Получение рекомбинантных белков западносибирских изолятов Borrelia burgdorferi sensu lato и изучение их антигенных свойств

Рябченко, Александр Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение рекомбинантных белков западносибирских изолятов Borrelia burgdorferi sensu lato и изучение их антигенных свойств
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение рекомбинантных белков западносибирских изолятов Borrelia burgdorferi sensu lato и изучение их антигенных свойств"

На правах рукописи

РЯБЧЕНКО АЛЕКСАНДР ВЛАДИМИРОВИЧ

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ЗАПАДНОСИБИРСКИХ ИЗОЛЯТОВ BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO И ИЗУЧЕНИЕ ИХ АНТИГЕННЫХ СВОЙСТВ

03.00.04 - биохимия 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2009 ^ [¡' "3 1

003472662

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук Беклемишев Анатолий Борисович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор биологический наук, профессор

Ильичёв Александр Алексеевич Гуляева Людмила Федоровна

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск

Защита состоится «. 2-3 » /^у^/ _2009 г. в Ю часов на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2; тел.: 8 (383) 333-54-81.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Научно-исследовательского института биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан 2009г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Русских Г. С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

По морфологическим и генетическим признакам различают 13 геновидов спирохет комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.) (Baranton et al, 1998), относящихся к семейству SPIROCHAETACAE. Этиологическая роль спирохет этого комплекса как инфекционных агентов, переносимых клещами рода Ixodes была установлена в 1982 г. американскими исследователями и была названа «болезнью Лайма» (Steere, 2006). В нашей стране это природноочаговое трансмиссивное заболевание получило название «иксодового клещевого боррелиоза» (ИКБ). Три геновида этого комплекса являются патогенными для человека (Wang et al, 1999) и три условнопатогенными (Richter et al, 2006; Hofmann, 2005; Stanek and Strle, 2003; Hengge et al, 2003). По широте распространения и уровню заболеваемости ИКБ занимает одно из ведущих мест среди природно-очаговых заболеваний. Ареал инфекции простирается по всей Северной Америке, Европе, России, Японии, Китае (Stanek, 2003).

Отличия в генетической структуре патогенных геновидов боррелий, обусловливают полиморфизм клинических проявлений и органных поражений человека. Основные симптомы ИКБ сходны во всем мире, но есть и региональные отличия. В первую очередь между болезнью, обнаруженной в Америке и вызываемой исключительно геновидом B.burgdorferi sensu stricto (s.s.) с характерными проявлениями артрита, И болезнью, обнаруженной в Европе. В Европе болезнь вызывается, прежде всего, геновидами B.garinii -возбудителем, характеризующимся нейротропностью и B.afzelii, поражающим часто только кожу с развитием акродерматигов. При отсутствии своевременного лечения, инфекции переходят в хроническую форму.

В виду разнообразия клинических проявлений заболевания, для подтверждения диагноза используют дополнительные лабораторные методы, среди которых широкое распространение получили методы, основанные на вьивление антител к возбудителю. В качестве антигенов используются лизаты клеток боррелий, либо рекомбинантные белки спирохет. Большая изменчивость антигенов возбудителя обуславливает сложность серодиагностики. Высокая вариабельность особенно характерна для внешних поверхностных белков боррелий, которые с одной стороны являются иммунодоминантными, с другой стороны - гомология среди белков этого класса варьирует от 70 до 100% даже среди изолятов выделенных на одной территории.

антигенов в изолятах циркулирующих на этой территории. В связи с этим, целью настоящего исследования являлось получение рекомбинантных иммунодоминантных белков западносибирских изолятов В. burgdorferi s.l. и сравнительное исследование их первичных структур и антигенных свойств.

Задачи исследования:

1. Оценить зараженность клещей Ixodes persulcatus Shulze, населяющих рекреационную зону Новосибирского Научного Центра, различными геновидами спирохет В.burgdorferi s.l.

2. Получить культуры западносибирских изолятов В. burgdorferi s.l.

3. На основе анализа литературных данных выбрать в качестве объектов исследования белки спирохет В.burgdorferi s.l. наиболее перспективные для создания средств серодиагностики ИКБ.

4. Сконструировать экспрессирующиие плазмидные векторы, пригодные для получения в клетках E.coli рекомбинантных белков боррелий и их последующей аффинной очистки.

5. Клонировать кодирующие области генов выбранных иммунодоминантных белков B.burgdorferi s.l. в клетках E.coli в составе экспрессирующих векторов.

6. Определить нуклеотидные последовательности клонированных генов спирохет B.burgdorferi s.l. и исследовать гомологию соответствующих им белков с опубликованными в базе данных GeneBank аналогичными белками боррелий.

7. Получить очищенные рекомбинантные белки западносибирских изолятов B.burgdorferi s.l. и исследовать их антигенные свойства методом ИФА на сыворотках больных ИКБ.

8. Оценить пригодность каждого из рекомбинантных антигенов боррелий для серодиагностики локализованной и диссеминированной стадий ИКБ.

Научная новизна работы

Исследована зараженность клещей Ixodes persulcatus Shulze, отловленных в рекреационной зоне ННЦ в 2003, 2005, 2006 и 2008 годах, различными геновидами спирохет B.burgdorferi s.l. Отмечены зависимые от года наблюдений колебания в количестве инфицированных спирохетами особей (20% - 32%). Установлено, что только два геновида боррелий циркулировали до 2006 г. в популяции иксодовых клещей на обследованной терриртории -B.garinii и B.afzelii, с доминирующим преобладанием первого (70%-80%), включающего представителей двух геномных групп: NT29 и 20047. В 2006 и 2008 г.г. в нескольких особях клещей обнаружены спирохеты геновида В. japonica.

Сконструированы оригинальные бактериальные экспрессирующие вектора pRAC и pRAC3, содержащие химерные регуляторные районы, полилинкер для клонирования генов и участки, кодирующие олигогистидиновые последовательности в С-концевой области рекомбинантных белков. Штаммы E.coli, несущие полученные векторы

обеспечивают трёхкратное увеличение синтеза белка GFP по сравнению с клетками, содержащими исходный экспрессирующий вектор pREB.

Определены нуклеотидные последовательности кодирующих областей генов flah, flaB, ospC, ospA и dbpB западносибирского изолята B.garinii, группы 20047т и гена ospC западносибирского изолята B.afzelii', выведены соответствующие этим генам аминокислотные последовательности белков. Нуклеотидные последовательности выше названных генов депонированы в электронную международную базу данных генетической информации GenBank под инвентарными номерами: EU979631.1, EU979630.1, EU979629.1, EU979628.1, EU979626.1 и EU979627.1.

На основе сравнения аминокислотных последовательностей антигенов FlaA, FlaB, OspC, OspA и DbpB спирохет В. burgdorferi s.l., представленных в базе данных GeneBank (декабрь 2008 г.) и установленных в настоящей работе, показано, что западносибирский изолят B.garinii группа 20047т (NSK-10-06, музейный штамм №10) филогенетически близок изолятам B.garinii, выделенным в Европе.

Исследованы антигенные свойства рекомбинантных белков FlaA, FlaB, OspC, OspA и DbpB методом ИФА в экспериментах с сыворотками от больных ИКБ и здоровых доноров. Продемонстрирована перспективность использования названных рекомбинантных белков для серодиагностики ИКБ. Предложена комбинация рекомбинантных антигенов для выявления антител к возбудителям ИКБ в крови больных, как с локализованной, так и с диссеминированной стадиями заболевания.

Практическая значимость работы

Полученные в настоящей работе данные о зараженности клещей Ixodes persulcatus, отловленных в рекреационной зоне ННЦ в 2003, 2005, 2006 и 2008 годах, различными геновидами спирохет B.burgdorferi s.l. могут быть использованы для прогнозирования эпидемической ситуации по ИКБ и возможных клинических проявлений заболеваний.

Создана музейная коллекция западносибирских изолятов B.burgdorferi s.l. распространенных на территории Новосибирской области и определена их геновидовая принадлежность. Коллекция включает 2 изолята B.afzelii, 14 изолятов B.garinii, 7 образцов смеси изолятов B.afzelii и B.garinii. Культуры полученных изолятов боррелий могут быть использованы в качестве посевного материала для культивирования и наработки биомассы спирохет и решения исследовательских и прикладных задач.

Сконструированы векторы pRAC и pRAC3 пригодные для клонирования и эффективной индуцируемой экспрессии генов в клетках E.coli. Штаммы E.coli, содержащие в составе этих векторов экспрессируемые гены флюоресцирующих белков, могут применяться в химической, фармацевтической, пищевой промышленности и в экологическом мониторинге окружающей среды в качестве цельноклеточных биосенсоров для обнаружения генотоксикантов в исследуемых образцах.

Сконструированные штаммы E.coli - продуценты рекомбинантных белков FlaA, OspC, OspA, DbpB и FlaB, специфичных для геновидов B.garinii (группа 20047т), и OspC B.afzelii, могут быть использованы в качестве источников получения соответствующих антигенов боррелий.

Разработана технология получения рекомбинантных белков В.burgdorferi s.l. с помощью экспрессии соответствующих им генов в составе сконструированного вектора pRAC3 и модифицированного в настоящей работе вектора pET36b(+) (рЕТт) в клетках E.coli (шт. BL-21(DE3) и Rosetta 2) и последующей аффинной очистки рекомбинантных полипептидов на металло-хелатных сорбентах.

Полученные в настоящей работе рекомбинантные антигены FlaA, FlaB, OspC, OspA и DbpB могут быть использованы в серодиагностике ИКБ, вызываемого спирохетами B.burgdorferi s.l., циркулирующими на азиатской территории России.

Положения, выносимые на защиту:

1. В рекреационной зоне Новосибирского научного центра в период с 2003 по 2008 г.г. в популяции клещей Ixodes persulcatus Schulze циркулировали только три геновида боррелий - B.garinii, B.afzelii и B.japonica с доминирующим преобладанием B.garinii (более 75%). Заражённость иксодовых клещей боррелиями составляла, в зависимости от года наблюдений, 20% - 32%.

2. Западносибирский изолят B.garinii группы 20047т (NSK10-06, музейный штамм №10) филогенетически близок боррелиям, изолированным на территории Европы.

3. Сконструированные плазмидные векторы pRAC, pRAC3 и модифицированный в настоящей работе вектор pET36b(+) (рЕТт) являются эффективными системами для экспрессии клонируемых в их составе генов в клетках E.coli.

4. Штамм E.coli, содержащий в составе плазмиду pRAC может применяться в качестве цельноклеточного биосенсора для обнаружения генотоксикантов.

5. По результатам исследований антигенных свойств рекомбинантных белков FlaA, FlaB, OspC, OspA и DbpB, данные белки могут быть рекомендованы для серодиагностики ИКБ.

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертационной работы доложены на следующих научных форумах: Междисциплинарный конгресс "Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека", 10-21 июня 2004, Судак, Украина; Международная конференция «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний». «Сосновка», Новосибирская область, 8-10 сентября 2004; Третий Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития", 14-18 марта, 2005 г., Москва; Московская

международная конференция «Биотехнология и медицина», 14-17 марта, 2006 г., Москва.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 14 работ, из них 4 тезиса, 9 статей и один патент.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, включающих обзор литературы, материалов и методов, результатов исследований и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающих 27 отечественных и 225 зарубежных источников и приложения. Материалы диссертации изложены на 160 страницах машинописного текста, включая 5 страниц приложений. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 25 рисунками. Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ НИИ биохимии СО РАМН.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Оценка зараженности клещей Ixodespersulcatus, населяющих рекреационную зону Новосибирского научного центра, спирохетами Borrelia burgdorferi s.l.

В работе использовали клещей Ixodes persulcatus Schulze, собранных в весенние периоды 2003, 2005, 2006 и 2008 гг. на территории Новосибирского научного центра (ННЦ). Для обнаружения и генотипирования геномных ДНК спирохет Borrelia burgdorferi s.l., выделенных непосредственно из клещей, использовали двух-этапную процедуру (Postic et al, 1994). На первом этапе определяли присутствие геномных ДНК боррелий в препаратах ДНК, выделенных из клещей, с помощью амплификации методом ПЦР межгенной области rrf-rrl (генов 5S и 23S рРНК) генома спирохет. ПЦР проводили в присутствии прямого (№ 126: 5'-TGCGAGTTCGCGGGAG-3') и обратного (№ 127: 5'-TCCTAGGCATTCACCATAGACTCTT-3') праймеров, причём для исключения ложноотрицательных результатов анализа, реакцию проводили в присутствие ДНК внутреннего контроля, в качестве которого служил ампликон фрагмента генома вируса гепатита В, размером 150 п.н. (Beklemishev et al., 2003). В качестве положительного контроля в ПЦР использовали геномную ДНК В.burgdorferi sensu stricto эталонного штамма В31. На втором этапе исследовали полиморфизм длин рестриктных фрагментов, полученных гидролизом ампликонов межгенной области rrf-rrl эндонуклеазами рестрикции MseI или Тги9\. Поскольку представителям каждого геновида геномной группы спирохет B.burgdorferi s.l. свойственен определённый набор отличающихся по размерам рестриктных фрагментов ампликона межгенной области rrf-rrl (Postic et al, 1996), то по результатам электрофоретического анализа полученных рестриктов можно судить о геновидовой принадлежности боррелий, содержащихся в исследуемом клеще.

На рис. 1 представлены результаты типичного анализа ПДРФ ампликонов межгенной области rrf-rrl, полученных на исследуемых образцах ДНК клещей.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14

п.н.

123 104

щ шшшщшяшшш

tmmm» «¡ЦШЬ«»"»)»

64 «W "'--üifc •*4'

57 М - . а

51 |и|р|| аа» ш» i» »i>i Mii Wf «

Рис. 1. Электрофореграмма рестриктных фрагментов ампликонов межгенной области, полученных в процессе генотипирования анализируемых образцов ДНК В.burgdorferi s.l. Электрофорез проводили в 12% ПААГ.

Дорожки: 1, 14 - маркеры молекулярных масс ДНК (pBR322, гидролизованная НаеIII); 2-13 -ампликоны межгенной области rif-rrl анализируемых образцов ДНК В. burgdorferi s.l., гидролизованные рестриктазой Miel.

На рис. 1 видно, что 7 исследуемых образцов (дорожки 2, 4, 7, 10-13) содержат геномную ДНК спирохет, относящихся к геновиду B.garinii (геномная группа 20047т); 1 образец (дорожка 3) - к геновиду B.japonica; 1 образец (дорожка 8) - к геновиду B.afzelii; 1 образец (дорожка 6) содержат смесь геномных ДНК спирохет B.garinii (геномные группы NT29 и 20047т); 1 исследуемый образец (дорожка 9) содержат смесь геномных ДНК спирохет B.japonica и B.garinii 20047т.

За 6-ти летний период мониторинга заражённости боррелиями иксодовых клещей, населяющих рекреационную зону ННЦ, было установлено, что в этой популяции клещей, циркулируют два патогенных для человека геновида спирохет В.burgdorferi s.l.: B.garinii и B.afzelii, и один непатогенный геновид -B.japonica. Результаты этих исследований представлены в таблице 1.

Доминирующим геновидом являются спирохеты B.garinii, включающие представителей двух геномных групп: NT29 и 20047 (с преобладанием подгруппы 20047т), и обнаруживаемые в более чем 75% инфицированных спирохетами клещей. Зараженность иксодовых клещей спирохетами Borrelia burgdorferi s.l., колебалась в зависимости от года наблюдений в пределах 20% -32%. Средняя годичная зараженность за весь наблюдаемый период составила 22,4±1,1%. С 2006 г. на территории Новосибирской области зафиксировано появление геновида B.japonica, распространённого в популяции клещей в Японии и на Дальнем Востоке РФ.

Таблица 1. Заражённость взрослых клещей I. persulcatus, отловленных в рекреационной зоне ННЦ в весенний период 2003 - 2008 г.г., различными геновидами спирохет В. burgdorferi s.l.

Год Кол-во клещей ПЦР-позитивные клещи, (%) Количество генотипированных ПЦР-позитивных образцов ДНК из клещей

общее кол-во В garinii NT29 B.garinii 20047т B.afzelii B.japonica mix

2003 210 31,7±6,0 37 10 14 3 - 10

2005 306 21,2±2,3 64 8 31 15 - 10

2006 590 26,1±1,8 154 13 97 20 6 24

2008 303 20,1 ±2,3 61 6 53 2 5 -

I2 1409 22,4+1,1 316 37 195 40 И 44

' Общая средняя ежегодная зараженность клещей за весь наблюдаемый период, mix - смесь геновидов B.afzelii и B.garinii.

Доля позитивных клещей определялась как р ± SD, по формулам: р = Р/п* 100% (1); SD = ^*(100-p)/n(2);

где Р - количество позитивных особей в конкретной выборке, п - величина выборки.

Изоляция и культивирование спирохет Borrelia burgdorferi s,l.

Изоляцию и выращивание боррелий проводили на среде BSK II, в двух вариантах: прямое культивирование из клещей и с использованием лабораторных мышей в качестве природного фильтра. При выращивании боррелий непосредственно из клещей I.persulcatus, в качестве посевного материала использовали гомогенат клещей. По 5 особей клещей гомогенизировали в среде BSK II, хитиновые оболочки осаждали центрифугированием, а надосадочную жидкость инокулировали в пробирки со средой. Пробы инкубировали 15 суток при 32°С, после чего культуры пересевали на свежую среду BSK II и выращивали еще 15 дней. Культивирование в общей сложности проводили в течение месяца. Во втором варианте, гомогенат клещей инъецировали животным внутрибрюшинно. Мышей после инъекций содержали 20 дней в виварии, затем кровь, сердце и мочевой пузырь извлекали и помещали в культуральную среду BSK II. Далее процедура была аналогична той, которая описана для культивирования боррелий из клещей. В результате этой работы нами было получено 37 изолятов боррелий, среди которых 24 изолята B.garinii; 3 изолята B.afzelii; и 10 образцов культур были представленны смесью изолятов B.garinii и B.afzelii. Полученные культуры использовали в качестве стабильного источника выделения ДНК спирохет и последующей амплификации методом ПЦР генов иммунодоминантных антигенов боррелий.

Выбор белков спирохет Borrelia burgdorferi s.l., перспективных для серодиагностики ИКБ

Известно, что спирохеты Borrelia burgdorferi s.l. характеризуются высокой антигенной изменчивостью. В связи с этим большую сложность представляет решение проблемы создания универсальных тестов для серодиагностики ИКБ. Принципиальное значение приобретает рациональный выбор антигенов боррелий и подбор их композиций для создания диагностических систем. На основе проведённого нами анализа литературных данных, наибольший интерес, с точки зрения создания тестов для серодиагностики ИКБ, представляют внешние поверхностные белки OspC и OspA, флагеллярные белки FlaA и FlaB и декоринсвязывающий белок DbpB. Белки OspC, FlaA и FlaB являются одними из первых антигенов индуцирующих иммунный ответ на ранней стадии инфекции ИКБ. Антигены OspA и DbpB индуцируют иммунный ответ на стадии диссеминированной инфекции и при хронизации болезни. Однако какие-либо сведения о первичной структуре генов этих белков для сибирских изолятов Borrelia burgdorferi s.l. в литературе отсутствовали. В связи с этим мы поставили перед собой задачу клонировать белок-кодирующие области этих генов, определить их первичные структуры, получить кодируемые ими рекомбинантные белки и исследовать их антигенные свойства.

Конструирование экспрессирующих векторов серии pRAC

Для удобства клонирования выбранных нами генов иммунодоминантых белков боррелий и обеспечения эффективной экспрессии этих генов в клетках E.coli были сконструированы экспрессирующие векторы серии pRAC. Новые конструкции векторов были созданы на основе вектора pREB-SAT, обеспечивающего экспрессию гена стафилококкового альфа-токсина (SAT) в E.coli (Камынина и Беклемишев, 1997; Беклемишев и др., 2008). Экспрессия гена SAT осуществлялась под контролем регуляторной области гена гесА Proteus mirabilis (рис. 2). Вектор pREB имеет ряд недостатков. В частности, терминатор транскрипции ТО в векторе pREB расположен на расстоянии 565 п.н. правее терминатора трансляции (стоп-кодона) вследствие чего существенно увеличивается длина транскрипта, синтезируемого на клонированном в составе вектора pREB целевом гене. Кроме того, сайт связывания рибосом (SD) расположен в векторе не на оптимальном расстоянии от инициирующего кодона ATG. Мы попытались усовершенствовать эту конструкцию, чтобы увеличить эффективность экспрессии клонируемых в её составе целевых генов. Для того, что бы отслеживать изменения в уровне экспрессии целевого гена, в составе различных конструкций векторов, вместо гена стафилококкового а-токсина был встроен ген зеленого флюоресцирующего белка GFP. Это позволило определять с помощью флюориметра относительное количество синтезируемого белка GFP непосредственно в культуре клеток. Затем мы выполнили ряд последовательных процедур по реконструкции вектора pREB2: 1) участок вектора pREB2, расположенный между сайтом рестрикции BamHI и терминатором транскрипции ТО, включающий ген дигидрофолатредуктазы,

был удалён, таким образом стоп кодон трансляции был помещён вблизи терминатора транскрипции ТО; 2) заменили участок плазмиды, включающий сайт SD и последовательность до инициирующего кодона ATG, регуляторного района гена recA Proteus mirabilis на соответствующий район сильного синтетического промотора Ptaq; 3) слева от сайта SD промотора Ptaq был встроен энхансер трансляции гена 10 бактериофага Т7 с помощью пары комплементарных синтетических олигонуклеотидов. Структуры исходной регуляторной области гена recA Proteus mirabilis и модифицированных конструкций показаны на рис. 3. Новый вектор получил рабочее название pRAC (рис.2).

Signal seq.

pBR322 region

Or! pMB

Art II (3345)

Sap 1(2407)

Рис. 2. Генетические карты рекомбинантных плазмид pREB-SAT и pRAC. PrecA - регуляторная область гена recA Proteus mirabilis; PrecA-mod - модифицированная регуляторная область гена recA Proteus mirabilis; RBS - рибосомосвязывающий сайт (последовательность Шайна-Дальгарно); Signal seq. - фрагмент гена hla S.aureus, кодирующий сигнальный пептид стафилококкового альфа-токсина (CAT); hla - область гена hla S. aureus, кодирующая полипептид-предшественник альфа-токсина; 6His - участок ДНК, кодирующий 6-ти гистидиновую последовательность; DHFR - ген дигидрофолатредуктазы; TO-region - область терминатора транскрипции гена tO бактериофага X; Orí pMBl - ориджин репликации плазмиды pMBl; pBR322 region - участок ДНК плазмиды pBR322; AmpR - ген bla, кодирующий бета-лактамазу - фермент обусловливающий устойчивость клеток E.coli к ампициллину.

SD Start

( 1 ) - AATGGTAGTGAC С CATCTTTATGCTTCACTGCC CAGAGGGAGATAACATG

(2)-****************************************** *ATT*TATG

(3 )---------------------ATT ААСТТТАТ ACAGGAAAC А * *ATT*TATG

Enhancer SD Start

Рис. 3. Сравнение первичных структур исходной и модифицированных регуляторных областей в районе сайта связывания рибосом разработанных плазмидных конструкций,

содержащих промотор гена recA Proteus mirabilis Обозначения: (1) - регуляторная область гена recA Proteus mirabilis-, (2-3) -модифицированная регуляторная область гена recA Proteus mirabilis, в составе экспрессирующих векторов pREB (1), pREB2/pREB3 (2) npRAC (3).

После проведённых реконструкций мы сравнили уровень синтеза белка GFP в клетках E.coli, содержащих различные варианты сконструированных плазмид. Клетки E.coli шт. BL21(DE3), содержащие плазмиду pRAC, примерно в три раза больше синтезировали белка GFP по сравнению с клетками, содержащими исходную плазмиду pREB2, со встроенным геном gfp (рис. 4А).

80 ИНН 130 мин 220 кия 300 ммк

Время (мвку-ты)

Г D PREB2 a PREB3 a pRAC j

200 400 600 800 1000 Время (секунды)

Рис. 4А. Гистограмма величин флюоресценции белка GFP в индуцированных налидиксовой кислотой клетках E.coli шт. B121(DE3), содержащих различные плазмидные конструкции pREB2, pREB3 и pRAC.

Рис. 4Б. Влияние различных экспозиций УФ-облучения на длине волны 302 нм на индукцию экспрессии гена бежа GFP в клетках E.coli шт. B121(DE3), содержащих рекомбинантную плазмиду pRAC.

Вектор pRAC был использован в лаборатории для клонирования и экспрессии гена ксилозо(глюкозо)изомеразы Escherichia coli К12 в клетках E.coli шт. BL21(DE3). Выход рекомбинантной ксилозоизомеразы составлял стабильно более 40% от общего белка клетки. Всё выше изложенное позволяет сделать вывод, что сконструированный нами вектор pRAC может быть использован для высокоэффективной экспрессии клонированных в его составе генов.

Экспрессия целевых генов, клонированных в составе векторов серии pREB и pRAC, осуществляется под контролем регуляторной области гена гесА Proteus mirabilis и индуцируется, в нашем случае, известным мутагеном -налидиксовой кислотой. Мы предположили, что штамм E.coli, содержащий вектор pRAC, может отвечать индукцией экспрессии гена белка GFP в ответ на воздействие каких-либо мутагенов физической или химической природы. Действительно, в серии экспериментов было показано, что при воздействии на клетки этого штамма ультрафиолетового излучения (рис. 4Б) и различных концентраций перекиси водорода, митомицина С, формальдегида и налидиксовой кислоты (рисунки не представлены), в клетках наблюдается дозозависимая индукция синтеза белка GFP. Полученные результаты позволили сделать вывод, что рекомбинантный штамм E.coli BL21(DE3), содержащий плазмиду pRAC может быть использован в качестве цельноклеточного биосенсора для обнаружения мутагенов в исследуемых образцах.

На завершающем этапе конструирования вектора, ген gfp был заменен на полилинкер - фрагмент ДНК Содержащий сайты узнавания эндонуклеазами

рестрикции ЕсоШ, Крп\, ДиНП, BstEU, HindllI и Xhol. Такая структура полилинкера была получена в целях удобства клонирования выбранных нами генов боррелий. За полилинкером следовала нуклеотидная последовательность, кодирующая 8-ми гистидиновый аминокислотный фрагмент в С-концевой области рекомбинантных белков. Это позволяло очищать белки с помощью аффинной хроматографии на металло-хелатных сорбентах. Этот вариант экспрессирующего вектора получил название pRAC3.

Клонирование генов ospA, ospC изолята B.garinii и гена ospC изолята B.afzelii в составе вектора рКАСЗ

Кодирующие области генов белков OspC, OspA, FlaA, FlaB и DbpB были получены с помощью ПЦР. Для амплификации генов использовали праймеры, подобранные исходя из сравнения нуклеотидных последовательностей соответствующих генов, опубликованных в базе данных GenBank. В каждом праймере на 5'-конце был предусмотрен сайт узнавания определённой эндонуклеазой рестрикции, имеющийся в полилинкере вектора pRAC3. По этим сайтам осуществляли гидролиз генов и их встраивание в вектор. В качестве матрицы для амплификации всех 5-ти генов использовали ДНК изолята B.garinii группы 20047 (NSK-10-06), поскольку этот геновид являлся самым встречаемым на территории Новосибирской области. Ген ospC амплифицировали также на ДНК изолята B.afzelii (NSK-05-06).

В качестве первых генов, проклонированных нами в составе вектора pRAC3 в клетках E.coli шт. Rosetta 2, были гены внешних поверхностных белков OspA и OspC. Наличие вставки генов в составе вектора подтверждали секвенированием. Клоны, в которых рамка трансляции белка не нарушалась, исследовали на индуцируемую продукцию целевого рекомбинантного антигена методом электрофореза лизатов клеток в ПААГ. Ни в одном из проанализированных клонов не было обнаружено видимых количеств белков OspA и OspC. По-видимому, очень низкий уровень синтеза этих полноразмерных антигенов обусловлен их высокой токсичностью для клеток E.coli, которую отмечали и другие исследователи (Dunn et al., 1990). Определённую ингибирующую роль могли сыграть и вторичные структуры синтезированных мРНК этих белков. В связи с этим в дальнейшей работе мы клонировали гены ospC, ospA, flak и flaB, с делегированными последовательностями, кодирующими сигналы секреции соответствующих белков. Кроме того, для повышения экспрессии генов было решено использовать вектор рЕТ36Ь(+), содержащий один из самых сильных промоторов (промотор гена 10 бактериофага Т7).

Клонирование кодирующих областей генов ospC, ospA, flaA, flaB и dbpB в составе вектора pETm

Чтобы вектор рЕТ36Ь<+) был удобен для клонирования выше названных генов, мы модифицировали его, путем встраивания под регуляторную область промотора полилинкера из вектора pRAC3. Модифицированный вектор был назван pETm. Для амплификации фрагментов генов ospC, о.урА, /1аА и flaB,

кодирующих соответствующие белки, лишённые сигналов секреции были подобраны новые праймеры.

В результате клонирования фрагментов генов ospC, ospA, flaA, flaB и гена dbpB в клетках E.coli в составе модифицированного вектора рЕТт, и последующей индукции экспрессии генов, мы наблюдали на электрофореграммах четкие мажерные полосы, соответстующие рекомбинантным белкам OspA, OspC B.garinii (OspC-Bg), OspC B.afzelii (OspC-Ba), FlaA, FlaB и DbpB (рис. 5).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Рис. 5. Электрофореграмма лизатов клеток клонов E.coli шт. Rosetta 2, содержащих рекомбинантные плазмиды рЕТт со встроенными фрагментами генов ospA, ospC-Bg, ospC-Ва, dbpB, flaA и flaB.

Дорожки; 1, 3, 5, 7, 10 и 12 - лизаты неиндуцированных ИПТГ клеток E.coli, продуцирующих белки OspA (1), OspC-Bg (3), OspC-Ba (5), DbpB (7), FlaA (10) и FlaB (12); дорожки: 2, 4, 6, 8, 11 и 13 лизаты индуцированных ИПТГ клеток E.coli, продуцирующих белки OspA (2), OspC-Bg (4), OspC-Ba (6), DbpB (8), FlaA (11) и FlaB (13); дорожка 9 - маркерные белки массой 65, 45 и 14,5 кДа.

Получение и очистка рекомбинантных белков боррелий.

В качестве штамма-продуцента рекомбинантных антигенов боррелий был использован штамм E.coli Rosetta2, содержащий плазмиду, обеспечивающую экспрессию генов т-РНК специфичных для редко встречаемых в E.coli кодонов. Полученные штаммы-продуценты обеспечивали высокий уровень синтеза рекомбинантных белков, который составлял от общего белка клетки 13% для OspA, 28% для OspC-Bg, 20% для OspC-Ba, 29% для DbpB, 30% для FlaA и 41% для FlaB. Рекомбинантные белки выделяли с помощью колоночной аффинной хроматографии на никель-хелатном сорбенте в денатурирующих или нативных условиях. В среднем выход очищенных белков составлял: 30 - 65 мг/л культуры клеток-продуцентов. Чистоту рекомбинантных белков определяли

методом электрофореза в ПААГ (рис. 6). Как видно на рисунке степень очистки белков достигала не менее 90%.

Рис. 6. Электрофореграмма препаратов очищенных рекомбинантных белков. Белки нанесены на дорожки в количестве ~20 мкг. Дорожки: (1 - 6) - препараты очищенных рекомбинантных белков ОэрА (1), ОврС-Ва (2), ОврС^ (3), Р1аА (4), Р1аВ (5) и ОЬрВ (6); 7 -маркерные белки (65,45 и 14,5 кДа).

Изучение антигенных свойств рекомбинантных белков боррелий

Антигенные свойства очищенных рекомбинантных белков боррелий исследовали методом твердофазного ИФА на панели сывороток больных с достоверным диагнозом ИКБ с мигрирующей эритемой (стадия локализованной инфекции) и более поздней стадией - стадией диссеминированной инфекции. Результаты исследования представлены в таблице 2.

В экспериментах по выявлению методом ИФА специфических антител класса ^М и наибольшей чувствительностью обладали рекомбинантные белки OspC-Bg и Р1аВ в обеих стадиях заболевания, локализованной и диссеминированной. Наименьшей чувствительностью обладали белки ОврА и ОЬрВ.

Рекомбинантные белки Р1аА, Р1аВ, OspC-Bg и ОэрС-Ва примерно в равной степени выявляли антитела в сыворотках больных с локализованной и диссеменированной стадиями заболевания. Существенные отличия были обнаружены только в случае использования рекомбинантных белков ОБрА и ОЬрВ. При тестировании сывороток больных ИКБ с локализованной стадией инфекции на наличие специфических антител класса ^М оба этих антигена показали низкую чувствительность 21,7% и 26,1%, соответственно. При выявлении в сыворотках больных ИКБ с диссеминированной стадией инфекции антител класса специфичных к белкам ОврА и ОЬрВ чувствительность к этими антигенами увеличивалась примерно в два раза - до 42%. Основываясь на этих данных можно утверждать, что белки ОБрА и ОЬрВ более пригодны для

выявления специфичных им в сыворотках крови больных ИКБ с диссеминированной стадией инфекции.

Таблица 2. Выявление методом ИФЛ специфических антител класса ^М и 1йС к рекомбинантным белкам В.Ьиг^Лог}еп $.1. в сыворотках больных ИКБ

Антигены Вид Количество сывороток с положительными результатами (% чувствительности)

ДО

Стадия I (с МЭ; п=46) (а) Стадия II (без МЭ; п=28) (б) Стадия I (с МЭ; п=30) (а) Стадия II (без МЭ; п=24) (б)

ОзрА В.^аппи 10(21,7) 3 (10,7) 10 (33,3) 10(41,6)

БЪрВ В.%аппИ 12 (26,1) 9(32,1) 10(33,3) 10(41,6)

Р1аА В.цаппи 18(39,1) 12 (42,8) 12 (40,0) 11 (45,8)

Р1аВ В.^аппН 25 (54,3) 16(57,1) 19 (63,3) 16(66,6)

ОэрС-Ва В.сфеШ 23 (50,0) 11 (39,3) 15 (50,0) 12 (50,0)

ОэрС-Вв В^аппи 28 (60,9) 20 (71,4) 21 (70,0) 18(75,0)

(а) - группа больных ИКБ с мигрирующей эритемой (локализованная инфекция), сыворотка взята в период 2-4 недели с начала заболевания; (б) - группа больных ИКБ без мигрирующей эритемы (диссеминированная инфекция), сыворотка взята в период 4-8 недели с начала заболевания; п - количество исследуемых образцов сывороток.

В ряде работ содержатся сведения о том что, некоторые белки боррелий взаимодействуют с антителами сывороток пациентов больных сифилисом и ревматоидным артритом. Поэтому специфичность каждого антигена мы определяли тестированием 30 сывороток здоровых доноров, 20 - больных сифилисом и 12 - ревматоидным артритом. Результаты тестирования представлены в таблице 3.

Таблица 3. Выявление методом ИФА антител класса ^М и 1йС к рекомбинантным белкам В.Ьи^йог/еп вЛ. в сыворотках от больных сифилисом, ревматоидным артритом и здоровых доноров

Сыворотки больных Сыворотки больных Сыворотки

Антигены сифилисом (11=20) ревматоидным артритом (п=12) здоровых доноров (п=30)

ДО 1ЕМ 180 ^М/ДО

ОзрА 0 0 0 0 0

ОЬрВ 0 0 0 0 0

Р1аА 2 (10,0) 3(15,0) 1 (8,3) 1 (8,3) 0

Р1аВ 3 (15,0) 3 (15,0) 2 (16,7) 2(16,7) 0

ОврС-Ва 1 (5,0) 1 (5,0) 1 (8,3) 0 0

ОэрС-Вд 1 (5,0) 1 (5,0) 1 (8,3) 1 (8,3) 0

п - количество исследуемых образцов сывороток.

По результатам тестирования этих сывороток на наличие антител класса ^М и к исследуемым рекомбинантным антигенам отрицательные

результаты были получены только с белками ОБрА и БЬрВ. В случае использования флагеллярных белков Р1аА и Р1аВ ложноположительные результаты были получены примерно в 17% проанализированных сывороток от больных сифилисом и ревматоидным артритом; в случае применения антигенов ОэрС-Ва и ОэрС-!^ - в 8%. Следует отметить, что со всеми изучаемыми белками не было получено ни одного ложноположительного результата при тестировании сывороток здоровых доноров.

Проанализировав взаимодействия сывороток с каждым рекомбинантным белком (данные не представлены) мы обнаружили, что одни антигены выявляют сыворотки, которые не выявляются другими антигенами. Если предусмотреть одновременное использование пары антигенов для обнаружения антител, например методом Вестерн-блотта или иммунохроматографическим методом, то можно ожидать, что чувствительность такого анализа существенно увеличится. В нашем случае мы ожидаем повышения чувствительности выявления специфических антител для пар антигенов ОБрАЯЭЬрВ, Р1аА/Р1аВ и OspC-Ba/OspC-Bg. Наибольшей чувствительностью, по результатам ИФА, полученным на исследуемой панели сывороток с индивидуальными антигенами, должна обладать пара антигенов OspC-Ba/OspC-Bg (табл. 4). Таким образом, используя композицию полученных рекомбинантных антигенов в Вестерн-блот анализе или иммунохроматографическом тесте можно добиться чувствительности обнаружения антител к антигенам спирохет В.Ьи^с1офп б.1. в сыворотках больных ИКБ, приближающейся к 100%.

Таблица 4. Ожидаемое количество (%) выявляемых сывороток больных ИКБ в ИФА с использованием пар рекомбинантных антигенов боррелий

Выявляемый класс антител на различных стадиях ИКБ

Пара антигенов Локализованная стадия Диссеменированная стадия

1ёМ, (п=46) № (п=30) 1ёМ, (п=28) (п=24)

ОврАЛЗЬрВ 20 (43,5%) 18(60,0%) 12 (42,8%) 20 (83,3%)

ИаА/ИаВ 28 (60,9%) 22 (73,3%) 21 (75,0%) 24 (100%)

ОврС-В^С^рС-Ва 39 (84,8%) 29 (96,7%) 26 (92,8%) 24(100%)

п - количество исследованных образцов сывороток с индивидуальными антигенами.

Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей полученных рекомбинантных белков боррелий

Аминокислотную последовательность каждого из полученных в настоящей работе рекомбинантных белков фЬрВ, ОэрА, Р1аА, Р1аВ, ОэрС В.цаппи 20047т и ОэрС В.а/геШ) сравнивали с последовательностями аналогичных белков боррелий, представленными в электронной базе данных СепВапк (декабрь 2008 г.).

Самая высокая степень гомологии была установлена для флагеллярных белков FlaA и FlaB. Оба белка показали максимальную 100%-ю гомологию с соответствующими белками-аналогами изолятов B.burgdorferi s.l. выделенных на территории Европы. В отличие от флагеллярных белков, для белка DbpB высокая гомология 92-100% была показана с аналогичными белками только изолятов геновида B.garinii, выделенных на территории Европы. Вариабельность белка OspA была значительно больше. Даже в рамках изолятов одного геновида B.garinii, полученных на территории Европы, гомология сравниваемых белков OspA варьировала от 75% до 100%.

Самая высокая гетерогенность была свойственна белкам OspC. При сравнении первичных структур полученных нами рекомбинантных антигенов OspC с опубликованными аминокислотными последовательностями аналогичных белков, наибольшая гомология была установлена с белками OspC изолятов боррелий, выделенных на территории Европы (97-67%). Следует отметить, что рекомбинантные антигены OspC-Bg и OspC-Ba изолятов B.garinii и B.afzelii циркулирующих на одной территории Новосибирской области имели гомологию по отношению друг к другу, составляющую всего 67%. Вполне понятно, что такие отличия в первичных структурах этих антигенов обусловливают их различную иммунореактивность с сыворотками больных ИКБ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе была определена зараженность и геновидовой состав спирохет Borrelia burgdorferi s.l. в клещах Ixodes persulcatus Schulze, обитающих на территории Новосибирского научного центра и отловленных в весенние периоды 2003, 2005, 2006 и 2008 г.г. Впервые на территории Новосибирской области в клещах Ixodes persulcatus были обнаружены спирохеты геновида Borrelia japónica (2006 и 2008 г.г.). В работе были получены культуры спирохет B.garinii и B.afzelii, циркулирующих в популяции иксодовых клещей, населяющих рекреационную зону ННЦ. Были проклонированы в клетках E.coli в составе экспрессирующих векторов pRAC3 и рЕТш кодирующие области генов внешних поверхностных липопротеинов (OspA и OspC), флагеллярных белков (FlaA и FlaB) и декоринсвязывающего белка В (DbpB) изолята B.garinii группы 20047Т и белка OspC изолята B.afzelii.

В работе были получены высоко очищенные рекомбинантные белки боррелий OspC-Bg, OspC-Ba, OspA, FlaA, FlaB и DbpB и исследованы их антигенные свойства методом ИФА на сыворотках больных ИКБ. По результатам ИФА можно сделать вывод о пригодности полученных в данной работе рекомбинантных антигенов OspC, FlaA и FlaB B.garinii и OspC B.afzelii для серодиагностики инфекций ранней и диссеминированной стадий. Рекомбинантные белки OspA и DbpB могут быть использованы для серодиагностики диссеминированной и хронической стадий ИКБ. Результаты ИФА свидетельствуют о необходимости использования композиций антигенов для увеличения чувствительности методов серодиагностики ИКБ. На примере рекомбинантных белков OspC изолятов B.garinii и B.afzelii показана

необходимость использования для серодиагностики гомологичных вариабельных антигенов, всех патогенных изолятов боррелий циркулирующих на территории Новосибирской области.

По данным сравнения аминокислотных последовательностей, полученных в настоящей работе рекомбинантных белков, с первичными структурами аналогичных белков боррелий, представленных в базе данных GenBank, изолят B.garinii 20047х (Nsk-10-06) филогенетически близок изолятам этого геновида, выделенным на территории Европы.

ВЫВОДЫ

1. Зараженность клещей Ixodes persulcatus Schulze, отловленных в рекреационной зоне ННЦ в весенние периоды с 2003 по 2008 г.г., спирохетами Borrelia burgdorferi s.l., колебалась в зависимости от года наблюдений в пределах 20% - 32%.

2. В популяции исследованных клещей Новосибирской области выявлены только три геновида боррелий - Borrelia garinii (группы NT29 и 20047т), Borrelia afzelii и Borrelia japónica с явным преобладанием первого (~75%).

3. Сконструированные плазмидные векторы pRAC3 и рЕТт, обеспечивают эффективную экспрессию клонируемых в их составе генов в клетках E.coli шт. BL21(DE3) и шт. Rosetta2 и последующую аффинную очистку рекомбинантных белков.

4. Штамм E.coli, содержащий вектор pRAC, может применяться в качестве цельноклеточного биосенсора для обнаружения мутагенов химичечской и физической природы в исследуемых образцах.

5. Штаммы E.coli BL21(DE3) и Rosetta2, несущие экспрессирующий вектор рЕТт со встроенными в него кодирующими областями генов flaA, flaB, ospC, ospA и dbpB B.garinii 20047т и ospC B.afzelii обеспечивают эффективный синтез соответствующих этим генам рекомбинантных белков.

6. Полученные в настоящей работе рекомбинантные антигены FlaA, FlaB, OspC, OspA и DbpB могут быть использованы для конструирования тест-систем серодиагностики локализованной и диссеменированной стадий ИКБ.

7. Западносибирский изолят B.garinii 20047х (Nsk-10-06) филогенетически близок изолятам этого геновида, выделенным на территории Европы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Рябченко A.B.. Ивлева И.Н., Беклемишев А.Б. Комплексная оценка зараженности клещей Ixodes persulcatus, распространённых в рекреационной зоне новосибирского научного центра, спирохетами Borrelia burgdorferi s.l. II Журнал инфекционной патологии. - 2004. - Т. 11. - № 3-4. - С. 107-110.

2. Рябченко A.B.. Терехова Д.В., Ивлева И.В., Бирюков А.Ю., Беклемишев А.Б. Выделение и типирование западно-сибирских изолятов боррелий, возбудителей иксодового клещевого боррелиоза // Тезисы докладов Международного мультидисциплинарного конгресса «Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека». - 2004. - Судак, Украина. - С. 141142.

3. Рябченко A.B. Получение западно-сибирских культур Borrelia burgdorferi s.l. II Аспирантский сборник НГПУ 2004. - Новосибирск: Изд. НГПУ. - 2004. - Ч. 2.-С. 160-168.

4. Рябченко A.B.. Караваев B.C., Ивлева И.Н., Терехова Д.В., Беклемишев А.Б. Оценка пригодности ряда антигенов сибирских изолятов Borrelia burgdorferi sensu lato для диагностики иксодового клещевого боррелиоза // Тезисы докладов Международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний». - 2004. -Новосибирск, Россия. - С. 272.

5. Рябченко A.B.. Беклемишев А.Б. Оценка зараженности клещей Ixodes persulcatus, отловленных весной 2005 г. в рекреационной зоне новосибирского научного центра, спирохетами Borrelia burgdorferi s.l. II Журнал инфекционной патологии. - 2005. - Т. 12. -№ 3-4. - С. 109-110.

6. Рябченко A.B.. Беклемишев А.Б., Ивлева И.Н. Конструирование вектора для эффективной экспрессии генов в клетках E.coli. И Материалы третьего Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития". - М: ЗАО "Экспо-биохим-технология", РХТУ им. Д.И. Менделеева. - 2005. - Ч. 1. - С. 99-100.

7. Рябченко A.B.. Караваев B.C., Беклемишев А.Б. Получение рекомбинантных форм некоторых иммунодоминантных белков западносибирских изолятов возбудителя Лайм-боррелиоза и оценка их диагностической значимости // Материалы московской международной конференции «Биотехнология и медицина». - М.: ЗАО «Экспо-биохим-технология», РХТУ им. Д.И. Менделеева, - 2006.-С. 55.

8. Лавриненко И.А., Лавриненко В.А., Рябченко A.B.. Беклемишев А.Б. Создание биосенсорной тест-системы для детекции повреждений ДНК путем использования репортерного белка GFP //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - Т. 141. -№ 1. - С. 38-40.

9. Рябченко A.B.. Беклемишев А.Б. Мониторинг заражённости клещей рекреационной зоны г. Новосибирска возбудителями Лайм-боррелиоза // Вестник НГУ. - 2007. - Т. 5. - С. 106-110.

10. Лавриненко И. А., Рябченко A.B.. Беклемишев А.Б. Создание цельноклеточной биосенсорной тест-системы для обнаружения генотоксических воздействий на клетку // Вестник НГУ. - 2007. - Т. 5. - С. 9599.

11. Рябченко A.B., Лавриненко И.А., Беклемишев А.Б. Рекомбинантная плазмидная ДНК для обнаружения агентов, повреждающих генетический аппарат клетки (варианты) II Патент РФ №2311459 от 27.11.2007.

12. Караваев B.C., Иванов И.Д., Рябченко A.B. Оценка иммунореактивности рекомбинантных белков OspC и фрагмента FlaB (f-FlaB) Borrelia garinii NT29 в экспериментах с сыворотками больных Лайм-боррелиозом // Бюллетень СО РАМН. - 2007. - № 5. - С. 53-57.

13. Рябченко A.B., Мамаев А.Л. Инфицированность клещей Ixodes persulcatus, отловленных весной 2006г. в лесопарковой зоне новосибирского академгородка // Бюллетень СО РАМН. - 2007. - № 5. - С. 58-61.

14. Караваев B.C., Иванов И.Д., Рябченко A.B.. Беклемишев А.Б. Получение рекомбинантных белков OspC и фрагмента FlaB (f-FlaB) западно-сибирских изолятов Borrelia garinii NT29 и исследование их свойств // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. - 2008. - № 1. - С. 18-22.

Подписано к печати 21 мая 2009 г. Тираж 100 экз. Заказ № 859. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рябченко, Александр Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Спирохеты Borrelia burgdorferi sensu lato как возбудитель иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ).

1.1.1. История открытия возбудителя ИКБ.

1.1.2. Эпидемиология иксодового клещевого боррелиоза.

1.1.2.1. Географическое распространение возбудителя ИКБ.

1.1.2.2. Пути передачи Borrelia burgdorferi sensu lato.

1.1.3 Патогенез и клиника ИКБ.

1.1.4. Механизмы уклонения спирохет Borrelia burgdorferi sensu lato от иммунной системы хозяина.

1.2. Морфологические и генетические особенности спирохет комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato.

1.3. Антигены спирохет комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato.

1.3.1. Семейство внешних поверхностных протеинов (Osp).

1.3.2. Декорин-связываюхцие белки (Dbp).

1.3.3. Флагеллярные белки (Fla).

1.3.4. Белок Р83.

1.3.5. Белок Р66.

1.3.6. Семейство основных мембранных белков (Вмр).

1.3.7. Белок РЗ5.

1.4. Диагностика ИКБ.

1.4.1. Обнаружение спирохет Borrelia burgdorferi sensu lato в биологических образцах методом культивирования на питательных средах.

1.4.2. ДНК-диагностика ИКБ.

1.4.3. Серодиагностика ИКБ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Реактивы, реагенты и прочие материалы.

2.2. Методы работы с ДНК.

2.2.1. Получение суммарного препарата ДНК из клещей.

2.2.2. Получение суммарного препарата ДНК из культур боррелий.

2.2.3. Выделение плазмидной ДНК из E.coli.

2.2.4. Быстрое выделение плазмидной ДНК из колоний E.coli.

2.2.5. Электрофорез ДНК в агарозных и полиакриламидных гелях.

2.2.6. Выделение ДНК из агарозного геля методом сорбции на мелкодисперсном оксиде кремния «Силика».

2.2.7. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции.

2.2.8. Лигирование фрагментов ДНК с использованием ДНК-лигазы бактериофага Т4.

2.2.9. Амплификация ДНК в системе ПЦР.

2.3. Методы работы с бактериями.

2.3.1. Используемые среды и общие приемы.

2.3.2. Изоляция спирохет В. burgdorferi s.l. из клещей.

2.3.3. Изоляция спирохет В.burgdorferi s.l. с помощью заражения мышей.

2.3.4. Обнаружение ДНК боррелий в культуре и генотипирование изолятов с помощью ПЦР.

2.3.5. Обнаружение ДНК боррелий в клещах и генотипирование изолятов с помощью ПЦР.

2.3.6. Трансформация компетентных клеток E.coli.

2.4. Индукция экспрессии клонированных генов боррелий в клетках E.coli.

2.4.1. Индукция экспрессии генов, клонированных в составе вектора pREB-SAT, либо в его производных.

2.5. Анализ белков методом электрофореза в ПААГ.

2.6. Очистка рекомбинантных белков аффинной хроматографией на никель-хелатном сорбенте.

2.7. Исследование антигенных свойств рекомбинантных белков боррелий.

2.7.1. Используемые сыворотки.

2.7.2. Твёрдофазный иммуноферментный анализ.

2.8. Определение первичной структуры фрагментов ДНК, сравнение аминокислотных последовательностей.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Получение изолятов Borrelia burgdorferi s.l. и определение их геновидовой принадлежности.

3.1.1. Культивирование спирохет Borrelia burgdorferi s.l., выделенных из клещей.

3.1.2. Культивирование спирохет Borrelia burgdorferi s.l. с помощью заражения лабораторных мышей.:.

3.2. Оценка зараженности клещей Ixodespersulcatus, населяющих рекреационную зону Новосибирского научного центра, спирохетами

В.burgdorferi s.l.

3.3. Конструирование векторов для экспрессии рекомбинантных белков клетках E.coli.

3.3.1. Клонирование гена gfp в E.coli в составе вектора pREB.

3.3.2. Конструирование плазмиды pREB3.

3.3.3. Конструирование плазмиды pRAC.

3.3.4. Конструирование вектора pRAC3.

3.4. Выбор генов спирохет Borrelia burgdorferi s.l. для клонирования в E.coli в составе экспрессирующих векторов.

3.5. Амплификация кодирующих областей генов ospC, ospA,flaA,flaQ и dbpB B.garinii 20047х и ospC B.afzelii, подготовка к клонированию.

3.6. Клонирование генов ospC и ospA в составе вектора pRAC3.

3.7. Модификация коммерческого вектора рЕТ36Ь(+).

3.8. Клонирование кодирующих областей геновflaA,flaB и dbpB в составе вектора рЕТш.

3.9. Переклонирование кодирующих областей генов ospA, ospC и flaA в составе вектора рЕТт.

3.10. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей полученных рекомбинантных белков FlaA, FlaB, DbpB, OspA, OspC

B.garinii группы 20047 и OspC B.afzelii.

3.10.1. Сравнительный анализ последовательностей антигена FlaA.

3.10.2. Сравнительный анализ последовательностей антигена FlaB.

3.10.3. Сравнительный анализ последовательностей антигена DbpB.

3.10.4. Сравнительный анализ последовательностей антигена OspA.

3.10.5. Сравнительный анализ последовательностей антигена OspC

B.afzelii (изолят NSK-05-06).

3.10.6 Сравнительный анализ последоваетльностей антигена OspC

В.garinii группа 20047т (изолят NSK-10-06).

3.11. Получение и очистка рекомбинантных белков.

3.12. Оценка иммунореактивности рекомбинантных белков в ИФА с сыворотками больных иксодовым клещевым боррелиозом.

3.12.1. Определение оптимальной концентрации антигена.

3.12.2. Анализ иммунореактивности рекомбинантных антигенов боррелий в ИФА с сыворотками больных ИКБ.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение рекомбинантных белков западносибирских изолятов Borrelia burgdorferi sensu lato и изучение их антигенных свойств"

Отличия в генетической структуре патогенных геновидов боррелий, обусловливают полиморфизм клинических проявлений и органных поражений человека. Основные симптомы ИКБ сходны во всем мире, но есть и региональные отличия. В первую очередь между болезнью, обнаруженной в Америке и вызываемой исключительно геновидом B.burgdorferi sensu stricto (s.s.) с характерными проявлениями артрита, и болезнью, обнаруженной в Европе. В Европе болезнь вызывается, прежде всего, геновидами B.garinii -возбудителем, характеризующимся нейротропностью и B.afzelii, поражающим часто только кожу с развитием акродерматитов. При отсутствии своевременного лечения, инфекции переходят в хроническую форму.

В виду разнообразия клинических проявлений заболевания, для подтверждения диагноза используют дополнительные лабораторные методы, среди которых широкое распространение получили методы, основанные на выявление антител к возбудителю. Основным методом, позволяющим быстро и относительно достоверно диагностировать ИКБ, является имунноферментный анализ, однако и он не дает 100% надежности результатов. Поэтому в Европе и

США диагностику иксодового клещевого боррелиоза (болезнь Лайма) осуществляют в 2 стадии: скрининговый ИФА с последующим подтверждающим иммуноблотом. Этот вариант представляется трудоемким и протяженным во времени, требует специально оборудованных лабораторий для постановки иммуноблотов и соответствующего персонала. Однако генетическое разнообразие В.burgdorferi s.l., обусловливающее характер течения болезни и различные клинические проявления ставит перед исследователями задачу распознавания конкретного геновида возбудителя. Зачастую, чтобы назначить адекватное лечение пациентам, также необходимо знать стадию болезни. Все это предполагает наличие богатого арсенала информативных методов диагностики заболевания.

Актуальность исследования

Используемые для серологической диагностики белки североамериканских и западноевропейских изолятов боррелий, такие как внешние поверхностные липопротеины, флагеллярные белки, основные мембранные белки, декорин-связывающие белки и некоторые другие хорошо изучены и описаны. Однако, практически отсутствует информация об аминокислотных последовательностях и иммунохимических свойствах антигенов спирохет комплекса В. burgdorferi s.l. распространенных на территории азиатской части России. Генетическое и антигенное разнообразие изолятов боррелий на меж- и внутривидовом уровнях, вследствие сравнительно высокой вариабельности антигенов, затрудняет разработку эффективных методов серодиагностики ИКБ. Большая протяженность территории России с запада на восток позволяет предполагать, значительное отличие антигенов в изолятах циркулирующих на этой территории. Можно предположить, что такие отличия аминокислотных последовательностей антигенов будут обусловливать и их иммунохимические свойства. Все эти причины сдерживают развитие работ по созданию высокоспецифичных и чувствительных методов диагностики иксодового клещевого боррелиоза, что, в свою очередь, остается важной задачей здравоохранения.

Цель работы — получение рекомбинантных иммунодоминантных белков западносибирских изолятов В. burgdorferi s.l. и сравнительное исследование их первичных структур и антигенных свойств.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Оценить зараженность клещей Ixodes persulcatus Shulze, населяющих рекреационную зону Новосибирского Научного Центра, различными геновидами спирохет B.burgdorferi s.l.

2. Получить культуры западносибирских изолятов В. burgdorferi s.l.

3. На основе анализа литературных данных выбрать в качестве объектов исследования белки спирохет B.burgdorferi s.l. наиболее перспективные для создания средств серодиагностики ИКБ.

4. Сконструировать экспрессирующие плазмидные векторы, пригодные для получения в клетках E.coli рекомбинантных белков боррелий и их последующей аффинной очистки.

Научная новизна работы

Исследована зараженность клещей Ixodes persulcatus Shulze, отловленных в рекреационной зоне ННЦ в 2003, 2005, 2006 и 2008 годах, различными геновидами спирохет В.burgdorferi s.l. Отмечены зависимые от года наблюдений колебания в количестве инфицированных спирохетами особей (20% - 32%). Установлено, что только два геновида боррелий циркулировали до 2006 г. в популяции иксодовых клещей на обследованной терриртории — B.garinii и B.afzelii, с доминирующим преобладанием первого (70%-80%), включающего представителей двух геномных групп: NT29 и 20047. В 2006 и 2008 г.г. в нескольких особях клещей обнаружены спирохеты геновида В. japonic а.

Определены нуклеотидные последовательности кодирующих областей генов flaA, flaB, ospC, ospA и dbpB западносибирского изолята B.garinii, группы 200471 и гена ospC западносибирского изолята B.afzelii; выведены соответствующие этим генам аминокислотные последовательности белков. Нуклеотидные последовательности выше названных генов депонированы в электронную международную базу данных генетической информации GenBank под инвентарными номерами: EU979631.1, EU979630.1, EU979629.1, EU979628.1, EU979626.1 иЕШ79627.1.

На основе сравнения аминокислотных последовательностей антигенов FlaA, FlaB, OspC, OspA и DbpB спирохет В. burgdorferi s.l., представленных в базе данных GeneBank (декабрь 2008 г.) и установленных в настоящей работе, т показано, что западносибирский изолят B.garinii группа 200471 (NSK-10-06, музейный штамм №10) филогенетически близок изолятам B.garinii, выделенным в Европе.

Практическая значимость работы

Создана музейная коллекция западносибирских изолятов B.burgdorferi s.l. распространенных на территории Новосибирской области и определена их геновидовая принадлежность. Коллекция включает 2 изолята B.afzelii, 14 изолятов В.garinii, 7 образцов смеси изолятов B.afzelii и В.garinii. Культуры полученных изолятов боррелий могут быть использованы в качестве посевного материала для культивирования и наработки биомассы спирохет и решения исследовательских и прикладных задач.

Сконструированные штаммы E.coli - продуценты рекомбинантных белков FlaA, OspC, OspA, DbpB и FlaB, специфичных для геновидов В.garinii (группа 200471), и OspC B.afzelii, могут быть использованы в качестве источников получения соответствующих антигенов боррелий. Разработана технология получения рекомбинантных белков В. burgdorferi s.l. с помощью экспрессии соответствующих им генов в составе сконструированного вектора pRAC3 и модифицированного в настоящей работе лектора рЕТ36Ь(+) (рЕТт) в клетках E.coli (шт. BL21(DE3) и Rosetta 2) и последующей аффинной очистки рекомбинантных полипептидов на металло-хелатных сорбентах.

Положения, выносимые на защиту

1. В рекреационной зоне Новосибирского научного центра в период с 2003 по 2008 г.г. в популяции клещей Ixodes persulcatus Schulze циркулировали только три геновида боррелий — B.garinii, B.afzelii и B.japonica с доминирующим преобладанием B.garinii (более 75%). Заражённость иксодовых клещей боррелиями составляла, в зависимости от года наблюдений, 20% - 32%. т

2. Западносибирский изолят B.garinii группы 200471 (NSK10-06, музейный штамм №10) филогенетически близок боррелиям, изолированным на территории Европы.

3. Сконструированные плазмидные векторы pRAC, pRAC3 и модифицированный в настоящей работе вектор рЕТ36Ь(+) (рЕТт) являются эффективными системами для экспрессии клонируемых в их составе генов в клетках E.coli.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации изложены в 13-ти публикациях и одном патентном документе, доложены на ученом совете НИИ биохимии СО РАМН.

1. Рябченко А.В., Ивлева И.Н., Беклемишев А.Б. Комплексная оценка зараженности клещей Ixodes persulcatus, распространённых в рекреационной зоне новосибирского научного центра, спирохетами Borrelia burgdorferi s.l. // Журнал инфекционной патологии. - 2004. - Т. 11. - № 3-4. - С. 107-110.

2. Рябченко А.В., Терехова Д.В., Ивлева И.В., Бирюков А.Ю., Беклемишев А.Б. Выделение и типирование западно-сибирских изолятов боррелий, возбудителей иксодового клещевого боррелиоза // Тезисы докладов Международного мультидисциплинарного конгресса «Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека». - 2004. — Судак, Украина. — С. 141-142.

3. Рябченко А.В. Получение западно-сибирских культур Borrelia burgdorferi s.l. // Аспирантский сборник НГПУ 2004. - Новосибирск: Изд. НГПУ. - 2004. - Ч. 2.-С. 160-168.

4. Рябченко А.В., Караваев B.C., Ивлева И.Н., Терехова Д.В., Беклемишев А.Б. Оценка пригодности ряда антигенов сибирских изолятов Borrelia burgdorferi sensu lato для диагностики иксодового клещевого боррелиоза // Тезисы докладов Международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний». — 2004. — Новосибирск, Россия. — С. 272.

5. Рябченко А.В., Беклемишев А.Б. Оценка зараженности клещей Ixodes persulcatus, отловленных весной 2005 г. в рекреационной зоне Новосибирского научного центра, спирохетами Borrelia burgdorferi s.l. // Журнал инфекционной патологии.-2005.-Т. 12.-№3-4.-С. 109-110.

6. Рябченко А.В., Беклемишев А.Б., Ивлева И.Н. Конструирование вектора для эффективной экспрессии генов в клетках E.coli II Материалы третьего Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития". - М: ЗАО "Экспо-биохим-технология", РХТУ им. Д.И. Менделеева.-2005.-Ч. 1.-С. 99-100.

7. Рябченко А.В., Караваев B.C., Беклемишев А.Б. Получение рекомбинантных форм некоторых иммунодоминантных белков западносибирских изолятов возбудителя Лайм-боррелиоза и оценка их диагностической значимости // Материалы московской международной конференции «Биотехнология и медицина». - М.: ЗАО «Экспо-биохим-технология», РХТУ им. Д.И. Менделеева. - 2006. - С. 55.

8. Лавриненко И.А., Лавриненко В.А., Рябченко А.В., Беклемишев А.Б. Создание биосенсорной тест-системы для детекции повреждений ДНК путем использования репортерного белка GFP // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - Т. 141.-№ 1.-С. 38-40.

9. Рябченко А.В., Беклемишев А.Б. Мониторинг заражённости клещей рекреационной зоны г. Новосибирска возбудителями Лайм-боррелиоза // Вестник НГУ. - 2007. - Т. 5. - С. 106-110.

10. Лавриненко И.А., Рябченко А.В., Беклемишев А.Б. Создание цельно-клеточной биосенсорной тест-системы для обнаружения генотоксических воздействий на клетку // Вестник НГУ. - 2007. - Т. 5. - С. 95-99.

11. Рябченко А.В., Лавриненко И.А., Беклемишев А.Б. Рекомбинантная плазмидная ДНК для обнаружения агентов, повреждающих генетический аппарат клетки (варианты) // Патент РФ № 2311459 от 27.11.2007.

12. Караваев B.C., Иванов И.Д., Рябченко А.В. Оценка иммунореактивности рекомбинантных белков OspC и фрагмента FlaB (f-FlaB) Borrelia garinii NT29 в экспериментах с сыворотками больных Лайм-боррелиозом // Бюллетень СО РАМН. - 2007. - № 5. - С. 53-57.

13. Рябченко А.В., Мамаев А.Л. Инфицированность клещей Ixodes persulcatus, отловленных весной 2006г. в лесопарковой зоне новосибирского академгородка // Бюллетень СО РАМН. - 2007. - № 5. - С. 58-61.

14. Караваев B.C., Иванов И.Д., Рябченко А.В., Беклемишев А.Б. Получение рекомбинантных белков OspC и фрагмента FlaB (f-FlaB) западно-сибирских изолятов Borrelia garinii NT29 и исследование их свойств // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. — 2008. — № 1. — С. 18-22.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Рябченко, Александр Владимирович

ВЫВОДЫ

2. В популяции исследованных клещей Новосибирской области выявлены только три геновида боррелий - Borrelia garinii (группы NT29 и 20047т), Borrelia afzelii и Borrelia japonica с явным преобладанием первого (—75%).

5. Штаммы E.coli BL21(DE3) и Rosetta2, несущие экспрессирующий вектор рЕТт со встроенными в него кодирующими областями генов flaA, flaB, ospC, ospA и dbpB B.garinii 200471 и ospC B.afzelii обеспечивают эффективный синтез соответствующих зтим генам рекомбинантных белков.

7. Западносибирский изолят B.garinii 200471 (Nsk-10-06) филогенетически близок изолятам этого геновида, выделенным на территории Европы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе была определена зараженность и геновидовой состав спирохет Borrelia burgdorferi s.l. в клещах Ixodes persulcatus Schulze, обитающих на территории Новосибирского научного центра и отловленных в весенние периоды 2003, 2005, 2006 и 2008 г.г. Впервые на территории Новосибирской области в клещах Ixodes persulcatus методом ПДРФ-анализа были обнаружены спирохеты геновида Borrelia japonica (2006 и 2008 г.г.). В работе были получены культуры спирохет B.garinii и B.afzelii, циркулирующих в популяции иксодовых клещей, населяющих рекреационную зону ННЦ. Были проклонированы в клетках E.coli в составе экспрессирующих векторов pRAC3 и рЕТт кодирующие области генов внешних поверхностных липопротеинов (OspA и OspC), флагеллярных белков (FlaA и FlaB) и декоринсвязывающего белка В (DbpB) изолята B.garinii группы 20047 и белка OspC изолята B.afzelii.

GenBank, изолят B.garinii 200471 (Nsk-10-06) филогенетически близок изолятам этого геновида, выделенным на территории Европы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рябченко, Александр Владимирович, Новосибирск

1. Алексеев А.Н., Арумова ЕА. Буренкова JI.A. Чунихин С.П. Об особенностях распространения возбудителя болезни Лайма и поведения зараженных им клещей poji^ Ixodes // Паразитология. 1993. - Т. 27. - С. 389-398.

2. Алексеев А.Н., Дубинина Е.В., Вашукова М.А., Волкова Л.И. Боррелии как вероятные антагонисты вируса клещевого энцефалита: паразитологический и клинический аспекты проблемы // Медиц. паразитол. 2001. - № 3. - С. 3-11.

3. Ананьева Л.П. Лаймская болезнь // В кн. Руководство по внутренним болезням. Ревматические болезни. М. Медицина. - 1997. - С. 344 - 352.

4. Ананьева Л.П. Лайм-боррелиоз или иксодовые клещевые боррелиозы. Часть 1. Этиология, клиника, диагностика // Инфекции и антимикробная терапия. -2002. Т. 4. - № 2. - С. 42-45.

5. Баранова Н.С., Лесняк О.М., Образцова Р.Г. Особенности поражения периферической нервной системы при Лайм-боррелиозе // Терапевт, архив. — 1997. -№ 5. -С. 20-25.

6. Беклемишев А.Б., Иванов И.Д. Рекомбинантная плазмидная ДНК, обеспечивающая синтез иммунодоминантного белка Borrelia garinii NT29, используемого для диагностики Лайм-боррелиоза (варианты). // Патент РФ на изобретение № 2260047 от 10.09.2005 г.

7. Беклемишев А.Б., Тлеулиева Р., Номоконова Н.Ю., Беляев Н.Н. Исследование гемолитических и антигенных свойств рекомбинантных форм альфа-токсина S.aureus//Бюллетень СО РАМН. 2008. - Т. 131.-№2.-С. 5-11.

8. Васильева И. С. и Наумов Р. Л. Паразитарная система болезни Лайма, состояние вопроса. Сообщение 1. Возбудители и переносчики // Acarina. —1996. -Т. 4. -№ 1-2.-С. 53-75.

9. Воробьева Н.Н. Клиника, лечение и профилактика иксодовых клещевых боррелиозов. Пермь: Урал-Пресс, 1998. - 136 с.

10. Ю.Горелова Н.Б., Коренберг Э.И., Ковалевский Ю.В. и др. Изоляция боррелий от клещей Ixodes trianguliceps (Ixodidae) и возможное значение этого вида в эпизоотологии иксодовых клещевых боррелиозов // Паразитология. — 1996. — Т.30. № 1.-С. 13-18.

11. П.Горелова Н.Б., Коренберг Э.И., Филлипова Н.А., Постик Д. Первая изоляция патогенных для человека боррелий от клещей Ixodes pavlovskyi Pom. // Докл. Академии наук. 2001. - Т. 378. - № 4. - С. 1-2.

12. Камынина Т.П., Беклемишев А.Б. Секреция рекомбинантного белка альфа-токсина S.aureus в культуральную среду из клеток E.coli // Тезисы докладов Второго съезда биохимического общества РАН, 19-23 мая, Россия, Пущино. — 1997.-С. 502.

13. Коренберг Э.И. Инфекции группы Лайм-боррелиоза иксодовые клещевые боррелиозы в России // Мед. паразитология и паразитар. болезни. - 1996. — № 3. -С. 14-18.

14. Коренберг Э.И., Горелова Н.Б., Постик Д., Котти Б.К. Новые для России виды боррелий — возможные возбудители иксодовых клещевых боррелиозов в России // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1999. —№ 2. -С. 3-5.

15. Коренберг Э.И., Крючечников В.Н., Деконенко Е.П. Серологические выявления болезни Лайма в СССР // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1986. -№ 6. - С. 111-113.

16. Коренберг Э.И., Нефедова В.В., Фадеева И.А., Горелова Н.Б. Основные итоги генотипирования боррелий в России // Журн. Бюллетень сибирской медицины. 2006. - Приложение 1. - С. 87-92.

17. Коренберг Э.И., Щербаков С.В., Крючечников В.Н. Материалы по распространению болезни Лайма в СССР // Мед. паразитология и паразитар. болезни. 1987. - № 2.-С. 71-73.

18. Кузнецов А. В., Сиденко В.П., Пономаренко А.Н. Концептуально-аналитические аспекты экологии природноочаговых болезней // Annals of Mechnicov Institute. 2008. -N. 2. - P. 5-11.

19. Куфко И.Т., Лесняк O.M., Мельников В.Г., Баранова Н.С., Рябицева О.Ф., Соколова З.И. Сравнительная клинико-лабораторная характеристика Лайм-артрита и реактивного артрита // Терапевт, архив. — 1997. — № 5. — С. 12-15.

20. Лавриненко И.А., Лавриненко В.А., Рябчзнко А.В., Беклемишев А.Б. Создание биосенсорной тест-системы для детекции повреждений ДНК путёмиспользования репортёрного белка GFP // Бюл. эксп. биол. мед. 2006. - Т. 141. -№ 1.-С. 33-35.

21. Масузава Т., Наумов Р.Л., Кудекен М., Харитоненков И.Г. Обнаружение Borrelia burgdorferi sensu stricto в Московской области, Россия. // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. — 2001. — № 2. — С. 52.

22. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. /7 Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир. 1984. - 480с.

23. Офицеров В.И. Лайм-боррелиоз и его диагностика // Информационный бюллетень: Новости «Вектор-Бест». 2003. -Т 28. - № 2. - С. 4-7.

24. Розанов А.С., Загребельный С.Н., Беклемишев А.Б. Клонирование гена ксилозо(глюкозо)изомеразы Escherichia coli К12 и изучение каталитических свойств продукта его экспрессии // Прикладная биохимия и микробиология. -2009.-Т. 45. -№ 1.-С. 38-44.

25. Фоменко Н.В., Мельникова О.В., Черноусова Н.Я., Епихина Т.И. Выявление антител к боррелиям комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato // Бюллетень сибирской медицины. 2008. - Прил. 1. - С. 78-84.

26. Aberer Е. Lyme borreliosis an update // .JDDG. - 2007. - № 5. - P. 406-413.

27. Alekseev A.N., Dubinina H.V., van de Pol I., Schouls L. Identification of Ehrlichia spp. and Borrelia burgdorferi in Ixodes ticks in the Baltic regions of Russia // J. Clin. Microbiol. 2001. - V. 39. - P. 2237-2242.

28. Al-Robaiy S, Knauer J, Straubinger RK. Borrelia burgdorferi organisms lacking plasmids 25 and 28-1 are internalized by human blood phagocytes at a rate identical to that of the wild-type strain // Infect. Immun. 2005. - V. 73. - P. 5547-5553.

29. Anderson J.F. Epizootiology of Lyme borreliosis // Scand. J. Infect. Dis. 1991. - V. 77.-P. 23-34.

30. Anderson J.F., Duray P.H., Magnarelli L.A. Borrelia burgdorferi and Ixodes damminii prevalence in the greater Philadelphia area. // J. Infect. Dis. 1990. - V. 161.-P. 181-182.

31. Anguita J., Hedrick M.N., Fikrig E. Adaptation of Borrelia burgdorferi in the tick and the mammalian host // FEMS Microbiol. Rev. 2003. - V. 27. - P. 493-504.

32. Arnez M., Ruzic-Sabljic E., Ahcan J., Radsel-Medvescek A., Pleterski-Rigler D., Strle F. Isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato from blood of children with solitary erythema migrans // Pediatr. Infect. Dis. J. 2001. - V. 20. - P. 251-255.

33. Asbrink E., Hovmark A. Early and late cutaneous manifestations in Ixodes-borne borreliosis (erythema migrans borreliosis, Lyme borreliosis) // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1988.-V. 539.-P. 4-15.

34. Baranton G., Ras N.M., Postic D. Molecular epidemiology of the aetiological agents of Lyme borreliosis // Wien. Klin. Wocheschr. 1998. - V. 110. - P. 850 - 855.

35. Baranton G., Seinost G., Theodore G., Postic D., Dykhuizen D. Distinct levels of genetic diversity of Borrelia burgdorferi are associated with different aspects of pathogenicity//Res. Microbiol.-2001.-V. 152.-P. 149-156.

36. Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes // Yale J. Biol. Med. 1984. -V. 57. - P. 521-525.

37. Barbour A.G, Fish D. The biological and social phenomenon of Lyme disease // Science. 1993.-V. 260.-P. 1610-1616.

38. Batsford S., Rust C. and Neubert U. Analysis of antibody response to the outer surface protein family in Lyme borreliosis patients // The Journal of Infections Diseases. -1998. V. 178. - P. 1676-1683.

39. Berger B.W. Current aspects of Lyme disease and other Borrelia burgdorferi infections // Dermatol. Clin. 1997. - V. 15. - P. 247-255.

40. Bergstrom S., Bundoc V.G. and Barbour A.G. Molecular analysis of linear plasmid-encoded major surface proteins, ospA and ospB, of Lyme-disease spirochete Borrelia burgdorferi // Molecular Microbilogy. 1989. - V. 4. - P. 479-486.

41. Berland R., Fikrig E., Rahn D., Hardin J. and FlaVell R. Molecular characterization of the humoral response to the 41-kilodalton flagellar antigen of Borrelia burgdorferi, the Lyme disease agent // Infection and Immunity. 1991. — V. 59. — P. 3531-3535.

42. Brettschneider S., Bruckbauer H., Klugbauer N., Hofmann H. Diagnostic value of PCR for detection of Borrelia burgdorferi in skin biopsy and urine samples from patients with skin borreliosis // J. Clin. Microbiol. 1998. - V. 36. - P. 2658-2665.

43. Bruckbauer H., Preac-Mursic V., Fuchs R., Wilske B. Cross-reactive proteins of Borrelia burgdorferi II Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1992. - V. 11. - P. 224232.

44. Bunkis J., Luke C. J., Bunikiene E., Bergstrom S., Barbour A.G. A surface-exposed region of a novel outer membrane protein (p66) of Borrelia spp. is a variable in size and sequence//Journal of Bacteriology. 1998.-V. 180. -P. 1618-1623.

45. Bunkis J., Olsen В., Westman G. and Bergstrum S. Variable serum immunoglobulin responses against different Borrelia burgdorferi sensu lato species in population at risk for patients with Lyme disease // J. Clin. Microbiol. 1995. - V. 33. - P. 14731478.

46. Bunkis J., Rosier D., Munchhoff P. and Wilske B. Molecular polymorphism of Lyme disease agent Borrelia garinii in northern Europe is influenced by noVel enzootic Borrelia focus in North Atlantic // J. Clin. Microbiol. 1996. - V. 34 . - P. 364-368.

47. Burgdorfer W., Barbur A.G., Hayes S.F., Benach J.L., Grunwaldt E., Davis J.P. Lyme disease-a tick-borne spirochetosis? // Science. 1982. - V. 216. - P. 1317 — 1319.

48. Cabello F.C., Godfrey H.P., Newman S.A. Hidden in plain sight: Borrelia burgdorferi and the extracellular matrix // Trends Microbiol. 2007. - V. 15. - P. 350-354.

49. Carriero M.M., Laux D.C., Nelson D.R. Characterization of the heat shock response and identification of heat shock protein antigens of Borrelia burgdorferi И Infect. Immun. 1990. - V. 58. - P. 2186-2191.

50. Casati S., Bernasconi M.V., Gern L., Piffaretti J.C. Diversity within Borrelia burgdorferi sensu lato genospecies in Switzerland by recA gene sequence // FEMS Microbiol. Lett. 2004. - V. 238. -P. 115-123.

51. Cassatt D.R., Patel N.K., Ulbrandt N.D., Hanson M.S. DbpA, but not OspA, is expressed by Borrelia burgdorferi during spirochetemia and is a target for protective antibodies // Infect. Immun. 1998. - V. 66. - P. 5379-5387.

52. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Recommendations for test performance and interpretation from the Second National Conference on Serologic Diagnosis of Lyme Disease // MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 1995. - V. 44 -P. 590-591.

53. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. 1987. -V. 162.-P. 156-159.

54. Coleman J.L., Gebbia J.A., Piesman J., Degen J.L., Bugge Т.Н., Benach J.L. Plasminogen is required for efficient dissemination of Borrelia burgdorferi in ticks and for enhancement of spirochetemia in mice // Cell. 1997. - V. 89. - P. 11111119.

55. Coleman J.L., Roemer E.J., Benach J.L. Plasmin-coated Borrelia burgdorferi degrades soluble and insoluble components of the mammalian extracellular matrix // Infect. Immun. 1999. - V. 67. - P. 3929-3936.

56. Coleman J.L., Rogers R.C., Rosa P.A., Benach J.L. Variation in the ospB gene of Borrelia burgdorferi result in differences in monoclonal antibody reactivity and in production of escape Variants // Inf. Immunity. 1994. - V. 62. - P. 303-307.

57. Chao L.L., Wu W.J., Shih C.M. First detection and molecular identification of Borrelia burgdorferi-like spirochetes in Ixodes granulatus ticks collected on Kinmen Island of Taiwan // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2009. - V. 80. - P. 389-394.

58. Coburn J., Cugini C. Targeted mutation of the outer membrane protein P66 disrupts attachment of the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, to integrin alphavbeta3 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - V. 100. - P. 7301-7306.

59. Coburn J., Fischer J.R., Leong J.M. Solving a sticky problem: new genetic approaches to host cell adhesion by the Lyme disease spirochete // Mol. Microbiol. -2005.-V. 57.-P. 1182-1195.

60. Coburn J., Magoun L., Bodary S.C., Leong J.M. Integrins a vP 3 and a 5p 1 mediate attachment of Lyme disease spirochetes to human cells // Infect. Immun. — 1998. — V. 66.-P. 1946-1952.

61. Crippa M., Rais O., Gern L. Investigations on the mode and dynamics of transmission and infectivity of Borrelia burgdorferi sensu s trie to and Borrelia afzelii in Ixodes ricinus ticks // Vector Borne Zoonotic Dis. 2002. - V. 2. - P. 3-9.

62. Cutler SJ., Moss J., Fukunaga M., Wright D.J., Fekade D., Warrell D. Borrelia recurrentis characterization and comparison with relapsing-fever, Lyme-associated, and other Borrelia spp II Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. - V. 47. - P. 958-968.

63. Derdakova M., Lencakova D. Association of genetic variability within the Borrelia burgdorferi sensu lato with the ecology, epidemiology of Lyme borreliosis in Europe // Ann. Agric. Environ. Med. 2005. - V. 12. - P. 165-172.

64. Dressier F., Ackermann R., Steere A.C. Antibody responses to the three genomic groups of Borrelia burgdorferi in European Lyme borreliosis // J. Infect. Dis. 1994. -V. 169. — P. 313-318.

65. Dumler J.S. Molecular methods for ehrlichiosis and Lyme disease // Clin. Lab. Med. 2003. - V. 23. - P. 867-884.

66. Dunn J.J., Buchstein S.R., Butler L.L., Fisenne S., Polin D.S., Lade B.N., Luft B.J. // Complete nucleotide sequence of a Circular plasmid from the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi // J. Bacteriol. 1994. - V. 176. - P. 2706-2717.

67. Eiffert H., Ohlenbusch A., Christen H.J., Thomssen R., Spielman A., Matuschka F.R. Nondifferentiation between Lyme disease spirochetes from vector ticks and human cerebrospinal fluid // J. Infect. Dis. 1995. - V. 171. - P. 476-479.

68. Eiffert H., Karsten A., Thomssen R., Christen HJ. Characterization of Borrelia burgdorferi strains in Lyme arthritis // Scand. J. Infect. Dis. 1998. - V. 30. - P. 265-268.

69. Embers M.E., Ramamoorthy R., Philipp M.T. Survival strategies of Borrelia burgdorferi, the etiologic agent of Lyme disease // Microbes Infect. 2004. - V. 6. -P. 312-318.

70. Fikrig E., Berland R., Chen M., Williams S., Sigal L.H., Flavell R.A. Serologic response to the Borrelia burgdorferi flagellin demonstrates an epitope common to a neuroblastoma cell line//PNAS. 1993. - V. 90.-P. 183-187.

71. Fikrig E., Feng W., Barthold S. W., Telford S.R., Flavell R.A. Arthopod- and host-specific Borrelia burgdorferi bbk32 expression and inhibition of spirochete transmission // J. Immunol. 2000. - V. 164. - P. 5344-5351.

72. Fischer J.R., LeBlanc K.T., Leong J.M. Fibronectin binding protein BBK32 of the Lyme disease spirochete promotes bacterial attachment to glycosaminoglycans // Infect. Immun. -2006. V. 74. - P. 435-441.

73. Fuchs H., Simon M.M., Wallich R., Bechtel M., Kramer M.D. Borrelia burgdorferi induces secretion of pro-urokinase-type plasminogen activator by human monocytes // Infect. Immun. 1996. - V. 64. - P. 4307-^1312.

74. Fukunaga M., Hamase A. Outer surface protein С gene sequence analysis of Borrelia burgdorferi sensu lato isolates from Japan I I J. Clin. Microbiol. 1995. — V. 33. - P. 2415-2420.

75. Ge Y. and Charon N.W. FlaA, a putative flagellar outer sheath protein, is not an immunodominant antigen associated with Lyme disease // Infect. Immun. — 1997. -V. 65.-P. 2992-2995.

76. Ge Y., Li C., Corum L., Slaughter C.A., Charon N.W. Structure and expression of the flaA periplasmic flagellar protein of Borrelia burgdorferi // Journal of Bacteriology. -1998. -V. 180.-P. 2418-2425.

77. Georgilis K., Steere A.C., Klempner M.S. Infectivity of Borrelia burgdorferi correlates with resistance to elimination by phagocytic cells // J. Infect. Dis. — 1991. — V. 163.-P. 150-155.

78. Gern L., Estrada-Pena A., Frandsen F., Gray J.S., Jaenson T.G., Jongejan F., Kahl O., Korenberg E., Mehl R., Nuttall P.A. European reservoir hosts of Borrelia burgdorferi sensu lato // Zentralbl. Bakteriol. 1998. -V. 28. - P. 196-204.

79. Gern L., Ни C.M., Kocinova E., Vyrostekova V., Rehacek J. Genetic diversity of Borrelia burgdorferi sensu lato isolates obtained from Ixodes ricinus ticks collected in Slovakia // Eur. J. Epidemiol. 1999. - V. 15. - P. 665-669.

80. Gern L., Rais O. Efficient transmission of Borrelia burgdorferi between со feeding Ixodes ricinus ticks (Acari: Ixodidae) // J. Med. Entomol. — 1996. — V. 33. — P. 189-192.

81. Gorbacheva V.Y., Godrey H.P., Cabello F.C. Analysis of bmp gene family in Borrelia burgdorferi sensy lato // Journal of Bacteriology. 2000. - V. 182. - P. 20372042.

82. Giambartolomei G.H., Dennis V.A., Philipp M.T. Borrelia burgdorferi stimulates the production of interleukin-10 in peripheral blood mononuclear cells from uninfected humans and rhesus monkeys // Infect. Immun. 1998. - V. 66. - P. 26912697.

83. Gilbert M.A., Morton E.A., Bundle S.F., Samuels D.S. Artificial regulation of ospC expression in Borrelia burgdorferi II Mol. Microbiol. 2007. - V. 63. - P. 1259-1273.

84. Gorelova N.B., Korenberg E.I., Postik D., Iunicheva lu.V., Riabova Т.Е. The first isolation of Borrelia burgdorferi sensu stricto in Russia // Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. -2001. Vol. 4. - P. 10-12.

85. Guo B.P., Brown E.L., Dorward D.W., Rosenberg L.C., Hook M. Decorin-binding adhesins from Borrelia burgdorferi II Mol. Microbiol. 1998. — V. 30. - P. 711-723.

86. Guo B.P., Norris S.J., Rosenberg L.C., Hook M. Adherence of Borrelia burgdorferi to the proteoglycan decorin // Infect. Immun. 1995. - V. 63. - P. 346772.

87. Hanincova K. Ecological aspects of Borrelia burgdorferi sensu lato // PhD Thesis. Institute of Zoology, Slovak Academy of Sciences, Bratislava. 2002.

88. Hanincova K., Schafer S.M., Etti S., Sewll H.S., Taragel'ova V., Ziak D., Labuda M., Kurtenbach K. Association of Borrelia afzelii with rodents in Europe // Parasitology. 2003. - V. 126. - P. 11-20.

89. Hanincova K., Taragel'ova V., Koci J., Schafer S.M., Hails R., Ullmann A.J., Piesman J., Labuda M., Kurtenbach K. Association of Borrelia garinii and B.valaisiana with songbirds in Slovakia // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69. -P. 2825-2830.

90. Hansen K., Asbrink E. Serodiagnosis of erythema migrans and acrodermatitis chronica atrophicans by the Borrelia burgdorferi flagellum enzyme-linked immunosorbent assay // J. Clin. Microbiol. 1989. - V. 27. - P. 545-551.

91. Hansen K., Hindersson P., Pedersen N.S. Measurement of antibodies to the Borrelia burgdorferi flagellum improves serodiagnosis in Lyme disease // J. Clin. Microbiol. 1988. - V. 26. - P. 338-346.

92. Hauser U., Lehnert G., Wilske B. Validity of interpretation criteria for standardized Western blots (immunoblots) for serodiagnosis of Lyme borreliosis based on sera collected throughout Europe // J. Clin. Microbiol. 1999. - V. 37. — P. 2241-2247.

93. Heikkila Т., Seppala I., Saxen H., Panelius J., Peltomaa M., Julin Т., Carlsson S.T., Lahdenne P. Recombinant BBK32 protein in serodiagnosis of early and late Lyme borreliosis // J. Clin. Microbiol. 2002. - V. 40. - P. 1174-1180.

94. Hengge U.R., Tannapfel A., Tyring S.K., Erbel R., Arendt G., Ruzicka T. Lyme borreliosis // Lancet. Infect. Dis. 2003. - V. 3. - P. 489-500.

95. Schwan T.G., Piesman J., Golde W.T., Dolan M.C., Rosa P.A. Induction of an outer surface protein on Borrelia burgdorferi during tick feeding // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995.-V. 92.-P. 2909-2913.

96. Hirschfeld M., Kirschning C.J., Schwandner R., Wesche H., Weis J.H., Wooten R.M., Weis J.J. Cutting edge: inflammatory signaling by Borrelia burgdorferi lipoproteins is mediated by Toll-like receptor 2 // J. Immunol. 1999. - V. 163. — P. 2382-2386.

97. Hofmann H. Lyme borreliosis Cutaneous manifestation // Hautarzt. — 2005. — V. 56.-P. 783-796.

98. Hoppa E., Bachur R. Lyme disease update // Curr. Opin. Pediatr. 2007. — V.19. - P. 275-280

99. Hubalek Z., Halouzka J. Distribution of Borrelia burgdorferi sensu lato genomic groups in Europe, a review // Eur. J. Epidemiol. 1997. - V. 13. - P. 951-957.

100. Humair P.F., Gern L. The wild hidden face of Lyme borreliosis in Europe // Microbes. Infect. 2000. - V. 2. - P. 915-922.

101. Indest K.J., Philipp M.T. DNA-Binding proteins possibly involved in regulation of the post-logarithmic-phase expression of lipoprotein P35 in Borrelia burgdorferi // J. Bacteriol. 2000. - V. 182 - P. 522-525.

102. Johnson S.E., Klein G.C., Schmid G.P., Bowen G.S., Feeley J.C., Schulze T. Lyme disease: a selective medium for isolation of the suspected etiological agent, a spirochete//J. Clin. Microbiol. 1984. - V. 19.-P. 81-82.

103. Johnson R.C., Schmid G.P., Hyde F.W., Steigerwalt A.G., Berenner D.J. Borrelia burgdorferi sp. nov.: etiologic agent of Lyme disease //Int. J. Syst. Bacteriol. 1984. - V. 34. - P. 496-497.

104. Kampen H., Rotzel D.C., Kurtenbach K., Maier W.A., Seitz H.M. Substantial rise in the prevalence of Lyme borreliosis spirochetes in a region of western Germany over a 10-year period // Appl. Environ. Microbiol. 2004. - V. 70. - P. 1576-1582.

105. Korenberg E.I., GorelovaN.B., Kovalevsky Yu.V. Ecology of Borrelia burgdorferi sensu lato in Russia // Lyme Borreliosis Epidemiology and Control. Oxford.-2002.-P. 175-200.

106. Kosik-Bogacka D., Kuzna-Grygiel W., Bukowska K. The prevalence of spirochete Borrelia burgdorferi sensu lato in ticks Ixodes ricinus and mosquitoes

107. Aedes spp. within a selected recreational area in the city of Szczecin // Ann. Agric. Environ. Med. 2004. - V. 11. - P. 105-108.

108. Kostrzynska M., Leung K.T., Lee H., Trevors J.T. Green fluorescent protein-based biosensor for detecting SOS-inducing activity of genotoxic compounds // J. Microbiol. Methods. 2002. - V. 48. - P. 43-51.

109. Kraiczy P., Skerka C., Kirschfink M., Zipfel P.F., Brade V. Immune evasion of Borrelia burgdorferi: insufficient killing of the pathogens by complement and antibody//Int. J. Med. Microbiol. -2002. -V. 291. Suppl. 33. - P. 141-146.

110. Kraiczy P., Wurzner R. Complement escape of human pathogenic bacteria by acquisition of complement regulators // Mol. Immunol. 2006. - V. 43. - P. 31^44.

111. Kurtenbach K., De Michelis S., Etti S., Schafer S.M., Sewell H.S., Brade V., Kraiczy P. Host association of Borrelia burgdorferi sensu lato the key role of host complement // Trends. Microbiol. - 2002. - V. 10. - P. 74-79.

112. Kuhlow С J., Garcia-Monco J.C., Coleman J.L., Benach J.L. Murine microglia are effective phagocytes for Borrelia burgdorfer i II J. Neuroimmunol. 2005. — V. 168. -P. 183-187.

113. Labuda M., Jones L.D., Williams Т., Nuttall P.A. Enhancement of tick-borne encephalitis virus transmission by tick salivary gland extracts // Med. Vet. Entomol. — 1993a.-V. 2.-P. 193-196.

114. Labuda M., Nuttal P.A., Kozuch O., Elekova E., Williams Т., Zuffova E., Sabo A. Non-viraemic transmission of tick-borne encephalitis virus: a mechanism for arbovirus survival in nature // Experientia. — 1993. -V. 49. P. 802-805.

115. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - V. 227. - P. 680-685.

116. Lazarus J.J., Meadows M.J., Lintner R.E., Wooten R.M. IL-10 deficiency promotes increased Borrelia burgdorferi clearance predominantly through enhanced innate immune responses // J. Immunol. 2006. - V. 177. - P. 7076-7085.

117. Liang F.T., Brown E.L., Wang Т., Iozzo R.V., Fikrig E. Protective niche for Borrelia burgdorferi to evade humoral immunity П Am. J. Pathol. 2004. - V. 165. — P. 977-985.

118. Liang F.T., Jacobs M.B., Bowers L.C., Philipp M.T. An immune evasion mechanism for spirochetal persistence in Lyme borreliosis // J. Exp. Med. — 2002. — V. 195.-P. 415-422.

119. Livey I., Gibbs C.P., Schuster R., Dorner F. Evidence for lateral transfer and recombination in OspC variation in Lyme disease Borrelia // Mol. Microbiol. — 1995. -V. 18.-P. 257-269.

120. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folinphenol reagent//J. Biol. Chem. 1951. - V. 193.-P. 265-275.

121. Ltinemann J.D., Krause A. Heterogeneity of Borrelia burgdorferi: etiopathogenetic relevance and clinical implications // Z. Rheumatol. — 2003. V. 62. -P. 148-154.

122. Lyme disease: United States, 2001-2002 / Centers for Disease Control and Prevention (CDC) // MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 2004. - V. 53. - P. 365369.

123. Magnarelli L.A., Miller J.N., Anderson J.F., Riviere G.R. Cross-reactivity of nonspecific treponemal antibody in serologic tests for Lyme disease // J. Clin. Microbiol. 1990. - V. 28. - P. 1276-1279.

124. Masuzawa T. Terrestrial distribution of the Lyme borreliosis agent Borrelia burgdorferi sensu lato in East Asia // Jpn. J. Infect. Dis. 2004. — V. 57. — P. 229235.

125. Masuzawa Т., Wilske В., Komikado Т., et al. Comparison of ospA for Borrelia burgdorferi sensu lato fron Japan, Europe and North America // Microbiological Immunology. 1996. - V. 40. - P. 539-545.

126. Montgomery R.R., Lusitani D., de Boisfleury C.A., Malawista S.E. Human phagocytic cells in the early innate immune response to Borrelia burgdorferi И J. Infect. Dis.-2002.-V. 185. -P.1773-1779.

127. Morrison T.B., Weis J.H., Weis J.J. Borrelia burgdorferi outer surface protein A (OspA) activates and primes human neutrophils // J. Immunol. 1997. - V. 158. — P. 4838-4845.

128. Nardelli D.T., Callister S.M., Schell R.F. Lyme Arthritis: Current Concepts and a Change in Paradigm // Clin. Vaccine Immunol. 2008. - V.l5. - P. 21-34.

129. Norris S.J. Antigenic variation with a twist: the Borrelia story // Mol. Microbiol. -2006.-V. 60.-P. 1319-1322.

130. Nuttall P.A., Paesen G.C., Lawrie C.H., Wang H. Vector-host interactions in disease transmission // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2000. - V. 2. - P. 381-386.

131. Obonyo M., Munderloh U.G., Fingerle V., Wilske В., Kurtti T.J. Borrelia burgdorferi in tick cell culture modulates expression of outer surface proteins A and С in response to temperature // J. Clin. Microbiol. 1999. - V. 37. - P. 2137-2141.

132. Ohnishi J., Piesman J., de Silva A.M. Antigenic and genetic heterogeneity of Borrelia burgdorferi populations transmitted by ticks // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2001.-V. 98.-P. 670-675.

133. Olsen В., Duffy D.C., Jaenson T.G., Gylfe A., Bonnedahl J., Bergstrom S. Transhemispheric exchange of Lyme disease spirochetes by seabirds // J. Clin. Microbiol. 1995. - V. 33. - P. 3270-3274.

134. Oschmann P., Kaiser R. Clinical cymptoms. / In: Lyme borreliosis and tick-borne encephalitis. Ed. Oschmann P, Kraiczy P, Halperin J, Brade V. (Hrsg). // I. Auflage-Bremen. UNI-MED. 1999. - P. 57 - 66.

135. Pachner A.R., Dail D., Bai Y., Sondey M., Рак L., Narayan K., Cadavid D. Genotype determines phenotype in experimental Lyme borreliosis // Ann. Neurol. — 2004.-V. 56.-P. 361-370.

136. Padula S.J., Sampiere A., Dias F., Szczepanski A., Ryan R.W. Molecular characterization and expres.s.ion of p23 (ospC) from a north american strain of Borrelia burgdorferi //Inf. and Immun. 1993. -V. 61. - P. 5097-5105.

137. Pal U., Yang X., Chen M., Bockenstedt L.K., Anderson J.F., Flavell R.A., Norgard M.V., Fikrig E. OspC facilitates Borrelia burgdorferi invasion of Ixodes scapularis salivary glands // J. Clin. Invest. 2004. - V. 113. - P. 220-230.

138. Pal U., Wang P., Bao F., Yang X., Samanta S., Schoen R., Wormser G.P., Schwartz I., Fikrig E. Borrelia burgdorferi basic membrane proteins A and В participate in the genesis of Lyme arthritis // J. Exp. Med. 2008. - V. 205. - P. 133141.

139. Panelius J., Lahdenne P., Heikkila Т., Peltomaa M., Oksi J., Seppala I. Recombinant OspC from Borrelia burgdorferi sensu stricto, B.afzelii and B.garinii in the serodiagnosis of Lyme borreliosis // J. Med. Microbiol. 2002. - V. 51. — P. 731— 739.

140. Parveen N., Leong J.M. Identification of a candidate glycosaminoglycan-binding adhesin of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi II Mol. Microbiol. -2000.-V. 35.-P. 1220-1234.

141. Pechova J., Stepanova G., Kovar L., Kopecky J. Tick salivary gland extract-activated transmission of Borrelia afzelii spirochetes // Folia. Parasit. 2002. - V. 49. -P. 153-159.

142. Pet'ko В., Stefancikova A., Tresova G., Peterkova J., Skardova I., Prokopekova H., Cislakova L. Ixodes ricinus as a source of human and canine Lyme boreliosis infection // Slov. Vet. J. 1996. -V. 21. - P. 313-318.

143. Pfister H.W., Rupprecht T.A. Clinical aspects of neuroborreliosis and post-Lyme disease syndrome in adult patients // Int. J. Med. Microbiol. 2006. - V. 9. - P. 1116.

144. Piesman J., Dolan M.C., Happ C.M., Luft B.J., Rooney S.E., Mather T.N., Golde W.T. Duration of immunity to reinfection with tick-transmitted Borrelia burgdorferi in naturally infected mice // Infect. Immun. 1997. - V. 65. - P. 4043-4047.

145. Postic D., Korenberg E., Gorelova N., Kovalevski Y.V., Bellenger E., Baranton G. Borrelia burgdorferi sensu lato in Russia and neighbouring countries: high incedence of mixed isolates // Res. Microbiol. 1997. - V. 148. - P. 691-702.

146. Preac-Mursic V., Wilske В., Reinhardt S. Culture of Borrelia burgdorferi on six solid media // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1991. - V. 10. - P. 1076-1079.

147. Probert W.S., Johnson B.J.B. Identification of a 47kDa fibronectin-binding protein expressed by Borrelia burgdorferi isolate B31 // Mol. Microbiol. 1998. - V. 30.-P. 1003-1015.

148. Purser J.E., Norris S. Correlation between plasmid content and infectivity in Borrelia burgdorferi // PNAS. 2000. - V. 97. - P. 13865-13870.

149. Randolph S.E., Gern L., Nuttall P.A. Co-feeding ticks: epidemiological significance for tick-borne pathogen transmission // Parasitol. Today. 1996. - V. 12. - P. 472-479.

150. Rasiah C., Schiltz E., Reighert J. and Vogt. A. Purification and characterization of trypsic peptide of Borrelia burgdorferi flagellin, which reduced cross-reactivity in immunoblots and ELISA // J. Gen. Microbiol. 1992. - V. 138. - P. 147-154.

151. Rauer S., Spohn N., Rasiah C., Neubert U., Vogt A. Enzyme-linked immunosorbent as.s.ay using recombinant ospC and internal 14-kDa flagellin fragment for serodiagnosis of early Lyme disease // J. Clinical Microbiology. -1998. -V. 36.-P. 857-861.

152. Robertson J., Guy E., Andrews N. A European multicenter study of immunoblotting in serodiagnosis of Lyme borreliosis // J. Clin. Microbiol. 2000. -V. 38.-P. 2097-2102.

153. Roessler D., Hauser U., Wilske B. Heterogeneity of BmpA (P39) among European isolates of Borrelia burgdorferi sensu lato and influence of interspecies variability on serodiagnosis // J. Clin. Microbiol. 1997. - V. 35 - P. 2752-2758.

154. Rupprecht ТА., Kirschning C.J., Рорр В., Kastenbauer S., Fingerle V., Pfister H.W., Koedel U. Borrelia garinii induces CXCL13 production in human monocytes through TLR2 // Infect. Immun. 2007. - V. 75. - P. 4351-4356.

155. Rupprecht T.A., Koedel U., Fingerle V., Pfister H.W. The Pathogenesis of Lyme Neuroborreliosis: From Infection to Inflammation // Mol. Med. 2008. - V. 14. - P. 205-212.

156. Rosa P.A. Microbiology of Borrelia burgdorferi II Semin. Neurol. 1997. - V. 17.-P. 5-10.

157. Sadziene A., Barbour A. Experimental immunization against Lyme Borreliosis with recombinant Osp proteins: an overview // Infection. 1996. - V. 24. - P. 195202.

158. Schmidt B.L. PCR in laboratory diagnosis of human Borrelia burgdorferi infections // Clin. Microbiol. Rev. 1997. - V. 10. - P. 185-201.

159. Schwan T.G., Piesman J. Temporal changes in outer surface proteins A and С of the Lyme disease-associated spirochete, Borrelia burgdorferi, during the chain of infection in ticks and mice // J. Clin. Microbiol. 2000. - V. 38. - P. 382-388.

160. Singh S.K., Girschick H.J. Lyme borreliosis: from infection to autoimmunity // Clin. Microbiol. Infect. 2004. - V. 10. - P. 598-614.

161. Stanek G., Strle F. Lyme borreliosis // Lancet. 2003. - V. 362. - P. 1639-1647.

162. Steere A.C., Malawista S.E., Smydman D.R., Shope R.E., Andiman W.A., Ross M.R., Steele F.M. Lyme arthritis: an epidemic of oligoarticular arthritis in children and adults in three Connecticut communities // Arthr. Pheum. 1977. - V. 20. - P. 717.

163. Steere A.C. Lyme disease //N. Engl. J. Med. 1989. -V. 321. - P. 586-596.

164. Steere A.C. Lyme disease // N. Engl. J. Med. 2001. - V. 345. - P. 115-125.

165. Steere A.C. Lyme borreliosis in 2005, 30 years after initial observations in Lyme Connecticut // Wien. Klin. Wochenschr. 2006. - V. 118. - P. 625-633.

166. Steere A.C., Dhar A., Hernandez J., Fischer P.A., Sikand V.K., Schoen R.T., Nowakowski J., McHugh G., Persing D.H. Systemic symptoms without erythema migrans as the presenting picture of early Lyme disease // Am. J. Med. — 2003. — V. 114.-P. 58-62.

167. Steere A.C., Glickstein L. Elucidation of Lyme arthritis // Nat. Rev. Immunol. -2004.-V. 4.-P. 143-152.

168. Steere A.C., Coburn J., Glickstein L. The emergence of Lyme disease // J. Clin. Invest.-2004.-V. 113.-P. 1093-1101.

169. Steere A.C., Klitz W., Drouin E.E., Falk B.A., Kwok W.W., Nepom G.T., Baxter-Lowe L.A. Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide // J. Exp. Med. 2006. - V. 203. -P. 961-971.

170. Strle F. Principles of the diagnosis and antibiotic treatment of Lyme borreliosis // Wien. Klin. Wochenschr. 1999. - V. 111. - P. 911-915.

171. Suhonen J., Komi J., Soukka J., Lassila O., Viljanen M.K. Interaction between Borrelia burgdorferi and immature human dendritic cells // Scand. J. Immunol. -2003.-V. 58.-P. 67-75.

172. Swanson S.J., Neitzel D., Reed K.D., Belongia E.A. Coinfections acquired from ixodes ticks // Clin. Microbiol. Rev. 2006. - V. 19. - P. 708-727.

173. Tilly K., Bestor A., Jewett M.W., Rosa P. Rapid clearance of Lyme disease spirochetes lacking OspC from skin // Infect. Immun. 2007. - V. 75. - P. 1517— 1519.

174. Wang G., van Dam A.P., Schwartz I., Dankert J. Molecular typing of Borrelia burgdorferi sensu lato: taxonomic, epidemiological, and clinical implications // J. Clin. Microbiol. 1999. -V. 12. - P. 633-653.

175. Wang G., van Dam A.P., Dankert J. Phenotypic and genetic characterization of a novel Borrelia burgdorferi sensu lato isolate from a patient with Lyme borreliosis // J. Clin. Microbiol. 1999a. - V. 37. - P. 3025-3028.

176. Wang I.N., Dykhuezen D.E., Qiu W., Dunn J.J., Bosler E.M., Luft B.J. Genetic diversity of ospC in local population of Borrelia burgdorferi sensu stricto // Genetics. -1999c.- V. 151.- P. 15-30.

177. Weber K. Aspects of Lyme borreliosis in Europe // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis.-2001.-V. 20.-P. 6-13.

178. Wilske В., Preac-Mursic V., Schierz G. Kuhbeck R., Barbour A.G., Kramer M. Antigenic variability of Borrelia burgdorferi II Ann. N. Y. Acad. Sci. 1988. — V. 539.-P. 126-143.

179. Wilske В., Busch U., Fingerle V., Jauris-Heipke S., Preac Mursic V., Rossler D., Will G. Immunological and molecular variability of ospA and ospC . Implication for Borrelia vaccine development // Infection. 1996. - V. 24. - P. 208-212.

180. Wilske В., Fingerle V., Schulte-Spechtel U. Microbiological and serological diagnosis of Lymeborreliosis // FEMS. Immunol. Med. Microbiol. 2007. - V. 49. -P. 13-21.

181. Wittenbrink M.M., Reuter C., Manz M.L., Krauss H. Primary culture of Borrelia burgdorferi from Ixodes ricinus ticks // Zentralbl. Bakteriol. 1996. - V. 285. - P. 20-28.

182. Wodecka В., Skotarczak B. First isolation of Borrelia lusitaniae DNA from Ixodes ricinus ticks in Poland // Scand. J. Infect. Dis. 2005. - V. 37. - P. 27-34.

183. Wormser G.P., McKenna D., Carlin J., Nadelman R.B., Cavaliere L.F., Holmgren D., Byrne D.W., Nowakowski J. Brief communication: hematogenous dissemination in early Lyme disease // Ann. Intern. Med. 2005. - V. 142. - P. 751-755.

184. Zambrano M.C., Beklemisheva A.A., Bryksin A.V., Newman S.A., Cabello F.C. Borrelia burgdorferi binds to, invades, and colonizes native type I collagen lattices // Infect. Immun. 2004. - V. 72. - P. 3138-3146.

185. Zhou J. and Blair D. F. Residues of the cytoplasmic domain of motA essential for torque generation in the bacterial flagellar motor // Journal Molecular Biology. -1997.-V. 273.-P. 428-439.

Информация о работе

Рябченко, Александр Владимирович
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Получение рекомбинантных белков западносибирских изолятов Borrelia burgdorferi sensu lato и изучение их антигенных свойств - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Получение рекомбинантных белков западносибирских изолятов Borrelia burgdorferi sensu lato и изучение их антигенных свойств - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы