Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение рекомбинантной фосфадилинозитол-специфичной фосфолиназы с Listeria Monocytogenes и оценка ее диагностической значимости

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Получение рекомбинантной фосфадилинозитол-специфичной фосфолиназы с Listeria Monocytogenes и оценка ее диагностической значимости"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ни.Н.».ГАМАЛЕИ

На правах рукописи

ЕРМОЛАЕВА СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИИЛИТПОП &0С&АТ11Д!Ш!110ЭНТ0Я-СПЕЦИ*ИЧ1ЮЯ ФОСФОЛНПАЗИ С ЫЭТЕГНА НОКОСУТООЕМЕЗ II ОЦЕНКА ЕЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ

ЗНАЧИМОСТИ

(03.00.07 - микробиология) (03.00.15 - генетика)

Дагореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Моекоа - 1995

Работа выполнена в Научно-исследовательском ордена Трудового Красного Знамени Институте эпидемиологии м микробиологии имени Н.•'.Гамалеи Российской Академии Медицинских Наук

Научные руководители: доктор биологических наук

И.С.Тартаковский доктор биологических наук А.Л.Гинцбург Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Е.А.Ведьынна

доктор биологических наук Т.С.Ильина

Ведущее учреждение: Московская медицинская академия

им.И.М.Сеченова

> Г А

Зацита состоится 1995г.

■ часов на заседании специализированного Совета

К 001.07.01 по присуждению ученой степени кандидата иаук в Научно-исследовательском институте эпидемиологии н микробиологии имени Н.«.Гамалеи РАМН (123098 Москва, ул.Гамалеи 18)

С диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке НИН эпидемиологии ■ микробиологии им Н.*.Гамалеи РАМН

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор медицинских наук

Е.И.Коптелова

Актуальность темы

К концу ХХ-ого веса в силу изменения экологической обстановки и условий жизни людей значительную роль в структуре инфекционной патологии стал* играть возбудители оппортунистических инфекций, такие как Listeria monocytogenes, Legionella pnevmophiJa, Klebsiella aerogenes, Pseudomonas aeroginosa и др.

С начала 80-х было зарегистрировано несколько крупных вспышек лнстериоза с высокий процентом смертности. В связи с этим резко усилился интерес к изучению механизмов патогенности возбудителя лнстериоза L.monocytogenes.

Одним из факторов патогенности листерий является фосфатидн-линозитол-специфичная фосфолипаза С (PI-PLC). Листерноэная PI-PLC принадлежит к семейству бактериальных секретируемых фосфолипаэ, специфичных к липиду эукариотической мембраны фосфатидилинозитолу. Высокий процент гомологии и сходство функционирования этих ферментов с эукариотическнми фосфолипазами привели к предположению о возможной имитации бактериальными фосфолипазами действия эукарио-тических (Ikezawa, 1986). Эукарнотические фосфолипазы, как было установлено в начале 80-х, являются ключевыми ферментами в регуляции многих внутриклеточных процессов эукариот. Продуцируя собственные фосфолипазы, бактерия могла бы изменять ыетаболнзн эукариотической клетки и нужном для себя направлении, например, ннги-бируя бактерицидный ответ, приспосабливая обмен вецеств эукариотической клетки к метаболическим потребностям бактерии и тому подобным образом.

Мутанты L.monocytogenes, дефектные по гену PI-PLC plcA демонстрируют понихенну» вирулентность. Это свидетельствует о необ-

ходимости PI-PLC для полного проявления вирулентных свойств лис-терий. С другой стороны было показано, что ген PI-PLC plcA присутствует только у патогенных представителей рода Listeria, что делает его потенциальный маркерои для дифференциации патогенных и непатогенных лнетернй.

Таким образом,•изучение PI-PLC L.monocytogenes имеет как глубокий научный интерес, так и практическое значение.

Пель и завами исследование

Целью работы было изучение экспрессии клонированного гена фосфатидилинозитол-специфичной фосфолипазы С (PI-PLC) L,monocytogenes в Е.соН, и возможности использования PI-PLC н ее гена в качестве видоспецифическнх паркеров.

Для достижения »той цели были поставлены следующий задачи:

- клонирование гена PI-PLC plcA в Е.соН н конструирование рекомбинантных плаэмнд, необходимых для изучения его экспрессии;

- сравнение уровня экспрессии гена plcA в Е.соН нз-под'собс-твенного и ге^ерологичного промоторов;

- получение иимуиоре&ктнвного рекоыбинантного белка, на основе создания гибридного белка, Protein А :: PI-PLC

л

- получение ыоноспецифнческой антисывороткн к PI-PLC)

- скрининг коллекции отаииов L.monocytogenes на прёдиет изучения продукции ими PI-PLC!

- разработка системы для выявления L.monocytogenes на основе метода полиыеразной цепной реакции; -

-апробации разработанной системы в условиях экспериментального заражения мышей.

Научная новизна работц

В результате изучения клонированного гена PI-PLC L.monocytogenes plcA детально исследованы процессы его транскрипции и трансляции в E.coll.

Создана оригинальная генная конструкция - гибридный ген spa:: plcA, S'-конец которого представляет собой фрагмент гена зра Белка A (Protein A) S.aureus, а Э'-колец - ген РI-PLC plcA.

Показано, что гибридный белок Protein A::PI-PLC экспрессиру-ется в E.coli в виде полноразыерного продукта. Разработана технология очистки гибридного белка Protein А :: PI-PLC.

Установлено, что поликлональная антиеыворотка к гибридному белку Protein А :: PI-PLC способна выявлять натнвную PI-PLC, что свидетельствует о том, что входя в состав гибридного бел^а, PI-PLC сохраняет, по крайней мере частично, антигенные детерминанты и, следовательно, натнвную коиформацип.

Впервые установлен факт наличия значительных вариаций в уровне экспрессии PI-PLC разными ятаммаик L.monocytogenes.

Практическую значимость работы составляет создание амплнфк-

кационных систем для выявления L.monocytogenes, основанных на

последовательностях генов PI-PLC plcA и листериолнэина hly. Обе

- г

системы являются вндоспецифичныии и высокочувствительными. Чувствительность системы на основе гена plcA достигает 1000 клеток в образце, чувствительность системы на основе гена hly колеблется мехду 10 и 100 клетками в образце. Разработана методика, позволяющая выявлять L.monocytogenes с помощь» аиплнфикацнотшх систем в тканях животных.

Апробация диссертационной работы состоялась на научной конференции отдела Медицинской Микробиологии НИИЭМ им.Н.С>.Гамалеи

РАМН (J6 июня 1994г.) По материалам диссертации опубликовано 2 статьи. Материалы диссертации доложены на Всероссийской конференции по проблемам листериоза (1993г.» Покров), на VIконференции "Новые направления о биотехнологии" (1994г., Пуцино).

Объем к структура диссертации. Работа изложена на 127 страницах машинописного текста и иллюстрирована 20-м рисунками н 5-я таблицами. Состоит иэ введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и мх обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 100 источников.

Работа выполнена на базе.лабораторий легионеллеза (руководитель - доктор биологических наук И.С.Тартаковскнй) и лаборатории молекулярной генетики патогенных микроорганизмов (руководитель -доктор биологических неук А.Л.Гинцбург).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Использованные итаммы и плаэмидм

В работе'были использованы атаыиы микроорганизмов и плазмк-ды, приведенные в таблице 1.

Молеолярио-генетические методы

Выделение хромосомной ДНК L.nonocjrtogenes проводили методом Магmuг et al (1961).

Аналитическое выделение плазмидной ДНК mj В. coli проводили методом Holmes and Quisly (1981). Препаративное выделение проводили методом Birnboim and Doly (1979).

Расцепление ДНК эндонуклеазаии рестрикции, электрофоретичес-кое разделение фрагментов ДНК, трансформацию E.coli осуществляли как описано в руководстве Маннатнс и др.(1984).

Таблица I Использовании: гзтаиим п плаэкиды

серогрулпа или списание

источник

Ия1ег1а вопосу1в{;г!1ез ЕЭО

ЯСТС МСТС

нстс нстс нстс

55143

Костичепко

7973

5343

5214

10527

19117

Нежобогза 12

013-75

Р13-32

Р22-59

Р37-345

РЗО-124

Р53-104

<25-14

Р27-117

Р73-316

Р26-34

Р40-Н4

Р2Э-130

Listsгja 1яяосия ЗЬСС 3723 ■

зг.сс'зэ79

11г1з?1а аса Ив» г л

3I.CC !3/1ЭЭ 5ггз^>йосог«! ш. рялоеюа^з 321

. -

ЗясШиа .ввЫШз Пг.сШнз «егоза

1ег1опе11 а ра«иторЬ Ла|

!1усор1я.вп2 Готгяспеаа 3 Мусор¡азка ?пгияоя1а2 I Еяейеач"еЫл I

1/2а

1/2а 1 /2С

4а 4 "о

1

1/2а 4Ь

::.о."

2/2а 1/2Ь

'зЬ

!!.Э

4Ъ •»?>

1Ъ 4Ь

5а

любезно предоставлен проо В.Гооелеы* тот же

тот 28

тот хе тот ае тот но тот ке НИИЭН на.Гамалеи клкн. изолят тот ге тот 2е тот яз тот зг тот зе тот зе

тот

тот яг тот дз тот да тот

тот тот тот

23. Э

Г'.О

любезно яредо

стаплеп

В.Гойзяач»

тот гга

(тот аз

ЙИЯСГ) вн.Гшш

иаолят | дкЗззяо предо | стаалем яро} | Костваозой И.К.

¡коллекция 3 |НШ{5М Глпялеп | тот? зе |

¡¡тот не !

ИВ 101 F-, hsdS20(te-,ea-) ,тесЛЗЗ тот же

атс 1, ртсА2, lacYl, 3&1K2

ipsL2 {Smr), sylS, ntll,

- supE44,

JM109 F'traD36, (lac pro),thl, тот.se

bctä, supE44, hsdill 7,

proAB, lacl* , lacZ YUS/recAt

£угЛ95 (Kai*)

W4830.1 Y-,Uis-,ilv-,salK-,(chlD- ТОТ

PülH Haitt.'*- CIC57 VI)

Плсэииди

FUC19 Apr (Hessins et

в!., 1981)

pLC2 данная работа

ptC3 pUCl9:iplcA данная робота

pJUT2T AjpT , spa Pharmccia

pLC7 произведши! pRIT2T, данная работа

sps::plсА

* Dr. W.GocbsJ, Universität Vurrbure, Gertaany

Выделение фрагментов ДНП из агороэного геля проводили методой "заиоразиоашиз-оттакаанпп" согласно Cawron-Burko and С1cwc11 (1934),'

Для чриготослеикл образцов L. полосу tagenза для анализа р ПГ'Р клетки обрсба^изелк посяедоЕатсльпо лкаоцнысм (ЗОшш) н Протеииа-зо2 К (30iü:h), восло чего либо вряыо использовали в ПЦР, лиВо есакдалн дебркс центрифугированием а илгрсцоитркфуге "Eppendorf (5uик 14тыс.о6'./«и!!)» и концентрировали ДНК этиловый спиртов

Поликерагну» цепнуы реакци» осуществляли в терыоцнклере "Perkin-Elmei", (Англия) по программе: для праймеров Fiel, PI с2 -93°C-1uhc, 50C-li3Hüä 72С-1ыииЗОсек s течение 35 циклов; для прайме ров Hlyl, 111у2 - 93С-1шш, 60C-1whh, 72-Imhü в течение 5 циклов, 93-1инИ| 57С-1ишзЗОсек, 72-1иннЗОсок - ¡циклов, 93С-1МИН, 55-1внн30сек, 72С-2ыии - 20 циклов.

Обратнув транскрипцию проводили с использование** обратной транскриптази M-MaLV фирмы "Дма-М" в условиях, рекомендованных изготовителей.

Риохнничесг.на метода

Очистку гибридного белка ЕелокА::Фосфолипаза проводили еле-

дующим образом: находящийся а нерастворимой фракции клеточного лиэатн. бело:: переводили п растворимое состояние обработкой 0,5'.; ТрнтонХ-100, затем подвергали афинной ' хроматография на колонке ТЕО-БерЬагозе 4В (РЪагтас1г»,-1,ХВ( Пввция). Для этого, после нанесения экстракта, колонку тцательно прокипали 10 иМ Тг!з-НС1 буфе-роц, рН=7.4 с добавлением 0.2 М КаС1 н 0.1% Тритона Х-ЮО. Элюцию рекомбинантоого белка осуществляла 1" уксусной кислотой с 0.1Я Тритонон Х-100.

Электрофорез белков а вертикальной геле осуществляли п системе ЬаевиН (1970).

Перенос белкоо на ннгроцеялгалоэную мсибраку (МННроге, США) и имиуноблотикг осучестплялн как описано Маииатнс и др.(1984).

Биологические метояч

Нииуииэаци» кролика осуществляли путам подкожного впадения на 1й, 10й дни и внутризеиного ппедения на 20й, ЗОЙ дни 200 икг очищенного белка разово. Сыворотку крови получали спустя 10 дне»! . после последней инъекции антигена.

Эксперименты по выязлени» Ь.аопосуСоеепса в селезенке ыыпей проводили па мьпяах линяя Ва1Ь/с, песоы 12-14г, которых инфицировали внутрпвошю Ь.пспосу^вепез, втаиы Костюченко (выделенный от больного). В определенные сроки злвотних стерильно вскрывала для взятия селезенки. Половинку селезенки иызя растирала в ступке с 1ил стерильного физиологического раствор. 100' нал вэоесн высевала на агаркзованну» среду ВН1 а инкубировали чаяхп а течение ночи. Для осахдокмя крупных обломков эусариотическкк слеток взвесь откручивали на иикроцентрифуго 5' ирва 2 тыс.об./иии» из супернат&нта бактерии осаздали центрифугированием а течение 5' при 8 тыс.об./мин н дважды отнизали физиологический раствором. После этого клетки обрабатывались также как и клетки ночной культуры 1.топосу^вспеа. ■ •

- s -

Рис.I Cxcuc конструировании pezouSim&uruux плазинд

РЕЗУЛЬТАТЫ iî 0БСУВДЕКК2 L. Клонирование гена PI-PLC vfcA в В.coil

nepuuu этапов работа явлклосе. клонирование гене PI-PLC plcA.

* - ^

Клснироаание осуществлялось lia основе опубликованной последовательности фрагмзнта rpouocouu l.tsonocytoger.es, содержащего ген plcA (Leliaoister-V?acbter et al., 1989). Cxcua клонирования приведена на рис.1. EcoRI-фрапгект xpouocouu L.aonocy toggles (st&uu EGD) p&sucpou около 1900ц.п. был очицен us агарозного геля н астроен в вектор рИС19 по сайту узнавания эндокуклеазы EcoRI. кидалось появление двух типов плоэиид, различающихся направленной считывания гена plcA относительно направления считывания с лактозного промотора вектора.

Отбирались клоны, дающие положительный сигнал в Полимеразной цепной реакции с прайыераык Р1с1,Р1с2 , специфичными к гену plcA.

Было отобрано 2 клона из 56. Рестрнкционний анализ показал, что отобранные клопы содержали идентичную плазмиду, содержащую

вставку размера около 1900 н.п. Рестрнктная карта вставки соответствовала опубликованной последовательности гена plcA. Это, ,i также положительные результата ПЦР доказывают, что нами был клонирован ген PI-PLC в составе плаэмнд, которые были обозначены PLC2 и pLC2(l). Дальнейшая работа проводилась с плазмидой pLC2. Направление считывания гена р1сЛ о ней (как и в pLC2(l)) было противоположно направлению считывания с лактозного промотора вектора.

Наличие экспрессии рекомбииантного белка, кодируемого плаз-мндой pLC2, иы питались обнаружить по появлению ферментативной активности, прн выращивания рекоыбннантного птамма HB101-pLC2 па среде, содеряареП фосфатндилинозитол. Наличие гидролизугепей активности должно было проявляться как. яозяленне непрозрачного гало вокруг колоний. Од::iко этим cnocoßoa выявить присутствие рекомбн-нант.-юго Селкг не удалось. ,

Mu объяснили это созиоятш отсутствием транскрипции рехомбн-нантного г«кг я В.coli зсяэдстзио того, что собственный промотор гана plcA iiueev нездноиичесху» -35 область я» я силу этого, аохет sio узнаваться ГНК-полямеразоЙ S.scli. С целью проверки этого предположения была поставляй» задача сравнять экспрессию рекоибн-иакткого гона с собственного проиотог". я гзтепологччного.

2.?;зученио тронскряпння ген* г>1сА я caí i

5 качестве гвтерояогичпог» прсиото?» ffwi вмбран промотор лактозного оперена 3. coli, сходящий я слегаз r.esTcn» pUOS9(pi:c. i) Плаэмида ptC2 силл cSpnííoTüia эндоизг8*з'У»а«ч KcoRI и Hindi. Hindi -конец фрагмента, с ода piar ого ran р1сЛ, распело ген а пологенип -46 от начала транездпяция. -ira с :<1псХ1-хснцон ззк-

тара приводит к получен«» аяазакди,' содг.ахп^е:! геи PI-PLC под

контролен собственного промоторе и промотора лактозного оперона. Полученная плазмнда была названа pLC3.

Наличие транскрипции гена PI-PLC в штаммах E.coli, содержащих плазыиды pLC2 и pLC3t было исследовано с помощью последовательных реакции обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции. Реакция обратной транскрипции проводилась на суммарной клеточной РНК E.coli. В ходе реакции обратной транскрипции проходил избирательный синтез кДНК фосфолнпаэы, инициируемый внесенным в реакционную смесь праймером Piel, комплементарным фосфолипазной мРНК. Полученный препарат кДНК использовался в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции, в ходе которой на кДНК фосфолипаэы амплифицировался специфический фрагмент двунитевой ДНК.

Наличие специфического продукта ПЦР было выявлено при использовании в качестве матрицы кДНК штаммов HB101-pLC2 и HB101-pLC3 (рис.2). В качестве отрицательного контроля использовались кДНК, полученная на «тайме HB101-pUC19, а также РНК штаммов HB101-pLC2 и HB101-pLC3, не прошедшая стадию обратной транс-

Ряс. 2 Анализ транскрипции рекоибиивнтного гена plcA в E.coli 1 - маркер, 2 - кДНК IIB101-pUCl9, 3- кДНК HB101-pLC2, 4 - РНК IIR101-pLC2, 5- кДНК HB101-pLC3, 6 - РНК HB101-pLC3

6 5 4 3 2 1

- и

крипции.

Таким образом было показано, что транскрипция гена plcA осуществляется в Б.col i как с собственного промотора, так и с гете-рологичного. Уровень выхода продукта ПЦР с кДНК ятамиа HD101-pLC3 превышал соответствующий уровень штамма IIB101-pLC2 прнбпизительно d 3-4 раза. Это качественно указывает на то, что уровень транскрипции с промотора лахтозиого оперона значительно вьпяе, чем с собственного. Поскольку в напей систеыэ разница в количестве продукта ПЦР d 3-4 раза указывает на разницу а количества вносимой иатрици п 100 н более раз.

3.Получение гибридного пакокбннаитного белка EnHS-inuXLlElzELQ

С цельгэ получения легко пиделлеиого пимунологическн активного белка мм поставил« cnoeil задачей создать конструкции, кодирующую гибридный белок Protein A::PI-PLC. Proteia X из Staphylococcus aureus обладает чрезвычайно высоки« сродством к Fe области ин-муиоглобулинои. Он часто используется для создания гнбридкых бел-коз, т.к. гибридный £5оло!с, содерзпщий в качестве N-конца Protein Л, легко fíoser быть очищен с поиощь» афннной хроматографии.

Для создания гибридной конструкции г»! использовали вектор PRIT2T. Вектор несет фрагыонт гена spa, кодирующий иммуноглобу-лпи-ссязмашавдА доиеи Protein А, с. доляаяокальнии сайтом клонирования па 3*-конце. В этот caí»? бил L'cr?oe¡: лпшенный промотора

о

структурный гем PI-PI.C. Схспа .toücTpyüponujfi!.'; представлена на рис Л. Лсс1-3а!г-фрагнвнт плазипдм pLC2 был подвергнут обработке эндонуклеаэой НаеШ з условчяз: - недореетригсцин. Тупой ¡сонец На-е111-Sa1í-фрагаеитг,содержащего ген plcA, расположен в полохении -5 от начала трансляции. Объединение его со Sisal-концом вектора

Рис.3 а)Анализ экспрессии рекомбинантного белка, кодируемого плазмидой pLC7 с помощью неспецифических антител, меченых псрок-сндазой хрена;1-лизат штамма N4830.l-pRIT2T, 2-лизат штамма N4830.1-pLC.7, б)очистка гибридного белка Protein А :: PI-PLC: 1- маркеры молекулярного веса 2-нерастворимая фракция лизата,

3-фракция, полученная в результате обработки 0,5Х Тритоном Х-100,

4-очищенный белок

приводило к образованию гибридного гена spa::plcA. Полученная плазыида была обозначена pLC7.

Поскольку в полученной конструкции гены spa и plcA находятся в одной райке считывания ми рассчитывали получить гибридный белок Protein A:¡PI-PLC размером около 66 кДа. N-конец этого белка представлял собой имиуноглобулин-свяэивающий фрагмент ProteinA размером около 30 кДа, а С-консц - PI-PLC размером 36 кДа.

С целью исследования продукта, кодируемого плазиидой pLC7,

- ÍJ -

бил проведен иммуноблотннг лизата штамма N4830. l-pLC7. Иммунобло-тинг проводился с коньюгатом неспецифических антикроличьих антител. Неспецифическое взаимодействие с антителами обеспечивалось имчуноглобулин-свяэывающим доменом FroteinA. В качестве контроля использовался несущий векторную плаомнду штамм N4830.l-pRIT2T. Контрольный штамм продуцировал неспецнфически иммунореактивнмй белок с массой около 30 кДа', соответствующий кодируемому им домену ProteinA. В штамме, содержащий рекомбииантную плазмнду pLC7, был выявлен неспецифически кымунореактивный белок размером около 66 кДа, что соответствует расчетному размеру гибридного белка Protein A::PI-PLC (Рис.За). Это доказывает созданная нами конструкция обеспечивала продукцию з E.coli полноразмерного гибридного белка ProtеinA::PI-PLC.

Приступив к очистке гибридного белка, ми обнаружили, что он находится в нерастворимой фракции клеточного лизата E.coli НВ101-pLC7 и, видимо, связан с мембранами. Гидрофобность гибридного белка определяется его фосфолипазной частью, т.к. кодируемый вектором pRIT2T иммуноглобулин-связизающий домен ProteinA пол-кость» находится в растворимой фракции. Обработка слабым детергентом (0,5Х Triton Х-100) нерастворимой фракции клеточного лизата позволила перевести гибридный белок в растворимое . состояние. После чего он был очищен с помощью аффинной хроматографии как описано а Материалах и Методах (Рис.36).

6. Получение моноспецнФической антисипоротки к ФосФолнпаде

Нашей следующей задачей было получение моноснецифической ан-тисыворотки, выявляющей PI-PLC. Приступая к иммунизации мы предполагали, что 1) фосфолнпаза сама по себе не будет являться сильным иммуногеном, т.к. анализ се структуры по методу (Норр and Woods, 1981) не выявил присутствия сильных антигенных детерминант, она слабо-гидрофильна и кроме того имеет гомологию с эукариоти-ческими PI-PLC (Leimeister-Wachter et a!., 1991); 2) что в соста-

ве гибридного белка фосфолипаэв сохраняет, по крайней мере частично, свою нативную структуру, и, следовательно, антигенные дел

терыинанты, и 3) что повторяющаяся структура фрагмента Белка А может стимулировать иммунный ответ в том числе и на фосфолилаэную часть, гибридного белка.

На основании этих соображений мы не стали выделять PI-PLC кз состава гибридного Белка. Иммунизация кролика проводилась очищенным препаратом гибридного белке Protein A::PI-PLC с целью по- * лучить сыворотку, специфично определяющую PI-PLC.

Иммунизация проводили кег: описано » Материалах и Методах. В обгцей сложности кролик был иммунизирован 800 мкг чистого белка. Полученная антисыворотка использовалась в разведениях 1:200

Для контроля специфичности мы использовали хультураль-ну» жидкость L.monocytogenes (втаьзу МСТС7973). Поликлональ-, пая антисыворотка к гибридному белку Protein А::Pi-PLC выявляла присутствие я культу-ралы^пй хндкости иимунореак,-тивиого белка с молекулярной массой около 34 ЕДа, что соответствует массе зрелой формы PI-PLC (Рис.4). Т.о. получен-аидкости L.monocytogsnas НСТС7973 пая нами полнклопальнап антк-1-антксыворотка к белку Protein/.: сыворотка к гкбрндноиу белку :PI-PLC, 2-контрольная Protein A::PI-PLC спсцнфи-

антксиворотка нои^ыун.юго чески выявляет иатианую

жипотного PI-PLC.

1:1000.

2 1.

Рис.4 Изучение специфичности... антисыворотки • к гибридному белку Protein A::PI-PLC в отношении натнвной фосфолипази, присутствуюцей в культуральной

- IS -

Это является свидетельство« факта, что P1-PLC сохраняет по крайней мере частично, свои антигенные детерминанты в составе гибридного белка Protein A::PI-PLC.

7 Анализ экспрессии реконбннпнтного гена plcA в E.coli

Полученная ангисыворотка была использована для анализа экспрессии рекомбмнантного гена PI-PLC в E.coli.

В штамме N4830.l-pLC3 было выявлено присутствие имммунореак-тивного белка с массой около 36 кДа, что соответствует массе рекомбинантной фосфолипаэы. В контрольном штамме этот белок отсутствует. Это доказывает,что в штамме E.coli, содержащем ген plcA под контролем промотора лактозного оперона, происходит экспрессия рекомбинантной PI-PLC. обладающей иммунологическими свойствами нативного белка.

Количество продуцируемого рекомбннаптного белка было оценено исходя из сравнения иммуноблотов раститрованного лизата N4830.1 -pLC3, содержащего известнее количество клеток, с раститровкой культуральной гидкости L.monocytogenes (штамм КСТС7973),количество фосфолипазы а которой било известно (данные предоставлены Ю.®.Белым). Оценка показало, что количество рекомбинантного белка не превышает 5 мкг в литре культуры. Относительно низкий уровень продукции рекомбинантной PI-PLC мы связали с возможный низким уровнем инициации трансляции гена plcA, связанным как со строением сайта связывания рибосом, так и с неканоническим инициирующим кодоном (TTG вместо ATG).

В штамме W4830.1-pLC2, в котором экспрессия гена plcA контролируется только собственным промотором, присутствие рекомбинантной PI-PLC с помощью антисиворотки выявлено не было. В то же время в нем было продемонстрировано наличие транскрипции гена plcA. Мы предположили, что этот факт отражает низкий уровень

транскрипции с собственного промотора. По-видимому1 он мог бить детектирован только благодаря высокой чувствительности использованного для выявления мРНК метода Обратной Транскрипции-Полиые-разной Цепной Реакции. Чувствительности метода иммуноблоткнга не достает для детекции соответствующего количества рекомбипантного, белка.

8 Анализ различий в уровне продукций PI-PLC разными ртам-уами L.monocytogenes

Изучение от&миоспецифических особенностей продукции PI-PLG листериямн преследовало цели, во-первых, установления возможных корреляционных связей усяду источником выделения » уровней продукции PI-PLC, во-вторых, изучения возможности создания на базе ыоноспсцифнческоА антнсыворсткн к PI-PLC нммуноферментной системы для выявления L.aonocytos^nes. *

Был проведен скрининг коллекции ытамиов L.monocytogenes, принадлежащих к разным серогруппам к выделенных из различных ис- -точннгос. Параллельно все втаымы проверялись на наличие гена plcA с помощью ПЦР.

Результат« представлены в,таблице 2. Всего был проверен 21 итамм ¡..monocytogenes Были обнаружены значительные итаыиоспецифн-чеекке отличия в уровне продукции P1-PLC: от четко бынвлясцой до не выявляемой. Четкой корреляция иежду уровней экспрессии к кс-точнкиои выделения но наблюдалось. Так, из 11 trrauuoa, выделенные от лвдей, продукция PI-PLC отсутствовала в 4, из них три птакма

Таблица 2 Скрининг птаимов I.monocytogenes

DTEMU источник серогрупла выявление ПЦР с

PI-PLC праймерамн

Pic Hly

L.monocytogenes

NCTC 7973 коллекция МСТС 1/2а + + +

EGD тот асе 1/2а - + +

NCTC 5343 тот ля 1/2с •f + +

НСТС 5214 тот же 4а + + +

NCTC 10527 тот яе 4Ь + + . +

МСТС 19117 тот же 4d ++ + +

12 ел ии. 1/2а + + +

Нелюбова клин., менингит, 1 • - + +

Костюченко КЛИН. 1 + +

Q 18-7,6,. клин., беременная 4Ь + + +

PI 8-32 клин. и.о. 4* + +

Р22-6Э клин., береиенная 1/2а + + +

Р87-345 клин., иоворождетшй 1/2Ь - + +

РЗО-124 клин.; здоровый 4Ь - +

Р53-194 клни., беременная 4Ъ - + +

Q9-14 клин., иенинглт II.о - + +

Р27-117 клин., пояорозденниЗ 4Ь + + +

Р78-315 окрухак^эя среда, сточнце води 4Ь ♦ + + -

P26-S4 пищевые ирод.,молоко 4Ь -

Р40-144 пицепие продукти 4Ь - . +

Р30-130 пи^опие прод., ск? 4Ь * ■9-

L. innocua

SLCC3723 коллекция НСТС 6Ь - - -

SLCC3379 тот гге б а. - - -

L.scel {¡¡eri

IS/100 ТОТ S8 t - -

Streptococcus

pneumoniae

321 коллекций ККМЗМ - -

128 ии.Гамалеи - -

Bacillus

subtil is

163 тот so -

Bacillus

csretis тот ге •' - и/о

Escherichia

coll

HB101 то г яе -

Legioiiel la

pneunophi1

Philadelph at тот я» . , V" ■ - и/о

Mycoplasma н/о

feraientas тот ate -

Mycoplasma н/о

pneumoniae тот же . —

н/о - не определялось

били выделены от больных людей и I - от здоропого, из 3 втаммоп, выделенных из продуктов питания продукция была выявлена в 1, и также PI-rLC была обнаружена в единственном втайне, выделенном из окружающей среды. С другой стороны у всех станков было выявлено присутствие гена plcA.

»

Интересно, что в птамме EGD» из которого, собственно, был клонирован ген plcA, продукция находится на чрезвычайно низком уровне и сдг>а различима при анализе иныуноблота. Другой штамм, NCTC19117, относящийся к ссрогруппе 4d, имел значительно повышенный уровень продукции. За базовый уровень был принят уровень

штамма МСТС7973, приблизительно соответствующий среднему уровню.

>

Т.о. мы показали, что уровень экспрессии PI-PLC в разных штаммах значительно различается, вплоть до невозможности выявления продукции PI-PLC с помощью нммуноблотннга, поэтому разработка' иммунологической системы для выявления .1.monocytogenes на основе моноспсцифической сызорогки к PI-PLC, по-видимому, не имеет перспектив. С другой стороны положительные результаты ПЦР говорят о перспективности разработки системы для выявления возбудителя на основе ПЦР.

9 Разработка амплнбиканионныя систем для выявления L.monocYta-senes

Суть метода полимеразной цепной реакции заключается в многократной амплификация специфического фрагмента ДНК патрицы, дозволяющей визуализировать этот фрагмент на гель-электрофорезе или с помочью блот-гибрндиьацнн.

Специфичность реакции обеспечивается использованием в качестве затравки специфичных для матрицы прайиеров и подбором таких условий проведения реакции, что гишнчие единичных нуклеотнд-

них замен в последовательности матрицы иигибирует реакции.

Разработанная пани амплификациопная система на основе последовательности гена plcA давала положительный результат со всеми исследованными штаммами L.полосуtogenes, принадлежащими к серог-руппаи 1/2з,1/2с, 4а, 4b, 4d (Табл.2). С другой стороны, при анализа непатогенных L. i ллосиа (штамми 5LCC3723, SLCC3379), L.sceli-Seri (штамм SLCC 13/100) результат бил отрицательным. Специфичность системы била такхе проверена на ряде других микроорганизмов: B.cereus (имеющую гомологичный ген), B.subtilis (штамм 168), В.coli '("IIB 101), L.pneumophi1л (Philadelphia), Mycoplasma pneumoniae, M.feraentas. В использованных нами условиях'неспецифических продуктоо реакции с ними не наблюдалось. Т.о.разработанная система специфично выявляет фрагмент ДИК L.aonocytoscnes и цохет бить использована для анализа бактериальных культур.

Чувствительность ПЦР определяли, используя клеточные лиз&ты L.nonocytogcnos (сатвки EGD), содержание от 10® до единичных клеток. Чувствительность нашей снстсш; составила 1000 клеток в образце. . "

«

С целью сравнения разработанной нами системы с уже имеющимися мы использовали систему на основе последовательности гена лнете-риолизкна hly, описанную в работа Пгпсег and BoycheJc (1989). Авторы показали, что эта система обеспечивают видоспецифическое проведение ПЦР. Наша данные это подтзердилн. Был исследован 21 итамм L.mor.ocytogenes (табл.2), псе они давали иолоянтельные результаты. Отрицательные результаты били получены с L.innocua (SLCC3723, SLCC3379), L.seTs ligeri (SLCC18/100), Streptococcus pneumoniae (321, 128), B.subtilis (1CS), E.coli (HB101).

Чувствительность при использовании системы на основе после-

дователыюсти гена Ыу у нас достигала 10 клеток в ^образце, что существенно превышало чувствительность системы на основе послсдо-вательности гена р1сЛ.

10 Разработка методики выявления листепнй в тканях дипотимк ее апробация в условиях экспериментального зараг-ения кии ей

Разрабатывая методику выявления листсркй в тказ!ях хивотни;:, иы использовали амплификацноииу» систему из основе последовательности гена лкстсрнолнзина Ыу.

Табл.3

Выявление г!а тэпосу1й£еп23 в селезенке

экспериментально зарагзных иьпзгй

1 1 1 ■ 1

| срок | доза зар&зениз | наличие 174 н.л. | высев |

(клеток) | продукта ПЦР 1 ! 1 1

| з дня | 1 10» | ■ + ! 1 Г + !

10' | + 1 +' 1 1 1

|7 дней | 10' I + 1 * 1

10« | + | + 1 1 ]

|14 дней| 10« | ! 1

104 | + 1 {

«•■ 1 ! !

¡21 день] 10« | - I ~ 1

10« ; ( 1 ~ 1 ! !

|28 дней| 105 | - I - ' 1

10« ( - ! - !

1 ,, * Л........ 1

+_ - отдельные колонии

Рутинно применяемая 1зетоднз:а саеиолыюП экстракики ДНК из ав-

вотных тканей приводит ¡с значительный потерям, что оиачктекьно

уменьшает чувствительность. Нашз Сила разработана методик» Ссзф--

нольной грубой экстракции ДНХ, позволяющая получить груЕо очищен-

шле, но не ингибирукяцие ПЦР препараты. В модельных экспериментах с внесением клеток лнетернй в образцы селезенки здоровых мышей, нам удавалось выявлять до 100 клеток в образце.

Разработанная система била использована для определения листерий в селезенке экспериментально зарахенкых животных. Заражение проводилось внутривенно сублеталышми дозами 104 и 105 клеток (втамк Костюченко). Параллельно проводились высевы на твердую питательную среду (табл.3).

В ПЦР возбудитель выявлялся па сроках до 2-х недель, что хорошо коррелировало с результатами высевов. При высевах на 14 день обнаруживались только отдельные колонии (до 10). Тем не менее в ПЦР возбудитель четко выявлялся. Это свидетельствует о том, что в селезенке мышей находились ухе не хизнеспособные, но еще сохранившие ДНК бактерии.

Т.о. разработанная нами методика выявления возбудителя на основе ПЦР является одновременно видоспецифичной и высокочувствительной и представляется перспективной для создания соответствующего диагностикума.

с

выводы

1. При клонировании гена фосфатидилинозитол-специфичной фосфолипазы С (PI-PLC) plcA из Listeria monocytogenes в E.coli установлено:

- транскрипция гена plcA в E.coli ыохет осуществляться как с собственного промотора, так и с лактозного;

- выявляемый рекоибкнанткый белок обладает. антигенными свойствами, аналогичными свойствам натипиой фосфолипазы;

- экспрессия рекомбинантного белка с лактозного промотора

составляет около 5 икг/литр культуры, что значительно превышает уровень экспрессии с собственного промотора.

2. Сконструирована плазмида, несущая гибридный ген spa::plcA, 5'-конец которого является частью гена белка A (spa) из Staphylococcus aureus, а 3'- конец - лишенным промотора геном. plcA. Показано, что полученная конструкция детерминирует синтез в E.coli полноразыерного гибридного белка Protein A::PI-PLC.

3. Получен очищенный препарат гибридного белка Protein А: :PI-PLC и поликлональная кроличья антисыворотка к нему. Полученная антисыворотка к гибридному белку специфично выявляет нативную ф'осфолкпаэу, что свидетельствует о сохранении антигенных детерминант фосфолипазы в составе гибридного белка.

4. Выявлены значительные вариации в уровне продукции PI-PLC разними штаммами L. monocytogenes, вплоть до невозможности выявления экспрессия фосфолипазы в некоторых, в то хе время ген PI-PLC plcA присутствует у всех исследованных штаммов.

5. Разработаны две видоспецифичные системы для выявления L.monocytogenes на основе метода полимеразной цепной реакции. Показано, что чувствительность системы на основе последовательности гена листериолизина Ыу выше аналогичной системы па основе гена pJcA и составляет около 10 клеток в пробе, против 1000 клеток у второй системы. Видоспсцифнчпость систем показана при скрининге 29 штаммов листсрий н др. ынкроорганнзиов.

6. Разработанная амплификациопная система на основе последовательности гена hly в условиях экспериментального заражения мишей выявляет возбудитель листериоэа в органах и тканях мышей в течение двух недель, не уступает по чувствительности и специфичности бактериологическому методу, но позволяет выявлять возбудитель в 10-15 раз быстрее.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ермолаева С.A. i Зигангирова Н.А., Маракуша Б.И., Тартаковский И.С., Гинцбург А.Л. "Разработка метода выявления Listeria monocytogenes на основе метода полимеразной цепной реакции"//Тез. Всероссийской конференции по проблемам лнетериоза. - Покров, 1993

2. Ермолаева С.А., Зигангирова Н.А., Маракуша Б.И., Тартаковский И.С., Прозоровский С.В. "Видосиецнфнческое выявление Listeria monocytogenes методом- направленной амплификации ДНК"// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1994. - N1. -С.26-30

3. Ермолаева С.А.. Белый И.О., Тартаковский И.С., Гинцбург А.Л. "Получение и характеристика гибридного белка Protei-nA::PI-PLC L.monocytogenes"// Тез. VI Конференции Российской Федерации " Новые направления биотехнологии. - Пущино, 24-26 мая 1994г. - С.75

4. Ермолаева С.А.■ Белый Ю.Ф., Тартаковский И.С., Гинцбург А.Л., Прозоровский С.В. "Клонирование и экспрессия фосфатидилино-зитол-специфичпой фосфолнпаэч С L.monocytogenes"// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1994. - NS. - С.