Получение, свойства и применение ДНК-содержащей нанопленки для пьезокварцевых биосенсоров

Фахруллин, Равиль Фаридович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение, свойства и применение ДНК-содержащей нанопленки для пьезокварцевых биосенсоров
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение, свойства и применение ДНК-содержащей нанопленки для пьезокварцевых биосенсоров"

На правах рукописи

ФАХРУЛЛИН РАВИЛЬ ФАРИДОВИЧ

ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ ДНК-СОДЕРЖАЩЕЙ НАНОПЛЕНКИ ДЛЯ ПЬЕЗОКВАРЦЕВЫХ БИОСЕНСОРОВ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань - 2006

Работа выполнена на кафедре биохимии ГОУ ВПО "Казанский государственный университет им. В.И.Ульянова-Ленина"

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,_

профессор [Винтер Виктор Георгиевич]

доктор биологических наук Абрамова Зинаида Ивановна

доктор химических наук, профессор Жданов Ренат Ибрагимович (лаборатория функциональной геномики и липидомики НИИ патологии и патофизиологии РАМН, г. Москва)

доктор биологических наук, профессор Чиков Владимир Иванович (лаборатория биохимии апопласта Казанского института биохимии и биофизики КНЦ РАН, г. Казань)

ФГУН «Казанский научно-

исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» Роспотребнадзора (г. Казань) 0

Защита диссертации состоится 28 сентября 2006 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском государственном университете по адресу: 420008, Республика Татарстан, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, Казанский государственный университет, аудитория № 209.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского при Казанском государственном университете.

Ведущая организация:

Автореферат разослан

"2 4"

августа 2006 г.

И.о. ученого секретаря диссертационного совета, доктор биологических наук

З.И. Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

Развитие биохимии в XXI веке определяется постоянным совершенствованием методов исследования. Результаты исследований в этой области активно внедряются в практику для разработки новых методов диагностики различных заболеваний (Jain, 2005).

Пристальное внимание исследователей привлекают антитела (AT) к на-тивной ДНК, повышенный уровень которых является диагностическим признаком ряда аутоиммунных заболеваний (Hahn, 1998). Однако сложность заключается в том, что AT к нативной ДНК постоянно присутствуют и в крови здоровых людей, уровень их содержания варьирует с изменением физиологического состояния организма. Применяемые в настоящее время для определения AT к нативной ДНК методы радиоиммунного, флуоресцентного и иммуноферментного анализа длительны, трудоемки и не всегда позволяют достоверно дифференцировать норму от патологии.

Одним из:новых подходов к детекции и изучению AT к нативной ДНК является разработка пьезокварцевых биосенсоров, отличающихся высокой чувствительностью и экспрессностью (Luppa et al., 2001). Принцип действия пьезокварцевых биосенсоров основан на масс-чувствительности (нано-гравиметрии) пьезокварцевого резонатора, позволяющей фиксировать из-менениямассы на поверхности электродов.в субнанограммовом диапазоне (Lu et al, 2004). Применение таких биосенсоров в проточно-инжекционном режиме дает возможность изучить процесс взаимодействия макромолекул in situ (Магхег et al., 2003).

■ На сегодняшний день описаны пьезокварцевые биосенсоры для ДНК-диагностики (Zhou et al., 2001) и определения некоторых ДНК-связывающих белков (Kim et al., 2002). Для формирования ДНК-содержащего рецепторного слоя подобных биосенсоров используется кова-лентная иммобилизация однонитевых олигонуклеотидов (Mirsky, 2002).

В последние годы для конструирования тонких пленок биологических веществ используются процессы самосборки, когда биополимеры самопроизвольно формируют наноструктурированные пленки, избегая при этом денатурации макромолекул (Whitesides, Grzybowski, 2002). Формирование и структуру ДНК-содержащей нанопленки можно изучать методами наногра-виметрического анализа и атомно-силовой микроскопии. Применение на-нопленок в качестве биоселективных элементов сенсоров позволяет сохранить антигенные свойства нативной ДНК. Изучение процессов создания нанопленок представляет самостоятельный интерес для исследования многих аспектов взаимодействия биологических макромолекул. В связи с этим представляется весьма актуальным разработка и определение свойств ДНК-содержащей нанопленки для использования в качестве чувствительного элемента пьезокварцевых биосенсоров для определения AT к нативной ДНК.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы было получение и характеристика свойств ДНК-содержащей нанопленки для создания рецепторного слоя пьезоквар-цевого биосенсора.

В работе были поставлены следующие задачи:

о исследовать сорбцию потенциальных слоев-предшественников (поли-Ь-лизин, фибронектин, спермин, спермидин и нафион) на поверхности серебряных и золотых электродов пьезокварцевых резонаторов и их способность к связыванию нативной ДНК;

о определить оптимальные . условия формирования поли-Ь-лизинового слоя-предшественника и ДНК-содержащей пленки;

о охарактеризовать кинетику формирования, стабильность, вязкостно-эластичные свойства и структуру поверхности ДНК-содержащей нанопленки;

о изучить возможность применения пьезокварцевого биосенсора на основе полученной ДНК-содержащей нанопленки для определения АТ к нативной ДНК в сыворотке крови.

Научная новизна.

Установлено, что поли-Ь-лизин может быть иммобилизован на поверхности серебряных и золотых электродов кварцевых резонаторов в процессе самосборки, без предварительной модификации металлической поверхности. •

Впервые для изучения межмолекулярного взаимодействия ДНК и по-ли-Ь-лизина использован метод проточно-инжекционного наногравиметри-ческого анализа с одновременным измерением частоты колебаний и реактивного сопротивления кварцевого резонатора. Показано, что характер связывания ДНК и иммобилизованного поли-Ь-лизина зависит от вторичной структуры полинуклеотида. Описана кинетика связывания ДНК с иммобилизованным поли-Ь-лизином, определены эластичные свойства ДНК-содержащей нанопленки. Методом атомно-силовой микроскопии получены изображения ДНК-содержащей нанопленки и изучена структура ее поверхности.

Установлено, что полученная ДНК-содержащая нанопленка может быть использована в качестве распознающего элемента биосенсоров для определения АТ к нативной ДНК.

Практическая значимость.

Разработанный способ поэтапной иммобилизации поли-Ь-лизина и нативной ДНК на серебряных и золотых электродах кварцевых резонаторов может быть использован при конструировании других типов биосенсоров или ДНК-содержащих покрытий.

Представленный в работе протокол применения пьезокварцевого биосенсора на основе ДНК-содержащей нанопленки может быть использован для экспресс-анализа АТ к нативной ДНК.

Положения, выносимые на защиту:

1. Способ формирования на металлических поверхностях нанострук-турированной эластичной ДНК-содержащей нанопленки.

2. Использование полученной ДНК-содержащей нанопленки в:: качестве чувствительного элемента пьезокварцевых биосенсоров для определения AT к нативной ДНК в биологических жидкостях.

Апробация работы. , ■ ■

Основные результаты исследований докладывались на ежегодных итоговых научных конференциях Казанского государственного университета (2004-2006 гг.), на Международной научной конференции «Новая Геометрия Природы» (Казань, 2003), Всероссийской конференции "Новые биокибернетические и телемедицинские технологии XXI века для диагностики и лечения заболеваний человека" (Цегрозаводск, 2003), Всероссийской конференции по аналитической химии "Аналитика России - 2004" (Москва, 2004), научно-практической конференции "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии" (Казань, 2004), VI - VIII Международных научных молодежных школах "Когерентная оптика и оптическая спектроскопия" (Казань, 2002-2004), VI Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2006), 10-ой Школе-конференции молодых ученых "Биология — наука XXI века" (Пущино, 2006), XIII Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем (Яльчик, Республика Марий Эл, 2006).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ.

Благодарности.

Автор посвящает работу светлой памяти научного руководителя профессора В.Г. Винтера, организатора исследований по созданию пьезокварцевых биосенсоров в Казанском государственном университете.

Автор выражает глубокую признательность и искреннюю благодарность за поддержку, консультации и помощь в работе научному руководителю д.б.н. З.И. Абрамовой; проф., д.б.н. Д.Г. Ишмухаметовой; проф., д.м.н. Л.И. Анчиковой; доц., к.ф-м.н. O.A. Коноваловой; инженеру, каф. биохимии B.C. Гаврилову; доц., к.б.н. В.И. Гаранину; проф., д.б.н. А.И. Голубеву; доц., к.ф-м.И. К.'Ю. Нагулину; доц., к.б.н. P.M. Сабир.ору и проф,, д.ф-м.н. М.Х. Салахову; а также всему коллективу кафедры биохимии КГУ.

Структура и объем диссертации. .

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 170 страницах машинописного текста, включает 52 рисунка и 6 таблиц. Список использованных библиографических источников включает 262 источника, из них 245 - иностранные работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объект исследования

В работе использовали коммерческие препараты поли-Ь-лизина (Sigma) и ДНК эритроцитов цыплят (Reanal). Сыворотки крови больных бронхиальной астмой и здоровых доноров любезно предоставлены Республиканской клинической больницей РТ, сыворотки крови больных системной красной волчанкой (СКВ) и очищенные AT к ДНК - проф. Д.Г. Ишму-хаметовой.

Методы исследования

Наногравиметрический анализ

Кварцевые микровесы для работы в газовом режиме были изготовлены на кафедре общей физики КГУ доц. К.Ю. Нагулиным. Для жидкостного анализа использовали кварцевые микровесы QCM 200 фирмы Stanford Research Systems (SRS, США). Схема экспериментальных установок изображена на рис. 1.

Рис. 1. Экспериментальная установка для проведения наногравиметри-

ческого анализа: А —в газовом режиме; Б—в жидкостном режиме

Анализ осуществляли в газовом и жидкостном (проточно-инжекционном) режимах. Серебряные электроды пьезокварцевых резонаторов (ПКР) для газового анализа механически шлифовали порошком А^Оз, затем отмывали в растворе, содержащем равные объемы 1М ЫаОН и 33% Н202, ополаскивали 96% этанолом и водой. Золотые электроды ПКР для газового анализа отмывали в растворе, содержащем равные объемы 1М №ОН и 33% Н2О2, ополаскивали 96% этанолом и водой. Предварительную очистку золотых электродов ПКР фирмы SRS осуществляли обработкой ультрафиолетом (134-340 нм) на расстоянии 10 см от источника, затем последовательно выдерживали в 1 М ИаОН, 1 М НС1 и повторяли обработку ультрафиолетом. В промежутках ПКР ополаскивали деионизованной водой.

Нанесение и оценку эффективности иммобилизации биологических слоев на поверхности электрода ПКР осуществляли методом анализа в газовом режиме. На электрод наносили определенный объем раствора исследуемого вещества и инкубировали в насыщенной водяными парами камере.

После инкубации жидкость удаляли с электрода, отмывали на магнитной мешалке и высушивали в сушильном шкафе при +37°С. Сорбцию оценивали по разности резонансной частоты колебаний ПКР (по модулю) до и после инкубации.

В проточно-инжекционном режиме ячейку, содержащую резонатор, помещали в термостат (+37°С), затем фиксированный объем жидкости вводили в стеклянный инжектор и пропускали через проточную ячейку при помощи перистальтического насоса со скоростью 80 мкл/мин. Присоединение веществ к поверхности электрода определяли по изменению резонансной частоты (ДБ) и реактивного сопротивления (ДИ.) электрода ПКР в реальном времени, с интервалом в 1 с.

Формирование и изучение свойств ДНК-содержащей нанопленки Для изучения взаимодействия поли-Ь-лизина и ДНК ¡п Бки резонатор помещали в проточную ячейку, пропускали через нее буфер до стабилизации сигнала, вносили в ячейку раствор нативной (нДНК) или денатурированной ДНК (дДНК) (50 мкг/мл), затем пропускали через ячейку буфер для удаления неприсоединившихся молекул ДНК. В качестве контроля использовали сорбцию ДНК на золотой электрод, не обработанный поли-Ь-лизином. V

Применение ДНК-содержащей нанопленки в качестве чувствительного элемента пьезокварцевого биосенсора

Для оценкк чувствительности пьезокварцевого биосенсора с рецептор-ным слоем из ДНК-содержащей нанопленки использовали образцы сывороток крови, содержащие АТ к нДНК (сыворотки крови больных СКВ, бронхиальной астмой), а также растворы, содержащие известные концентрации очищенных препаратов АТ к нативной ДНК. В качестве контроля использовали сыворотки крови здоровых доноров, а также растворы моноклональ-ных АТ к человека, АТ к денатурированной ДНК и ДНКазы I. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически (Х=280 нм). Содержание АТ к нативной ДНК в используемых образцах предварительно определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) (Сатарова и др., 1994). Для предотвращения неспецифической сорбции электроды ПКР, модифицированные ДНК-содержащей нанопленкой, предварительно обрабатывали раствором бычьего сывороточного альбумина (1% раствор в фосфатно-солевом буфере).

Сыворотки крови разводили в фосфатно-солевом буфере с твином до концентрации белка, равной 0,1 мг/мл. При анализе в газовом режиме на электрод наносили 40 мкл сыворотки, инкубировали в течение часа во влажной камере, затем отмывали последовательно в буфере, воде, высушивали и определяли сдвиг частоты.

При проточно-инжекционном анализе через проточную ячейку'с установленным ПКР пропускали определенный объем раствора очищенных АТ

или разведенной сыворотки, затем отмывали фиксированным объемом буфера. Присоединение AT к ДНК-содержащей нанопленки оценивали по изменению резонансной частоты и реактивного сопротивления биосенсора в реальном времени, с интервалом в 1 с.

Атомно-силовая микроскопия (АСМ)

При изучении поэтапного формирования нанопленки 100 мкл раствора поли-Ь-лизина (0,1 мг/мл) в 0,05 М NaOH-глициновом буфере (рН 10,6) наносили на электрод, инкубировали в течение 60 мин при +37°С, отмывали в воде и высушивали, после чего изучали поверхность методом АСМ. Затем 100 мкл раствора ДНК (50 мкг/мл) в 0,05 М Tris-HCl буфере (рН 7,2), содержащем 0,15 М NaCl и 0,001 М ЭДТА, наносили на электрод и инкубировали в течение часа, затем отмывали в воде и высушивали, после чего изучали поверхность методом АСМ.

Изучение поверхностной структуры электродов и ДНК-содержащей нанопленки проводили в полуконтактном режиме на воздухе при комнатной температуре на атомно-силовом микроскопе Solver Р47Н (ЗАО «НТ-МДТ», РФ), сканер - 50 мкм, со сканирующей головкой «Смена Б». Использовали кремниевые кантилеверы (радиус кривизны острия - менее 10 нм, резонансная частота колебаний зонда - 190-225 кГц). Сканирование проводили с разрешением 1024x1024 точек.

Оценка результатов и статистическая обработка

Определение изменения поверхностной массы при газовом анализе осуществляли с использованием уравнения Зауэрбрея (Sauerbrey, 1959). Регистрацию и первичную обработку экспериментальных данных кварцевых микровесов QCM 200 осуществляли при помощи программы Lab View 1.0. Вязкостно-эластичные свойства пленки ДНК-содержащей пленки определяли, используя отношения экспериментальных значений сдвига резонансной частоты и реактивного сопротивления (ARMF) (Xie et al., 2003). Кинетику взаимодействия поли-Ь-лизина и ДНК описывали с помощью функции нелинейного приближения программы Prizm 4. Для сравнения выборок использовали непараметрический критерий Манна-Уитни (Акберова, 2004). Полученные результаты обрабатывали при помощи программы SigmaStat 9.0. Обработку изображений сканированных объектов производили с помощью программного обеспечения «Nova» RC 1.0.26.578 для зондовых микроскопов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изучение сорбции слоя-предшественника для иммобилизации ДНК

В предварительных экспериментах было установлено, что ДНК при иммобилизации на золотых электродах не может быть закреплена на метал-

лической поверхности непосредственно. В связи с этим было необходимо использовать какой-либо слой-предшественник для иммобилизации ДНК. В качестве возможных слоев-предшественников были выбраны ДНК-связывающие полипептиды - поли-Ь-лизин и фибронектин, полиамины -спермин и спермидин, а также нафион (перфторсульфонатный полимер, обладающий нанокластерной структурой и формирующий однородные пленки на поверхности металлов). На рис. 2-А показано изменение частоты колебаний ПКР в зависимости от сорбции исследуемых веществ на поверхности электрода.

1ЮО 1400 9 1200 3 10»

5 »

сшрмии сгирмидим лолмпиаин (ифнен фи6роинт*и спермим сгирмидин полигинии ч»ф«ои фибронмгтин

А Б

Рис. 2. А - сорбция слоя-предшественника на поверхности электрода ПКР;

, Б — присоединение ДНК к слою-предшественнику

Спермин и спермидин не связываются с металлической'повёрхностйо и удаляются при отмывке. Это может быть обусловлено небольшим размером молекул (молекулярная масса спермина и спермидина равна 348,2 Да и 254,63 Да соответственно). Поли-Ь-лизин, нафион и фибронектин образовывали пленки на поверхности электродов: сдвиг частоты при иммобилизации составляет 84±2 Гц, 1218+275 Гц и 175±15 Гц соответственно. Далее было установлено, какое из данных веществ в иммобилизованном состоянии обладает способностью к связыванию ДНК. Результаты исследования показаны на рис. 2-Б. Наибольший сдвиг частоты (60±8 Гц) обусловлен присоединением ДНК к иммобилизованному поли-L-лизину. Фибронектин также связывает ДНК, однако значительно менее эффективно. Нафион не связывает ДНК, что объясняется отрицательным поверхностным зарядом нафионовой пленки, отталкивающей отрицательно заряженную ДНК (Jang et al., 2004). Исходя из этого, в качестве слоя-предшественника для иммобилизации ДНК выбран высокомолекулярный полипептид поли-Ь-лизин.

Для определения оптимальных условий формирования поли-Ь-лизинового. слоя-предшественника на металлическом электроде было изучено влияние таких факторов, как рН, температура, время инкубации и концентрация поли-L-лизина в растворе. Результаты представлены на рис. 3.

■ 1 I

3.0 6.0 13 ю.в 12.6

МО ]

МП ¥

10 20 30 40 50 во 70 (О 90 100 110 120 8р*мя мяувмм (м*4

Кони« пути» <мг»мо)

в г

Рис. 3. Влияние на сорбцию поли-Ь-лизина на поверхности электрода кварцевого резонатора: А — рН буфера; Б — времени инкубации; В — температуры инкубации; Г— концентрации поли-Ь-лизина в растворе

В частности, установлено, что наиболее эффективно поли-Ь-лизин сорбируется из ЫаОН-глицинового буфера (рН 10,6). Это может быть связано с тем, что при иммобилизации а-спиральных молекул поли-Ь-лизина наиболее вероятна компактная укладка полипептида на поверхности электрода. При кислых значениях рН (3,0 и 5,0) поли-Ь-лизин обладает неупорядоченной структурой, которая из-за электростатического отталкивания -ЫН2 групп недостаточно прочно присоединяется к поверхности металла и удаляется в процессе отмывки, о чем свидетельствует меньший сдвиг частоты (рис. 3-А).

Также было показано, что пленка поли-Ь-лизина формируется на поверхности электрода в течение первых 60 мин, дальнейшая инкубация не вызывает значительного сдвига частоты (рис. 3-Б).

Важным аспектом при разработке биосенсора является определение оптимальной температуры формирования биорецепторной пленки. Как показано на рис. 3-В, присоединение поли-Ь-лизина к электроду не зависит от температуры в пределах от +4°С до +37°С. Результаты можно объяснить тем, что при щелочных значениях рН в диапазоне температур от 0 до +38°С поли-Ь-лизин находится в а-спиральном состоянии. Изучение сорбции поли-Ь-лизина при температурах выше +40°С не проводили, так как известно,

что при температурах выше +40°С данный полипептид приобретает р-структуру (ЯосНдиег-МаЫог^о е1 а1., 2005). Р-слой поли-Ь-лизина, иммобилизованный на электроде биосенсора, из-за пространственного несоответствия участков взаимного присоединения данных макромолекул (Ы1\уа е1 а1., 2002), связывает ДНК гораздо менее эффективно, чем а-спиральная структура. ';

Таким образом, формирование слоя-предшественника происходит одинаково эффективно как в холодильной камере (+4°С), так и при комнатной температуре (+25 °С) или в термостате (+37°С), что упрощает технологию получения пленки.

Кроме того, как показано на рис. 3-Г, увеличение концентрации поли-Ь-лизина в инкубационном растворе вызывает лишь незначительное увеличение сдвига частоты, что позволяет использовать малые концентрации поли-Ь-лизина (0,1 мп/мл).

В настоящее время для разработки пьезокварцевых биосенсоров наиболее часто используют ГЖР с золотыми или серебряными электродами. Нами была установлена зависимость сорбции поли-Ь-лизина от материала электрода. Результаты представлены на рис. 4.

Рис. 4. Зависимость сорбции поли-Ь-лизина от материала электродов ПКР

Пьезокварцевые резонаторы с серебряными электродами относительно дешевы и доступны, но предназначены для работы в герметично закрытом корпусе с инертной атмосферой. Для создания биосенсоров резонатор необходимо освободить от корпуса, что способствует образованию оксидной пленки на поверхности серебряных электродов. Это отрицательно влияет на иммобилизацию биологических макромолекул.

Для удаления оксидной пленки серебряные электроды шлифуют абразивным материалом. Эффективность сорбции поли-Ь-лизина на шлифованной поверхности серебряного электрода значительно.возрастает, однако структура поверхности обуславливает неоднородную толщину слоя, что может вызвать десорбцию последующих слоев во время отмывок. Для изучения топографии электродов нами использован метод атомно-силовой микроскопии, позволяющий изучить шероховатость исследуемой поверхности. АСМ-изображения электродов показаны на рис. 5.

А Б

Рис. 5. Поверхности электродов кварцевых резонаторов: А- золотой электрод; Б - серебряный электрод

Шлифованная поверхность серебряных электродов обладает развитой поверхностной структурой со средним параметром шероховатости Ä,=146 нм. Эффективная площадь такого электрода изменяется при каждой обработке абразивом, поэтому невозможно обеспечить воспроизводимую иммобилизацию поли-Ь-лизина. Кроме того, при использовании шлифованных серебряных электродов в жидкой среде происходит неконтролируемое внедрение жидкости в полости поверхности электрода, что также отрицательно сказывается на стабильности и воспроизводимости анализа.

Резонаторы с золотыми электродами, напыленными на полированную поверхность кварцевого кристалла, лишены этих недостатков (Marx, 2003). Нами установлено, что средний параметр шероховатости золотых электродов 3 нм. Золотое покрытие электрода отличается химической и механической стабильностью. Кроме того, полированная поверхность делает возможным равномерное распределение молекул, что обеспечивает воспроизводимые результаты измерений. В связи с этим для дальнейшего изучения иммобилизации ДНК и иммуноанализа использовали резонаторы с золотыми электродами.

Формирование и изучение свойств ДНК-содержащей пленки

Определение оптимальных условий иммобилизации ДНК на поверхности золотого электрода, модифицированного поли-Ь-лизином, проводили в газовом режиме. Результаты показаны на рис. 6.

I 50 1 «0

3»

■ »I

В кислой среде (рН 3,0) молекула ДНК не несет суммарного отрицательного заряда, что препятствует ее связыванию с поли-Ь-лизином. При рН 10,6 аминогруппы поли-Ь-лизина находятся в незаряженном состоянии, соответственно, они не могут участвовать во взаимодействии с отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК. В нейтральной среде (рН 7,4) ДНК заряжена отрицательно, а по-ли-Ь-лизин - положительно, что . обуславливает эффективное присоединение ДНК к слою-предшественнику (рис. 6-А).

Оптимальной концентрацией ДНК для формирования ДНК-содержащей пленки является концентрация 50 — 100 мкг/мл (рис. 6-Б). При более высоких концентрациях ДНК (500 - 1000 мкг/мл), по-видимому, происходит взаимное экранирование фосфатных групп по-линуклеотида, что затрудняет взаимодействие с поли-Ь-лизином.

ДНК связывается с поли-Ь-лизином одинаково эффективно при . +25°С и +37°С, тогда как при инкубации на холоду наблюдается значительно меньшее присоединение ДНК (рис. 6-В).

На основании полученных результатов, в дальнейшем, для формирования ДНК-содержащей пленки использовали растворы ДНК с концентрацией 50 мкг/мл в 0,05 М Тпв-НО буфере (рН 7,2), инкубацию проводили при + 37°С. Следующим этапом характеристики ДНК-содержащей пленки было изучение динамики ее формирования в.проточно-инжекционном режиме. Для этого использовали кварцевые микровесы С?СМ 200. Одновременное измерение резонансной частоты и реактивного сопротивления с их помо-

Кмцсятрмм ДНК ■ растра

I I I

• I

Тамтратура

Рис. 6. Зависимость присоединения нашивной ДНК к электроду, модифицированному поли-Ь-лизином, от: А -рН и состава буфера; Б — концентрации ДНК (мкг/мл); В — температуры инкубации (°С)

щью позволяет не только оценить присоединение массы, но и определить вязкостно-эластичные свойства тонких пленок.

На рис. 7 показано изменение сигнала ПКР, на электрод которого нанесен поли-Ь-лизин, при пропускании через проточную ячейку нативной и денатурированной ДНК. В качестве контроля использовали не модифицированный поли-Ь-лизином электрод. ДНК не связывается с чистой золотой поверхностью, о чем свидетельствует нулевой сдвиг частоты и реактивного сопротивления.

Время (с) 8ремя (с)

А Б

Рис. 7. Изменение: А - частоты колебаний; Б — реактивного сопротивления ПКР, модифицированного поли-Ь-лизином, при взаимодействии с нативной (3) и денатурированной ДНК (2). Контроль (1)—электрод, не модифицированный поли-Ь-лизином

Характер взаимодействия полипептида с нативной и денатурированной ДНК существенно отличается. Присоединение нативной ДНК к поли-Ь-лизину обуславливает сдвиг частоты 60±12 Гц, денатурированной - 21±3 Гц. Изменение реактивного сопротивления также свидетельствует о различиях в механизме присоединения нативной и денатурированной ДНК к по-ли-Ь-лизину. Связывание нативной ДНК обуславливает сдвиг сопротивления 11±1 Ом, тогда как значение сдвига сопротивления при связывании денатурированной ДНК находится в пределах ±1 Ом. Нами определено время насыщения (26,5 мин), когда присоединение дополнительной массы к электроду прекращается и кривая присоединения нативной ДНК выходит на плато. Полученная пленка обладает эластичными свойствами, о чем свидетельствует значение соотношения ЛЯУДР, равное 0,183 Ом/Гц. Такая ДНК-содержащая пленка может быть использована в качестве чувствительного компонента пьезокварцевого сенсора, так как присоединение дополнительной массы к ее поверхности можно описать уравнением Зауэрбрея для эластичных пленок (Би, 2005).

Для изучения стабильности иммобилизованного комплекса полигЬ-лизина с нативной и денатурированной ДНК через проточную ячейку, в течение длительного времени после образования комплекса, пропускали буфер и наблюдали за процессом десорбции. На рис. 8 показано, что денатурированная ДНК постепенно удаляется буфером с поверхности модифицированного поли-Ь-лизином электрода, тогда как нативная ДНК остается в связанном состоянии. Различия в характере связывания нативной и денатурированной ДНК можно объяснить следующим.

Принято считать, что при формировании комплексов нуклеиновых кислот полилизином связывание происходит за счет электростатического взаимодействия между отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК и положительно заряженными 6-аминогруппами поли-Ь-лизина (Зенгер, 1987). Однако позднее было высказано предположение о том, что важную роль в процессе ком-плексообразования между поли-Ь-лизином и ДНК играет вторичная структура полинуклеотида (>Лууа е1 а!., 2002).

По нашим данным, денатурированная ДНК значительно менее эффективно связывается с поли-Ь-лизином, чем нативная ДНК. Очевидно, в основе связывания лежит исключительно электростатическое взаимодействие, поэтому при отмывке денатурированная ДНК легко удаляется с поверхности электрода. В случае комплекса поли-Ь-лизина с нативной ДНК электростатическое связывание дополняется конформационным взаимодействием, что обуславливает высокую стабильность комплекса и позволяет использовать его в качестве ДНК-содержащей нанопленки для конструирования ДНК-биосенсоров для определения АТ к нативной ДНК.

Важную роль во взаимодействии иммобилизованной нативной ДНК и АТ играет структура ДНК-содержащего чувствительного слоя. Для изучения структуры ДНК-содержащей пленки нами был применен метод атомно-силовой микроскопии. Результаты (табл. 1) показывают, что поли-Ь-лизин формирует нанопленку толщиной около 8,68 нм, что соответствует толщине мономолекулярного слоя на твердой поверхности (уап ёеп Веискеп й а1., 2006).

0 2000 4000 6000 8000 1000012000

Время (с)

Рис. 8. Изменение частоты колебаний ПКР при длительной отмывке нанопленки, содержащей денатурированную ДНК (I) и нативную ДНК (2)

Таблица 1. Значения параметров перепада высот, среднеквадратичной шероховатости и толщины покрытия при поэтапном формировании ■ ' ____ ДНК-содержащей нанопленки

Пленка: Параметр

перепада высот (нм): среднеквадратичной шероховатости (нм): толщина (нм):

золото 19,75±2,01 2,59±0,05 -

поли-Ь-лизин - 28,43±4,68 3,19±0,31 8,68

ДНК 37,86 ±4,61 4,55±0,13 9,43

Нанесение нативной ДНК приводит к образованию ДНК-содержащей нанопленки, при этом толщина слоя ДНК составляет около 9,43 нм. Увеличение среднеквадратичной шероховатости свидетельствует о том, что молекула ДНК при взаимодействии с поли-Ь-лизином компактизуется в конденсированные формы различной морфологии.

АСМ - изображения нанопленок, полученные в режиме изучения топографии, представлены на рис. 9. Показано, что последовательное нанесение поли-Ь-лизина и нативной ДНК приводит к возникновению на поверхности электрода выпуклых областей и впадин между ними. Перепад высот для ДНК-содержащей нанопленки варьирует от 2 до 40 нм, что свидетельствует о развитой поверхностной структуре пленки. О неоднородности поверхности, полученной при иммобилизации ДНК, говорит и увеличение, значения параметра шероховатости.

А Б В

Рис. .9, АСМ-изображения (режим топографии): А — чистый золотой электрод; Б - золотой электрод, модифицированный поли-Ь-лизином; В — золотой электрод, модифицированный последовательно поли-Ь-лизином и

ДНК

: Изображения поверхностей чистых и модифицированных электродов, полученные в режиме фазового контраста (рис. 10) и отличающиеся высоким разрешением, дают наглядное представление о поэтапном

формировании в процессе самосборки и строении ДНК-содержащей нанопленки.

А Б В

Рис. 10. АСМ-изображенш (режим фазового контраста): А - чистый золотой электрод; Б — золотой электрод, модифицированный поли-Ь-лизином; В — золотой электрод, модифицированный последовательно поли-

Ь-лизином и ДНК

Таким образом, иммобилизация поли-Ь-лизина на золотом электроде с последующим нанесением ДНК позволяет получить эластичную нанострукту-рированную ДНК-содержащую пленку, прочно закрепленную на поверхности биосенсора.

Применение пьез о кварцевого биосенсора на основе ДНК-содержащей нанопленки для определения антител к нативной ДНК

Анализ в газовом режиме

Для оценки возможности обнаружения АТ к ДНК с помощью разработанного нами наногравиметрического ДНК-биосенсора в газовом режиме использовали образцы крови больных СКВ, отличающиеся по уровню содержания АТ к нДНК по данным иммуноферментного анализа (ИФА), приведенным в относительных единицах (отн. ед.). В качестве контроля использовали сыворотку крови здорового донора. Результаты показаны на рис. 11.

Сдвиг частоты колебаний биосенсора увеличивается с увеличением уровня содержания АТ к нДНК в исследуемых сыворотках. Полученные результаты показывают, что использование биосенсора в газовом режиме позволяет дифференцировать образцы сывороток крови больных СКВ по содержанию АТ к нДНК.

Проба (1 - контроль; 2,3,4 - СКВ)

Рис. 11. Определение содержания АТк ДНК в сыворотках крови здорового донора (1) и больных СКВ (2-4) в газовом режиме (под номерами проб указаны данные ИФА в отн. ед.)

Наблюдаемый существенный сдвиг частоты после инкубации биосенсора в растворе сыворотки здорового донора, возможно, связан с неспецифической сорбцией белков сыворотки.

Использование биосенсора в газовом режиме позволяет определить разницу в количестве вещества, присоединившегося к электроду до и после анализа, однако при этом невозможно проследить процесс присоединения.

Анализ в жидкостном режиме

В отличие от газового режима, жидкостной (проточно-инжекционный) анализ дает возможность изучить процесс взаимодействия рецепторного слоя и определяемого вещества в динамике. Кроме того, отпадает необходимость в отмывке и высушивании биосенсора.

На первом этапе, для исключения влияния неспецифической сорбции, оценку чувствительности биосенсора в проточно-инжекционном режиме осуществляли, используя очищенные АТ к нДНК. В качестве контроля использовали АТ к дДНК, моноклональные (анти-1§Е человека) и ДНКазу I. Типичный отклик биосенсора показан на рис. 12.

1000 2000 3000 Время (с)

Рис 12. Отклик биосенсора при взаимодействии с очищенными АТ к нДНК (1), ДНКазой I (2), моноклональными /¿К? (анти-1%Е человека) (3) и АТ к дДНК (4): А-АР;Б-АЯ

Присоединение АТ к нДНК (линия 1) обуславливает резкое падение частоты колебаний и увеличение реактивного сопротивления биосенсора. Пропускание через проточную ячейку контрольных растворов, содержащих как моноклональные ^О (анти-^Е человека) (линия 3), так и АТ к дДНК (линия 4), вызывает лишь незначительный сдвиг частоты и сопротивления (табл. 2.), что исключает возможность неспецифического отклика в ходе анализа АТ к нДНК.

Таблица 2. Проточно-инясекционный иммуноанапиз при взаимодействии с очищенными АТ к нДНК, АТк дДНК, моноклональными ^й) иДНКа-

зой I

Образец: ^Сг (анти-нДНК) (анти-ДДНК) Моноклональные (анти-^Е) ДНК аза I

ДБ (Гц): 18±2 5±1 4±1 10±1

ДК. (Ом): 17±1 2±1 1±1 3±1

ДН/ДБ (Ом/Гц): 0,94 0,4 0,25 0,3

В отличие от контрольных взаимодействие ДНКазы I с чувствительным слоем биосенсора (линия 2) характеризуется поступательным падением частоты, что свидетельствуют о присоединении фермента к ДНК. Однако, и величина сдвига частоты, и скорость присоединения ДНКазы I существенно отличаются от присоединения АТ к нДНК к ДНК-содержащей нанопленке. Соотношение ДШДР, наблюдаемое при присоединении АТ к нДНК к поверхности ДНК-содержащей нанопленки и равное 0,94 Ом/Гц (табл. 2), свидетельствует о вязкостно-эластичном характере сформированного слоя (Би, 2005), что принципиально отличается от эластичного присоединения ДНКазы I и неспецифических АТ. Полученные результаты позволяют предположить, что пьезокварцевый ДНК-биосенсор на основе ДНК-содержащей нанопленки может использоваться для изучения характера взаимодействия ДНК-связывающих белков с ДНК.

Разработка любого биосенсора направлена на определение анализируемого вещества не только в модельных растворах, но и в крови пациентов. В связи с этим нами изучена возможность применения ДНК-содержащей нанопленки в качестве чувствительного элемента биосенсора при проточно-инжекционном анализе образцов крови больных СКВ и здоровых доноров. Типичные кривые отклика биосенсора показаны на рис. 13.

20 0 -20 -40 -60 -ВО -100

мод пробы 1

отмыка буфером

■3? 14

"и а

отмывка буфером V.

ИОД пробы

2000 3000 Время (с)

2000 3000 Время (с)'

4000 5000

Рис. 13. Типичный отклик биосенсора при анализе сывороток крови боль. ной СКВ (2) и здорового донора(1): А-АР; Б - А11

Отклик при взаимодействии образца сыворотки, содержащей повышенный уровень АТ к нДНК (линия 2), с чувствительным покрытием биосенсора,! существенно отличается от взаимодействия с образцом сыворотки крови здорового донора (линия 1). Дифференцировать специфическое взаимодействие АТ к нДНК от неспецифической сорбции компонентов контрольной сыворотки можно как по значениям сдвига частоты, так и по значениям сдвига сопротивления (табл. 3).

Таблица 3. Проточно-инжекционный иммуноанализ образцов крови

больных СКВ и здоровых доноров

Образец: СКВ Здоровый донор

Данные ИФА (отн. ед.): 0,91 0,075

ДБ (Гц): 93 ±б 14±3

ДЯ (Ом): 9±1 2±1

При этом одновременное измерение двух независимых параметров (частоты и сопротивления) обеспечивает высокую специфичность анализа.

-Чувствительность разработанного биосенсора к уровню содержания АТ к нДНК в крови изучали с использованием сывороток крови больных бронхиальной астмой с известным содержанием АТ к нДНК. Типичные кривые отклика биосенсора при пропускании исследуемых образцов показаны на рис. 14.

Время (с) 8Р«МЯ М

А Б

Рис. 14. Типичный отклик биосенсора при анализе сывороток крови человека, содержащих АТ к ДНК. Линии 1, 2, 3- сыворотки больных бронхиальной астмой; 4 — сыворотка больной СКВ: А - АР; Б - АЯ

После введения образцов сыворотки крови в проточную ячейку происходит падение частоты колебаний (рис. 15-А) и увеличение реактивного сопротивления (рис. 15-Б), пропорциональное содержанию АТ в образцах (табл. 4). Отмывка буфером приводит к удалению присоединившиеся неспецифических компонентов, при этом значения частоты и сопротивления выравниваются и в дальнейшем не изменяются.

Таблица 4. Проточно-инжекционный иммуноанализ сывороток крови больных бронхиальной астмой (БА) и СКВ, содержащих АТ к ДНК

Проба: Астма 1 Астма 2 Астма 3 СКВ

Данные ИФА (отн. ед.): 0,33 0,62 0,87 1

ДР (Гц): 22±3 30±1 43±2 55±2

ДЯ (Ом): 1±1 - 2±1 3±1 4±1

Полученные результаты свидетельствуют о стабильности присоединения АТ к ДНК-содержащей нанопленке.

Перспективы проведения экспресс-анализа с помощью пьезокварцевого ДНК-биосенсора

Нами выявлена зависимость скорости присоединения АТ к нДНК к биосенсору от уровня содержания АТ в анализируемом образце. Результаты показаны на рис. 15.

Изучение динамики присоединения АТ к нДНК в реальном времени показало, что ощутимый сигнал фиксируется прибором уже с первых минут введения образца, в отличие от методов иммуноферментного или газового наногравиметрического анализа, предполагающих длительные стадии инкубации.

500 550 600 650 700 750 800 Время (с)

5°'°

500 550 600 650 700 750 800 Время (с)

А Б

Рис., 15. Экспресс-анализ АТк нДНК в образцах сывороток больных бронхиальной астмой (1,2) и СКВ (3) А - АЕ; Б-АЯ. Содержание АТ к нДНК: 0,2; 0,8 и 1 отн. ед., соответственно . .

Мы предполагаем, что разработанный нами биосенсор на основе ДНК-содержащей нанопленки, может быть использован в проточно-инжекционном режиме для экспресс-анализа AT к н ДНК.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что поли-Ь-лизин может быть использован в качестве предшественника для иммобилизации нативной ДНК на поверхности золотых и серебряных электродов пьезокварцевых резонаторов.

2. Определены условия формирования поли-Ь-лизинового слоя-предшественника на электроде пьезокварцевого резонатора, изучена зависимость формирования пленки от материала электродов. v

3. Оптимизированы условия формирования ДНК-содержащей нанопленки. Методами наногравиметрического анализа и атомно-силовой микроскопии определены кинетика формирования, вязкостно-эластичные свойства и структура ДНК-содержащей нанопленки.

4. Разработан пьезокварцевый биосенсор на основе ДНК-содержащей нанопленки и показана возможность его применения для определения антител к нативной ДНК в сыворотке крови.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Коновалова O.A. Перспективы создания ДНК-модифицированных им-муносенсоров на основе пьезоэлектрических и электрохимических трансдьюсеров / O.A. Коновалова, Р.Ф. Фахруллин, В.Г. Винтер // VI Международная научная молодежная школа «Когерентная оптика и оптическая спектроскопия». Сборник статей. - Казань. 2002. - С.342-348.

2. Фахруллин Р.Ф. ДНК-модифицированный наносенсор на основе пьезоэлектрического кварцевого резонатора / Р.Ф. Фахруллин, К.Ю. Нагу-лин, O.A. Коновалова, Ф.Ф. Мухлисуллина, В.Г. Винтер // VII Международная научная молодежная школа «Когерентная оптика и оптическая спектроскопия». Сборник статей. -Казань. 2003. - С.215-221.

3. Салахов М.Х. Микрогравиметрические биосенсоры на основе пьезок-варцевых резонаторов / М.Х. Салахов, В.Г. Винтер, O.A. Коновалова, Р.Ф. Фахруллин // «Новая Геометрия Природы»: Труды объединенной международной научной конференции. Т II: Биология, медицина. - Казань. 2003. - С.318-324.

4. Коновалова O.A. Возможности использования ДНК-модифицированного пьезоэлектрического биосенсора для определения AT к ДНК / O.A. Коновалова, Р.Ф. Фахруллин, В.Г. Винтер // «Новые биокибернетические и телемедицинские технологии 21 века для диагностики и лечения заболеваний человека». Тезисы докладов второй междисциплинарной конференции, посвященной 300-летию г. Петрозаводска. - Петрозаводск. 2003. - С.55-56.

5. Фахруллин Р.Ф. Изучение сорбции биологического чувствительного слоя на поверхности электродов пьезокварцевого наносенсора / Р.Ф. Фахруллин, O.A. Коновалова, К.Ю. Нагулин, В.Г. Винтер // Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии: Материалы научно-практической конференции. Казань , 17-18 июня 2004 г. Труды молодых ученых, под ред. Р.Г Василова. - М.: «Русская панорама», 2004. - С.138-143.

6. Фахруллин Р.Ф. Применение пьезокварцевого наносенсора для определения ДНК-интеркалирующих соединений / Р.Ф. Фахруллин, O.A. Коновалова, Ф.Ф. Мухлисуллина, К.Ю. Нагулин, В.Г. Винтер // Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии: Материалы научно-практической конференции. Казань , 17-18 июня 2004 г. Труды молодых ученых, под ред. Р.Г Василова. - М.: «Русская панорама», 2004. - С.143-148.

7. Фахруллин Р.Ф. Изучение сорбции биологического чувствительного слоя на поверхности электродов пьезокварцевого наносенсора / Р.Ф. Фахруллин, O.A. Коновалова, К.Ю. Нагулин, В.Г. Винтер // VIII Международная научная молодежная школа «Когерентная оптика и оптическая спектроскопия». Сборник статей. - Казань. 2004. - С.239-245.

8. Фахруллин Р.Ф. Применение пьезокварцевого наносенсора для определения ДНК-интеркалирующих соединений / Р.Ф. Фахруллин, O.A. Ко-

"новалова, Ф.Ф. Мухлисуллина, К.Ю. Нагулин, В.Г. Винтер // VIII Международная научная молодежная школа «Когерентная оптика и оптическая спектроскопия». Сборник статей. - Казань. 2004. - С.245-251.

9. Винтер В.Г. Создание ДНК-наносенсоров на основе пьезокварцевых резонаторов /В.Г. Винтер, O.A. Коновалова, Р.Ф. Фахруллин, В.В. Чижов,

С.С. Харинцев, М.Х. Салахов // Наукоемкие технологии. - 2004. — №4. -Т. 5. -С. 24-30.

Ю.Фахруллин Р.Ф. Иммобилизация покрытий и контроль чувствительных слоев пьезокварцевого наносенсора / Р.Ф. Фахруллин, К.Ю. Нагулин, O.A. Коновалова, Л.И. Анчикова, Е.Ю. Подшивалина // «Аналитика России — 2004» (Всероссийская конференция по аналитической химии). -Москва.-2004. Тезисы докладов. - С.103. . , ,

11.FakhrulUn R.F.' The development of DNA-nanosensors based on piezoelectric resonators / R.F. Fakhrullin, S.S. Kharintsev, O.A. Konovalova, M.Kh. Salakhov, V.G. Vinter // Problems of nonlinear analysis in engineering systems.-2005. - V. 2 (23) - P. 37 - 48.

12.Фахруллин Р.Ф. Кварцевый наногравиметрический анализатор как инструмент для изучения межмолекулярного взаимодействия ДНК и поли-L-лизина / Р.Ф. Фахруллин, М.В. Матвеева // Материалы VI Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века". — Казань. 2006. Тезисы докладов. — С.114.

13.Фахруллин Р.Ф. Определение оптимальных условий формирования пол- лилизиновой пленки для иммобилизации ДНК на поверхности электро, дов пьезокварцевых резонаторов / Р.Ф. Фахруллин, O.A. Коновалова,

[В.Г. Винтер|, М.Х. Салахов // Сборник материалов 10-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука. XXI века", -Пущино. 2006. - С. 170.

14.Фахруллин Р.Ф. Определение AT к ДНК в сыворотке крови иммунизированных кроликов / Р.Ф. Фахруллин, Е.Ю. Подшивалина, O.A. Коновалова, Л.И. Анчикова, К.Ю. Нагулин, З.И. Абрамова, М.Х. Салахов II

- Структура и динамика молекулярных систем. Сборник тезисов докладов и сообщений на XIII Всероссийской конференции. - Уфа. 2006. — С.257

15.Фахруллин Р.Ф. Наногравиметрический ДНК-биосенсор: формирование биорецепторной пленки и определение AT к ДНК / Р.Ф. Фахруллин, |В.Г. Винтер|, З.И. Абрамова, Л. И. Анчикова, Е.Ю. Подшивалина, O.A. Коновалова, К.Ю. Нагулин, М.Х. Салахов // Биомедицинские тех. нологии и радиоэлектроника. - 2006. - № 8-9 ^ 6$ — 7? _

16.Фахруллин Р.Ф. Изучение межмолекулярного взаимодействия ДНК и полилизина методами наногравиметрического анализа и атомно-силовой микроскопии / Р.Ф. Фахруллин, З.И. Абрамова, O.A. Коновалова, М.Х. Салахов И Ученые записки Казанского государственного университета. — 2006. — Т. 148. Серия «Естественные науки», книга 3. С,/6* у / .

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф.207

Тел: 272-74-59, 541-76-41, 541-76-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжски.н межрегиональным территориальным управлением МИТР РФ. Подписано в печать 25.08.2006 г. Усл. п.л 1,5. Заказ Л» К-5173. Тираж 100 экз. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фахруллин, Равиль Фаридович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Антитела к нативной ДНК как критерий диагностики аутоиммунных заболеваний

1.2. Наногравиметрические биосенсоры как инструмент биохимических исследований

1.2.1. Биосенсоры на основе пьезокварцевых резонаторов

1.2.2. Физические основы масс-чувствительности пьезокварцевых резонаторов

1.2.3. Конструирование пьезокварцевого биосенсора

1.2.4. Иммобилизация биологического компонента биосенсора

1.3. Методы формирования и изучения свойств ДНК-содержащих рецепторных покрытий биосенсоров

1.3.1. Ковалентные методы иммобилизации нуклеиновых кислот

1.3.2. Нековалентные методы иммобилизации нуклеиновых кислот

1.3.3. Бионанотехнологические подходы к иммобилизации нуклеиновых кислот

1.3.4. Атомно-силовая микроскопия как инструмент для изучения биологических объектов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение, свойства и применение ДНК-содержащей нанопленки для пьезокварцевых биосенсоров"

Актуальность проблемы

Развитие биохимии в XXI веке определяется постоянным совершенствованием методов исследования. Последнее десятилетие происходит стремительное внедрение в биологическую науку новых подходов к изучению взаимодействия биологических макромолекул. В результате разработаны и постепенно входят в практику эффективные методы лабораторной диагностики различных заболеваний (Jain, 2005а).

Объектом пристального внимания исследователей являются антитела (AT) к ДНК, высокое содержание которых отмечается при системной красной волчанке (СКВ) и некоторых других аутоиммунных заболеванях (Blatt, Glick, 1999; Pincus et al., 2002, Pisetsky, 2004), в связи с чем постоянно ведется поиск новых методов анализа (Hahn, 1998).

Одним из подходов к детекции и изучению AT к нативной ДНК является разработка пьезокварцевых биосенсоров, отличающихся высокой чувствительностью и экспрессностью (Luppa et al., 2001; Kankare et al., 2006). Принцип действия пьезокварцевых биосенсоров основан на массV чувствительности пьезокварцевого резонатора, позволяющей фиксировать изменения массы на поверхности электродов в субнанограммовом диапазоне (Lu et al, 2004). Применение таких биосенсоров в проточно-инжекционном режиме дает возможность изучить процесс взаимодействия макромолекул in situ (Marxer et al., 2003). Из альтернативных средств исследования в аналитической химии и материаловедении пьезокварцевые сенсоры превращаются в один из мощных инструментов молекулярной биологии, генетики, нейробиологии, микробиологии, иммунологии и биохимии (Shons et al., 1972; Ко, Park, 2005; Yang et al., 2006).

На сегодняшний день описаны пьезокварцевые биосенсоры для ДНК-диагностики (Zhou et al., 2001) и определения некоторых ДНК-связывающих белков (Kim et al., 2002). Для формирования ДНК-содержащего рецепторного слоя подобных биосенсоров используется ковалентная иммобилизация однонитевых олигонуклеотидов (Mirsky, 2002).

Практически любой из биологически значимых полимеров - ДНК, белки, углеводы, может быть отнесен к нанообъектам, то есть таким объектам, хотя бы одно из линейных измерений которых не превышает 100 нм (Seeman, 2001; Котельников, 2004). Относительно недавно было установлено, что нанообъекты характеризуются особыми свойствами, позволяющими использовать их во многих научных и практических приложениях (Kawasaki, Player, 2005). Нанотехнология - область знания о структуре и свойствах нанообъектов, буквально ворвалась в биологию, предоставив последней целый арсенал высокоточных методов (Roco, 2003). Не исключено, что использование в качестве «строительных блоков» нанотехнологии таких биологических полимеров как ДНК (Park et al., 2005) в недалеком будущем позволит разработать наноустройтва и наномашины, которые коренным образом преобразуют современную науку и технику (Drexler, 1981).

Если еще недавно основное внимание уделялось традиционным методам, заключающимся в переходе от макрообъектов к микрообъектам, то сегодня разрабатывается также обратный подход - от малого к большему, или, как выразился один из основателей нанотехнологии Ричард Фейнман (Feynman, 1960; Silva, 2004): «снизу вверх». В связи с этим, в последние годы для формирования тонких пленок биологических веществ используются процессы самосборки молекулярных ансамблей (Winfree et al., 1998; Whitesides, Grzybowski, 2002). Формирование и структуру ДНК-содержащей нанопленки можно изучать методами наногравиметрического анализа и атомно-силовой микроскопии. Применение нанопленок в качестве биоселективных элементов сенсоров позволяет сохранить антигенные свойства нативной ДНК. Изучение процессов создания нанопленок представляет самостоятельный интерес для исследования многих аспектов взаимодействия биологических макромолекул. В связи с этим представляется весьма актуальным разработка и определение свойств ДНК-содержащей нанопленки для использования в качестве чувствительного элемента пьезокварцевых биосенсоров для определения AT к нативной ДНК.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было получение и характеристика свойств ДНК-содержащей нанопленки для создания рецепторного слоя пьезокварцевого биосенсора.

В работе были поставлены следующие задачи: о исследовать сорбцию потенциальных слоев-предшественников (поли-Ь-лизин, фибронектин, спермин, спермидин и нафион) на поверхности серебряных и золотых электродов пьезокварцевых резонаторов и их способность к связыванию нативной ДНК; о определить оптимальные условия формирования поли-Ь-лизинового слоя-предшественника и ДНК-содержащей пленки; о охарактеризовать кинетику формирования, стабильность, вязкостно-эластичные свойства и структуру поверхности ДНК-содержащей нанопленки; о изучить возможность применения пьезокварцевого биосенсора на основе полученной ДНК-содержащей нанопленки для определения AT к нативной ДНК в сыворотке крови.

Научная новизна

Впервые для изучения межмолекулярного взаимодействия ДНК и поли-L-лизина использован метод проточно-инжекционного наногравиметрического анализа с одновременным измерением частоты колебаний и реактивного сопротивления кварцевого резонатора. Показано, что характер связывания ДНК и иммобилизованного поли-Ь-лизина зависит от вторичной структуры полинуклеотида. Описана кинетика связывания ДНК с иммобилизованным поли-Ь-лизином, определены эластичные свойства ДНК-содержащей нанопленки. Методом атомно-силовой микроскопии получены изображения ДНК-содержащей нанопленки и изучена структура ее поверхности.

Установлено, что полученная ДНК-содержащая нанопленка может быть использована в качестве распознающего элемента биосенсоров для определения AT к нативной ДНК.

Практическая значимость

Представленный в работе протокол применения пьезокварцевого. биосенсора на основе ДНК-содержащей нанопленки может быть использован для экспресс-анализа AT к нативной ДНК.

Положения, выносимые на защиту:

1. Способ формирования на металлических поверхностях наноструктурированной эластичной ДНК-содержащей нанопленки.

2. Использование полученной ДНК-содержащей нанопленки в качестве чувствительного элемента пьезокварцевых биосенсоров для определения AT к нативной ДНК в биологических жидкостях.

Апробация работы

Основные результаты исследований докладывались на ежегодных итоговых научных конференциях Казанского государственного университета (2004-2006 гг.), на Международной научной конференции «Новая Геометрия Природы» (Казань, 2003), Всероссийской конференции "Новые биокибернетические и телемедицинские технологии XXI века для диагностики и лечения заболеваний человека" (Петрозаводск, 2003), Всероссийской конференции по аналитической химии "Аналитика России -2004" (Москва, 2004), научно-практической конференции "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии" (Казань, 2004), VI - VIII Международных научных молодежных школах "Когерентная оптика и оптическая спектроскопия" (Казань, 2002-2004), VI Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2006), 10-ой Школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2006), XIII Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем (Яльчик, Республика Марий Эл, 2006).

Структура и объем диссертации

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Фахруллин, Равиль Фаридович

ВЫВОДЫ

140

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фахруллин, Равиль Фаридович, Казань

1. Альтшуллер, Г.Б. Управление частотой кварцевых генераторов / Г.Б. Альтшулер // - М.: Связь.- 1975, - 215 с.

2. Акберова, Н.И. Сравнение данных. II. Непараметрические критерии значимости / Н.И. Акберова // Казань: Изд-во КГУ, - 2004а. -50 с.

3. Акберова, Н.И. Описательная статистика. Интервальные оценки / Н.И. Акберова // Казань: Изд-во КГУ, - 20046. - 40 с.

4. Андрианов, К.А. Кремнийорганические соединения / К.А. Андрианов // М.: Госхимиздат, - 1955. - 520 с.

5. Андриевский, Р.А. Наноструктурные материалы / Р.А. Андриевский, А.В. Рагуля // М.: Изд-во «Академия», - 2005. - 192 с.

6. Благой, Ю.П. Металлокомплексы нуклеиновых кислот в растворах // Ю.П. Благой, B.JI. Галкин, Г.О. Гладченко // Киев: Наукова думка, - 1991.-272 с.

7. Винтер, В.Г. Создание ДНК-наносенсоров на основе ' пьезокварцевых резонаторов / В.Г. Винтер, О.А. Коновалова, Р.Ф. Фахруллин, В.В. Чижов, С.С. Харинцев, М.Х. Салахов // Наукоемкие технологии. 2004, - Т. 5, - № 4, - С. 24-30.

8. Калмыкова, Е.Н. Разработка пьезокварцевых иммуносенсоров для проточно-инжекционного анализа высоко- и низкомолекулярных соединений / Е.Н. Калмыкова, Т.Н. Ермолаева, С.А. Еремин // Вестн. Моск. Ун-Та. Сер. 2. Химия. 2002. - Т. 43. - № 6, - С. 339-403.

9. Котельников, А.И. Белки как природные наноструктуры. Роль квантовых и динамических факторов в дистанционном переносе электрона в белках / А.И. Котельников // Рос. хим. ж. 2002. - Т. XLVI. -№5.-С. 42-49.

10. Кузнецова, Н.Н. Методы генной инженерии / Н.Н. Кузнецова, В.Г. Винтер // М.: Биоинформсервис, 1997. - 180 с.

11. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин // М.: Высшая школа, 1990.-352 с.

12. Малов, В.В. Пьезорезонансные датчики / В.В. Малов // М: Энергоатомиздат, 1986, - 272 с.

13. Миронов, В.Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии / В.Л. Миронов // Нижний Новгород: РАН Институт физики микроструктур, 2004. - 114 с.

14. Мэзон, У. Физическая акустика: методы и приборы ультразвуковых исследований (Т.1) / под ред. У. Мэзона // М.: Мир, 1960.-430 с.

15. Остерман, Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие) / Л.А. Остерман // М.: Наука, 1981. - 288 с.

16. Поздняков, П.Г. Справочник по кварцевым резонаторам / под ред. Позднякова П.Г. // М.: Связь, 1978. 245 с.

17. Пышкина, О.А. Компактная конформация комплекса ДНК-катионный ПАВ в хлороформе / О.А. Пышкина, В.Г. Сергеев. А.В. Лезов, А.Б. Мельников, Е.И. Рюмцев, А.Б. Зенин, В.А. Кабанов // Доклады Академии Наук. 1996, - Т. 349, - № 6, - С. 772-775.

18. Сатарова, Л.И. Оптимизация иммуноферментной тест-системы для определения антител к ДНК / Л.И. Сатарова, Л.А. Гафиятуллина, Д.Г. Аглиуллина, В.Г. Винтер // Биотехнология, 1994, -Т. 11-12,-С. 38-41.

19. Тернер, Э. Биосенсоры: основы и приложения / под ред. Э. Тернера. // М.: Мир, 1992. - 614 с.

20. Зенгер, В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот / В. Зенгер // Пер. с англ. М.; Мир. 1987. - 584 с.

21. Abad-Valle, P. Genosensor on gold films with enzymatic electrochemical detection of a SARS virus sequence / P. Abad-Valle, M.T.

22. Fernandez-Abedul, A. Costa-Garcia // Biosens. Bioelectron. 2005. - V. 20. -P. 2251-2260.

23. Aberl, F. HIV serology using piezoelectric immunosensors / F. Aberl, H. Wolf, C. Kolinger, S. Drost, P. Woias, S. Koch // Sensor Actuator B-Chem. 1994. - V. 18/19. - P. 271-275.

24. Alaejos, M.S. Application of amperometric biosensors to the determination of vitamins and a-amino acids / M.S. Alaejos, F.J.G. Montelongo // Chem. Rev. 2004. - V. 104. - P. 3239-3265.

25. Almadidy, A. Direct selective detection of genomic DNA from coliform using a fiber optic biosensor / A. Almadidy, J. Watterson, P.A.E. Piunno, S. Raha, I.V. Foulds, P.A. Horgen, A. Castle, U. Krull // Anal. Chim. Acta. 2002. -V. 461. - P. 37-47.

26. Arlinghaus, F. Analysis of biosensor chips for identification of nucleic acids / F. Arlinghaus, M.N. Kwoka // Anal. Chem. 1997. - V. 69. -P. 3747-3753.

27. Aslanoglu, M. Functionalized monolayer for nucleic acid immobilization on gold surfaces and metal complex binding studies / M. Aslanoglu, A. Houlton, B.R. Horrocks // Analyst 1998. - V. 123(4). - P. 753-754.

28. Atashbar, M.Z. QCM biosensor with ultra thin polymer film / M.Z. Atashbar, B. Bejcek, A. Vijh, S. Singamaneni // Sensor Actuator B-Chem. -2005.-V. 107.-P. 945-951.

29. Babkina, S.S. Amperometric DNA biosensor for the determination of auto-antibodies using DNA interaction with Pt(II) complex / S.S. Babkina, N.A. Ulakhovich, Yu.I. Zyavkina // Anal. Chim. Acta. 2004. - V. 502. - P. 23-30.

30. Bain, C.D. Formation of organic thiols from solution onto gold / C.D. Bain, E.B. Troughton, Y.T. Tao, Y. Evall, G.M. Whitesides, R.G. Nuzzo // J. Am. Chem. Soc. 1989. - V. 111. - P. 321-335.

31. Ballou, S.P. Antinative DNA detection by the Crithidia Luciliae method / S.P. Ballou, I. Kushner // Arthritis Rheum. 1979. - V. 22. - P. 321328.

32. Bandyopadhyay, K. Deposition of DNA-functionalized gold nanospheres into nanoporous surfaces / K. Bandyopadhyay, E. Tan, L. Ho, S. Bundick, S.M. Baker, A. Niemz // Langmuir. 2006. - V. 22. - P. 4978-4984.

33. Bardea, A. Amplified electronic transduction of oligonucleotide interactions: novel routes for Tay-Sachs biosensors / A. Bardea, A. Dagan, I. Willner // Anal. Chim. Acta. 1999. - V. 385. - P. 33-43.

34. Ban-antes, A. A DNA and histone immobilization method to study DNA-histone interactions by surface plasmon resonance / A. Ban-antes, P.J. Navano, M.J. Benitez, J.S. Jimenez // Anal. Biochem. 2006. - V. 352. - P. 151-153.

35. Benites, M.J. A method of reversible biomolecular immobilization for the surface plasmon resonance quantitative analysis of interacting biological macromolecules. / M.J. Benites, J.S. Jimenes // Anal. Biochem. -2002.-V. 302.-P. 161-168.

36. Bill, R.M. Anti-DNA autoantibodies: the other DNA-binding proteins / R.M. Bill, N.B. Blatt, G.D. Glick // Bioorg. Med. Chem. 1997. -V.5.-P. 467-472.

37. Binnig, G. Atomic force microscope / G. Binnig, C.F. Quate, C. Gebert // Phys. Rev. Letts. 1986. - V. 56. - P. 930-933.

38. Blatt, N.B. Anti-DNA autoantibodies and systemic lupus erythematosus / N.B. Blatt, G.D. Glick // Pharmacol. Therapeut. 1999. - V. 83.-P. 125-139.

39. Blodgett, K.B. Build-up films of barium stearate and their optical properties / K.B. Blodgett, I. Langmuir // Phys. Rev. 1937. - V. 51. - P. 964-982.

40. Brandt, O. Peptide nucleic acids on microarrays and other biosensors / O. Brandt, J.D. Hoheisel // Trends Biotechnol. 2004. - V. 22. -№ 12.-P. 617-622.

41. Bryant, M.A. Surface Raman scattering of self assembled monolayers formed from 1-alkanethiols at Ag / M.A. Bryant, J.E. Pemberton // J. Am. Chem. Soc. 1991. - V. 113. - P. 3629-3637.

42. Bussiek, N. Polylysine-coated mica can be used to observe systematic changes in supercoiled DNA conformation by scanning force microscopy in solution. // M. Bussiek, N. Mticke, J. Langowski // Nucleic Acids Res. 2003. - V. 31. - No 22. - P. 137 - 145.

43. Casero, E. XPS and AFM characterization of oligonucleotides immobilized on gold substrates / E. Casero, M. Darder, D. J. Diaz, F. Pariente, J. A. Martin-Gago, H. Abruna, E. Lorenzo // Langmuir. 2003. - V. 19. - P. 6230-6235.

44. Cavalieri, L.F. A DNA-acrylamide gel column for analyzing proteins that bind to DNA, I. DNA polymerase / L.F. Cavalieri, E. Carroll // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1970. - V. 67. - P. 807-812.

45. Caruso, F. Quartz crystal microbalance and surface plasmon resonance study of surfactant adsorption onto gold and chromium oxide surfaces / F. Caruso, T. Serizawa, D.N. Furlong, Y. Okahata // Langmuir -1995. V.ll.-P. 1546-1552.

46. Caruso, F. Quartz crystal microbalance study of DNA immobilization and hybridization for nucleic acid sensor development / F. Caruso, E. Rodda, D.N. Furlong, K. Niikura, Y. Okahata // Anal. Chem. -1997.-V. 69.-P. 2043-2049.

47. Caruso, F. In-situ measurement of DNA immobilization and hybridization using a 27 MHz quartz crystal microbalance / F. Caruso, D.N. Furlong, K. Niikura, Y. Okahata // Colloid Surface B. 1998. - V. 10. - P. 199-204.

48. Ceppellini, R. A DNA-reacting factor in serum of a patient with lupus erythematosus diffusus / R. Ceppellini, E. Polli, F. Celada // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1957. - V. 96. - P. 572-574.

49. Collings, A.F. Biosensors: recent advances / A.F. Collings., F. Caruso // Rep. Prog. Phys. 1997. - V. 60. - № 11. - P. 1397-1445.

50. Coo, L. Nafion-based optical sensor for the determination of selenium in water samples / L. Coo, I. S. Martinez // Talanta. 2004. - V.64. -P. 1317-1322.

51. Cheng, L. Interactions of alkanethiols with single crystal iron: the low temperature decomposition of ethanethiol on the Fe surface / L. Cheng, A.B. Bocarsly, S.L. Bernasek, T.A. Ramanarayanan // Langmuir. 1994. - V. 10.-P. 4542-4550.

52. Cheng, G. A sensitive DNA electrochemical biosensor based on magnetite with a glassy carbon electrode modified by multi-walled carbon nanotubes in polypyrrole / G. Cheng, J. Zhao, Y. Tu, P. He, Y. Fang // Anal. Chim. Acta. 2005. - V. 533. - P. 11-16.

53. Chimenti, D. Induction of anti-DNA Antibodies in preautoimmune NZB x NZW F1 mice by immunization with a DNA-DNAse I complex / D. Chimenti, S. Marchini, S. Bombardieri // J. Autoimmun. 2000. - V. 15 - P. 9-13.

54. Choi, Y.S. Development of a new DNA chip microarray by hydrophobic interaction / Y.S. Choi, D.K. Kim, Y.S. Kwon // Colloid Surface A.-2002. V. 201.-P. 261-264.

55. Chrisey, L.A. Fabrication of patterned DNA surfaces / L.A. Chrisey, C.E. O'Ferrall, B.J. Spargo, C.S. Dulcey, J.M. Calvert // Nucleic Acids Res, 1996. - V.24. - №15. - P. 3040-3047.

56. Davis, F. Structured thin films as functional components within biosensors / F. Davis, S.P.J. Higson // Biosens. Bioelectron. 2005. - V. 21. -P.l-20.

57. Dong, Y. The frequency response of QCM in electrochemically characterizing the immobilization on gold electrode / Y. Dong // Sensors. Actuat. B-Chem. 2005. - V. 108. - P. 22-626.

58. Drexler, E.K. Molecular engineering: an approach to the development of general capabilities for molecular manipulation / E.K. Drexler // Proc. Nat. Acad. Sci. 1981. - V. 78. - № 9. - P. 5275-5278.

59. Dufrene, Y.F. Advances in the characterization of supported lipid films with the atomic force microscope / Y.F. Dufrene, G.U. Lee // Biochimica Biophysica Acta. 2000. - V. 1509. - P. 14-41.

60. Dupont-Filliard, A. Biotin/avidin system for the generation of fully renewable DNA sensor based on biotinylated polypyrrole film / A. Dupont-Filliard, M. Billon, T. Livache, S. Guillerez // Anal. Chim. Acta 2004. - V. 515. -P. 271-277.

61. Eila, D. Anti-DNA autoantibodies: a puzzle of autoimmune phenomena / D. Eila, Y. Naparstek // Immunol, today. 1998. - V. 20. - No. 8.-P. 339-342.

62. Endlich, N. Observation and manipulation of different structural variants of individual cation-DNA complexes in the light microscope / N. Endlich, K.O. Greulich // J. Biotechnol. 1995. - V. 41. - P. 149-153.

63. Fabreguette, F.H. Quartz crystal microbalance study of tungsten atomic layer deposition using WF6 and Si2H6 / F.H. Fabreguette, Z.A. Sechrist, J.W. Elam, S.M. George // Thin Solid Films. 2005. - V. 488. - P. 103-110.

64. Fawcett, N.C. A quartz crystal detector for DNA / N.C. Fawcett, J.A. Evans, L.C. Chen, K.A. Drozda, N. Flowers // Anal. Lett. 1998. - V. 21.-P. 1099-1110.

65. Flanagan, M.T. Surface plasmon resonance for immunosensors / M.T. Flanagan, R.H. Pantell // Electron. Lett. 1984. - V. 20. - P. 968-970.

66. Florin, E.L. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs / E.L. Florin, V.T. Moy, H.E. Gaub // Science. 1994. - V. 264. - P. 415-417.

67. Feynman, R.P. There is plenty of room at the bottom: an invitation to enter a new field of physics / R.P. Feynman // Eng. Sci. 1960. - V. 23. -P. 22-38.

68. Frederix, P.L.T.M. Atomic force bio-analytics / P.L.T.M. Frederix, T. Akiyamay, U. Staufery, C. Gerberz, D. Fotiadis, D.J. Muller, A. Engel // Curr. Opin. Chem. Biol. 2003. - V. 7. - P. 641-647.

69. Frey, B.L. Covalent attachment and derivatization of poly-L-lysine monolayers on gold surfaces as characterized by polarization-modulation FT-IR spectroscopy / B.L. Frey, R.M. Corn // Anal. Chem. 1996. - V. 68. - P. 3187-3193.

70. Gambhir, A. Characterization of DNA immobilized on electrochemically prepared conducting polypyrrole-polyvinyl sulfonate films /

71. A. Gambhir, М. Gerard, S.K. Jain, B.D. Malhotra // Appl. Biochem. Biotech. -2001.-V. 96.-P. 303-309.

72. Garsia, R. Dynamic atomic force microscopy methods // R. Garsia, R. Perez // Surf. Sci. Rep. 2002. - V. 47. - P. 197-301.

73. Georgieva, V. Quartz resonator with thin ТЮ2 for NH3 detection / V. Georgieva, P. Stevchev, P. Vitanov, L. Spassov // Vacuum. 2004. - V. 76.-P. 203-206.

74. Gizeli, E. Immunosensors / E. Gizeli, C. R. Lowe // Curr. Opin. Biotech. 1996. - V. 7. - P. 66-71.

75. Grabar, P. Autoantibodies and the physiological role of immunoglobulins / P. Grabar // Immunol. Today. 1983. - V. 4. - P. 337349.

76. Gtipel, W. Interface analysis in biosensor design / W. Gtipel // Biosens. Bioelectron. -1995. V. 10. - P. 853-859.

77. Guilbault, G.G. Analytical uses of piezoelectric crystals / G.G. Guilbault, J. Jordan // CRC Rev. 1988. - V. 19. - P. 1-28.

78. Hahn, B.H. Antibodies to DNA / B.H. Hahn // New Engl. J. Med. 1998. - V. 338. - No. 7. - P. 1359-1368.

79. Hang, T.C. Frequency dependent and surface characterization of DNA immobilization and hybridization / T.C. Hang, A. Guiseppi-Elie // Biosens. Bioelectron. 2004. - V. 19. - P. 1537-1548.

80. Hansma, H.G. DNA condensation for gene therapy as monitored by atomic force microscopy / H.G. Hansma, R. Golan, W. Hsieh, C.P. Lollo, P. Mullen-Ley, D. Kwoh // Nucleic Acids Res. 1998. - V. 26. - No. 10. - P. 2481-2487.

81. Hartmann, J. Supramolecular interactions on mass sensitive sensors in gas phases and liquids / J. Hartmann, J. Auge, R. Lucklum, S. Rosier, P. Hauptmann, B. Adler, E. Dalcanale // Sensors Actuat. B-Chem. -1996.-V. 34.-P. 305-311.

82. Hashimoto, К. Sequence-specific gene detection with a gold electrode modified with DNA probes and an electrochemically active dye / K. Hashimoto, K. Ito, Y. Ishimon // Anal. Chem. 1994. - V. 66. - P. 38303833.

83. Hazani, M. DNA-mediated self-assembly of carbon nanotube-based electronic devices / M. Hazani, F. Hennrich, M. Kappes, R. Naaman, D. Peled, V. Sidorov, D. Shvarts // Chem. Phys. Lett. 2004. - V. 391. - P. 389392.

84. He, L. Colloidal Au-enhanced surface plasmon resonance for ultrasensitive detection of DNA hybridization / L. He, M.D. Musick, S.R. Nicewarner, F.G. Salinas, S.J. Benkovic, M.J. Natan, C.D. Keating // J. Am. Chem. Soc. 2000. - V. 122. - P. 9071-9077.

85. Heme, T.M. Characterization of DNA probes immobilized on gold surfaces / T.M. Heme, M.J. Tarlov // J. Am. Chem. Soc. 1997. - V. 119. -P. 8916-8920.

86. Higashi, N. Immobilization of DNA through intercalation at self-assembled monolayers on gold / N. Higashi, M. Takahashi, M. Niwa // Langmuir.-1999.-V. 15.-P. 111-115.

87. Holborow, J. A serum factor in lupus erythematosus with affinity for tissue nuclei / J. Holborow, D.M. Weir, G.D. Johnson // Bio. Med. J. -1957.-V. 2.-P. 732-734.

88. Hoshino, Y. Effect of ultrasound on DNA polymerase reactions: Monitoring on a 27-MHz quartz crystal microbalance / Y. Hoshino, T. Kawasaki, Y. Okahata // Biomacromolecules. 2006. - V. 7. - P.682-685.

89. Huang, E. Studies of surface coverage and orientation DNA molecules immobilized onto preformed alkanethiol self-assembled monolayers / E. Huang, F. Zhou, L. Deng // Langmuir. -2000. V. 16. - P. 3272-3280.

90. Hur, Y. Development of a SH-SAW sensor for the detection of DNA hybridization / Y. Hur, J. Han, J. Seon, Y. E. Рак, Y. Roh // Sensors Actuat A-Phys. 2005. - V. 120. - P. 462-467.

91. Ivanova, E.P. Poly(L-lysine)-mediated immobilization of oligonucleotides on carboxy-rich polymer surfaces / E.P. Ivanova, D.K. Pham, N. Brack, P. Pigram, D.V. Nicolau // Biosens. Bioelectron. 2004. - V. 19. -P. 1363-1370.

92. Isola, N.R. MALDI-TOF mass spectrometric method for detection of hybridized DNA oligomers / N.R. Isola, S.L. Allman, V.V. Golovlev, C.H. Chen // Anal. Chem. 2001. - V. 73, - P. 2126-2131.

93. Ito, K. Quantitative analysis for solid phase hybridization reaction and binding reaction of DNA using a quartz crystal microbalance / K. Ito, K. Hashimoto, Y. Ishimori // Anal. Chim. Acta. -1996. V. 327. - P. 29-35.

94. Jain, К. K. Nanotechnology in clinical laboratory diagnostics / K.K. Jain // Clin. Chim. Acta. 2005a. - V. 358. - P.37-54.

95. Jain, K.K. The role of nanobiotechnology in drug discovery / K.K. Jain // Drug Discov. Today. 2005b. - V10, 21. - P. 1435-1442.

96. Jalili, N. A review of atomic force microscopy imaging systems: application to molecular metrology and biological sciences / N. Jalili , K. Laxminarayana // Mechatronics. 2004. - V. 14. - P. 907-945.

97. Jang, S.S. Effect of monomeric sequence on nanostructure and water dynamics in Nafion 117 / S.S. Jang, V. Molinero, T. Cagin, W.A. Goddard // Solid State Ionics. 2004. - V. 175. - P. 805-808.

98. Jiang, T. Detection of TP 53 mutation using a portable surface plasmon resonance DNA-based biosensor / T. Jiang, M. Minunni, P. Wilson, J. Zhang, A.P.F. Turner, M. Mascini // Biosens. Bioelectron. 2005. - V. 20. -P. 1939-1945.

99. Jianrong, С. Nanotechnology and biosensors / C. Jianrong, M. Yuqing, H. Nongyue, W. Xiaohua, L. Sijiao // Biotechnology Adv. 2004. -V. 22.-P. 505-518.

100. Johnson, P.A. Polymer-anchored DNA gene monolayers / P.A. Johnson, M.A. Gaspar, R. Levicky // J. Am. Chem. Soc. 2004. - V. 9 -126. -No. 32.-P. 9911-9920.

101. Kanazawa, K.K. The oscillation frequency of a quartz resonator in contact with a liquid / K.K. Kanazawa, J.G. Gordon // Anal. Chim. Acta. -1985, V.175, P.99-105.

102. Kankare, J. Method for measuring the losses and loading of a quartz crystal microbalance / J. Kankare, K. Loikas, M. Salomaki // Anal. Chem.-2006.-V. 78.-P. 1875-1882.

103. Katayose, S. Water-soluble polyion complex associates of DNA and poly(ethylen glycol)-poly(L-lysine) block polymer / S. Katayose, K. Kataoka // Bioconjugate Chem. 1997. - V. 8. - P. 702-707.

104. Kawasaki, E.S. Nanotechnology, nanomedicine, and the development of new, effective therapies for cancer / E.S. Kawasaki, A. Player // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2005. - V. 1. - P. 101- 109.

105. Kern, W. Cleaning solutions based on hydrogen peroxide of use in silicone semiconductor technology / W. Kern, D.A. Puotinen // RCA Rev. -1970.-V. 31(2).-P. 187-198.

106. Kim, J.H. Solid-phase genetic engineering with DNA immobilized on a gold surface / J. H. Kim, J.A. Hong, M. Yoon, M.Y. Yoon, H.S. Jeong, H. J. Hwang // J. Biotechnol. 2002. - V. 96. - P. 213-221.

107. Kim, Y.M. Specific modulation of the anti-DNA autoantibody-nucleic acids interaction by the high affinity RNA aptamer / Y.M. Kim, K.H. Choi, Y.J. Jang, J. Yu, S. Jeong // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. -V.300-P. 516-523.

108. Kim, T.W. Polycations enhance emulsion-mediated in vitro and in vivo transfection / T.W. Kim, H. Chung, I.C. Kwon, H.C. Sung, B.C. Shin, S.Y. Jeong // Int. J. Pharmaceut. 2005. - V. 295. - P. 35-45.

109. Kidoaki, S. Mechanistic aspects of protein/material interactions probed by atomic force microscopy / S. Kidoaki, T. Matsuda // Colloid. Surface. B. 2002. - V. 23. - P. 153-163.

110. Kunze, M. Quartz crystal microbalance studies of the contact between soft, viscoelastic solids / M. Kunze, K.R. Shull, D. Johannsmann // Langmuir. 2006. - V. 22. - P. 169-173.

111. Ко, J.K. Piezoelectric olfactory biosensor: ligand specificity and dose-dependence of an olfactory receptor expressed in a heterologous cell system / H.J. Ко, Т.Н. Park // Biosens. Bioelectron. 2005. - V. 20 - P. 1327-1332.

112. Kruchinin, A.A. Surface plasmon resonance monitoring by means of polarization state measurement in reflected light as the basis of a DNA probe biosensor / A.A. Kruchinin, Y.G. Vlasov // Sensors Actuat B-Chem. -1996.-V. 30.-P. 77-80.

113. Lao, R. Electrochemical interrogation of DNA monolayers on gold surfaces / R. Lao, S. Song, H. Wu, L. Wang, Z. Zhang, L. He, C. Fan // Anal. Chem. 2005. - V. 77. - P. 6475-6480.

114. Lassalle, N. Electropolymerisable pyrrole-oligonucleotide: synthesis and analysis of ODN hybridisation by fluorescence and QCM / N. Lassalle, A. Roget, T. Livache, P. Mailley, E. Vieil // Talanta. -2001. V. 55. -P. 993-1004.

115. Legay, G. DNA nanofilm thickness measurement on microarray in air and in liquid using an atomic force microscope / G. Legay, E. Finot, R. Meunier-Prest, M. Cherkaoui-Malki, N. Latruffe, A. Dereux // Biosens. Bioelectron. 2005. - V. 21. - P. 627-636.

116. Li, L. Catalytic activity of anti-thyroglobulin antibodies / L. Li, S. Paul, S. Tyutyulkova, M.D. Kazatchkine, S. Kaveri, // J. Immunol. 1995. -V. 154.-P. 3328-3334.

117. Li, J. A DNA-detection platform with integrated photodiodes on a silicon chip / J. Li, C. Xu, Z. Zhang, Y. Wang, H. Peng, Z. Lu, M. Chan // Sensors Actuat. B-Chem. 2005. - V. 106. - P. 378-382.

118. Lin, L. Study on colloidal Au-enhanced DNA sensing by quartz crystal microbalance / L. Lin, H.Q. Zhao, J.R. Li, J.A. Tang, M.X. Duan, L. Jiang // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. - V. 274. - P. 817-820.

119. Litman, R.M. A deoxyribonucleic acid polymerase from micrococcus luteus (micrococcus lysodeikticus) isolated on deoxyribonucleic acid-cellulose / R.M. Litman // J. Biol. Chem. 1968. - V. 243. - P. 62226233.

120. Liu, T. The enhancement effect of gold nanoparticles as a surface modifier on DNA sensor sensitivity / T. Liu, J. Tang, L. Jiang // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. - V. 313. - P. 3-7.

121. Lobert, P.E. Immobilization of DNA on CMOS compatible materials / P.E. Lobert, D. Bourgeois, R. Pampin, A. Akheyar, L.M. Hagelsieb, D. Flandre, J. Remacle // Sensors Actuat. B-Chem. 2003. - V. 92.-P. 90-97.

122. Lojou, E. Quartz crystal microbalance and voltammetry monitoring for layer-by-layer assembly of cytochrome c3 and poly(ester sulfonic acid) films on gold and silver electrodes / E. Lojou, P. Bianco // J. Electroanal. Chem. 2003. - V. 557. - P. 37-47.

123. Lu, F. Quartz crystal microbalance with rigid mass partially attached on electrode surfaces / F. Lu, H.P. Lee, S.P. Lim // Sensor Actuat. A-Phys. -2004. V. 112.-P. 203-210.

124. Luppa, P.B. Immunosensors principles and applications to clinical chemistry / P.B. Luppa, L.J. Sokoll, D.W. Chan // Clin. Chim. Acta. -2001. -V. 314.-P. 1-26.

125. Lvov, Yu. Assembly of thin films by means of successive deposition of alternate layers of DNA and poly(allyl amine) / Yu. Lvov, G. Decher, G. Sukhorukov // Macromolecules. 1993. - V. 26. - P. 5396-5399.

126. Mannelli, I. Quartz crystal microbalance (QCM) affinity biosensor for genetically modified organisms (GMOs) detection / I. Mannelli, M. Minnuni, S. Tombelli, M.M. Spiriti, M. Mancini // Biosens. Bioelectron. -2003. -V. 18. P. 129-140.

127. Mannelli, I. Direct immobilization of DNA probes for the development of affinity biosensors /1. Mannelli, M. Minnuni, S. Tombelli, R. Wang, M.M. Spiriti, M. Mancini // Bioelectrochemistry. 2005. - V. 66. - P. 129-138.

128. Marie, R. Adsorption kinetics and mechanical properties of thiol-modified DNA-oligos on gold investigated by microcantilever sensors / R. Marie, H. Jensenius, J. Thaysen, C.B. Christensen, A. Boisen // Ultramicroscopy. 2002. - V. 91. - P. 29-36.

129. Martin, S. Characterization of a quartz crystal microbalance with simultaneous mass and liquid loading / S. Martin // Anal. Chem. 1991. - V. 63.-P. 2272-2281.

130. Marquette, C.A. Impedance based DNA chip for direct Tm measurement / C.A. Marquette, I. Lawrence, C. Polychronakos, M.F. Lawrence // Talanta. 2002. - V.56. - P. 763-768.

131. Marx, K.A. Quartz crystal microbalance: a useful tool for studying thin polymer films and complex biomolecular systems at the solutionsurface interface / K.A. Marx // Biomacromolecules. 2003. - V.4. - No 5. - P. 10991120.

132. Marxer, C.G. Study of adsorption and viscoelastic properties of proteins with a quartz crystal microbalance by measuring the oscillation amplitude / C.G. Marxer, M.C. Coen, L. Schlapbach // J. Colloid. Interf. Sci. -2003.-V. 261.-P. 291-298.

133. Matthews, B.W. Protein-DNA interaction. No code for recognition / B.W. Matthews // Nature. -1988. V. 335. - P. 294-295.

134. Meinkoth, J. Hybridization of nucleic acids immobilized on solid supports / J. Meinkoth, G. Wahl // Anal. Chem. 1984. - V. 138. - P. 267284.

135. Mirsky, V.M. New electroanalytical applications of selfassembled monolayers / V.M. Mirsky // Trends Anal. Chem. 2002. - V. 21. - P. 439450.

136. Mizutani, T. Adsorption chromatography of nucleic acids on silicone-coated porous glass / T. Mizutani // J. Biochem. 1983. - V. 94. - P. 163-169.

137. Mo, X. Microbalance-DNA probe method for the detection of specific bacteria in water / X. Mo, Y. Zhou, H. Lei, L. Deng // Enzyme. Microb. Tech.-2002. -V. 30. -P. 583-589. ~ '''

138. Mouratou, B. A method for the detection and screening of catalytic anti-DNA antibodies / B. Mouratou, S. Rouyre, J. Guesdon // J. Immunol. Methods. 2002. - V. 269. - P. 147- 155.

139. Muller, M. Orientation of a-helical poly(L-lysine) in consecutively adsorbed polyelectrolyte multilayers on texturized silicon substrates / M. Muller // Biomacromolecules, 2001, - V. 2, - P. 262-269.

140. Muller, D. J. Biomolecular imaging using atomic force microscopy / D.J. Muller, K. Anderson // Trends Biotechnol. 2002. - V. 20. - №. 8. - P. 46-49.

141. Munro, J.C. Adsorption of disulfide-modified polyacrylamides to gold and silver surfaces as cushions for polymer-supported lipid bilayers / J.C. Munro, C.W. Frank // Polymer. 2003. - V. 44. - P. 6335-6344.

142. Muramatsu, H. Computation of equivalent circuit parameters of quartz crystals in contact with liquids and study of liquid properties / H. Muramatsu, E. Tamiya, I. Karube // Anal. Chem. 1988. - V. 60, - P. 21422146.

143. Nakamura, R. A plasma-polymerized film surface plasmon resonance immunosensing / R. Nakamura // Anal. Chem. 1997. - V. 69. - P. 4649-4652.

144. Nakamura, F. Preparation of a branched DNA self-assembled monolayer toward sensitive DNA biosensors / F. Nakamura, E. Ito, Y. Sakao, N. Ueno // Nano Lett. 2003. - V. 3, - No. 8. - P. 1083-1086.

145. Niemeyer, C.M. Nanoparticles, proteins, and nucleic acids: biotechnology meets materials science / С. M. Niemeyer // Angew. Chem. Int. Ed. 2001. - V. 40. - P. 4128-4158.

146. Niikura, K. Direct monitoring of DNA polymerase reactions on a quartz-crystal microbalance / K. Niikura, H. Matsuno, Y. Okahata // J. Am. Chem. Soc. 1998. - V. 120. - P. 8537-8538.

147. Niwa, M. Interaction between poly lysine monolayer and DNA at air-water interface / M. Niwa, M. Morikawa, K. Yagi, N. Higashi // Int. J. Biol. Macromol. 2002. - V. 30. - P. 47-54.

148. Noyes, B.E. Nucleic acid hybridization using DNA covalently coupled to cellulose / B.E. Noyes, G.R. Stark // Cell. -1975. V. 5. -P. 301310.

149. Nkanwo, E. Impedance analysis of thikness-shear mode quartz crystal resonators in contact with linear viscoelastic media / E. Nkanwo, C.J. Durning // Rev Sci. Instrum. 1998. - V.69(6). - P.2375-2384.

150. Oh, S.J. Characteristics of DNA microarrays fabricated on various aminosilane layers / S.J. Oh, S.J. Cho, C.O. Kim, J.W. Park // Langmuir. -2002.-V. 18.-P. 1764-1769.

151. O'Sullivan, C.K. Commercial quartz crystal microbalances -theory and applications / C.K. O'Sullivan, G.G. Guilbault // Biosens. Bioelectron. 1999. - V. 14. - P. 663-670.

152. Park, K. The behavior of quartz crystal microbalance in high pressure C02 / K. Park, M. Koh, C. Yoon, H. Kim, H. Kim // J. Supercrit Fluid. 2004. - V. 29. - P. 203-212.

153. Park, S. H. Finite-size, fully addressable DNA tile lattices formed by hierarchical assembly procedures / S. H. Park, C. Pistol, S. J. Ahn, J. H. Reif, A. R. Lebeck, C. Dwyer, Т. H. LaBean // Angew. Chem. Int. Ed. 2005. -V. 44,-P. 1-5.

154. Paul, S. Catalytic hydrolysis of vasoactive intestinal peptide by human autoantibody. / S. Paul, D.J. Voile, C.M. Beach, D.R. Johnson, M.J. Powell, R.J. Massey // Science. 1989. - V. 244. - P. 1158-1163.

155. Patolsky, F. Au-nanoparticle nanowires based on DNA and polylysine templates / F. Patolsky, Y. Weizmann, O. Lioubashevski, I. Willner // Angew. Chem. Int. Ed. 2002. - V. 41. - № 13. - P. 2323-2327.

156. Penn, S. G. Nanoparticles for bioanalysis / S.G. Penn, L. He, M.J Natan // Curr. Opin. Chem. Biol. 2003. - V. 7. - P. 609-615.

157. Peschel, S. Immobilization of gold nanoparticles on solid supports utilizing DNA hybridization / S. Peschel, B. Ceyhan, C.M. Niemeyer, S. Gao, L. Chi, U. Simon // Mat. Sci. Eng. 2002. - V. 19. - P. 47-50.

158. Pisetsky, D.S. The immune response to cell death in SLE / D. S. Pisetsky // Autoimmunity Rev. 2004. - V. 3. - P. 500- 504.

159. Piunno, P.A. Fiber-optic DNA sensor for fluorometric nucleic acid determination / P.A. Piunno U.J. Krull, R.H. Hudzon, M. Damha, H. Cohen // Anal. Chem. 1995. - V. 67. - P. 6235-2643.

160. Pividori, M.I. Electrochemical genosensor design: immobilisation of oligonucleotides onto transducers surfaces and detection methods / M.I. Pividori, A. Merkoci, S. Alegret, // Biosens. Bioelecton. 2000. - V. 15. - P. 291-303.

161. Pletcher, D. Instrumental methods in electrochemistry / D. Pletcher // Horwood Publishing, 2001 Chichester. P. 230.

162. Renee, L. Piezoelectric quartz crystal biosensors / L. Renee, L. Bunde, E. J. Jarvi, J. J. Rosentreter // Talanta. 1998. - V.46. - P. 1223-1236.

163. Robbins, W.C. Complement fixation with cell nuclei and DNA in lupus erythematosus / W.C. Robbins, H.R. Holman, H. Deicher, H.G. Kunkel // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1957. - V. 96. - P. 575-579.

164. Roco, M.C. Nanotechnology: convergence with modern biology and medicine / M. С Roco // Curr. Opin. Biotech. 2003. - V. 14. - P. 337346.

165. Rodriguez-Maldonado, L. Dynamic light scattering from high molecular weight poly-L-lysine molecules / L. Rodriguez-Maldonado, A. Fernandez-Nieves, A. Fernandez-Barbero // Colloid. Surface. A. 2005. - V. 270-271.-P.335-339.

166. Rosenheck, R. The far ultraviolet absorption spectra of polypeptide and protein solutions and their dependence on conformation / R. Rosenheck, P. Doty // Biochemistry 1961. - V. 47. - P. 1775-1758.

167. Rostagno, A. Biochemical analysis of the interaction of fibronectin with IgG and localization of the respective binding sites / A. Rostagno, M. Williams, B. Frangione, L.I. Gold // Molecular. Immunol. 1996. - V. 33. -No. 6.-P. 561-572.

168. San Paulo, A. Unifying theory of tapping-mode atomic-force microscopy / A. San Paulo, R. Garcia // Phys. Rev. 2002. - V. 66. -P.041406-1 -041406-4.

169. Sany, J. Pathogenic role of antinuclear antibodies in lupus disease / J. Sany // Ann. Med. Intern. 1990. - V. 141. - P. 222-226.

170. Sastry, M. Studies on the formation of DNA-cationic lipid composite films and DNA hybridization in the composites / M. Sastry, V. Ramakrishnan, M. Pattarkine, K.N. Ganesh // J. Phys. Chem. B. 2001. -V.105.-P. 4409-4414.

171. Sastry, M. Electrostatic assembly of nanoparticles and biomacromolecules / M. Sastry, M. Rao, K.N. Ganesh / Accounts Chem. Res. 2002. - V. 35. - No. 10. - P. 456-460.

172. Satjapipat, M. Selective desorption of alkanethiols in mixed self-assembled monolayers for subsequent oligonucleotide attachment and DNA hybridization / M. Satjapipat, R. Sanedrin, F. Zhou // Langmuir 2001. - V. 17.-P. 7637-7644.

173. Sauerbrey, G. Verwendung von Schwingquarzen fur Wagung Diinner Schichten und fur Mikrowagung / Z. Sauerbrey // Z. Physik. 1959. -V. 155.-P. 206-222.

174. Schuck, P. Use of surface plasmon resonance to probe the equilibrium and dynamic aspects of interactions between biological macromolecules / P. Schuck // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1997. -V. 26.-V. 541-566.

175. Seeman, N.C. DNA nicks and nodes and nanotechnology / N.C. Seeman // Nano. Lett. 2001. - V. 1. - № 1. - P. 22-26

176. Si, S.H. Electrochemical quartz crystal microbalance study on electropolymerization of m-phenylenediamine: effects of aniline and polyaniline / S.H. Si, Y.J. Xu, L.H. Nie and S.Z. Yao // Electrochimika Acta. 1995. - V. 40. - № 11. - P. 2715-2721.

177. Silva, GA. Introduction to nanotechnology and its applications to medicine / G.A. Silva // Surg. Neurol. 2004. - V. 61. - P. 216 -220.

178. Simon, A. Strategies and results of atomic force microscopy in the study of cellular adhesion / A. Simon, M. Durrieu // Micron. 2006. - V. 37. -P.l-13.

179. Smeenk, R.J.T. Anti-dsDNA: choice of assay in relation to clinical value / R.J.T. Smeenk, H.G. van den Brink, K. Brinkman, R.M. Termaat, J.H.M. Berden, A.J.G. Swaak // Rheumatol. Int. 1991. - V. 11. - P. 101-107.

180. Shen, G. Detection of antisperm antibody in human serum using a piezoelectric immunosensor based on mixed self-assembled monolayers / G. Shen, H. Wang, S. Tan, J. Li, G. Shen, R. Yu // Anal. Chim. Acta. 2005. -V. 540.-P. 279-284.

181. Shons, A. An immunospecific microbalance / A. Shons, F. Dorman, J.J. Najarian // Biomed. Mater.Res.- 1972.- V. 6, P. 565 - 570

182. Stengel, G. Viscoelastic modeling of template-directed DNA synthesis / G. Stengel, F. Hook, W. Knoll // Anal. Chem. 2005. - V. 77. - P. 3709-3714.

183. Stokes, R.P. A simple, rapid ELISA method for the detection of DNA antibodies / R.P. Stokes, A. Cordwell, R.A. Thompson // J. Clin. Pathol. 1982.-V. 35.-P. 566-573.

184. Su, X. Comparison of surface plasmon resonance spectroscopy and quartz crystal microbalance techniques for studying DNA assembly and hybridization / X. Su, Y. Wu, W. Knoll // Biosens. Bioelectron. 2005. - V. 21,-P. 719-726.

185. Sukhorukov, G.B. Preparation and investigation of Langmuir films of complexes of nucleic acids and octadecylamine / G.B. Sukhorukov, V.V. Yerokhin, A. Tronin // Biophysics. 1993. - V. 38. - P. 257-262.

186. Shuster, A.M. DNA hydrolyzing autoantibodies / A.M. Shuster, G.V. Gololobov, O.A. Kvashuk, A.E Bogomolova, I.V. Smirnov, A.G. Gabibov // Science. 1992. - V. 256. - P. 665 - 673.

187. Szabo, K. Monofunctional (dimethylamino)silane as silylating agent / K. Szabo, N.L. Ha, P. Schneider, P. Zeltner, E. Kovats // Helv. Chim. Acta.-1984. -V. 67.-P. 2128-2142.

188. Tasneem, S. Binding of SLE autoantibodies to native poly(I), ROS-poly(I) and native DNA: a comparative study / S. Tasneem, R. Ali // J. Autoimmun. 2001. - V. 17.-P. 199-205.

189. Tedeshi, L. An integrated approach for the design and synthesis of oligonucleotide probes and their interfacing to a QCM-based RNA biosensor / L Tedeshi, L. Citti, C. Domenici // Biosens. Bioelectron. 2005. - V. 20. - P. 2376-2385.

190. Tredgold, R.H. Order in thin molecular films / R.H. Tredgold // Cambridge University Press, Cambridge, 1994. 370p.

191. Tsai, С. An ultra sensitive DNA detection by using gold nanoparticle multilayer in nano-gap electrodes / C. Tsai, T. Chang, C. Chen, F. Ко, P. Chen // Microelectron. Eng. 2005. - V. 78-79. - P. 546-555. .

192. Vercoutere, W. Biosensors for DNA sequence detection / W. Vercoutere, M. Akeson // Curr. Opin. Chem. Biol. 2002. - V. 6. - P. 816822.

193. Voinova, M.V. 'Missing mass' effect in biosensor's QCM applications / M.V. Voinova, M. Jonson, B. Kasemo // Biosens. Bioelectron. -2002.-V. 17.-P. 835-841.

194. Wang, J. DNA biosensors based on peptide nucleic acids (PNA) recognition layers. A review / J. Wang // Biosens. Bioelectron. 1998. - V. 13.-P. 757-762.

195. Wang, J. Real-time monitoring of enzymatic cleavage of nucleic acids using a quartz crystal microbalance / J. Wang, M. Jiang, E. Palecek // Bioelectrochemistry and Bioenergetics 1999. - V. 48. - P. 477-480.

196. Wang, J. From DNA biosensors to gene chips / J. Wang // Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. - P. 3011-3016.

197. Wang, J. Electrochemical nucleic acid biosensors / J. Wang // Anal. Chim. Acta 2002. - V. 469. - P. 63-71.

198. Wang, J. Electrochemical detection of DNA hybridization based on carbon-nanotubes loaded with CdS tags / J. Wang, G. Liu, M. R. Jan, Q. Zhu // Electrochem. Commun. 2003a. - V. 5. - P. 1000-1004.

199. Wang, R. Immobilisation of DNA probes for the development of SPR-based sensing / R. Wang, S. Tombelli, M. Minunni, M.M. Spiriti, M. Mascini // Biosens. Bioelectron. 2004a. - V. 20. - P. 967-974.

200. Wang, S.G. DNA biosensors based on self-assembled carbon nanotubes / S.G. Wang, R. Wang, P.J. Sellin, Q. Zhang // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004b. - V. 325. - P. 1433-1437.

201. Wang, H. Immunophenotyping of acute leukemias using a quartz crystal microbalance and monoclonal antibody-coated magnetic microspheres / H. Wang, H. Zeng, G. Shen, R. Yu // Anal. Chem. 2006. - V. 78. - P. 2571-2578.

202. Watterson, J.H. Towards the optimization of an optical DNA sensor: control of selectivity coefficients and relative surface affinities / J.H. Watterson, P.A.E. Piunno, U.J. Krull // Anal. Chim. Acta. 2002. -V. 457. -P. 29-38

203. Wei, Y. Microarray preparation based on oxidation of agarose-gel and subsequent enzyme immunoassay / Y. Wei, G. Ning, Z. Hai-Qian, W. Jian-Guo, W. Yi-Hong, K. Wesche // Sensors. Actuat. B-Chem. 2004. - V. 98.-P. 83-91.

204. Winfree, E. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals / E. Winfree, F. Liu, L. A. Wenzler, N. C. Seeman // Nature 1998. -V. 394. - P.539-544.

205. Whitesides, G.M. Self-Assembly at all scales / G.M. Whitesides, B. Grzybowski // Science 2002. - V. 295. - P. 2318-2421.

206. Withers, J.R. Nanomechanical measurements with AFM in the elastic limit / J.R. Withers, D.E. Aston // Adv. Colloid. Interfac. 2006. - V. 120.-P. 57-67.

207. Wong, E.L.S. Charge transfer through DNA: a selective electrochemical DNA biosensor / E.L.S. Wong, J.J. Gooding // Anal. Chem. -2006.- V. 78.-P. 2138-2144.

208. Wu, Z. A PEG piezoelectric immunoassay for the determination of transferrin in human serum / Z. Wu, G. Shen, L. Xie, R. Yu // Sensors Actuat. B-Chem. 2000. - V. 71. - P. 99-107

209. Xia, Y. One-dimensional nanostructures: synthesis, characterization, and applications / Y. Xia, P. Yang, Y. Sun, Y. Wu, B. Mayers, B. Gates, Y. Yin, F. Kim, H. Yan // Adv. Mater. 2003. - V. 15. - № 5.-P. 353-389.

210. Xiao, C. DNA-containing organized molecular structure based on controlled assembly on supported monolayers / C. Xiao, M. Yang, S. Sui. // Thin solid films. 1998. - V. 327-329. - P. 647-651.

211. Xu, В. A mica-modified quartz resonator for a quartz crystal microbalance study / B. Xu, H. Wang, Y. Wang, G. Zhu, Z. Li, E. Wang // Anal. Sci.-2000.- V. 16.-P. 1061-1063.

212. Yang, M. Genosensor technology and the detection of interfacial nucleic acid chemistry / M. Yang, M.E. McGovern, M. Thompson // Anal. Chem. 1997. - V. 346. - P. 259-275.

213. Yang, M. Adsorption kinetics and ligand-binding properties of thiol-modified double stranded DNA on a gold surface / M. Yang, H.C.M. Yau, H.L. Chan // Langmuir. 1998. - V. 14. - P. 6121-6129.

214. Yang, L.C. Virus electrodes for universal biodetection / L.C. Yang, P.Y. Tam, B.J. Murray, T.M. Mclntire, C.M. Overstreet, G.A. Weiss, R.M. Penner // Anal. Chem. 2006. - V. 78. - P. 3265-3270.

215. Yip, C.M. Atomic force microscopy of macromolecular interactions / C.M. Yip // Curr. Opin. Struct. Biol. 2001. - V. 11. - P. 567572.

216. Yoshimoto, M. Properties of the overtone mode of the quartz crystal microbalance in a low-viscosity liquid / M. Yoshimoto, S. Tokimura, K. Shigenobu, S. Kurosawa, M. Naito // Anal. Chim. Acta. 2004. - V. 510. -P. 15-19.

217. Yu, F. Oligonucleotide hybridization studied by a surface plasmon diffraction sensor (SPDS) / F. Yu, D. Yao, W. Knoll // Nucleic Acids Res. -2004. V. 32. - No.9. - P. 755-761.

218. Zhang, C. Development of a new kind of dual modulated QCM biosensor / C. Zhang, G. Feng, Z. Gaot // Biosens. Bioelectron. 1997. - V. 12.-№12.-P. 1219-1225.

219. Zhang, H. Bovine serum albumin as a means to immobilize DNA on a silver-plated bulk acoustic wave DNA biosensor / H. Zhang, R. Wang, H. Tan, L. Nie, S. Yao // Talanta 1998a. - V. 46. - P. 171-178.

220. Zhang, H. Immobilization of DNA on silver surface of bulk acoustic wave sensor and its application to the study of UV-C damage / H. Zhang, R. Wang, W. Wei, S. Yao // Anal. Chim. Acta. 1998b. - V. 374 (1). -P. 31-38.

221. Zhang, R.Y. Investigation of ordered ds-DNA monolayers on gold electrodes / R.Y. Zhang, D.W. Pang, Z.L. Zhang, J.W. Yan, J.L. Yao, Z.Q. Tian, B.W. Mao, S.G. Sun // J. Phys. Chem. B. 2002. - V. 10. - P. 1123311239.

222. Zhang, Z. Plasma polymer film structure and DNA probe immobilization / Z. Zhang, Q. Chen, W. Knoll, R. Foerch, R. Holcomb, D. Roitman // Macromolecules 2003. - V. 36. - P. 7689-7694.

223. Zhang, G. Attachment of DNA to microfabricated arrays with self-assembled monolayer / G. Zhang, T. Tanii, T. Miyake, T. Funatsu, I. Ohdomari // Thin Solid Films 2004. - V. 464-465. - P. 452- 455.

224. Zhang, Y. Quartz crystal microbalance coated with carbon nanotube films used as humidity sensor / Y. Zhang, K. Yu, R. Xu, D. Jiang, L. Luo, Z. Zhu // Sensors Actuat. A-Phys. 2005. - V. 120. - P. 142-146.

225. Zhao, Y. DNA-modified electrodes; part 4: optimization of covalent immobilization of DNA on self-assembled monolayers / Y. Zhao, D. Pang, S. Hu, Z. Wang, J. Cheng, H. Dai. // Talanta 1999. - V.49 (4). - P. 751-756.

226. Zhao, H.Q. DNA biosensor with high sensitivity amplified by gold nanoparticles / H.Q. Zhao, L. Lin, J.R. Li, J.A. Tang, M.X. Duan, L. Jiang // Nanoparticle Res. 2001. - V. 3. - P. 321-323.

227. Zhou, Y.M. An amperometric immunosensor based on Nafion-modified electrode for the determination of Schistosoma japonicum antibody / Y.M. Zhou, Z.Y. Wu, G.L. Shen, R.Q. Yu // Sensors Actuat. B-Chem. -2003. V. 89. - P. 292-298.

228. Zhu, N. Electrochemical DNA biosensors based on platinum nanoparticles combined carbon nanotubes / N. Zhu, Z. Chang, P. He, Y. Fang // Anal. Chim. Acta 2005a. - V. 545. - P. 21-26.

229. Zhu, L. A quartz crystal microbalance (QCM) study of single-strand DNA hybridization and hydrolytic cleavage / L. Zhu, Y. Gao, H. Shen, Y. Yang, L. Yuan // J. Anal. Chem. 2005b. - V. 60. - № 8. - P. 780-783.

Информация о работе

Фахруллин, Равиль Фаридович
кандидата биологических наук
Казань, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

Получение, свойства и применение ДНК-содержащей нанопленки для пьезокварцевых биосенсоров - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы