Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение штаммов Escherichia coli с повышенной продукцией нуклеозидфосфорилаз и их использование при синтезе нуклеозидов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Получение штаммов Escherichia coli с повышенной продукцией нуклеозидфосфорилаз и их использование при синтезе нуклеозидов"

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ (ШРОБИОЯОГИИ

На правах рукописи ДУДЧИК НАТАЛЬЯ ВЛАДИМИРОВНА

' УДК 615.281:577.113.012.6

ПОЛУЧШЕ ШТАММОВ eskerichia coli С ПОЕНШПЮЯ ' ПРОДУКЦИЕЙ НУКЛЕОЗВДФООЮШАЗ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИГЛ СИНТЕЗЕ НУЙЛЕОЗЭДОЗ

(03.СЮ.07 - ютсроОкологяя)

' & в 7 о р о Ф е р а т дкссортощкг на соискание ученой стспегй кандидата бполопгсескнз иэул

-1-Й/) Шясх - 1992

Работа выполнена в лаборатории микробиологической трансформации нуклеиновых кислот Института микробиологии АН Беларуси

Научные руководитель:

кандидат биологических наук, старший научны* сотрудник А.И.Зинченко.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор С.П.Коваленко;

кандидат биологических наук О.П.Чернов.

Ведущая организация:

Институт Сиооргашческой химии АН Беларуси.

. Зшита диссертации состоится "----Х992 г.

в чао на заседании Специализированного совета.К 006.09.01

по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте микробиологии АН Беларуси по адресу: 220141, г. Минск, Академгородок, ул. Жодинская, 2.

О диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН Беларуси.

Автореферат разослав

1992 "г.

Ученый секретарь Специализирпованного советь

кандидат биологических наук " Н.В.Образцова

ОЕЗАЯ кАРАКТЕРКС'Тша РАБОТЫ

^ТУ§®Ш51Ь_П2о5лемы. Одним из основных классов биохимических реагентов, которые необходимы для проведения исследований в области 4язико-хииичэской биологии и биотехнология, яв.'.ягугоя природные компоненты нуклеиновых гислот и ш ксда^мцироьашше аналоги. Кроме того, мюгае природные и модифкцировашшэ сочдине-1шя нуклеиновой природа, в т.ч. нуклеозиды, прсяв-пяют рвзнооораз-ную фенологическую активное* j (Прес^ракенская, Мельник, 1984: D« ciare1, 1980; Зе.чсков и др., 1989) и представляют. ь результате этого, значительный интерес для химиотерапии различил заболеваний человека и животных.

Химические методы синтеза куклэозидов часто трудоемки и харг.чтериэултея недостаточной специфичность/а, что снизсаот выход келаемш. продуктов. В связи с этим, щхдетьвляетел актуальной разработка научных основ ферментативного получения природных и модифщирсвашмх нуклэозидов, в т.ч. на основа использования для биокатализа . сравнительно легкодоступных нефракционирозанных микробных клеток.

Шль_и_задачи^с:2|е5дващ1п. Цель настоящей работы состояла в экспериментальном похучениии штампов Escherichia coli с повышенной нуклеозидфосфорклазной активностью клеток и использование таких клеток v синтезе природных и модифицированных нуклеозидсв. Для достижения этой цели били поставлены следующие задачи:

, '■- селекция мутантов с повшг..;нным синтезом тимъ/игфосфсрилазы, пуртшуклеозидфоофорилазы и уридинфосфорилазы;

- амплификация генов нуклеозидфосфорилаз путем клондсований doc оперона в составе рекомбишитной многокопийной шшмиды и изучение выражения пла?мидных гешз нукпеозидфосфорплаз з клетках

Е, ooilj

- разработка мэтодов С1штеза рада природам: и мс.t ¡фицировагашх нуклеозидов, исполььуя целые клетки экспериментально полученнчх высоксактигашх ктаммов е. сои.

В9153ая_новизна. Локазана принципиальная возможность получения ...утантов в. сои с дерэпрессированшм синтезов формантов аьо-: оперона на основе использования в качестве селектирующих агентов ( в состврл селэк '-'.вшх сред тд:йВД1Г*>ваЕных нуклеозвдов т>одтна , (ткпинарабинознда а з'-фгор-г'.г'-дидэзокситимйдииа),

Вперзыо в клетках в. ooii изучено мракение кловдфовадлоге в

составе многокопмйной гибридной плазшлу гена т •шдинфосфорклазн, находякегосд под контролем .пить одного из двух промоторов, в частности derfa. Показано, что экспрессия гена тИ'.;шшфосфорипа-аы спосоона подвергаться катаболитной репрессии не только ттри хромосомной, но также к при плазмидаой .-.окализации этого гена.

практическая ценности дабоун. Зксперимевталыю получены штаммы в. ooii с дерепрессироззнныч световом ташдинфосфорилазы, щртиуклеозидфйефорклаэы и уридимфосфорилазы. Продемонстрирована возмохнорть использования целых клеток гик штаммов в качестве биокататазаторов при получении ряда природных и модифицированных нуклеозидов. Штамм в. coli ШТ-ЗД/1 а защищен авторским свидетельством СССР * Î66I20D как гатБмм бактерий для получения противовирусного ¡-^тлвозида широкого спектра действия - рииавирина (1 -А-п-рибофуракоаил-1.г>4- триазол-э-карбоксакшда).

Апрсбация работы. Материалы диссертационной, работы "представлялись па Конференциях молодых ученых: < "Микроорганизмы - продуценты биологически акткьннх' веществ" (рига, 1984), "Совремьшше проблемы бйог&Анологт шкроорганх:мов": (Рига, 1987) и "Синтез . я■ исследование б>^ло.гическ* актявшх: соединений" (Рига,-1989).

Ш5^а1ыя^зультатов_исслийовБга1й. По материалам диссертации опубликовано 5 статей, тезисы 3 докладов и получено авторское свидетельство не изобретение.

Обьем_и_структ2ря работы. Диссертация изложена на i'6? страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков и 22 таб-лца. РябоТз состоит из вЕ*де<ля, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, в&г<дов и списка использованной .■"лтера-тури (158 источников, из них 143- на иностранных языках).

СОДЕРЖАНИЕ РАГОТЫ

О Б 3 О Р Л И ТЕ РА Т Г- Р Ы

Известно, что катаболизм нуклеозидоь в клетках к. coli осуществляется с участием 8 ферментов. Гены четырех из них, а именно дозоксирибоальдолазы, ТФ, фосфоде.чоксирибомутазы и ШФ, собраны в состав одного оперона (deo-оперона), а остальные локализуются в. отдельно лежащих участках ДНК в. сои. Транскрипция иншхии-

РУ8ТСЯ С двух Промоторщх участков - daoPt И deoPS. находящимся йод негативным контролем продуктов двух генов - Deон и cytn, синтезирующих специфические белки-репрессорц. cytR-penpeccop рогули-рует, кроме этого, выражение генов цитидиндёзашнази и УРФ. Мутационные повреждения гаюв CytR и deoR, приводящие к инактивации белков-репрессоров, повышают активность рассматриваемых структурных генов.

- ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАШЯ

Объекта."® исследования слукяли ктаммн бактерий Eaoherichia coli, лвляждаеся музейнши культурам, а также полученные селекционная путем и с использованием техники рэкомоинантннх ДНК.

Бактерии культов: »вали в колбах Эрленмэйера различного объема (0,25-1,0 л) на термоо^'атируешл. зноттель-аппаратах, а также в ферментерах АК-3 и. АК-Ю производства СК£ ETI АН СССР (г. Пуцяно) при 37°С.

Для описания процессов роста культур е. coli и синтеза нук-леог:щфосфорилаз вычисляли удельную скорость роста и и удельную скорость синтеза ферментов■ «= по формулам:

p=cbfdt«z-1 И c=dE.dt*x"1 (Tai-ul. 1973)

В качестве öctiosmx питательннх сред использовали коммерческий мясо-пептошшй бульон- с добвалением 0,5% дрожжевого. экстракта, а такте 4%-тй ферментолизат БВК. В качестве минимальной среда использовали среду- Адамса следующего состава (г/л): килс1-1.о: кн2ро4-1.5: Na2Hïo4-3.£.i Msso4-o,i. Источники углерода (глюкозу, глицерин;. использовали в концентрации 0,2-0,4%, а нук-леозидц■ - 0,iS. Необходимые добавки'вносили в следунцих концен-тращшх (!5кг/Ш5): тиш«ш-5; биотин-0,5; г'-дэзокситимндян-йО; танин (если не указано особо)-20; аминокислоти-50. Антибиотик!! вносили в следующих концентрациях (мкг/мл): тетрациювш-15-30; да-геадшцш-25-50.

л Потребность бактерия в тюявде определяли на агаризованной среде Адамса с глюкозой и различными концентрациями тишна.

При селекции мутанте, в бактериальнув суспензии (Ю8-Ю9 клэ-ток/мл) исходного иташга щеевали на селективную среду с необходимыми добавкаш!, Чаяжи инкубировали при 37°С. Виросгив клони р.'счиаались и повторно проверялись на способность к росту на селективных средах.

Анализ генотипа му?антов проводили методом рашшк на се лак-

гйвныв среда.

Выделение плазмид осуществляли тремя способами. Быстрое выделение для массового анализа проводили, как описано в работа "oiitas и Quiaiey (1981). получешя препаратшят количеств ПЛЗЗШ1Д'использовали К9ТОД Blrnbolm И Coly (1979), а для выделения высокоочицегош препаратов плазшццюй ДНК - разработанный наш способ, который позволяет отделять' щазмидную да от РНК, хромосомальиой ДНК и белков Ооз гфглмшг.:п ферментов, фэнольной ^хстракцйй Juai ультрацэнтрифугировапия. В этом методе использовано свойство вдтавйока осаждать полианкош из солевых растворов. Фракционируя ид пошлпчгаю заряда молекул. Суг.шрпнй препарат нуклеиновых кислот ооаздаяи, .прибавляя .цвтоаяон из расчета 4 мт на I .ыг нуклеиновых кислот. Осадок цэтавлоповыя солей осаздали. цантрифупфоватзом и растворллз! в 0,5 М iiaci, а затем дваздл гареосаздзли • атаиояом,

Рестр-.жшда, датирование и. элелтро^роз ДЖ проводила по f.'a-гоштису и соаот, (ISS4).

. Трансформация ' 15ДОТОК. ОСУВД'РТОЛЯХК НОТОДОМ .Handel И Higa

dove). - ' ■ ■'.';'■;{■'■■ ' .

- Активность Тй и ;УК>' определяли споктрсфотомограчески но •измеиеш» погадокня .при распадо г'-дезоксктк/дкшш. до такяяа ; (при S00 ка>.ввй-ураг®аа.'до урацдла (прл 290 ш), ^оотеотствошю. За I од, активзюотй.11рщцма.'в! такое количество фораднта, которое; обессачивадо. траюформащ® :'1 ЗД^ль • "'(готввтствуидзго субстрата зз 1 mm пр;г37°С (бео^еточныйлизат) im при Б0-60°с (цолно клотки). Активность ГШ определяли по реакции 'cira-теза ад-энозит из адеюша в; рибозо-I-P с; продварцтэлъшм фэо^зродазом шюэгащ. За ходоьг реакшга следили с гюэдь»-''тонкослойной хроматограф;?.: (ТОХ). V : - " ^: ■ " " -.

• Валок',оцр9дэллла ПО' Jioypi! -4bpWy • «ftЧД., '.-1951) .'

"Обработку' юэдскглутаронш альдегидом провояш иэ.Зпгееако н соавт.' (19Э0).•'■ •';■..' - ^ '•.;.''■'■; .-:■■'■■"'" ' , Смесь г '-дезоккгауклеозндоа, полученная в результате гидролиза ■ ДНК МЙЦвДНОМ ppufe Spioaria Violaaca, предостевдаиа к.б.н: Бараем В.К. (¡'¡¡статут ьикрабкакогаг ДК Беларуси). .

Ход синтезов ¡.сонтратаровалн -ира' псетл" ТСХ.на сластшах "Siluiol-UV^.j'V (Ktivalior, ЧОХОСДОВаКВЯ) ' И СУЙ-СШКТрОСКОЯКИ' ИЗ сп&ктро^отомотро RSpooord "UV-VIS" (Eorl Soles,. .ГДР);. ВзЕеСТВЛ 'обнар55вшаиа •;' в •.••''■SS-cssie,-. • •.• вдзата&ящровола 'ср'аыанием с обргзаачи-сзвдетелямл и шлифовала буферами раствора». Для под-

тверадения индивидуальности и строения молекул были истолкована данные ТСХ, УФ- и 'н-ЯМР-спектроскопии, а также элементного анализа. Последние два вида анализов выполнялись сотрудниками лаборатории химии нуклеотидов и полинуклеотидов Института биоорганической химии АН Беларуси (заведующий лабораторией доктор химических наук Й.А.Михайлопуло).

При статистической об. аботке результатов экспериментов (Аш-морин, Воробьев, 1962) проводили определение создай- арифметических и их доверительных интервалов для уровня вероятности 95S.

Использованные в работе модифицированные компоненты нуклеиновых ¡сполот были лзбезно предоставлены д.х.н. Михайлопуло !'.А., за что автор выражает ому искреннюю признательность.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

I • 0°MH§™§L __E^coii__с_á'iEeiJD'í S21ÍE05 а.ЩШ___син-

В процессе селекции мутантов в. сюи с дврвпрэсслровашшм синтезом нуклеозид$осфорилаз (обусловлошш инактивацией бел-ков-рэпрэссороз Dócil И CytK) НЭКИ 611ЛП ШЮЛЬаоВЭНЫ . СЛЗДУВДИО подхода, описакшэ в литературе: а) по снишгав потребности а ткмине у тшпватасимах'. иташов. и б) по скорости роста на куклеозидах .как вдаястваишх -вдошяках углерода.

Неходкий для 'селекции вташ Я. coli СУ-905 (thy thia мо) нуждался для роста в 20 мкг/мл тижша. Отбор мутантов со ciuv-Евгоюй потребностью з тшгшю проводился на агаржюватюй среда Адомса с 0,2% глякозой и'2 tátr/кл тампна. Шло отобрано IS клонов независимого происхождения. Анализ генотипа мутантов, проведений методом реплик на ряд селективных сред с '■ нуклеозидами в качестве едкнетвепнчг источников углерода и 'низким содержанием -тимина, показал, что 4 из них икеат фенотип' мутантов по дезоксирибокутазе (не растут на кнезикэ и тдаиднне,. прявляя потребность в тшкшо 0,5-1,0 мкг/ш1); 12 - фенотип мутантов по дезокса^ибоаньдолазо (но растут на тнгэдзю, ко растут па инозине, проявляя потребность в -тимикэ 1,5-2,0 wjtr/мл).

' При дальнейшей ..селекции полученная' мутантов по ешкешга потребности. в тишне ta применили новый подход в составлении селективной среда, ' закличаигдайся в /том, что в качестве единственного'. источника тамина били использовали его трудасрасщегошег/ша

под действием ТФ нуклеозиды, в частности, ага-тьу и з'-f-г' . З'-ddThd. Эти нуклеозиды могут служить источникам! тимина лишь в случав .высокого уровня активности ТФ, что наблюдается в клетках daoR- или cytR-мутантов. Принципиально важно, что функционирование ТФ в этом случае необходимо как для расщепления указанных соединений , так и для дальнейшнго использования полученного тимина. Эффективное разложение нуклеозвдов и усвоение освобождающегося при этом тимина клетками мутантов с высокой активность» ТФ приводит к тому, что последние получают резко вырэ-кенное преимущество при росте на таких средах.

При селекции на средах с ога-тьу было получено около 100 крупных колоний из штамма М, (дефектного по dra) и около 70 колоний из иташа Mg0 (дефектного по etrm>. При использовании э'-г-г'.з'-ddThd эта' цифрысоставили соответственно 60 и 35 колоний. Наиболее активным из. них оказался втеш БИГ-чД/т с генотипом deoR, dr-ft".

акспоркменталъние дагашэ по сравнению эффективности предложенного нами метода отбора мутанток с дерепрессией сштеза doo-Фермантов и описанного в литературе метода, основашюго на сверхсниквшш потребности в тимине ауксотрофов, дефектных по dra или drtn, пр',шедени в табл. t.

Таблица 1

Частота выявления мутантов с дерепрессией синтеза ТФ при раличных методах их получения

Штамл Частота выявления мутантов при исаользовании

СБОрхИИЗКИХ ara-Thy 3'-F -2',3'-dflThd концентраций тимина

М, <7.3±I,0)-I0~8 (8,7*I,I)-I0~7 (4,0±0,Э)-10"7:

(thy'dra")

Ы28 (4,0±0,7)-I0_8 (6,2±0,7)-10~7 (8,2*0,6)-Ю-7

(thy"drm~)

Из донных таблицы видно, что частота выявления дерепресси-рованных по лао-оперону мутантов как минимум на порядок вике при

Б. coli

и его генотип

кспользоввюга предлож&шюго наш метода составлокиа селектшяшх сред с ат-л-тьу и з' -у-г' ,з--алуьа. по сравнению с известными из литератур« ютодамя.

Следуюиий этап селекции состоял в отборе мутантов с дере-првссироваяным синтезом нуклеозидфосфоршгаз по скорости рсэда на нуклеозидах как едатстввшшх источниках углерода. Селекция '.<рово-дилась в несколько этапов, которые сопровождались последовательным приростом активности до тех пор, пока не достигался макси-мэльний уровень активности фэрмеша, который укэ не. удавалось превысить используемыми приемами. Так, при отборе быстрорастущих на инозине колоний: кзогеншх штаммов М, и БМГ-чДЛа не удалось превысить уровень активности ТФ, составляющий 3,9-4,0 ед/мг белка (рис. 1).

12 3 4 56 1г Зтапи

Рис. 1. изменение активности 1Ф при проведений селекции в. со11 М, (А) И БМТ-1.Ц/18 (Б) на средах а ' инозином как источником'углерода. Но оси ординат - активность фермента в ад/мг белка.

Для даллиСшего уьелвчения.; активности аеэ-фэрмвнтов и УГФ, ^бусдаитанного вввдчни&м в' тытт рогулятохяюй' мутации oyta, штзии я.' '.он Ш?-ЗДЛа- проводи через селективную- среду с урвдшом кос шгочймксм углерода. Из иолучешнх быстрорастущие; клоков отобрали етчкм ■ - наиболее активный по УРФ и

лэг-^рглэнтам. ,

В тпбл. 2'приведены данные", показнваювге, как изменялась активность ¿(уклеозвдфосфорилаз у разных втаюмв е. сои в процессе селекции.

Исходной для селекции тиминзависимый ьгамм СЫ-906 характеризовался назквки активностями адкя';оз1ьцфосфорвлаз, а именно: 82 ед/мг - ТФ, во ед/мг - 1Ш я 81 ед/Мг - У?Ф.

В промокуточном штамме М, (с блоком синтеза ага) активность УГО не отличается от исходной, в тоня врамя активность ТФ и ШФ увеличена в 2,8-3 раза, что объясняется накоплением клетке 2-»пь-5-р - индуктора синтеза аео-фермептов.

Штаммы БМТ-1'Д/1ал ЗДЛа и 4Д/1а имеют дэрепрессированный синтез нуклеозидфосфорилаз. Кэ данвсх табл. видно, как идет возрастание активности- ТФ и П® в этих итаммах вслед за увеличением стешни дерепрессгаг. Для иташа с инактивироЕашшм суги репрессором характерна таю» и высокая активность УРФ.

Из данных табл. 2 видно такжо, что двои и су гк <1ь-зй ита;.ш отличаются мевду соСоЯ по отношению к источнику .углерода. При внрадавашш «юон-мутантов в среде с гдакозой наблюдается лшм» не- . значительное шшше активности чуклв$зид1)осфорилаз. Более значительная. степвг.к репрессии (1,8 раза) юаейт мосто для ¿еок оугр итвмма.. Этот феномен объясняется известными из литературы дакаыш о том,, что промотор!, суги-типа штотся катаболитчувствьтельными.

Дальнейшее применение селективных .процедур не приводило к увеличения активности нуклеозидфосфорилаз, поэтому на следующем этапе работы нами была осуществлена амплификация генов нуюшо-сшйосфоралаз путем клонирования лао-оперона в составь рако-ыбюшитной шогошшйной тлаз»<шдз.

2. Клонирование аоо-оплюна в.сои в составе рекомбИ1'"Цтшх, ^лазмид ,

В качество донора аео-опарона нами был выбран штада ь. сои Ш-е09, несущий плазмиду раш, сс„е ржавею в своем составе <1во-опэрон в. оон. Плазздца рлиг имеет кшет рад недостатков, в т.ч. большой размер (30 т. п. п. ). наличие ^агмента ДКХ фага V к др., которые затрудняют рабе ту о ней. Е'с^язи с этим, ш цере-клонировали один, из вгШ-Фрашттов плазмиду рдлл на много-копийнуи плазмиду рвдзгт. Полученная, в^^ результате плазмпда рщг иыаег следуюцие характеристики: иаоольшой размер -(12 т. п. н. наличие- сайтов рестрикции для большого числа рестр'.астаз (что ва-ано дл» дальнейшей работа с шшмвдой). , .

, ТйОЛ. -3-

Активноста аео-ферментов и УРЗ> (ед/мг бежа) в ¿есклэточшх экетргэтах р.-'уляторшх мутантов Е. со11

и^зки Генотип Активность ТФ при выращаванш! • активность пш при выращгзашш активность урф При выращивании

ив •. глицерине на глюкозе на глицерине на глдкозе ьа глицерина на глюкозе

аз-зуб Дикий тип 82*9 64±6 604в 49±2 81±8 42±4

»1 230*2 186±9 90^4 83*1 45±2

ШТ-1ДЛа 4га~ сЗ.еоК^ 1030±60 950±26 Б9С±Ю 540±20 81±в 45+4

ШТ-ЗД/1Э <1гв~ лвон^ 3900*68 3510±22 21 .'-¿160 1900*100 И6±12 81±б

БШ'-4Д/18 Йга~ йес С- 6320±92 3640±140 2920±240 172С&53 Ю24±63 67СЬЭ0

оуъй

След/от ожэтить, что она несет в своем состава deo-оперон в. сои баз промотора deoPi. Ътсеченкого рестриктазой Bgiïl на стадии конструирования рекомбянантной плазмиды. Однако, данные ряда авторов свидетельствуй: о том, что „при хромосомальной локализации deo-оперона инициация транскрипции идет в основном с промотора аворг. Представляло интерес изучить, сохранится ли эта закономерность при плазмидиой локализации оперона.

В качестве реципиентов наш были использовали и-шя-ш е. coli СМ-809 и AM-I903, содержала делецию всего оперона или его части. Отбор трансформаитов tpp+ и deo+. о,повременно наследующих маркор ампициллинустойчивости вектора рвизг7, проводили на минимальной среде с тимином как источником тимидилата, a такхе lia среде с инозином в качестве единственного источника углерода. Было отобрано 40 клонов-трансформантов, из которых была выделена плазмидяая ДНК «проанализирована с помощью электрофореза в агарозном геле, а также с применением ростриктаз BomHi. Belli. S0101 + Hii.aïII. Для дальнейшей работы мы отобрали клон N12, несущий рокомбинантнуо плазмиду ргаг

0 цель» изучить выражение генов doo-сяэрона в составе полученной плазмиды и сравнить их функционирование с гошмидой рАМ1, серию изогенннх штаммов в.coli с различными регуляторннми

Яд/77 Н£&£/1)

Рис. 2. Рестрикшгстшаг. карта плазмиды рквз.

бит H lüg/S)

дотациями по dep-одарсну трансформировали плазмидачш рлш и рпиг, а затем определяли активность TS в боскдеточшх якстрактаг. (табл. 3). Из таблица видно, что активность ТФ в клетках с гошзмидаки достоверно вше. чем только с хромосомальиой локализацией аео-оиерона, длп обеих изучаемых план;,гад, 'Гатс, для иташа AM-I70I (лисий тип) отмечается значительное увеличение активности ТФ; в 30 раз - при шрая^ивании на. глицерине и в 6-14 раз - при выращавягош на глюкозе. При переходе к дерепрессированнкм штешам также отмечается увеличение активности ТФ, связанное с введением плазмщ, но в значительно меньшей степени. Наименьший прирост апшшюсти ТФ «менее 2 ,.ргз) наблюдается для наиболее дэропрессдаованного штвк«ма AM-I7I3 (с идективированшма как EeoR-, тач и cj-tR-репрессорами).

Таблица 3

Активность тф в бесклеточпнх экстрактах различных итзмиоб в. сои, содержащих плазмиды ¿ami п piros

Иташ

Генотип по

регулятогонм

ге.чам

Введепнея плазмида

Активность фермента {9д/мг белка) у бактерий, внрэденных на среде

с глюкозой

с глицерином

AM-I70I ¿M-I70I AM-I70I

Дикий тип Дикий тип Дикий тип

рАМ1 pNDS

40 ± г 560 t 40 230 ± 30

5S ± 7 1750 ± 800 1700 i 300

Ж-1705 cytr AM-I705 сута AM-I705 cjrtR

pAM1

ргог

1Б0 t 30 850 ± 50 480 1 ЭО

400 ± 30 ; 2260 ¿90 2530 + 500

aw-i70i>

am-i 70s

am-1705

(3«oH d-oP deep

pAMl

ркпг.

1270 ¿ 280 3860 ± 270 1290 ± 70

1280 л 300 4030 jc 120 3700 ± 600

AM-I7I3 ovtR deoK - 3800.i 460 . 4900 * 180

AM-I7I3 . oytR deoH pAMi : 6950 ± 300 8630 ± I?,0

AM-I7I3 c?tR dcoR pND2 . 4570 ± 200 8640 ±800

Данные таблиц« свидетельствуют также о том, что в условиях катаболитной репрессии активность ТФ ниже, чем в условиях ее снятая, как для бесплзздащннх штаммов, так и ^ для штаммов, с

шшмидама , аксщрескея клонированного з составе гибридных

илазиид гена ТФ сохраняет чувствительность к позитивной рвгуляда* В го т врамя зря выращцванк« на глицерине активность исследуемого фермента в »слешах <с плазмидой с полным оео-опероном на.'отличается от активности: f® в плетках, лзсущих плазмвду без промотора deoPi- Это свидетельствует, об отсутствии в данных условиях вклада промотора doopt в траносрипцию deo-огюрона.

Феномен бояе^ выракенного отклика дапоп хтаммов, но сравнена* с дерепрес сиро вашими zvamtam, на введение в них плазмид может *шть объяснен следующим образом. Возмокно, активность ТО по каким-либо причинам в клетке не может подняться выше определенного предела (всаошш, что наличие нуклеозидфосфорилаз не является вдзяенш-н&обходишм дл< клетки б. eon), Поэтому даже сведение большой дозы гена ТФ -ь клетки без репрэссора не сопровождается адекватным увеличением активности фэрмеэта. Таким образом, на изучаемой нами экспериментальной модели амплификация гена ТЬ не рриродит к значительному увеличению активности Фермента по ; срчашада со шшдавд с дерепрессироВанным его синтезом. Узким i звеном в экспрессии гена мокет Рыть мощность транскрипционного, треааля'мошюго или посттрансляционкого аппарата клетки.

Возвращаясь -к цели данного раздела работы, ш вы'/аденн констатировать, что многократаое повышение дозы deo-оперона путем клонирования его в клетках с дерепрессированным' синтезом 4во-4®рмэнтов дало нагл возможность получить клетки в. coxi -с активностью ТФ, всего лить в '1,6-1,8 раза более высокой, чем активность фермента к исходном штамма-хозяина.

3. Изучение физиологических потребностей в. joii ЩТ-4Д/1Э при'глубинном культивировании в :>шнгк;ль"ых ч комплексных средах i

Для культивирования е. coli предлагается большой* табор сред, однако ни oium кз них не может считаться универсальной. Наша задача сост. ала в той, чтобы добиться максимального выхода активности йуклеозидфосфзрилаз с единицы сЛема питательной среда. Изучав динамику роста биомассы культуры и нуклео- , видфосфоршшноЯ активно'--ти в клотках продуцента n;a внращиванки его в кинимальвой граде (модифищгоовенняй среда Адамсз) и в ряде комплексных сред (Ш2Б с добавками дроюкавого экстракта, пептона, ферментслизата ВЕК), ми оитансишюъ на следующих средах: (А.); фврментолизвт БВК - G,5-4%; pH (Б) фермеатолизат БВК -

I.5-2V глюкоза - 0,3-0,6%, pH 7,2-7,4. При использовании этих

сред урожай йиогааес» составляв' 1,7-2,0 «г/мл в расчета на сухую массу.

Наиболее активные' клэтая балд "получена- на среде (А), при этом активность ПН® составила 05 ед/цг, а активность ТФ - 48 ед/мг в расчете на сухуп массу клеток.

Наибольший выход активности нуклоо.ч/дфосформаз с единиц« объема среды, достигомый пр1.,исаользоваика указанных сред, состаг-лл для И> - 70-05 ед/'мл и дия 1Щ - 140-155 ед/мл.

"ля ы:жла;»!Ш иред рассмотренные показателя были нш» з 3-15 раз. Кроне того, максгалалышэ показатели накопления бпомвсси и активностей ферментов в клетках достигаются к 14-18 ч при использовании комплексных сред и к 20-24 ч - при использовании юипгадышх.

Рис. 3. Измэнэпиэ удельной скорости роста (т ч-1) и удельной скорости синтеза ГО'З и ТФ {*? ед«ч"1. мг-1) в процессе культквирс. анил. в. соИ БЖМД/13 в среде ;А).

О 4 8 12 16 Враст культивирования, ч

Ка рис. 3 пряведэны давннз по избиении удельной скорости роста культура и удельной скорости синтеза ШЭ я ТО в процессе кулмивировслшя в, сои Ш-4Д/1а в комплексной .среде (А). Наибольшая удляьиая скорость роста (0,49 ч~5> нвблвдоется иа начальных этапах культивирований (4 ч\ Для Ш© й ТО максимальная . удельная скорость синтеза, ранная соответственно 40 ад-иг"1» ч"1 и

20 одна-"1. V1,

достигается такгз к 4 ч культивирования.

4. Использование высокое стпэдих по нуклеозидЗЪсФэрклзззм •. штатов в. сои в синтезах пуклеозндов

На заключительном этапе работа полученные нами штамш в. coit.с повшепной продукцией нуклэозидфосфорилаз были примадонн в синтезах ряда природах и модифицированных нуклеозиДов: г'-дезок-сиаденозкнз, г'-дезокситишдина, рибавирина и 5-иод-г'-догоксиурвдина.

Рибавирин является противовирусным препаратом с широким спектром действия, Хшвяеский метод сиитеги этого созданения имеет такие недостатки, как образование побочных продуктов в виде структурных изомеров рибавирина и его а-аноыара. В последние года зару»1е*аше исследователи провели широкий скрингнг микроорганизмов е отобрала рад бактериальных атакиов, клетки которых обладают сют-сбностью к сшгаэзу рибавирина из 1,2,4-триззол-з-кар0сксамиди СШ) и рияит.шх дсвороз углеводного фрагмента. Характерно, что «mimt aou Тфоивляж низкуюистинность в етих реакциях.

Ь ргмках предложенного нами .способа сшгпза рибавирина cor лэсаа_«шда._____„.^.с_____________

были оптимизированы такие параметр», КяК температура проведения процесса, рН среда, концентрация фосфатного.Oyiepa, сботношештз субстратов реакции, концентрация бшкатадаз&тсров. На рис, i отраетн ход синтеза рабаварзнз с 'ксшчъаоваиибм кдоток нескольких . штаммов к. coït. Видео,, что наиболее эффективны в мой рештак штаммы БМТ- ад/ta и ЕИМДЛь.

Уместно заметить, чго щкдаженшй пакя способ превосходит известные. сгособы-аналогя по тасому основному показатель, квк гаход целевою продукта. Ток, а ' штшэдша условиях в ранках нашего способа стегшь кодеров» ТКЛ составляет 80-95* га ЯО-Ьй «г •рзакции. '. ' ■ ¡' ...•■..•.■

л, 1,

I 2 Вреш ннкубащм,

Рис. 4. Синтез рибавирша из ТКА и гуанозина с использованием клеток е. оон СМ-906 (I), Ш-П (2), БМТ-1Д/1а (3). БНТ-ЗД/) а (4) и аГГ-4Д/1а (5).

По оси ординат - выход продукта.

г'-дезоксиаденозин - природный нукяеозид, входящий в состав ДИК', представляет интерес как ¡{сходный субстрат для химического синтеза потенциальных лекарственных средств против СГОЩа, а именно г'.з'-дидезоксиадеиозина и продукта его дезагшшрования -2* ,э'—дидезоксишюзинз.

Имеющие практическое значение способы получения г'-дезокси-аденозша состоят в гидролиза ДНК фермента!.« - зкзонуклевзой и фосфатазой. Недостаток этих способов состоит в шгаком выхода указанного нуклеозида, т. к. он является лишь одним из четырех нуклеозидных компонентов ДНК. Нами била предпринята попытка повысить выход г'-дезоксиаденозина из ДНК после ее ферментативного пиролиза мицелием, гриба зрюаг1а violaoea Ш-105Д за счет ферментативного трансдезоксиробозплирования аденина с использованием смеси г'-дезоксинуклеозидов в качестве доноров углеводнсго фрагмента. Следует отметить, что ряд факторов, влияющих на синтез указанного нуклеозида (величины рН и температуры реакционной среды, концентрации биокат^газаторов и субстратов), были неми изучены и оптимизированы.

Проведение процесса получения г'-дезоксяаденознна из гидролизата ДНК и адешша под действием ферментов целых клеток в.

О

«■он Ш'-1Д/1 а позволило . достичь 83,5!&-иого выхода целевого продукта п расчете па суммарное количество г'-дезоксинуклеозздов в .гатролазат ДКК, что намного превышает его выход при стандартном гидролизе ДНК. '

Дна кричный подход бал применен нами при получении г'-дезок-сктимидана .' потребность в котором в последние года резко возросла, т.к. он используется.для синтеза азидотинадоша - основного препарата б химиотерапии СПИДа. В .результате использования траис-дезоксирибозилирования тишша клеткши в. coil ВУГ-1Д/1а в сочетании с предварительным тадролизом ДНК до смеси г'-дозоксинуклео-видов был достигнут выход целевого продукта, равный 36,5 мас-S от исходной ДНН'.

Кеобдоимо подчеркнуть, что предложенные наш способа получения г'-дэзоксиаденозшш и г'-дезокситюдидана являются '■довольногарешктавдтгаподходами, нозволящкьз! - более полно угалиг/.фоьать углеводный компонент нуклеиновой кислоты.

—:—«-Н-«.—* AM-1701/piroa (I).

По оси орданат - выход про-

Рис. 5. Синтез 5-иод-г'-дезок-■сиурпдина, катализируемый ¡слетками Е. coil AM-I70I (3) К

<

70

I

50

дукта.

Время инкубации, час

По наиему мнению, определенную .-новину составляло тащ? гагальвованио нами для синтеза' нуклеозидов клеток бактащ, ■lwoypx кленировашай! deo-оперон., Так,.'нами впервые..'продемонстр^Г

ровано использование прл сийтозо вддифтшровзнного нуклэооэда (5-иод-г'-дазоксяурядона> в качестве ферментного препарата моток бактериального штамма, полученного гащо-шшанершш путьм.

На рис. 5 представленн результаты экспериментов по. синтезу указанного нуклеозвда». канализируемому...клеткаш родительского гаташа з. coli AM-I70I и vtjim зсаотамаом в плакшдой рнкг. Еидио, что штаи-ь содзрзащкй плаз;,яэдг, превосходит родительский как по скорости сштеза целевого.продукта, так и'по воличйнв дастпгаоко-го шхсдэ реакции Так, машлмалышй выход продукта при испольео-вашзд исходного штажа составил 42S 6а V ч, a прл нспользовзшш вташа с плазмздой — 65S за 1:ч реакция.

оаюекнв результлтн и бшщ

I. Впервио в штодэ получения мутактов с дэрепрессировзннкм .синтезом формантов Део-опэрспа в состава • селективной срэдн в качество солектируггеих агентов -испояьзоваш модафвдвр-. штыэ яук-леозмда (тайшарабпнозид и з'-^фтор-г*.з'-дадэзоксихпготдаи), что позвоглло .■увеяппть а^Щоктквность отбора aeraras мутантов.

2. В результата отбора с использованиям разяпших селективных сред получэгш мутанткпе штамма в. мл, клетки которых'проявляют шсокяо активности тшдашфосф^'рилазн, ^шшуклеозидфосфо-¡шазы и уридгаХосфорилазв.

3. Получена гибридная 1мзг*!пдз piroa, содержащая лео-сдарон л. сои с удаленным промоторшд! участком deoPi. О использованием указанной плазмкди впэрвно в клетках в. coli.изучена ькснрэссая клонированного гена тяутадаХос^оргшзп,- находящегося под контролем одного из двух-.промоторов, упрзвляэдях транскрипцией dt'o-onepona. Показано, что:

а) упиягшвь а клетках с дэрепресснроваш®,! синтезом генов •deo-отарсна дозы газа.т-гушнфо'сфортяози'та" приводит к адакззтио-. му увеличению окт!п?носп: этого фзр/ента; •

б) экспрессия гена/здв^гквбсворвяааа. сяосйСва подвергаться катаболктнсЯ роярзсскя ко только в составе xposeccrai;;' да т жя и при 'плазкидяоЗ локаетзацня этого гека; ;;

в) в клэттсаг с - познигЕна жташфовшзнаа ярскотором авога вклад промотора а-о? i в трзпскг.ззЕД кло^фсгаанкого dao-c::opo:'a отсутствует. . -. -.''. -' ■'/ .'.' .

4. С иопольгсванаем ие.та к^этск получогсых мутантнкх птам-

мов е. ooii в качестве биокатализаторов разработаны способы получения г'-дезоксиаденозина, г'-дезокситимвдша, i-/5-в-рибофурано-зил-1,г.д-триазол-з-карбоксамвда (рибавирина) и 5-иод-г•-дезокси-уридина. При атом в случав синтеза 5-иод-г•-дезоксиуридина впервые продемонстрировано применение в качестве биокатализатора бактериальных клеток, несущих клонированный deo-оперон е. coil.

5. Разработан простой способ выделения плазмвд 13 клеток бактерий, который основан на свойстве цетавлона (бромистого цвтилтримэталаммония) осаждать полианионы из солевых растворов, фракционируя их по величине заряда молекул. Метод позволяет получать препараты плазмидной ДНК, практически свободные от примесей белка, РНК и хромосомальной ДНК, без применения ферментов, фенольной экстракции, колоночной хроматографии и . ультрацентрифугировг'ниа.

. СШСОК ЕАБОТ, ОПУВЛИКОВАШШХ ПО ЙЫЕ ДИССЕРТАЦИЙ

I. Дудчик Н.В., Ерошевская Л.А., БараЯ В.Н., Зинченко- А.И. Прос-. той метод выделения плазмид дифференциальным осавдением цетав-jioiioM // Тез. докл. Конф. молод, ученых "Микроорганизмы - продуценты биологически активных веществ" - Рига, 1984. - С. 14. Z. Дудчык Н.У., Ерашэуская Л.А., Папоу Ш.Л., Барай У.М., 31нчанка A.i. Прости мзтад выдзялення бактэрыяльных плазмгд з дапамогай бромютага ц&тылтрыметыламошю // Бесщ АН БССР, сер. б1ял. навук. - 1984. - й Б. - С. 64-6?.

3. СЫщенко С.И., Дудчик H.H. Влияние компонентов питательной сре-

ды на биосинтез нуклеозидфосфорил-з Esoherlci la coli' EM-II // Тез. докл. Конф. молод, ученых "Современные проблемы биотехнология микроорганизмов" - Рига, 1987. - С. Ш. .

4. Дудчик Н.В., Зинченко А.И., Мауриныа Ю.А. Ферментативный синтез вирауола и его 5'-монофосфата // Тез. докл. Конф. молод.

- ученых "Синтез и исследование биологически активных соединений" - Рига, 1989. - С. Iii. б. Дудчик Н.В., Зинченко А.И., Барай В.Н., Мауриньш Ю.А., Сентп-рева С.Л., Квасвк Е.И. Синтез 1-(/?-о-рибофуранозил)-1 .г.д.-три-азол-з-карбоксамида и его ъ'-монофосфата с использованием ферментов микроорганизмов // Изв. АН БССР, сер. хим. наук. -: 1990.- £ Б.-С. 90-94. 6. Zinchon&o A.I., BartV.N., Bokut З.В., Dudchik N.V., Bolyaö-

▼a Yu.V., Mlkhallopulo I.Ai/Hyntbeeia ol 2*-<?.et>iqrVnymiüln« Ьу an enzymatlo tгапл¿чохугЛЪозуlfttien // Biotoohnol. 3ott. -1 «О. - VöJ . «Й. No 5. - Р. 3*1 -346.

7. 2inoher>Hrs A.I., üarei V.U., Bfkut S.B<v ¿itdehik U.V., КгмпК В.T.. Mlkhailopulol.A. Erizymatlo synthesla ot C* -deory»d<»no-Bin» // Bioteohnol. r«tt< - 199T. - Voi »a, So. C. - 2. B7-90,

8, А.СЛВ6120Г СССР, МНИ5 С 12 Т. 1/20. Штамм бактерий EaeWichio eoi-s для полученнч рибдафина '/ Н.1>. Цудчнк. В.Н.БпраЯ, А.И. Зиечеккс-. С.Б. "Зеку?*, Е. И.Кваскй, Г И, Лё.Них^Йлопуло. - № 4724353 /30-13! Опубл. 07.Bi№. » Й5, i

гг