J. Regulation of aromatic amino acid transport systems in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 1977. V.132. N.2. P.453-461.

118. Hoeltzli S.D., Frieden С. Stopped-flow NMR spectroscopy: real-time unfolding studies of6.19F-tryptophan-labeled Escherichia coli dihydrofolate reductase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V.92. N.20. P.9318-9322.

119. Furter R. Expansion of the genetic code: site-directed p-fluorophenylalanine incorporation in Escherichia coli. Protein Sci. 1998. V.7. N.2. P.419-426.

120. Browne D.T., Kenyon G.L., Hegeman G.D. Incorporation of mono fluoro tryptophans into proteins during the growth of Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Communs. 1970. V.39. N.l. P.13-19.

121. Hull W.E., Sykes B.D. Fluorotyrosine alkaline phosphate: internal mobility of individual tyrosines and the role of chemical shift anisotropy as a 19F nuclear spin relaxation mechanism in protein. J. Mol. Biol. 1975. V.98. N.l. P.121-153.

122. Robertson D.E., Kroon P. A., Ho C. NMR and fluorescence studies of substrate induced conformational changes of histidine-binding protein J of Salmonella typhimurium. Biochemistry. 1977. V.16. N.7. P.1443-1451.

123. Millet F., Raftery M.A. An NMR method for characterizing conformation changes in proteins. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972. V.47. P.625-632.

124. Gregory D.H., Gerig J.T. Prediction of fluorine chemical shifts in proteins. Biopolymers.1991. V.3I. P.845-858.

125. Chambers S.E., Lau E.Y., Gerig J.T. Origins of fluorine chemical shifts in proteins. J. Am. Chem. Soc. 1994. V.116. P.3603-3604.

126. Dios A.C., Pearson J.G., Oldfield E. Secondary and tertiary structural effects on protein NMR chemical shifts: an ab initio approach. Science. 1993. V.260. N.5113. P.1491-1496.

127. Yao J., Dyson H.J., Wright P.E. Chemical shift dispersion and secondary structure prediction in unfolded and partly folded proteins. FEBS Lett. 1997. V.419. N.2-3. P.285-289.

128. Oldfield E. Chemical shifts in amino acids, peptides, and proteins: from quantum chemistry to drug design. Annu. Rev. Phys. Chem. 2002. V.53. P.349-378.

129. Hoeltzi S.D., Frieden С. 19F NMR spectroscopy of 6-19F.tryptophan-labeled Escherichia coli dmydrofolate reductase: equilibrium folding and ligand binding studies. Biochemistry. 1994. V.33. P.5502-5509.

130. Ropson U., Frieden C. Dynamic NMR spectral analysis and protein folding: identification of a highly populated folding intermediate of rat in testinal fatty acid-binding protein by 19F NMR. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991. V.89. P.7222-7226.

131. Pearson J.G., Montez В., Le H., Oldfield E., Chien E.Y., Sligar S.G. Assignment and analysis of fluorine nuclear magnetic resonance spectra of 4-fluorotryptophan myoglobins and hemoglobins. Biochemistry. 1997. V.36. N.12. P.3590-3599.

132. Wagner G., Wutrich K. Observation of internal motility of proteins by nuclear magnetic resonance in solution. Methods Enzymol. 1986. V.131. P.307-326.

133. Martin B.L., Graves D.J. Application of 19F nuclear magnetic resonance to examine covalent modification reactions of tyrosyl derivatives: a study of calcineurin catalysis. Anal Biochem. 1988. V.170. N.l. P.152-160.

134. Monasterio 0., Nova E., Lopez-Brauet A., Lagos R. Tubulin-tyrosine ligase catalyzes covalent binding of 3-fluoro-tyrosine to tubulin: kinetic and 19FJNMR studies. FEBS Lett. 1995. V.374. N.2. P.165-168.

135. Schmitt L., Boniface J. J., Davis M.M., McConnell H.M. Conformational isomers of a class II МНС-peptide complex in solution. J. Mol. Biol. 1999. V.286. N.l. P.207-218.

136. Bourret R.B., Brokovich K.A., Simon M.I. Signal transduction pathways involving protein phosphorylation in prokaryotes. Annu. Rev. Biochem. 1991. V.60. P.401-441.

137. Hazelbauer G.L., Berg H.C., Matsumura P. Bacterial motility and signal transduciton. Cell.1993. V.73.P.15-22.

138. Parkinson J.S., Kofoid E.C. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu. Rev. Genet. 1992. V.26. P.71-112.

139. Stock J.B., Lukat G.S. Bacterial chemotaxis and the molecular logic of intracellular signal transduction networks. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 1991. V.20. P.109-136.

140. Но С., Pratt Е.А., Wu C.S., Yang J.T. Membrane-bound D-lactate dehydrogenase of

141. Escherichia coli: a model for protein interactions in membranes. Biochim. Biophys. Acta. 1989. V.988. P.173-184.

142. Hoeltzli S.D., Frieden C. Refolding of 6-19F.tryptophan-labeIed Escherichia coli dihydrofolate reductase in the presence of ligand: a stopped-flow NMR spectroscopy study. Biochemistry. 1998. V.37. N.l. P.387-398.

143. Schuler В., Kremer W., Kalbitzer H.R., Jaenicke R. Role of entropy in protein thermostability: folding kinetics of a hyperthermophilic cold shock protein at high temperatures using 19F NMR. Biochemistry. 2002. V.41. N.39. P.l 1670-11680.

144. Birdsall В., Tendler S.J., Arnold J.R., Feeney J., Griffin R.J., Carr M.D. NMR studies of multiple conformations in complexes of Lactobacillus casei dihydro folate reductase with analogues of pyrimethamine. Biochemistry. 1990. V.29. N.41. P.9660-9667.

145. Laurents D.V., Baldwin R.L. Characterization of the unfolding pathway of hen egg white lysozyme. Biochemistry. 1997. V.36. N.6. P. 1496-1504.

146. Sun Z.Y., Pratt E.A., Simplaceanu V., Ho C. A 19F-NMR study of the equilibrium unfolding of membrane-associated D-lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Biochemistry. 1996. V.35. N.51. P.16502-16509.

147. Kranz J.K., Lu J., Hall K.B. Contribution of the tyrosines to the structure and function of the human U1A N-terminal RNA binding domain. Protein Sci. 1996. V.5. N.8. P. 15671583.

148. Hoeltzli S.D., Frieden C. Real-time refolding studies of 6-19F-tryptophan labeled Escherichia coli dihydrofolate reductase using stopped-flow NMR spectroscopy. Biochemistry. 1996. V.35. N.51. P.16843-16851.

149. Peteranderl R., Rabenstein M., Shin Y.K., Liu C.W., Wemmer D.E., King D.S., Nelson H.C. Biochemical and biophysical characterization of the trimerization domain from the heat shock transcription factor. Biochemistry. 1999. V.38. N. 12. P.3559-3569.

150. Luck L.A., Falke J J. Open conformation of a substrate-binding cleft: 19F NMR studies of cleft angle in the D-galactose chemosensory receptor. Biochemistry. 1991. V.30. N.26. P.6484-6490.

151. Smith L.J., Alexandrescu A.T., Pitkeathly M., Dobson C.M. Solution structure of a peptidefragment of human alpha-lactalbumin in trifluoroethanol: a model for local structure in the molten globule. Structure. 1994. V.2. N.8. P.703-712.

152. Neville D., Rozanas C.R., Tulk B.M., Townsend R.R., Verkman A.S. Biochemistry. 1998. V.37. P.2401-2409.

153. Xu A.S., Morris M.B., Kuchel P.W. Band-3 mediated uptake of beryllofluoride complexes by human erythrocytes. Biochemistry. 1992. V.31. N.38. P.9263-9268.

154. Grage S.L., Wang J., Cross T.A., Ulrich A.S. Solid-state 19F-NMR analysis of 19Flabeled tryptophan in gramicidin A in oriented membranes. Biophys. J. 2002. V.83. N.6. P.3336-3350.

155. Sanders C.R., Schwonek JP. Simulation of NMR data from oriented membrane proteins: practical information for experimental design. Biophys. J. 1993. V.65. N.4. P. 1460-1469.

156. Falke J. J., Luck L.A., Scherrer J. 19F nuclear magnetic resonance studies of aqueous andtransmembrane receptors. Examples from the Escherichia coli chemosensory pathway. Biophys. J. 1992. V.62. N.l. P.82-86.

157. Glaser R.W., Ulrich A.S. Susceptibility corrections in solid-state NMR experiments with oriented membrane samples. Part I: applications. J. Magn. Reson. 2003. V.l64. N.l. P.104-114.

158. Klefhaber Т., Labhardt A.M., Baldwin R.L. Direct NMR evidence for an intermediate preceding the rate-limiting step in the unfolding of ribonuclease A. Nature. 1995. V.375. N. 6531. P.513-515.

159. Hoeltzi S.D., Ropson I. J., Freiden C. Application of equilibrium and stopped-flow 19F

160. NMR spectroscopy to protein folding: studies of E. coli dihydrofolate reductase. Tech. Protein Chem. 1994. V.5. P.455-465.

161. Ropson I.J., Frieden C. Dynamic NMR spectral analysis and protein folding: identification of a highly populated folding intermediate of rat intestinal fatty acid-binding protein by 19F NMR. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V.89. N.l5. P.7222-7226.

162. Bourret R.B., Drake S.K., Chervitz S.A., Simon M.I., Falke J.J. Activation of the phosphosignaling protein CheY. II. Analysis of activated mutants by 19F NMR and protein engineering. J. Biol. Chem. 1993. V.268. N.l8. P. 13089-13096.

163. Ho C., Rule G.S., Pratt E.A. Nuclear magnetic resonance, biochemical and moleculargenetic studies of the membrane bound D-lactate dehydrogenase of E.coli. Byophys. J. 1986. V.49. N.l. P.113-115.

164. Gerig G.T., Klinkenborg J.C., Nieman R.A. Assigment of fluorine magnetic resonance signals from rabbit cyanomethemoglobin. Biochemistry. 1983. V.22. N.9. P.2076-2087.

165. HagenD.S., Weiner J.H., Sykes B.D. Fluorotyrosine M13 coat protein: fluorine-19 nuclear magnetic resonance. Studi of the motional propeties of the integral membrane protein in phospholipid vesicles. Biochemistry. 1978. V.17., N.18. P.3860-3866.

166. HagenD.S., Weiner J.H., Sykes B.D. Investigation of solvent accessibility of thefluorotyrosyl residues of M13 coat protein in deoxycholate micelles and phospholipid vesicles. Biochemistry. 1979. V.18. N.10. P.2007-2012.

167. Caplow M., Shanks J. Microtubule dynamic instability does not result from stabilization of microtubules by tubulin-GDP-Pi subunits. Biochemistry. 1998. V.37. N.37. P.12994-13002.

168. Barbar E., Martin T.M., Brown M., Rittenberg M.B., Peyton D.H. Binding of phenylphosphocholine-carrier conjugates to the combining site of antibodies maintains a conformation of the hapten. Biochemistry. 1996. V.35. N.9. P.2958-2967.

169. Scheuring J., Lee J., Cushman M., Patel H., Patrick D.A., Bacher A. (Trifluoromethyl)lumazine derivatives as 19F NMR probes for lumazine protein. Biochemistry. 1994. V.33. N.24. P.7634-7640.

170. Henry G.D., Maruta S., Ikebe M., Sykes B.D. Observation of multiple myosin subfragment

171. ADP-fluoroberyllate complexes by 19F NMR spectroscopy. Biochemistiy. 1993. V.32. N.39. P. 10451-10456.

172. Connick T.J., ReillyR.T., Dunlap R.B., Ellis P.D. Fluorine-19 nuclear magnetic resonance studies of binary and ternary complexes of thymidylate synthase utilizing a fluorine-labeled folate analogue. Biochemistry. 1993. V.32. N.38. P.9888-9895.

173. Street I.P., Lin H.K., Laliberte F., Ghomashchi F., Wang Z., Perrier H., Tremblay N.M., Huang Z„ Weech P.K., Gelb M.H. Slow- and tight-binding inhibitors of the 85-kDa human phospholipase A2. Biochemistry. 1993. V.32. N.23. P.5935-5940.

174. Percival M.D., Withers S.G. 19F NMR investigations of the catalytic mechanism of phosphoglucomutase using fluorinated substrates and inhibitors. Biochemistry. 1992. V.31.N.2. P.505-512.

175. Luck L.A., Falke J.J. 19F NMR studies of the D-galactose chemosensory receptor. 2. Ca(II) binding yields a local structural change. Biochemistry. 1991. V.30. N.17. P.4257-4261.

176. Liang T.C., Abeles R.H. Complex of alpha-chymotrypsin and N-acetyl-L-leucyl-L-phenylalanyl trifluoromethyl ketone: structural studies with NMR spectroscopy. Biochemistry. 1987. V.26. N.24. P.7603-7608.

177. Campbell A.P., Cachia P. J., Sykes B.D. Interaction of troponin I and troponin C: 19F NMR studies of the binding of the inhibitory troponin I peptide to turkey skeletal troponin C. Biochem. Cell Biol. 1991. V.69. N.9. P.674-681.

178. Rong D., Lovey A.J., Rosenberger M., Avignon D.A., Li E. NMR studies of fluororetinol analogs complexed to two homologous rat cellular retinol-binding proteins. Biochim. Biophys. Acta. 1994. V.1208. N.l. P.136-144.

179. Evans J.N., Arvidson D.N., Gunsalus R.P., Roberts M.F. Multinuclear NMR studies of the trp-repressor. Biochim. Biophys. Acta. 1992. V.1160. N.2. P.156-162.

180. Cao В., Endsley S., Andersen N.H. 19F NMR studies of tryptophan/serum albumin binding. Bioorg. Med. Chem. 2003. V.l 1. N.l. P.69-75.

181. Huwe J.K., Larsen G.L., Castellino S. An investigation of the binding site of alpha 2u-globulin using isotopically labeled ligands and inverse nuclear magnetic resonance techniques. Chem. Res. Toxicol. 1996. V.9. N.l. P.215-222.

182. Leone M., Rodriguez-Mias R.A., Pellecchia M. Selective Incorporation of 19F-Labeled Trp Side Chains for NMR-Spectroscopy-Based Ligand-Protein Interaction Studies. Chembiochem. 2003. V.4. N.7. P.649-650.

183. Rong D., Lin C.L., Avignon D.A., Lovey A.J., Rosenberger M., Li E. 19F-NMR studies of retinol transfer between cellular retinol binding proteins and phospholipid vesicles. FEBS Lett. 1997. V.402. N.2-3. P.l 16-120.

184. Jenkins B.G., Lauffer R.B. Detection of site-specific binding and co-binding of ligands to human serum albumin using 19F NMR. Mol. Pharmacol. 1990. V.37. N.l. P.l 11-118.

185. Dubois B.W., Cherian S.F., Evers A.S. Volatile anesthetics compete for common binding sites on bovine serum albumin: a 19F-NMR study. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V.90. N.l4. P.6478-6482.

186. McDowell L.M., Lee M., McKay R.A., Anderson K.S., Schaefer J. Intersubunit communication in tryptophan synthase by carbon-13 and fluorine-19 REDOR NMR. Biochemistry. 1996. V.35. N.10. P.3328-3334.

187. Dupureur C.M., Hallman L.M. Effects of divalent metal ions on the activity and conformation of native and 3-fluorotyrosine-PvuII endonucleases. Eur. J. Biochem. 1999. V.261. N.l. P.261-268.

188. Karlin A. Emerging structure of the nicotinic acetylcholine receptors. Nature. 2002. V.3. P.102-114.

189. Changeux J.P., Edelstein S.J. Allosteric receptors after 30 years. Neuron. 1998. V.21. N.5. P.959-980.

190. Katchalski-Katzir E., Kasher R., Balass M., Scherf Т., Harel M., Fridkin M., Sussman J.L.,

191. Fuchs S. Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor. Biophys. Chem. 2003. V.100. N.l-3. P.293-305.

192. Oblas В., Boyd N.D., Singer R.H. Analisis of receptor ligand interactions using nitrocellulose gel transfer: aplication to Torpedo acetilcholine receptor and alpha-bungarotoxin. Anal. Biochem. 1983. V.130. P.l-8.

193. West A. P., Bjorkman P. J., Dougherty D. A. and Lester H. A. Expression and Circular Dichroism Studies of the Extracellular Domain of the Subunit of the Nicotinic Acetylcholine Receptor. J. Biol. Chem. 1997. V. 272. N. 41. P.25468-25473.

194. Burstein Y, Patchornik A. Selective chemical cleavage of tryptophanyl peptide bonds in peptides and proteins. Biochemistry. 1972. V.l 1. N.25. P.4641-4650.

195. Alexeev Т., Krivoshein A., Shevalier A., Kudelina I., Telyakova O., Vincent A., Utkin

196. Yu., Hucho F., Tsetlin V. Physicochemical and immunological studies of the N-terminal domain of the Torpedo acetylcholine receptor alpha-subunit expressed in Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 1999. V.259. P.310-319.

197. Donelly-Roberts D.L., Lentz T.L. // Mol. Brain. Res. 1993. V.19. P.55-61.

198. Кондаков В.И., Арсеньев A.C., Уткин Ю.Н., Карлсон Е., Гуревич А.З., Цетлин В.И., Быстрое В.Ф., Иванов В.Т. // Биоорган, химия. 1984. Т. 10. С.869-890.

199. Vincent A., Newson-Davis J. Acetylcholine receptor antibody as a diagnostic test for myasthenia gravis: results in 153 validated cases and 2967 diagnostic assays. Journal of Neurosurgery and Psychiatry. 1985. V.48. P. 1246-1252.

200. MacLennan С., Beeson D., Vincent A., Newsom-Davis J. Human nicotinic acetylcholine receptor alpha-subunit isoforms: origins and expression. Nucleic Acids Research. 1993. V.21. N.23. P.5463 -5467.

201. Brejc К., van Dijk W.J., Klaassen R.V., Schuurmans M., van Der Oost J., Smit A.B., Sixma Т.К. Crystal structure of an ACh-binding protein reveals the ligand-binding domain of nicotinic receptors. 2001. Nature. V.411. N.6835. P.269-276.

202. Celie P.H., van Rossum-Fikkert S.E., van Dijk W.J., Brejc K., Smit A.B., Sixma Т.К. Nicotine and carbamylcholine binding to nicotinic acetylcholine receptors as studied in AChBP crystal structures. 2004. Neuron. V.41. N.6. P.907-914.

203. Tsetlin V.I., Dergousova N.I., Azeeva E.A., Kryukova E.V., Kudelina I.A., Shibanova

204. E.D., Kasheverov I.E., Methfessel C. Refolding of the Escherichia coli expressed extracellular domain of alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor. Eur. J. Biochem. 2002. V.269. N.l 1. P. 2801-2809.

205. Dunckley Т., Wu J., Zhao L., Lukas R.J. Mutational analysis of roles for extracellular cysteine residues in the assembly and function of human alpha 7-nicotinic acetylcholine receptors.Biochemistry. 2003 V.42. N.4. P.870-876.

206. Neugebauer R., Betz H., Kuhse J. Expression of a soluble glycine binding domain of the NMDA receptor in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Coramun. 2003. V.305. N.3. P.476-483.

207. Schroeder W., Meyer H.E., Buchner K., Bayer H., Hucho F. Phosphorylation sites of the nicotinic acetylcholine receptor. A novel site detected in position delta S362. Biochemistry. 1991. V.30. P.3583-3588.

208. Wagner K., Edson K., Heginbotham L., Post M., Huganir R.L., Czernik A.J. Determination of the tyrosine phosphorylation sites of the nicotinic acetylcholine receptor. J. Biol. Chem. 1991. V.266. P.23784-23789.

209. Vuillard L., Braun-Breton C., Rabilloud T. Non-detergent sulphobetaines: a new class of mild solubilization agents for protein purification. Biochem. J. 1995. V.305. P.337-343.

Информация о работе

Алексеев, Тимофей Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.03

Диссертация

Получение в E. coli, ренатурация и исследование внемембранных доменов холинорецепторов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы