Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение рекомбинантного человеческого эндостатина и исследование его антиангиогенных и противоопухолевых свойств

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение рекомбинантного человеческого эндостатина и исследование его антиангиогенных и противоопухолевых свойств"

На правах рукописи

□ОЗОБВБТЗ

Позднякова Наталья Владимировна

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБ ИIIАIIТ110 ГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЭНДОСТАТИНА И ИССЛЕДОВАНИЕ ЕГО АНТИАНГИОГЕННЫХ И ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ СВОЙСТВ

Специальность 03 00 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

003058673

Работа выполнена в Государственном учреждении здравоохранения Московском научно-исследовательском институте медицинской экологии Департамента здравоохранения г. Москвы

Научные руководители член-корреспондент РАМН,

доктор химических наук, профессор Сергей Евгеньевич Северин

доктор биологических наук, профессор Сергей Викторович Луценко

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Александр Иванович Глухое

кандидат биологических наук Анастасия Вячеславовна Березникова

Ведущее учреждение Институт биоорганической химии

им ММ ШемякинаиЮА Овчинникова РАН

Защита состоится » , //-¿Р//7 2007 г в часов на заседании

Диссертационного Совета Д 212 203 13 при Российском университете дружбы народов по адресу 117198, г Москва, ул Миклухо-Маклая, дом 8, медицинский факультет

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу 117198, г Москва, ул Миклухо-Маклая, дом 6

Автореферат разослан «/#» /Лщрд^ 2007 г

Е В. Лукашева

Ученый секретарь Диссертационно! о совета Д 212 203 13 доктор биологических наук, профессор

Общая характеристика работы Актуальность проблемы. Раковые опухоли могут расти только при условии формирования собственной сети кровеносных сосудов, обеспечивающих опухоль кислородом и нутриентами С тех пор, как американский ученый И Фолкман постулировал зависимость роста опухолей от их кровоснабжения, специалисты, работающие в области молекулярной медицины, пытаются бороться со злокачественным ростом, блокируя ангиогенез - процесс образования новых опухолевых кровеносных сосудов из пред существующих [Ро!ктап 1, 1971] Возможно, именно с помощью антиангиогенной терапии удастся обойти одно из главных препятствий в химиотерапии рака, состоящее в том, что злокачественные клетки быстро приобретают устойчивость к противоопухолевым препаратам Опухолевый рост сопровождается одновременным формированием сосудистой сети После сеанса химиотерапии большинство раковых клеток погибает, но некоторая их часть благодаря мутациям, хромосомным перестройкам или индукции экспрессии отдельных генов оказывается устойчивой и выживает, неповрежденными остаются и сосуды, так что опухоль снова быстро прогрессирует При этом такая опухоль, прошедшая естественный отбор, уже обладает лекарственной устойчивостью, и повторное лечение этим препаратом не приносит терапевтического эффекта

Особый интерес в качестве мишени химиотерапии представляют собой клетки, выстилающие внутренние стенки сосудов, образующие эндотелий У вновь образовавшихся капилляров эндотелиальные клетки имеют маркеры, отличающие их от эндотелиальных клеток полностью зрелых сосудов Это важно, поскольку позволяет вести поиск лекарственных препаратов, специфически разрушающих только новообразованные сосуды, не повреждая остальные Важно также, что клетки эндотелия доброкачественны и генетически стабильны и поэтому не обладают способностью к быстрому приобретению устойчивости Таким образом, при проведении антиангиогенной терапии после сеанса лечения разрушается не сама опухоль, а питающая ее кровеносная сеть, что является причиной быстрой регрессии опухоли, лишенной оксигенизации и источников питания При прекращении проведения терапии может наблюдаться повторный рост опухоли, однако лекарственная устойчивость не возникает

Среди известных в настоящее время ингибиторов ангиогенеза одним из наиболее перспективных является эндостатин, который представляет собой С-концевой протеолитический фрагмент коллагена XVIII Даже при длительном терапевтическом применении эндостатин не вызывает возникновения резистентности у опухолевых клеток и при этом обладает ярко выраженным терапевтическим эффектом Необходимо заметить, что этот антиапгиогенный агент может быть использован не только в противоопухолевой

терапии, но и при лечений других болезней, связанных с нарушением ангиогенеза Важной особенностью антиангиогенной терапия является возможность ее комбинированного применения с другими видами терапии, такими как радио-, иммуно- или химиотерапия

Широкие терапевтические перспективы диктуют необходимость разработки эффективных систем получения растворимого рекомбинантного эндостатина Так как в системе экспрессии Escherichia coli получение рекомбинантного эндостатина в растворимой форме, предпочтительной для использования в клинической практике, представляет собой трудно разрешимую проблему, в настоящее время для клинических исследований в США и Нидерландах используется рекомбинантный человеческий эндостатин, полученный в дрожжевой системе экспрессии (Р pastora) Однако в дрожжевой системе экспрессии выход целевого белка невысок и недостаточен для массового использования в клинической практике [Dhanabal М at al, 1999], а в системе Е coli белок экспрессируется в виде нерастворимых в физиологических условиях телец включения Поэтому по-прежнему остается актуальной проблема разработки метода получения растворимого рекомбинантного эндостатина в системе экспрессии Е coli, которая по сравнению с другими [Zhang L at al, 2003, Su Z at al, 2006, Park J at al, 2001, Rokstad A at al, 2003] является наименее затратной и наиболее технологически простой, способной обеспечить высокие выходы биологически активного белка Важной задачей является также исследование возможностей повышения биодоступности и терапевтической эффективности эндостатина при его применении в составе наночастиц и липосом

Исходя из этого, актуальной целью данного исследования являлась разработка эффективного метода получения рекомбинантного эндостатина человека и исследование возможности применения его различных форм для терапии злокачественных новообразований

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи •разработать эффективный метод получения рекомбинантного эндостатина человека и исследовать т vitro специфическую активность полученного белка,

• сравнить т vitro чувствительность пролиферирующего и конфлюентного эндотелия к действию рекомбинантного эндостатина человека,

• получить наночастицы на основе поли-М-виншпшрролидона с эндостатином и исследовать их противоопухолевую активность in vivo,

• получить липосомную форму эндостатина на основе лецитина и холестерола и исследовать in vivo ее противоопухолевую активность,

• в экспериментах in vivo исследовать терапевтическую эффективность сочетанного применения липосомной формы эндостатина и химиопрепаратов доксорубицина, карминомицина и таксола

Научная новизна Сконструирована экспрессионная плазмида, позволяющая эффективно осуществлять индуцируемую экспрессию эндостатина человека в клетках штамма-продуцента Разработаны модифицированные методы очистки и ренатурации рекомбинантного эндостатина, позволяющие получать высокоочищенный препарат белка с высоким выходом Впервые получены липосочная и наносомная формы эндостатина и продемонстрировано, что противоопухолевая активность этих форм значительно превышает активность свободного эндостатина Впервые продемонстрировано, что комбинированное применение липосомной формы эндостатина и противоопухолевых химиопрепаратов позволяет существенно повысить эффективность противоопухолевой терапии

Практическая значимость результатов работы Разработанные методы получения рекомбинантного эндостатина могут найти применение в биотехнологии для осуществления пилотных наработок эндостатина

Полученные липосомная и наносомная формы эндостатина, оказывающие эффективное противоопухолевое действие, могут найти применение в области молекулярной медицины при создании новых антиаигиошшых противоопухолевых средств

Продемонстрированное преимущество комбинированной противоопухолевой терапии, включающей применение липосомной и наносомной форм эндостатина и цитотоксических препаратов, создает предпосылки для поиска новых наиболее уязвимых к терапии типов опухолей и разработки эффективных схем терапии в области практической онкологии По результатам проведенной работы оформлен патент РФ на изобретение Апробация работы и публикации Основные результаты исследования обсуждались на 19-м заседании Европейской ассоциации исследования рака (Будапешт, Венгрия, 2006) По теме диссертации опубликованы 1 тезисы доклада, 3 печатные работы и оформлена заявка на выдачу патента РФ на изобретение

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает следующие разделы введение, обзор литературы, главу с описанием материалов и методов исследования, собственные результаты исследования и их обсуждение, выводы и список цитированной литературы Библиографический указатель имеет № наименований, из них '[ отечественных и /j У зарубежных источников и J электронных ресурса Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит Л таблиц и рисунка

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клеточные линии В работе использовали клеточные линии карциномы предстательной железы человека DU 145, карциномы молочной железы человека MCF-7, меланомы В 16, культуру эндотелиальных клеток аорты быка АВАЕ, линию эндотелиальных клеток лимфатических сосудов мыши SVEC4-10, первичную культуру эндотелиальных клеток пупочной вены человека HUVEC, а также гладкомышечные клетки аорты быка линии bSMC и первичную культуру фибробластов человека

Получение липосомной формы эндостатина Липосомы, содержащие эндостатин, получали методом экструзии [MacDonald R.C, 1991]

Получение наночастиц. Наночастицы на основе модифицированного поли-М-винилпирролидона с эндостатином бьши получены, как описано в работе [Sharma D , 1996] Для определения степени включения веществ в наночастицы полученные препараты осаждали ультрацентрифугированием и измеряли в супернатанте концентрацию невключенного вещества спектрофотометрическим методом Распределение размеров наночастиц определяли методом динамического светорассеяния на широкоугловом лазерном фотометре рассеянного света ALV-5 (Германия)

Определение ЦТА препаратов in vitro проводили, используя МТТ-тест согласно методике [Mosmann Т, 1983] для количественного определения выживаемости клеток при инкубации в среде, содержащей цитотоксический агент Выживаемость клеток в контрольной и в обработанной препаратами группах определяли через 72 ч инкубации

Определение противоопухолевой активности препаратов in vivo Исследование противоопухолевой активности различных препаратов эндостатина проводили на мышах линии C57BL/6 с привитыми опухолями мышиной меланомы В16 Опухолевые клетки трансплантировали подкожно в область спины животных (2x105 клеток в 0,1 мл физиологического раствора) Каждая контрольная группа состояла из 10 животных, экспериментальная - из 6 животных Препараты эндостатина вводили животным внутривенно, начиная с 7-го дня после прививки опухоли Терапию препаратами эндостатина осуществляли в течение 20 дней Размер солидных опухолей измеряли один раз в 2-3 дня В качестве химиопрепаратов при комбинированной терапии применялись антибиотики антрациклинового ряда доксорубицин и карминомицин, а также цитостатик класса таксанов таксол Химиопрепараты вводились животным внутривенно в течение 5-ти дней, начиная со 2-го дня после прививки опухоли

Статистическая обработка результатов Статистическую достоверность полученных данных определяли, используя /-критерий Стьюдента с помощью компьютерной программы

Efrigin™ 6.0 (Mieroed Software Inc., США). Как статистически значимый рассматривали уровень jö<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОЕАШ!Я И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

PTS lût о к BS

Получение растворимого ре комби навйгного эндостатина человека Для получения рекомВшантного эндостатина человека била сконструирована

плазм ид нал ЛИК. содержащая ген эндостатина человека. качестве

источника гена эндостатина была использована библиотека генов человека. Фрагмент геиз коллагена XVII!, соответству ющи й последовательности, кодирующей эндосгатин, бьш выделен методом амплификации Полученный участок вставили по сайтам рестрикции Со1Е1 ВагаН! и Нш<Ш1 в вектор рОЕ,

„ _ __ _ . Результирующий вектор назвали рОЕ-Еп(1

Рис. 1. ЗкСпрСССНОННЫИ вектор рОг-г.пп, 1 г

колирующий биосинтез рекомбмма........о (рис 1). Далее подбирали подходящий

ЛтрК

Lad'

-Ц|.1ЛС1Я[НМ11 'IL' l.ils. kn

К. coli Щ 109.

штиммс-продуцен гс

целевого белка. Уровень синтеза эндостатина человека определяли в различных штаммах Escherichia coli, содержащих плазмиду pQE-End. В результате проведенного скрининга штаммов был выбран оптимальный продуцент - штамм Е. сой JM 109, в котором уровень продукции целевого белка был достаточно стабильным и максимальным в условиях исследования. Экспрессию гена эндостатина человека осуществляли в рекомбинантной плазм иде

штамм-продуцент

KjU

44 I

67- I

43 4 •SU 1

20,1 - I

14.4- I

экспрессии

I

Рис. 2, Электрофореграмма тотальны! .,, , г. Г ЛН1ЯТОВ клеток штаммоп hl, coli JM 109,

руь-ыш в среде для наращивания ь. сои, ............ММН1И1,0 н иегрямсфор-

сначала в отсутстоге индуктора I ас-промотора ""?«»»"»«"> мепр««. ™.,ыМ вектором

pQt.-t.nd. ] СТЯИДПрТ!.; молекулярных мие^ 2

ИПТГ, л по достижении мутности среды Ш«и = штамм сЫ<- содержащий плазмиду

pQK-End; 3

0,4-0,6 добавляя индуктор ИПТГ до pQE-End.

цггамм. tte несущин плазмцды

концентрации 0.1-0.3 мМ и продолжая экспрессию под контролем индуцированного lac-rrpoMO'lOpa рекомбинаятной плазмиды, Уровень продукции бедка ожидаемой молекулярной массы (20 к Да} анализировали с помощью электрофореза лизатов клеток Е. coli » 15%-ном ПАЛ!' и присутствии ДСН (рис. 2). Как следует из представленных данных, клетки Е. coli, содержащие плазмиду pQEÏ-Ënd, экспрессируюг рекомбинантиый энлостатан. 11родуктнвноёть полученного штамма Е. coli J M109 составила 46 tipln культуры.

Для удаления бактериальной клеточной ободочки я линополисахаридов с помощью л изо ним а получали протопласты. Это облегчало дальнейшую дезинтеграцию клеток и позволило увеличить вы ход целевого продукта. Уяыразву ковая дезинтеграция протопластов клеток с последующим uei прифугиро ванием и ресуснеидиро ван не м осадка проводилась трижды, причем для лучшей отмывки гелец включения от белковьех и небелковых примесей в буферы был введен на первых двух этапах отмывки детергент - 0,1% раствор дезоксихолата натрия - и на нос.цбднем 2 M раствор мочевины 11олученный осадок телец включения был сразу же суспендирован в нейтральном буфере, заморожен при -70"С и лнофильно высушен. 11ред став ленная методика позволила получить тельца включения, содержащие отдостатин высокой степени чистоты (рис. 3, дорожки 3,4).

Экспрессирующийся эндоетатнн образует нерастворимые телыЩ включения в клетках штамм а-продуцента IÎ связи с угим в процессе очистки необходимо последовательное выделение и солюбилнзация телец включения. Однако при переведении эпдостатипа из денатурирующих условий в условия, при которых возможно образование

дисульфидных связей, происходит его преципитация. >ю связано со свойствами самого белка. который, if а к было обнаружено [Kranenburg 2003, Gebbink I . 200 (|, склонен к образованию не только м еж молекулярных дисульфидных связей, но н характерных амилоидных структур, стабилизированных водородными

межмолекуляриымн связями,

возникающими между ^-структурами молекул Были предложены различные методики получения ренатурированного эпдостатипа (Huang Х..2001. Хи R..2002], в

«Да

&1-

144 - —

i г з 4 s б i s Рис. 3. )|,к i рофореэ препаратов тндостатння : ря%л нчйы% спдии вытеснив. 1 стандарты молекулярной массы; 2 биомасса лтамми-

ирпд> |ц-п:-,1, 3, 4 препарат телец нк.чюченин; 5, 6 препарат эпдостатипа ht стадии ренатурацни: 7. Я осадок [еослс с i.: vu: ренатурации. 2. 5. 1 & прнсучствии р-меркагттрэтанола: ■ 6. 3 й отсутствии

ß - M L' р Кн I П^ Т: «Йш,

том числе с использованием молекулярных шалеронов [Хч N.. 2005]. Однако проблема получения эндосшина в кативнОЙ Конформации в препаративных количествах и с высоким выходом в полной мере до настоящего времени не решена и остается актуальной и на сегодняшний день.

Анализ показал, что практически весь эндостатин и тельцах включения содержится и {Полностью восстановленной форме, характеризующейся меньшей подвижностью в ПАЛ!". 13 связи с этим был предпринят подбор условий рсиагурации Реп ату рацию эндостатина проводили при низкой концентрации белка - 0.02 мг/мл в буфере, содержащем 0,1 М раствор трис-гидрохдррида, (рН 8.0). I М раствор мочевины, 1% раствор О-маинигола, I мМ расти о р глутатиона окисленного (0880) и 5мЫ раствор глутатнона восстановленного (0811), в течение 4 еут 11ри этих условиях наряду с ренатурацией эндостатина все же происходит его частичная агрегация. Основная часть агрегированного эндостатина (50%) образуется при переходе из еильноденапурирующих условий (6 М раствор мочевины) в

слабоденатурируюнше (1 М раствор мочевины) (рис. 3. дорожки 7 и К). 11ри исключении редокс-пары (0811-088(1) и I М раствора мочевины из буфера в чоде диализа ре] [ату р про ванный белок не агрегирует и может храниться и буфере, содержащем 0.1 М раствор трнс-гидрохлорида (рН 8.0), при +4°С в течение как минимум

месяца. Раствор белка с иомотио

А зад 5.0 4 0 3.0 2.0 1.0 0 0

Эндостатин

I

UL

10

20 30

Время. МИН

Рис. Профиль i i m 1111 и реконбнн я нгпого ihukiíi i имя человека на колонке с Superóse (Phsrmada) í.í'.lv j.5 сч); члнн'ш флефшно-солеионбуфер,11И 7.4.

кДа

94-

4J

диализа был переведен в буфер, содержащий 0.05 М раствор ацетата аммония (р!14.0). и диофилмш высушен. Перевод белка в кислый буфер возможен в связи с высокой растворимостью реи атурирова ш юго эндостатина, сохраняющего свою наггивную конформацню при кислых значениях рН ILi В. ,2004, Wu Х„ 2004].

Для дальнейшей очистки белка использовали гель-фильтрацию на колонке Superóse 12 (Pharmacia) при умеренном давлении (КР1.С). Профиль и и они и белка с

30

20.1 й • 14.4- *

Рис. 5. Электрофоре грамма и реп ар я i а эндостатина поем Сталин очистки мл колонке с Superóse 12. 1 ^ндарты моле кулярнпн массы; 2 препарат эндостатина н опсутствии Р-меркастоотанола; Ъ i присутствии |i-

меркаптоэтанола.

колонки и электрофоретический анализ полученного препарата приведены на рис 4 и 5, соответственно В результате очистки был получен белок с чистотой >98% Выход эндостатина составил 46 мг из 1 л культуры

Получение наночастиц, содержащих эндостатин

В результате работы были получены наночастицы с соотношением [активное вещество/полимер] 1 2 При данном соотношении веществ степень включения эндостатина в наночастицы составляла -85% Диапазон размеров наночастиц составлял от 17 до 100 над Усредненный диаметр наночастиц составлял 55,8 нм Получение липосомной формы эндостатина

Для получения липосомной формы эндостатина применяли метод экструзии Липосомы получали ультразвуковой обработкой дисперсии оволецитин-холестерин-белок с последующим многократным продавливаниеч через ядерный поликарбонатный фильтр Размер полученных липосом был строго фиксированным и составлял 100 нм Поскольку капилляры, образовавшиеся в результате опухолевого неоангиогенеза, характеризуются наличием в слое эндотелия большого количества пор размером до 800 нм, липосомы при циркуляции в кровотоке будут проникать преимущественно в солидные опухоли [Allen Т, 2004], обеспечивая направленный транспорт антиангиогенного препарата

Исследование цитотоксичсской активности препаратов т vitro Цитотоксическая активность эндостатина в отношении эндотелиальных клеток линий HUVEC, ABAF и SVEC4-10

Исследование специфической биологической активности полученного эндостатина in vitro проводили на культурах

К мкМ

эндотелиальных клеток аорты быка АВАЕ (рис 6), эндотелиальных клеток лимфатических сосудов мыши 5УЕС4-10, а также на первичной культуре эндотелиальных клеток пупочной вены человека (1ШУЕС) (рис 7), при этом в качестве контроля использовали препарат природного эндостатина человека Эндостатин

о-

0 001

0,01

о.) 1

Концентрация, мкМ

— Покоящиися

0 035

0 198

оказывал дозозависимое ЦИТО- Рис 6 Цитотоксическая активность эндостатина

в отношении покоящихся и пролифернрующих токсическое действие на все три типа эндотелиальных клеток линии АВАЕ

исследовавшихся эндотелиальных клеток Природный и рекомбинантный эндостатин обладали близкой ЦТА в отношении всех линий исследуемых эндотелиальных клеток, что свидетельствует о нативной структуре рекомбинантного белка При этом наибольший цитотоксический эффект рекомбинантный эндостатин оказывал в отношении линии эндотелиоцитов пупочной вены человека НиУЕС (1С50 = 0,022 мкМ) В отношении клеточных линий АВАЕ и 8УЕС4-10 рекомбинантный эндостатин проявлял несколько более низкую ЦТА (1С50 = 0,035 мкМ и 0,052 мкМ, соответственно)

Сравнение ЦТА рекомбинантного эндостатина в отношении покоящегося и пролиферирующего эндотелия показало, что препарат эндостатина проявлял значительно более высокую активность в отношении пролиферирующего эндотелия, характерного для опухолевой кровеносной сети Пролиферирующие эндотелиальные клетки НиУЕС и АВАЕ

оказались заметно более

чувствительными к действию эндостатина в сравнении с соответствующими конфлюэнтными культурами Так, ЦТА рекомбинантного эндостатина в отношении

пролиферирующих эндотелиальных клеток линии НиУЕС превышала активность препарата в отношении покоящихся клеток более чем в 20 раз (рис 7) В случае клеток линии АВАЕ различие ЦТА препарата эндостатина в отношении покоящихся и

пролиферирующих клеток было менее выражено, активность эндостатина в отношении пролиферирующих клеток превышала активность в отношении покоящихся в 6 раз (рис 6) По-видимому, различная чувствительность покоящегося и пролиферирующего эндотелия к действию эндостатина обусловлена фенотипическими различиями активно пролиферирующих и покоящихся клеток

Таким образом, полученный белок проявляет выраженную антиангиогенную активность в отношении различных линий эндотелиальных клеток, что характеризует его в качестве эффективного антиангиогенного агента Очевидно, что активно пролиферирующий эндотелий опухолевых сосудов может являться перспективной мишенью действия эндостатина и других аптиангиогенных агентов

140120

£ 100-и

0

1 80'

га

00

8 бо

2 £0

40

20 •

1СИ

—Покоящимся

эндотелии — — Пролиферирующии

эндотелии 0 022

0 455

0 001 0,01 0,1 1

Концентрация, мкМ

Рис 7 Цитотоксическая активность эндостатина в отношении покоящихся и пролиферирующих эндотелиальных клеток линии НИУЕС

Цитотоксическая активность эндостатипа в отношении гладкомышечных, соединительнотканных и раковых клеточных линий

Для подтверждения специфичности действия эндостатина человека мы инкубировали растворы этого белка с нормальными клетками - гладкомышечными клетками аорты быка линии Ь8МС и фибробластачи человека (рис 8) и с клетками злокачественных опухолей эпителиального гистогенеза линий ОШ45 и МСР-7 (рис 9)

Как следует из данных, представленных на рис 8, эндостатин проявлял цитотоксическое действие на гладкомышечные клетки и фибробласты только в очень высоких (> 5 мкМ) концентрациях В тех дозах, в которых данный ингибитор опухолевого ангиогенеза применяется в

экспериментальной терапии (< 1 мкМ), он никак не влиял на жизнедеятельность нормальных клеток По-видимому, цитотоксический эффект очень высоких

1 «Н »

ш

I 40 20-

Ш

-о- ЬБМС — — Фибробласты

1

Концентрация, мкМ

Рис 8 Цитотоксическая аыгивность эндостатина в отношении бычьих гладкомышечных клеток линии Ь5МС и фнбробластов человека

доз препарата объясняется неспецифическич (например, увеличение осмотического давления среды) подавлением жизнедеятельности нормальных клеток и не имеет физиологического значения

Подобный эффект наблюдали при действии эндостатина на раковые клетки человека - карциномы линий ОШ45 и МСР-7 В дозах менее 1 мкМ исследуемый белок никак не влиял на пролиферацию данных клеточных линий, цитотоксическое действие проявлялось только в дозах более 7 мкМ (рис 9) Можно говорить, что в таких дозах ЦТА препарата практически полностью обусловлена неспецифическим подавлением жизнеспособности клеток в культуре

\

—011145 -Л— МСР-7

(С„, мкМ 19,3

0,1

10

Концентрация, мкМ

Рис 9 Цитотоксическая аетивность эндостатина в отношении раковых клеток человека линий 1)1' 145 и МСР-7

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о высокой специфичности действия эндостатина в отношении активно пролиферирующего эндотелия сосудов Очевидно, что при введении препарата в организм животных или человека он будет оказывать влияние tía эндотелиоциты опухолевых сосудов, отличающихся высокой степенью пролиферативной активности Разрушение опухолевой кровеносной сети должно приводить к нарушению кровоснабжения и подавлению роста опухоли

Исследование противоопухолевой активности препаратов т vivo Исследование противоопухолевого потенциала наночастиц, содержащих эндостатин, в модельных экспериментах in vivo

Известно, что эндогенные полипептидные ингибиторы ангиогенеза подвержены быстрому удалению из организма посредством системы почечной фильтрации [Scappaticci F , 2002] Применение подобных препаратов в составе полимерных наночастиц, очевидно, должно продлить время пребывания их в организме за счет постепенного высвобождения из «наноконтейнеров» и, соответственно, повысить эффективность их действия Проведенные в настоящей работе исследования противоопухолевой активности полученных препаратов показали, что применение эндостатина в составе наночастиц на основе поли-Ы-винилпирролидона в течение 20 дней в дозах 100мг/кг веса животного приводит к значительному снижению интенсивности опухолевого роста по сравнению не только с нелеченным контролем, но и с животными, получавшими гомогенный препарат эндостатина (рис 10) Так, показатель ТРО на день отмены курса терапии наночастицами с эндостатином составлял 66% Аналогичный показатель для гомогенного белка составлял 41% Применение

препарата наночастиц с эндостатином приводило также к значительному УСПЖ животных по отношению как к контролю, так и к группе животных, которым вводили гомогенный ингибитор (табл 1)

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о том, что применение эндостатина в составе полимерных наночастиц способствует повышению эффективности реализации его терапевтического действия, что выражается в более интенсивном

дни посте прививки onj \olll

Рис 10 Влияние гомогенного и вктюченного в наночастииы эндостатина на рост опухолей меланомы В16 у мышеи линии C57BI/6

торможении роста опухолей и увеличении средней продолжительности жизни экспериментальных животных, получавших препарат наночастиц, по сравнению с применением гомогенного препарата Очевидно, что для поиска наиболее эффективных схем терапевтического применения наночастиц, содержащих эндостатин, требуются углубленные дополнительные исследования

Таблица 1 Влияние антиангиогенных препаратов и включающих их наночастиц на увеличение продолжительности жизни мышей линии С57В1/6 с привитыми опухолями меланочы В16 по сравнению с нелеченным контролем

Группа животных СПЖ*, дни УСПЖ**, %

Контроль 33,2±3,6 -

Эндостатин 41,4±3,1*** 24,7

Наночастицы 45,8±3,2*** 37,9

* - средняя продолжительность жизни экспериментальных животных, ** - увеличение средней продолжительности жизни экспериментальных животных, *** - р<0,05 по отношению к контролю

Исследование противоопухолевой активности липосомной формы эндостатина in vivo

Липосомы получали ультразвуковой обработкой дисперсии оволецитин-холестерин-

белок с последующим многократным

продавливанием через ядерный

поликарбонатный фильтр Суммарное

содержание липидов (оволецитина и

холестерина) в липосомах составило

25 мг/мл суспензии, содержание

эндостатина - 3,4 мг/мт суспензии

Размер полученных липосом был строго

фиксированным и составлял 100 нм

Липосомный и гомогенный

рис 11 Динамика развития солидных опухолей рекомбинантный эндостатин вводили меланомы В16 у экспериментальных мышей при

терапии липосомной и нелипосомной формами парентерально мышам С опухолями рекомбинантного эндостатина т,, ,

меланомы В16 ежедневно в течение 20-ти дней Результаты исследования противоопухолевой активности препаратов эндостатина в отношении меланомы В16 у мышей приведены на рис 11 и в табл 2 Как видно из рис 11 и табл 2, применение липосомной формы эндостатина приводит к

о зооп г

— —Коктропь

—л—Эндостатин

—С—Эндостатин липосомный

г ^ S*

/

у /

15 20 25 30 35 40 Дни после прививки опухоли

значительно большему торможению роста опухолей у мышей (68 7%) по сравнению с животными, которым вводили водный раствор белка (34,6%) Терапия липосомной формой эидостатина также приводила к более чем двукратному УСПЖ по сравнению с терапией нелипосомным препаратом (табл 2)

Таблица 2 Сравнительная эффективность противоопухолевого действия эидостатина и его липосомной формы в отношении мышиной меланомы В16 т vivo

Группа животных ОРО*, % СПЖ, дни УСПЖ, %

Контроль 100 27,4±3,1 -

Эндостатин 65,4 32,9±3,6 20,1

Липосомная форма 31 3 42,7±2,2 55,8

* - относительный размер опухоли, данные на 31 день после прививки опухоли

Исследование возможности применения липосомной формы эндостатина в схемах противоопухолевой комбинированной терапии

Поскольку опухоль тесно интегрирована в систему жизнеобеспечения организма и ее прогрессия в значительной степени зависит от системы кровоснабжения, очевидно, что эффективное подавление опухолевого роста может быть достигнуто в результате воздействия как непосредственно на опухолевые клетки, так и на кровеносные сосуды, снабжающие опухоль нутриентами и кислородом Таким образом, опухолевый рост может быть подавлен с помощью сочетанного применения химиопрепаратов, действующих на опухолевые клетки, и антиангиогенных агентов, вызывающих деструкцию опухолевой кровеносной сети В качестве антиангиогенного агента мы испопьзовали липосомную форму эндостатина, проявляющую более высокую антиангиогенную активность по сравнению со свободным белком В качестве химиопрепаратов были выбраны антибиотики антрациклинового ряда доксорубицин и карминомицин, а также цитостатик класса таксанов таксол, традиционно применяемые в онкологической практике

Исследование возможности комбинированного применения липосомной формы эндостатина с химиопрепаратами проводили на мышах с привитыми опухолями меланомы В16 При введении липосомной формы эндостатина в схемы лечения животных химиопрепаратами карминомицина, доксорубицина и таксола во всех случаях наблюдалось существенное повышение эффективности терапии, выражавшееся как в замедлении роста опухолей, так и увеличении продолжительности жизни животных (табл 3) Так, по сравнению с индивидуальной терапией карминомицином, доксорубицином и таксолом, относительный размер опухолей у животных при комбинированной терапии с применением

липосомного эндостатина был ниже в 1,58, 1,45 и 1,46 раза, соответственно Комбинированная терапия также приводит к значительному увеличению СПЖ животных (табл 3) Наибольший эффект достигался при комбинированном применении липосомной формы эндостатина и таксола - торможение роста опухолей у мышей по сравнению с нелеченным контролем составляло 85,3%, а увеличение СПЖ - 85,9% При применении липосомной формы эндостатина в комбинациях с препаратами доксорубицином и карминомицином торможение роста опухолей было также значительным и составило 83,2% и 80,6%, соответственно

Таблица 3 Противоопухолевая активность липосомной формы рекомбинаптного эндостатина при его индивидуальном применении и в комбинациях с противоопухолевыми химиопрепаратами

Группа животных ОРО*, % СПЖ, дни УСПЖ, %

Препарат 1 Препарат 2

- - 100 27,4±3,1 -

Карминомицин 30,6 38,0±2,8 38,8

Доксорубицин 24,3 40,3±4,1 47,1

Таксол 21,5 40,2±2,4 46,7

Липосомная форма эндостатина - 31,3 42,7±2,2 55,8

Карминомицин 19,4 46,5±3,4 69,7

Доксорубицин 16,8 5 0,1 ±2,3 83,0

Таксол 14,7 50,9±2,9 85,9

* - относительный размер опухоли, данные на 31 день после прививки опухоли

Вероятно, что дальнейшее увеличение эффективности комбинированного применения липосомной формы эндостатина и различных химиопрепаратов может быть достигнуто при разработке оптимальных схем терапии и выборе химиопрепаратов, наиболее действенных в отношении конкретных типов опухолей

Представленные результаты свидетельствуют о высоком потенциале применения липосомной формы рекомбинантного эндостатина человека в качестве противоопухолевого антиангиогенного препарата, который может быть применен для терапии онкологических заболеваний как индивидуально, так и в комбинации с различными противоопухолевыми химиопрепаратами

выводы

1 Сконструирована экспрессионная плазмида, несущая ген эндостатина человека, на основе которой разработан штамм-продуцент Е coliJM109, позволяющий осуществлять индуцируемую экспрессию эндостатина в тельцах включения Продуктивность штамма составила 46 мг/л культуры

2 Разработаны эффективные модифицированные методы очистки и ренатурации рекочбинантного эндостатина человека из штамма-продуцента Е coll JM109 и получен высокоочищенный препарат белка с выходом 48%

3 Показано, что полученный с помощью разработанного метода препарат рекомбинантного эндостатина проявляет специфическую ЦТА в отношении эндотелиапьных клеток человека (HUVEC), быка (АВАЕ) и мыши (SVEC4-10), сравнимую с активностью природного эндостатина человека

4 Продемонстрирована т vitro более высокая чувствительность пролиферирующего эндотелия к действию рекомбинантного эндостатина человека по сравнению с конфлюентными культурами эндотелиоцитов

5 Получены наночастицы на основе поли-Ы-винилпирролидоиа с эндостатином и исследована их противоопухолевая активность в отношении модельных опухолей мышиной меланомы В16 in vivo Показано, что применение эндостатина в составе наночастиц позволяет значительно повысить эффективность его противоопухолевого действия

6 Получена липосочная форма эндостатина на основе лецитина и холестерола и продемонстрирована in vivo ее противооп>холевая активность в отношении меланомы мыши линии В16, значительно превышающая активность свободного белка

7 В экспериментах т vno показано, что применение липосомной формы эндостатина в сочетании с хичиопрепаратами доксорубицином, карминомицином и таксотом позволяет существенно повысить эффективность противоопухолевой терапии экспериментальных животных по сравнению с применением индивидуальных препаратов

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Гороховец H В , Дигтярь А В , Корженевский Д А , Луценко Е В , Луценко С В , Макаров В А , Позднякова H В , Северин Е С , Северин С Е , Соловьев А И , Фельдман H Б Препарат человеческого эндостатина и способ его получения // Заявка на выдачу патента РФ № 2004135222 от 2 12 2004 г , решение о выдаче от 11 01 06

2 Lutsenko S V, Feldman N В , Pozdnyakova N V , Digtyar A V , Lutsenko E V, Kaplun A P , Sevenn S E , Shvets V 1 Inhibition of melanoma B16 growth m mice by liposomal forms of angiostatm and endostatin // Abstracts of 19th Meeting of the European Association for Cancer Research, Budapest, Hungary, 2006 - P 176

3 Фельдман H Б , Позднякова H В , Николаенко Т В , Дигтярь А В , Кривошеева О С , Луценко Е В , Грицкова И А , Луценко С В , Северин С Е , Швец В И Полимерные мицеллы на основе поли-М-винилпирролидона как эффективные средства доставки противоопухолевых антиангиогенных препаратов // Молекулярная медицина - 2006 -№4 -С 33-37

4 Калинина Е С , Позднякова H В , Корженевский Д А , Фельдман H Б , Луценко С В , Швец В И Выделение и изучение биологических свойств рекомбинантного человеческого эндостатина //Вестник МИТХТ -2006 -№1 -С 23-26

5 Позднякова H В , Корженевский Д А , Луценко Е В , Архапчев M Ю , Дигтярь А В , Фельдман H Б, Луценко С В, Северин С Е Разработка метода получения растворимой формы рекомбинантного человеческого эндостатина и исследование его противоопухолевого потенциала // Молекулярная медицина - 2007 - №2 - В печати

Список использованных сокращений

ДСН - додецилсульфат натрия ИШГ - гаопропилтио-/Ш-галактопиранозид ОРО - относительный размер опухоли по- пары оснований нуклеотидов ПААГ - полиакриламидный гель

СПЖ - средняя продолжительность жизни экспериментальных животных

УСПЖ - увеличение средней продолжительности жизни экспериментальных животных

ЦТА - цитотоксическая активность

вБН - глутатион восстановленный

ОЭБО - глутатион окисленный

1С50 - молярная концентрация вещества, вызывающая гибель 50% клеток

Позднякова Наталья Владимировна (Россия) Получение рекомбинантного человеческого эндостатина и исследование его антиангиогенных и противоопухолевых свойств

Работа посвящена разработке модифицированной эффективной и технологически простой системы получения и очистки биологически активного рекомбинантного эндостатина человека, получению липосом и наночастиц, содержащих рекомбинантный эндостатин, и исследованию m vivo противоопухолевых свойств полученных препаратов эндостатина человека в различных схемах моно- и комбинированной терапии

В ходе работы сконструирована экспрессионная плазмида, несущая ген эндостатина человека, на основе которой разработан штамм-продуцент Escherichia coll, позволяющий осуществлять индуцируемую экспрессию эндостатина в тельцах включения Разработаны эффективные модифицированные методы очистки и ренатурации рекомбинантного эндостатина человека из штамма-продуцента Е coli, в результате чего получен высокоочшценный препарат биологически активного белка с экспериментально доказанной специфичностью действия Полученный белок использован для создания наносомных и липосомных форм препарата эндостатина

В экспериментах m vivo продемонстрировано, что противоопухолевая активность эндостатина в составе наночастиц и липосом значительно превышает активность свободного белка Показано также, что применение липосомной формы эндостатина в сочетании с химиопрепаратами доксорубицином, карминомицином и таксолом позволяет существенно усилить эффективность противоопухолевой терапии экспериментальных животных по сравнению с применением индивидуальных препаратов

Pozdnyakova Natalia V (Russia) Production of recombinant human endostatm and analysis of its antiangiogemc and antitumor activity

Work descnbes modified effective and practicable system to obtain biologically active recombinant human endostatm, including endostatm containing liposomes and nanoparticles, with subsequent in vivo analysis of antitumor effect of these preparations using various forms of mono-and combined therapy A human endostatm gene containing plasmid was constructed to express protem in Escherichia coh inclusion bodies for high efficiency Modified methods were developed for refolding and purification of recombinant protem Purified endostatm with proven specificity and biological activity was used for obtain endostatm containing liposomes and nanoparticles

Therapy with endostatm containing liposomes and nanoparticles results in enhanced antitumor effect in comparison with application of soluble endostatm It was shown, that combining chemotherapy with endostatm containing liposomes essentially mcreases antitumor effect m comparison with application of individual preparations

Подписано в печать 16 04 2007 г Исполнено 17 04 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 360 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 \v\vvv аик>геГега1 ш

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Позднякова, Наталья Владимировна

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Опухолевый ангиогенез и инвазия: общие механизмы регуляции.

1.2. Краткая история развития представлений об ангиогенезе.

1.3. Эндостатин: физико-химические свойства, происхождение.

1.3.1. Коллаген XVIII.

1.3.2. Изоформы коллагена XVIII.

1.3.3. Структурная организация молекулы эндостатина.

1.3.4. Образование Р-структур.

1.4. Механизм действия и физиологические функции эндостатина.

1.4.1. Протеолитические пути получения эндостатина.

1.4.2. Рецепторы эндостатина.

1.4.3. Свойства пептидных фрагментов эндостатина.

1.5. Перспективы клинического применения эндостатина.

1.5.1. Общие подходы к антиангиогенной терапии.

1.5.2. Перспективы терапевтического использования рекомбинантного человеческого эндостатина.

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Реактивы.

2.2. Клеточные линии.

2.3. Конструирование экспрессионного вектора эндостатина человека.

2.4. Наращивание биомассы штамма-продуцента Е. coli.

2.5. Получение растворимого рекомбинантного эндостатина из штамма-продуцента Е. coli.

2.6. Получение липосомной формы эндостатина.

2.7. Получение наночастиц и определение их размеров.

2.8. Методика культивирования клеток для проведения исследований на покоящемся и пролиферирующем эндотелии

2.9. Определение ЦТА эндостатина в отношении культур клеток MCF-7, DU145, АВАЕ, SVEC4-10, bSMC и фибробластов человека.

2.10. Определение ЦТА эндостатина в отношении клеток линии HUVEC.

2.11. Оценка выживаемости клеток.

2.12. Исследование противоопухолевой активности препаратов рекомбинантного эндостатина in vivo.

2.13. Статистическая обработка результатов.

Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение

3.1. Конструирование экспрессионного вектора и биосинтез рекомбинантного эндостатина человека в клетках штамма-продуцента Escherichia coli JM 109.

3.2. Получение растворимого рекомбинантного эндостатина из

Е. coli.

3.2.1. Получение телец включения.

3.2.2. Солюбилизация телец включения.

3.2.3. Ренатурация эндостатина.

3.2.4. Гель-фильтрация.

3.3. Цитотоксическая активность рекомбинантного эндостатина в отношении эндотелиальных клеток линий HUVEC, АВАЕ и SVEC4-10.

3.4. Цитотоксическая активность рекомбинантного эндостатина в отношении гладкомышечных, соединительнотканных и раковых клеточных линий.

3.5. Получение наночастиц, содержащих рекомбинантный эндостатин, и исследование их терапевтического противоопухолевого потенциала в модельных экспериментах in vivo.

3.6. Получение липосомной формы рекомбинантного эндостатина и исследование ее антиангиогенной противоопухолевой активности in vivo.

3.7. Исследование возможности применения липосомной формы рекомбинантного эндостатина в схемах противоопухолевой комбинированной терапии.

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение рекомбинантного человеческого эндостатина и исследование его антиангиогенных и противоопухолевых свойств"

Раковые опухоли могут расти только при условии формирования собственной сети кровеносных сосудов, обеспечивающих опухоль кислородом и нутриентами. С тех пор, как Фолкман постулировал [46] зависимость роста опухолей от их кровоснабжения, специалисты, работающие в области молекулярной медицины, пытаются бороться со злокачественным ростом, блокируя ангиогенез - процесс образования новых опухолевых кровеносных сосудов из предсухцествующих [191]. Возможно, именно с помощью антиангиогенной терапии удастся обойти одно из главных препятствий в химиотерапии рака, состоящее в том, что злокачественные клетки быстро приобретают устойчивость к противоопухолевым препаратам. Опухолевый рост сопровождается одновременным формированием сосудистой сети. После сеанса химиотерапии большинство раковых клеток погибает, но некоторая их часть благодаря мутациям, хромосомным перестройкам или индукции экспрессии отдельных генов оказывается устойчивой и выживает; неповрежденными остаются и сосуды, так что опухоль снова быстро прогрессирует. При этом такая опухоль, прошедшая естественный отбор, уже обладает лекарственной устойчивостью, и повторное лечение этим препаратом не приносит терапевтического эффекта.

Особый интерес в качестве мишени химиотерапии представляют собой клетки, выстилающие внутренние стенки сосудов, образующие эндотелий. У вновь образовавшихся капилляров эндотелиальные клетки имеют маркеры, отличающие их от эндотелиальных клеток полностью зрелых сосудов. Это важно, поскольку позволяет вести поиск лекарственных препаратов, специфически разрушающих только новообразованные сосуды, не повреждая остальные. Важно также, что клетки эндотелия доброкачественны и генетически стабильны и поэтому не обладают способностью к быстрому приобретению устойчивости. Таким образом, при проведении антиангиогенной терапии после сеанса лечения разрушается не сама опухоль, а питающая ее кровеносная сеть, что является причиной быстрой регрессии опухоли, лишенной оксигенизации и источников питания. При прекращении проведения терапии может наблюдаться повторный рост опухоли, однако лекарственная устойчивость не возникает.

Среди известных в настоящее время ингибиторов ангиогенеза одним из наиболее перспективных является эндостатин, который представляет собой С-концевой протеолитический фрагмент коллагена XVIII. Даже при длительном терапевтическом применении эндостатин не вызывает возникновения резистентности у опухолевых клеток и при этом обладает ярко выраженным терапевтическим эффектом. Необходимо заметить, что этот антиангиогенный агент может быть использован не только в противоопухолевой терапии, но и при лечении других болезней, связанных с нарушением ангиогенеза. Важной особенностью антиангиогенной терапии является возможность ее комбинированного применения с другими видами терапии, такими как радио-, иммуно- или химиотерапия.

Широкие терапевтические перспективы диктуют необходимость разработки эффективных систем получения растворимого рекомбинантного эндостатина. Так как в системе экспрессии Escherichia coli получение рекомбинантного эндостатина в растворимой форме, предпочтительной для использования в клинической практике, представляет собой трудно разрешимую проблему, в настоящее время для клинических исследований в США и Нидерландах используется рекомбинантный человеческий эндостатин, полученный в дрожжевой системе экспрессии (Pichia pastoris). Однако в дрожжевой системе экспрессии выход целевого белка невысок и недостаточен для массового использования в клинической практике [26], а системе Е. coli. белок экспрессируется в виде нерастворимых в физиологических условиях телец включения. Поэтому по-прежнему остается актуальной проблема разработки метода получения растворимого рекомбинантного эндостатина в системе клеток Е. coli., которая по сравнению с другими [116,133, 134,158,165, 175,177,188] является наименее затратной и наиболее технологически простой, способной обеспечить высокие выходы биологически активного белка. Важной задачей является также исследование возможностей повышения биодоступности и терапевтической эффективности эндостатина при его применении в составе наночастиц и липосом.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Позднякова, Наталья Владимировна

Выводы

1. Сконструирована экспрессионная плазмида, несущая ген эндостатина человека, на основе которой разработан штамм-продуцент Е. coli JM109, позволяющий осуществлять индуцируемую экспрессию эндостатина в тельцах включения. Продуктивность штамма составила 46 мг/л культуры.

2. Разработаны эффективные модифицированные методы очистки и ренатурации рекомбинантного эндостатина человека из штамма-продуцента Е. col JM109 и получен высокоочищенный препарат белка с выходом 48%.

3. Показано, что полученный с помощью разработанного метода препарат рекомбинантного эндостатина проявляет специфическую ЦТА в отношении эндотелиальных клеток линий человека (HUVEC), быка (АВАЕ) и мыши (SVEC4-10), сравнимую с активностью природного эндостатина человека.

4. Продемонстрирована in vitro более высокая чувствительность пролиферирующего эндотелия к действию рекомбинантного эндостатина человека по сравнению с конфлюентными культурами эндотелиоцитов.

5. Получены наночастицы на основе поли-Ы-винилпирролидона с эндостатином и исследована их противоопухолевая активность в отношении модельных опухолей мышиной меланомы В16 in vivo. Показано, что применение эндостатина в составе наночастиц позволяет значительно повысить эффективность его противоопухолевого действия.

6. Получена липосомная форма эндостатина на основе лецитина и холестерола и продемонстрирована in vivo ее противоопухолевая активность в отношении меланомы мыши линии В16, значительно превышающая активность свободного белка.

7. В экспериментах in vivo показано, что применение липосомной формы эндостатина в сочетании с химиопрепаратами доксорубицином, карминомицином и таксолом позволяет существенно повысить эффективность противоопухолевой терапии экспериментальных животных по сравнению с применением индивидуальных препаратов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Позднякова, Наталья Владимировна, Москва

1. Ackley В. D., Crew J. R., Elamaa H., Pihlajaniemi Т., Kuo С. J. and Kramer J. M. The NCl/Endostatin domain of Caenorhabditis elegans type XVIII collagen affects cell migration and axon guidance. // J. Cell Biol. 2001. - №152. - P. 1219-1232.

2. Allen T.M., Cullis P.R. Drug delivery systems: entering the mainstream. // Science.-2004.-№303 5665.-P. 1818-22.

3. Arenillas J.F., Alvarez-Sabin J. Basic Mechanisms in Intracranial Large-Arteiy Atherosclerosis: Advances and Challenges. // Cerebrovasc Dis. 2005. - №20 2.-P. 75-83.

4. Arnold F., West D.C. Angiogenesis in wound healing. // Pharmacol Ther. -1991.-№52 3. P. 407-422.

5. Becker C.M., Sampson D.A., Short S.M., Javaherian K., Folkman J., DAmato R.J. Short synthetic endostatin peptides inhibit endothelial migration in vitro and endometriosis in a mouse model. // Fertil Steril. 2006 - №85 1. - P. 7177.

6. Berger A. C., Feldman A. L., Gnant M. F. et al. The angiogenesis inhibitor, endostatin, does not affect murine cutaneous wound healing. // J. Surg. Res. -2000.-№91.-P. 26-31.

7. Bergers G., Javaherian K., Lo К. M., Folkman J. and Hanahan D. Effects of angiogenesis inhibitors on multistage carcinogenesis in mice. // Science. 1999. -№284.-P. 808-812.

8. Blezinger P., Wang J., Gondo M. et al. Systemic inhibition of tumor growth and tumor metastases by intramuscular administration of the endostatin gene. // Nat. Biotechnol. 1999. -№17. - P. 343-348.

9. Bloch W., Huggel K., Sasaki T. et al. The angiogenesis inhibitor endostatin impairs blood vessel maturation during wound healing. // FASEB J. 2000. -№14.-P. 2373-2376.

10. Boehle A. S., Kurdow R., Schulze M et al. Human endostatin inhibits growth of human non-small-cell lung cancer in a murine xenotransplant model. // Int. J. cancer. 2001. - №94. - P. 420-428.

11. Boehm Т., Folkman J., Browder D. and O'Reilly M. R. Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance. // Nature. -1997.-№390.-P. 404-407.

12. Broun N.J., Staton C.A., Rodgers G.R., et al. Fibrinogen E fragment selectively disrupts the vasculature and inhibits the grows of tumors in a syngeneic murine model. // Br J Cancer. 2002. - №86. - P. 1813-1816.

13. Brouty-Boye D., Zetter B.R. Inhibition of cell motility by interferon. // Science. -1980.-№208.-P. 516-518.

14. Calvo A., Yokoyama Y., Smith L.E., et al. Inhibition of the mammary carcinoma angiogenic switch in C3(1)/SV40 transgenic mice by a mutated form of human endostatin. // Int J Cancer. 2002. - №101 3. P. 224-234.

15. Camphausen K., Moses M.A., Beecken W.D., Khan M.K., Folkman J., O'Reilly M.S. Radiation therapy to a primary tumor accelerates metastatic growth in mice. // Cancer Res. 2001. - №61 5. - P. 2207-2211.

16. Cao Y., Xue L. Angiostatin. // Semin. Thromb. Hemost. 2004. - №30 1. - P. 83-93.

17. Carmeliet P., Jain R.K. Angiogenesis in cancer and other diseases. // Nature. -2000. №407. -P 249-257.

18. Cattaneo M.G., Pola S., Francescato P., Chillemi F., Vicentini L.M. Human endostatin-derived synthetic peptides possess potent antiangiogenic properties in vitro and in vivo. // Exp Cell Res. 2003. - №283 2. - P. 230-236.

19. Chang J.H., Javier J.A., Chang G.Y., Oliveira H.B., Azar D.T. Functional characterization of neostatins, the MMP-derived, enzymatic cleavage products of type XVIII collagen. // FEBS Lett. 2005. - №579 17. P. 3601-3606.

20. Colorado P. C., Torre A., Kamphaus G. et al. Anti-angiogenic cues from vascular basement membrane collagen. // Cancer Res. 2000. - №60. - P. 2520-2526.

21. Crum R., Szabo S., Folkman J. A new class of steroids inhibits angiogenesis in the presence of heparin or a heparin fragment. // Science. 1985. - №230. - P. 1375-1378.

22. Dans К., Behrendt N., Hetyer-Hansen G., Johnsen M., Lund L.R., Ploug M., Romer J. Plasminogen activation and cancer. // Thromb. Haemost. 2005. -№93.-P. 676-681.

23. Davidoff A.M., Leary M.A., Ng C.Y., et al. Autocrine expression of both endostatin and green fluorescent protein provides a synergistic antitumor effect in a murine neuroblastoma model. //.Cancer Gene Ther. 2001. - №8 7. - P. 537-545.

24. Dhanabal M., Volk R., Ramchandran R., Simons M. and Sukhatme V. P. Cloning, expression, and in vitro activity of human endostatin. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. - №258. - P. 345-352.

25. Dhanabal M., Ramchandran R., Volk R. et al. Endostatin: yeast production, mutants, and antitumor effect in renal cell carcinoma. // Cancer Res. 1999. -№59.-P. 189-197.

26. Dhanabal M., Ramchandran R., Waterman M. J. F., Lu H., Knebelmann В., Segal M. and Sukhatme V. P. Endostatin induces endothelial cell apoptosis. // J. Biol. Chem. 1999. - №274. - P. 11721-11726.

27. Ding Y.H., Javaherian K., Lo K.M. et al. Zinc-dependent dimers observed in crystals of human endostatin. //Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. - №95. - P. 10443-10448.

28. Dixelius J., Cross M., Matsumoto Т., Sasaki Т., Timpl R. and Claesson-Welsh L. Endostatin regulates endothelial cell adhesion and cytoskeletal organization. // Cancer Res. 2002. - №62. - P. 1944-1947.

29. Dong S., Cole G.J., Halfter W. Expression of collagen XVIII and localization of its glycosaminoglycan attachment sites. // J. Biol. Chem. 2003. - №278. - P. 1700-1707.

30. Eccles S.A. Parallels in invasion and angiogenesis provide pivotal points for therapeutic intervention. // Int. J. Dev. Biol. 2004. - №48. - P. 583-598.

31. Eder J. P Jr, Supko J. G, Clark J. W. et al. Phase I clinical trial of recombinant human endostatin administered as a short intravenous infusion repeated daily. // J. Clin Oncol. -2002. -№20 18. P. 3792-803.

32. Eisterer W., Jiang X., Bachelot Т., et al. Unfulfilled promise of endostatin in a gene therapy-xenotransplant model of human acute lymphocytic leukemia. // Mol Ther. 2002. - №5. - P. 352-359.

33. Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups. // Arch. Biochem. Biophys. 1959. -№82 1.-P. 70-77.

34. Engelse M.A., Hanemaaijer R., Koolwijk P., van Hinsbergh V.W. The fibrinolytic system and matrix metalloproteinases in angiogenesis and tumor progression. // Semin. Thrombos. Hemostas. 2004. - №30 1. - P. 71-82.

35. Ergun S., Kilic N., Wurmbach J. H. et al. Endostatin inhibits angiogenesis by stabilization of newly formed endothelial tubes. // Angiogenesis. 2001. - №4. -P. 193-206.

36. Felbor U., Dreier L., Bryant R. A. R. et al. Secreted cathepsin L generates endostatin from collagen XVIII. // EMBO J. 2000. - №19. - P. 1187-1194.

37. Feldman A.L., Рак H., Yang J.C., Alexander H.R. Jr., Libutti S.K. Serum endostatin levels are elevated in patients with soft tissue sarcoma. // Cancer. -2001.-№91 8. P. 1525-1529

38. Fernandez A., Udagawa Т., Schwesinger C., Beecken W., Achilles-Gerte E., McDonnell Т., D'Amato R. Angiogenic potential of prostate carcinoma cells overexpressing bcl-2. // J. Natl. Cancer Inst. 2001. - №93 3. - P. 208-213.

39. Ferrara N. Vascular endothelial growth factor: molecular and biological aspects. // Curr Top Microbiol Immunol. 1999. - №237. - P. 1-30.

40. Ferreras M., Felbor U., Lenhard Т., Olsen B. R. and Delaisse J.-M. Generation and degradation of human endostatin proteins by various proteinases. // FEBS Lett. 2000. - №486. - P. 247-251.

41. Folkman J. Fundamental concepts of the angiogenic process. // Curr. Mol. Med. 2003. - №3. - P. 643-651.

42. Folkman J., Klagsbrun M. Angiogenic factors review. // Science. 1987. -№235.-P. 442-447.

43. Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. // N Engl J Med. -1971.-№285.-P. 1182-1186.

44. Fukai N., Eklund L., Marneros A.G., Oh S.P., Keene D.R., Tamarkin L., Niemela M., lives M., Li E., Pihlajaniemi Т., Olsen B.R. Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities. // EMBO J. 2002. №21 7. -P. 1535-1544.

45. Gebbink F.B.G., Voest E. E., Reijerkerk A. Do antiangiogenic protein fragments have amyloid properties? // Blood. 2004. - №104 6. - P. 16011605.

46. Halfter W., Dong S., Schrurer В., Cole G.J. Collagen XVIII is a basement membrane heparan sulfate proteoglycan. // J. Biol. Chem. 1998. - №273. - P. 25404-25412.

47. Han J., Ohno N., Pasco S., Monboisse J. С., Borel J. P. and Kefalides N. A. A cell binding domain from the 3 chain of type IV collagen inhibits proliferation of melanoma cells. //J. Biol. Chem. 1997. -№272. - P. 20395-20401.

48. Hanai J., Dhanabal M., Karumanchi S.A., Albanese C., Waterman M., Chan В., Ramchandran R., Pestell R., Sukhatme V.P. Endostatin causes G1 arrest of endothelial cells through inhibition of cyclin Dl. //J Biol Chem. 2002. -№277 19.-P. 16464-16469.

49. Hanai J., Gloy J., Karumanchi S.A., Kale S., Tang J., Hu G., Chan В., Ramchandran R., Jha V., Sukhatme V.P., Sokol S. Endostatin is a potential inhibitor of Wnt signaling. // J Cell Biol. 2002. - №58 3. - P. 529-539.

50. Hanna N.N., Seetharam S., Mauceri H.J., et al. Antitumor interaction of short-course endostatin and ionizing radiation. // Cancer J. 2000. - №6. - P. 287293.

51. He Y., Zhou H., Tang H., Luo Y. Deficiency of disulfide bonds facilitating fibrillogenesis of endostatin. // J Biol Chem. 2006. - №281 2. - P. 10481057.

52. Hebert C., Siavash H., Norris K., Nikitakis N.G., Sauk J.J. Endostatin inhibits nitric oxide and diminishes VEGF and collagen XVIII in squamous carcinoma cells. // Int J Cancer. 2005. - №114 2. - P. 195-201.

53. Herbst R.S., Hess К R, Tran H.T et al. Phase I Study of recombinant human endostatin in patients with advanced solid tumors. // J. Clin. Oncol. 2002. -№20.-P. 3792-3803.

54. Herbst R. S., Mullani N. A., Davis D. W. et al. Development of biologic markers of response and assessment of antiangiogenic activity in a clinical trial of human recombinant endostatin. // J. Clin. Oncol. 2002. - №20. - P. 3804— 3814.

55. Hohenester E, Sasaki T, Mann K, Timpl R. Variable zinc coordination in endostatin. // J Mol Biol. 2000. - №297 1. - P. 1-6.

56. Hohenester E., Sasaki Т., Olsen B.R., Timpl R. Crystal structure of the angiogenesis inhibitor endostatin at 1.5 A resolution. // EMBO J. 1998. -№17.-P. 1656-1664.

57. Huang X., Wong M.K.K., Zhao Q. et al. Soluble Recombinant Endostatin Purified from Escherichia coli: Antiangiogenic Activity and Antitumor Effect. // Cancer Res. 2001. - № 61. - P. 478-481.

58. Hurt E.M., Wiestner A., Rosenwald A. et al. Overexpression of cmaf is a frequent oncogenic event in multiple myeloma that promotes proliferation and pathological interactions with bone marrow stroma. // Cancer Cell. 2004. -№5.-P. 191-199.

59. Indraccolo S., Gola E., Rosato A., et al. Differential effects of angiostatin, endostatin and interferon-alpha(l) gene transfer on in vivo growth of human breast cancer cells. // Gene Ther. 2002. - №9. - P. 867-878.

60. Iozzo R. V. and San Antonio J. D. Heparan sulfate proteoglycans: heavy hitters in the angiogenesis arena. // J. Clin. Invest. 2001. - №108. - P. 349-355.

61. Iversen P.O., Sorensen D.R., Benestad H.B. Inhibitors of angiogenesis selectively reduce the malignant cell load in rodent models of human myeloid leukemias. // Leukemia. 2002. - №16. - P. 376-381.

62. Javaherian K., Park S.Y., Pickl W.F., LaMontagne K.R., Sjin R.T., Gillies S., Lo K.M. Laminin modulates morphogenic properties of the collagen XVIII endostatin domain. // J Biol Chem. 2002. - №277 47. - P. 45211-45218.

63. John H. , Radtke K. , Standker L. , Forssmann W.G. Identification and characterization of novel endogenous proteolytic forms of the human angiogenesis inhibitors restin and endostatin. // Biochimica et biophysica acta. -2005.-№1747 2. P. 161-170.

64. John H., Forssmann W.G., Determination of the disulfide bond pattern of the endogenous and recombinant angiogenesis inhibitor endostatin by mass spectrometry. // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2001. - №15. - P. 1222— 1228.

65. John H., Preissner K.T., Forssmann W.G., Standker L. Novel glycosylated forms of human plasma endostatin and circulating endostatin-related fragments of collagen XV. // Biochemistry. -1999. №38 32. - P. 10217-10224.

66. Jones M., Leroux J. Polymeric micelles a new generation of colloidal drug carriers///Eur. J.Pharm. Biopharm.- 1999.-№482.-P. 101-111.

67. Jouanneau E., Alberti L., Nejjari M. et al. Lack of antitumor activity of recombinant endostatin in a human neuroblastoma xenograft model. // J Neurooncol. 2001. - №51. - P. 11 -18.

68. Kamphaus G.D., Colorado P.C., Panka D.J., Hopfer H., Ramchandran R., Torre A., Maeshima Y., Mier J.W., Sukhatme V.P., Kalluri R. Canstatin, a novel matrix-derived inhibitor of angiogenesis and tumor growth. // J Biol Chem. -2000.-№275. P. 1209-1215.

69. Karumanchi S. A., Jha V., Ramchandran R. et al. Cell surface Glypicans are low-affinity endostatin receptors. // Mol. Cell. 2001. - №7. - P. 811-822.

70. Kim Y. M„ Hwang S., Kim Y. M., Pyun B. J., Kim T. Y., Lee S. Т., Gho Y. S. and Kwon Y. G. Endostatin blocks VEGF-mediated signaling via direct interaction with KDR/Flk-1. II J. Biol. Chem. 2002. - №277. - P. 2787227879.

71. Kisker O., Becker С. M., Prox D. et al. Continuous administration of endostatin by intraperitoneally implanted osmotic pump improves the efficacy and potency of therapy in a mouse xenograft tumor model. // Cancer Res. 2001. - №61. -P. 7669-7674.

72. Koch A.E., Harlow L.A., Haines G.K., Amento E.P., Unemori E.N., Wong W.L., Pope R.M. and Ferrara N. Vascular endothelial growth factor. A cytokine, modulating angiogenesis in rheumatoid arthritis. // J. Immunol. 1994. - №152. -P. 4149-4156.

73. Kolkhorst V., Sturzebecher J., Wiederanders B. Inhibition of tumor cell invasion by protease inhibitors: correlation with the protease profile. // J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1998. - №124. - P. 598-606.

74. Kranenburg O, Kroon-Batenburg L.M, Reijerkerk A. et al. Recombinant endostatin forms amyloid fibrils that bind and are cytotoxic to murine neuroblastoma cells in vitro. // FEBS Lett. 2003. - №539 1-3. - P. 149-155.

75. Kruger E. A., Duray P. H., Tsokos M. G. et al. Endostatin inhibits microvessel formation in the ex vivo rat aortic ring angiogenesis assay. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. - №268. - P. 183-191.

76. Kuo C. J., LaMontagne K. R. Jr, Garcia-Cardena G. et al. Oligomerization-dependent regulation of motility and morphogenesis by the collagen XVIII NCI/Endostatin domain. // J. Cell Biol. 2001 - №152. - P. 1233-1246.

77. Kuroiwa M, Ikeda H, Hongo T, Tsuchida Y, et al. Effects of recombinant human endostatin on a human neuroblastoma xenograft. // Int J Mol Med. -2001.-№8.-P. 391-396.

78. Lein P. J., Turner D. C., Flier L. A. and Terranova V. P. The NCI domain of type IV collagen promotes axonal growth in sympathetic neurons through interaction with the alpha 1 beta 1 integrin. // J. Cell Biol. 1991. - №113. - P. 417-428.

79. Li В., Wu X., Zhou H. et al. Acid-Induced Unfolding Mechanism of Recombinant Human Endostatin. // Biochemistry. 2004. - №43. - P. 25502557.

80. Li D., Clark C.C., Myers J.C. Basement membrane zone type XV collagen is a disulfide-bonded chondroitin sulfate proteoglycan in human tissues and cultured cells. //J. Biol. Chem. 2000. - №275. - P. 22339-22347.

81. Lin H.-C., Chang J.-H., Jain S. et al. Matrilysin cleavage of corneal collagen type XVIII NCI domain and generation of a 28-kDa fragment. // Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 2001. - №42. - P. 2517-2524.

82. Liu D.L., Wen J.X., Tong W.C., Ben L.H. Inhibition of lung adenocarcinoma LA795 in mice by recombinant human endostatin. // Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao. -2001. -№21. P. 917-919.

83. MacDonald R.C., MacDonald R.I., Menco B.P. et al. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles. // Biochim. Biophys. Acta. 1991. -№1061 2. - P. 297-303.

84. MacLachlan Т.К., Dhanabal M. Insights into differential endostatin activity. // Cancer Biol. Ther. 2004. - №3 11. - P. 1167-1168.

85. Maniotis A.J., Folberg, R., Hess A. et al. Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro: vasculogenic mimicry. // Am J Pathol. -1999.-№155.-P. 739-752.

86. Matsumura Y., Yokoyama M., Kataoka K. et al. Reduction of the side effects of an antitumor agent, KRN5500, by incorporation of the drug into polymeric micelles. //Jpn. J. Cancer Res. 1999. -№90 1. - P. 122-128.

87. Matsuno H., Yudoh K., Uzuki M. et al. Treatment with the angiogenesis inhibitor endostatin: anovel therapy in rheumatoid arthritis. // J. Rheumatol. -2002.-№29.-P. 890-895.

88. Miao R. Q., Agata J., Chao L., and Chao J. Kallistatin is a new inhibitor of angiogenesis and tumor growth. // Blood. 2002. - October 16. - №100 9. - P. 3245-3252.

89. Monboisse J. C., Garnotel R., Bellon G., Ohno N., Perreau C., Borel J. P. and Kefalides N. A. The alpha 3 chain of type IV collagen prevents activation of human polymorphonuclear leukocytes. // J. Biol. Chem. 1994. - №269. - P. 25475-25482.

90. Mongiat M., Sweeney S. M., San Antonio J. D., Fu J., and IozzoR. V. Endorepellin, a Novel Inhibitor of Angiogenesis Derived from the С Terminus of Perlecan. // J. Biol. Chem. 2003. - №278 6. - P. 4238-4249.

91. Mori K., Ando A., Gehlbach P. et al. Inhibition of choroidal neovascularization by intravenous injection of adenoviral vectors expressing secretable endostatin. // Am. J. Pathol. 2001. - №159. - P. 313-320.

92. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxity assays. // J. Immunol. Meth. 1983. -№65.-P. 55-63.

93. Nakanishi Т., Fukushima S., Okamoto K. et al. Development of the polymer micelle carrier system for doxorubicin. // J. Control Release. 2001. - №74 1-3.-P. 295-302.

94. Nishiyama N, Kataoka K. Polymeric micelle drug carrier systems: PEG-PAsp(Dox) and second generation of micellar drugs. // Adv. Exp. Med. Biol. -2003.-№519.-P. 155-177.

95. Nishiyama N., Kato Y., Sugiyama Y., Kataoka K. Cisplatin-loaded polymer-metal complex micelle with time-modulated decaying property as a novel drug delivery system. //Pharm. Res. -2001. -№18 7. P. 1035-1041.

96. O'Reilly M.S., Boehm Т., Shing Y., et al. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. // Cell. 1997. - №88. - P. 277-285.

97. O'Reilly M.S., Holmgren L., Shing Y., et al. Angiostatin: a novel angiogenesis ingibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma. // Cell. 1994. - №79. - P. 315-328.

98. O'Reilly M.S., Pirie-Shepherd S., Lane W.S., FoIkmanJ. Antiangiogenic activity of the cleaved conformation of the serpin antithrombin. // Science. -1999.-№285.-P. 1926-1928.

99. Oh S.P., Warman M.L., Seldin M. F. et al. Cloning of cDNA and genomic DNA encoding human type XVIII collagen and localization of the alpha 1 XVIII.collagen gene to mouse chromosome 10 and human chromosome 21. // Genomics. 1994. - №19. P. 494-499.

100. Olsen B.R. From the editor's desk. // Matrix Biol. 2002. - №21. - P. 309-310.

101. Ortega N„ Werb Z. New functional roles for non-collagenous domains of basement membrane collagens. // Journal of Cell Science. 2002. - №115. - P. 4201-4214

102. Park J.H., Chang K.H., Lee J.M., Lee Y.H., Chung I.S. Optimal production and in vitro activity of recombinant endostatin from stably transformed Drosophila melanogaster S2 cells. // In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2001. - №37 1. - P. 5-9.

103. Pawliuk R., Bachelot Т., Zurkiya O. et al. Continuous intravascular secretion of endostatin in mice from transduced hematopoietic stem cells. // Mol Ther. -2002,-№5.-P. 345-351.

104. Perris R., Syfrig J., Paulsson M., Bronner-Fraser M. Molecular mechanisms of neural crest cell attachment and migration on type I and IV collagen. // J. Cell Sci. 1993. -№106. - P. 1357-1368.

105. Rakic J. N., Gerber H-P. and Lecouter J. The biology of VEGF and its receptors. // Nature Med. 2003. - №6. - P. 669-676.

106. Rakic J. N., Maillard C., Jost M. et al. Role of plasminogen activatorplasmin system in tumor angiogenesis. // Cell Mol. Life Sci. 2003. - №60. - P. 463-473.

107. Rastinejad F., Polverini P.J., Bouck N.P. Regulation of the activity of a new inhibitor of angiogenesis by a cancer suppressor gene. // Cell. 1989. - №56 3.-P. 345-355.

108. Rehn M., Pihlajaniemi T. Type XV and type XVIII collagens, a new subgroup within the family of collagens. // Cell Dev. Biol. -1996. №7. - P. 673-679.

109. Rehn M., Veikkola Т., Kukk-Valdre E., Nakamura H., Ilmonen M., Lombardo C. R., Pihlajaniemi Т., Alitalo K. and Vuori K. Interaction of endostatin with integrins implicated in angiogenesis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. -№98.-P. 1024-1029.

110. Reijerkerk A., Mosnier L.O., Kranenburg O. et al. Amyloid Endostatin Induces Endothelial Cell Detachment by Stimulation of the Plasminogen Activation System.//Molecular Cancer Research.-2003. -№1.-P. 561-568.

111. Reis R.C, Schuppan D., Barreto A.C., Bauer M., Bork J.P., HasslerG., Coelho-Sampaio T. Endostatin competes with bFGF for binding to heparin-like glycosaminoglycans. // Biochem Biophys Res Commun. 2005. - №333 3. -P. 976-983.

112. Reynolds L. E., Wyder L., Lively J. C., Taverna D., Robinson S. D., Huang X., Sheppard D., Hynes R. O. and Hodivala-Dilke К. M. Enhanced pathological angiogenesis in mice lacking B3 integrin or B3 and 135 integrins. // Nat. Med. -2002.-№8.-P. 27-34.

113. Rhim T.Y., Park C.S., Kim E., Kim S.S., Human prothrombin fragment 1 and 2 inhibit bFGF-induced ВСЕ cell growth. // Biochem Biophis Res Commun. -1998.-№252.-P. 513-516.

114. Risau W. Embryonic angiogenesis factors review. // Pharmacol. Ther. -1991. -№51.-P. 371-376.

115. Rokstad A.M., Holtan S., Strand В., et al. Microencapsulation of cells producing therapeutic proteins: optimizing cell growth and secretion. // Cell Transplant. 2002. - №11 4. - P. 313-324.

116. Rokstad A.M., Strand В., Rian K., Steinkjer В., Kulseng В., Skjak-Braek G., Espevik T. Evaluation of different types of alginate microcapsules as bioreactors for producing endostatin. // Cell Transplant. 2003. - №12 4. - P. 351-364.

117. Saarela J., Rehn M., Oikarinen A. et al. The short and long forms of type XVIII collagen show clear tissue specificities in their expression and location in basement membrane zones in humans. // Am. J. Pathol. 1998. - №153. - P. 611-626.

118. Sanz L. and Alvarez-Vallina L. The extracellular matrix: a new turn of the screw for antiangiogenic strategies. // Trends. Molec. Med. 2003. - №9. - P. 256-262.

119. Saphir A. Angiogenesis: the unifying concept in cancer? // J Natl Cancer Inst. -1997. -№89 22. P. 1658-1659.

120. Sasaki Т., Fukai N., Mann K., Gohring W., Olsen B. R„ and Timpl R. Structure, function and tissue forms of the C-terminal globular domain of collagen XVIII containing the angiogenesis inhibitor endostatin. // EMBO J. 1998. - №17 15.-P. 4249-4256.

121. Satchi-Fainaro R., Puder M., Davies J.W., Tran H.T., Sampson D.A., Greene A.K., Corfas G., Folkman J. Targeting angiogenesis with a conjugate of HPMA copolymer and TNP-470. // Nat. Med. 2004. - №10 3. - P. 255-261.

122. Savic R., Luo L., Eisenberg A., Maysinger D. Micellar nanocontainers distribute to defined cytoplasmic organelles. // Science. 2003. - №300 5619. -P. 615-618.

123. Scappaticci F.A. Mechanisms and future directions for angiogenesis-based cancer therapies. // J. Clin. Oncol. 2002. - №20 18. - P. 3906-3927.

124. Schmidt A., Addicks K., Bloch W. Opposite effects of endostatin on different endothelial cells. // Cancer Biol. Ther. 2004. - №3 11. - P. 1162-1166.

125. Schmidt A., Wenzel D., Ferring I., Kazemi S., Sasaki Т., Hescheler J., Timpl R., Addicks K., Fleischmann B.K., Bloch W. Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis. // Dev. Dyn. 2004. - №230 3. - P. 468-480.

126. Shahan T. A., Ohno N., Pasco S., Borel J. P., Monboisse J. C. and Kefalides N. A. Inhibition of tumor cell proliferation by type IV collagen requires increased levels of camp. // Connect. Tissue Res. 1999. - №40. - P. 221-232.

127. Sharma D., Chelvi T.P., Kaur J. et al. Novel Taxol formulation: polyvinylpyrrolidone nanoparticle-encapsulated Taxol for drug delivery in cancer therapy. // Oncol Res. 1996. - №8 7-8. - P. 281-286.

128. Shichiri M. and Hirata Y. Antiangiogenesis signals by endostatin. // FASEB J. -2001.-№15.-P. 1044-1053.

129. Sidky Y.A., Borden E.C. Inhibition of angiogenesis by interferons: effects on tumor- and lymphocyte-induced vascular responses. // Cancer Res. 1987. -№47 19.-P. 5155-5161.

130. Skovseth D.K., Veuger M.J.T., Sorensen D.R. et al. Endostatin dramatically inhibits endothelial cell migration, vascular morphogenesis, and perivascular cell recruitment in vivo.//Blood.-2005. -№105.-P. 1044-1051.

131. Solaun M.S., Mendoza L., De Luca M., et al. Endostatin inhibits murine colon carcinoma sinusoidal-type metastases by preferential targeting of hepatic sinusoidal endothelium. // Hepatology. 2002. - №355. - P. 1104-1116.

132. Sorensen D. R., Read T. A., Porwol T. et al. Endostatin reduces vascularization, blood flow, and growth in a rat gliosarcoma. // Neuro-Oncol. 2002. - №4. - P. 1-8.

133. Sorenson D.R., Leirdal M., Iverson P.O., Sioud M. Combination of endostatin and a protein kinase С alpha DNA enzyme improves the survival of rats with malignant glioma. // Neoplasia. 2002. - №4. - P. 474-479.

134. Standker L., Schrader M., Kanse S. M., Jurgens M., Forssmann W. G. and Preissner К. T. Isolation and characterization of the circulating form of human endostatin. // FEBS. Lett. 1997. - №420. - P. 129-133.

135. Steele F.R. Can "negative" be positive? Mol Ther. 2002. - №5. - P. 338-339.

136. Su Z., Wu X., Feng Y., Ding C., Xiao Y„ Cai L„ Feng W., Li X. High level expression of human endostatin in Pichia pastoris using a synthetic gene construct. // Appl Microbiol Biotechnol. 2007. - №73 6. - P. 1355-1362.

137. Sudhakar A., Sugimoto H., Yang C., Lively J., Zeisberg M., Kalluri R. Human tumstatin and human endostatin exhibit distinct antiangiogenic activities mediated by avP3 and a5pl integrins. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2003. -№100 8.-P. 4766-4771.

138. Suzuki O.T. et al. Molecular analysis of collagen XVIII reveals novel mutations, presence of a third isoform, and possible genetic heterogeneity in Knobloch syndrome. // Am J Hum Genet. 2002. - №71. - P. 1320-1329.

139. Swidzinska E., Ossolinska M., Naumnik W., Trojan S., Chyczewska E. Serum endostatin levels in patients with lung carcinoma. // Rocz Akad Med Bialymst. -2005.-№50.-P. 197-200.

140. Taddei L., Chiarugi P., Brogelli L. et al. Inhibitory effect of full-length human endostatin on in vitro angiogenesis. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1999.-№263.-P. 340-345.

141. Tjin Tham Sjin R.M., Satchi-Fainaro R., Birsner A.E et al. A 27-Amino-Acid Synthetic Peptide Corresponding to the NH2-Terminal Zinc-Binding Domain of Endostatin Is Responsible for Its Antitumor Activity. // Cancer Res. 2005. -№65.-P. 3656-3663.

142. Trinh L., Noronha S.B., Fannon M., Shiloach J. Recovery of mouse endostatin produced by Pichia pastoris using expanded bed adsorption. // Bioseparation. -2000.-№9.-P. 223-230.

143. Welsh A.O. and Enders A.C. Chorioallanoic placenta formation in the rat: I. luminal epithelial cell death and extracellular matrix modifications in the mesometrial region of implantation chambers. // Am. J. Anat. -1991. №192. -P. 347-365.

144. White C.W., Sondheimer H.M., Crouch E.C., Wilson H., Fan L.L. Treatment of pulmonary hemangiomatosis with recombinant interferon alfa-2a. // N. Engl. J. Med. 1989. - №320 18. - P. 1197-1200.

145. Wickstrom S.A., Alitalo K., Keski-Oja J. An endostatin-derived peptide interacts with integrins and regulates actin cytoskeleton and migration of endothelial cells. // J Biol Chem. 2004. - №279 19. - P. 20178-20185.

146. Wodarz A., Nusse R. Mechanisms of Wnt signalling in development. // Annu Rev Cell Dev Biol. 1998. - №14. - P. 59-88.

147. Wu J., Fu W., Luo J., Zhang T. Expression and purification of human endostatin from Hansenula polymorpha A16. // Protein Expr. Purif. 2005. - №42 1. - P. 12-19.

148. Wu P., Yonekura H., Li H., et al. Hypoxia down-regulates endostatin production by human microvascular endothelial cells and pericytes. // Biochem Biophys Res Commun. -2001. -№288 5. P. 1149-1154.

149. Wu X., Huang J., Chang G., Luo Y. Detection and characterization of an acid-induced folding intermediate of endostatin. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -2004.-№320 3.-P. 973-978.

150. Xia H., Zhang L., Wen J.X., Tong W.C. Expression and purification of human endostatin in Pichia pastoris and its inhibition on the growth of mouse pulmonary adenocarcinoma cell line LA795. // Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao. -2002.-№22 5.-P. 393-396.

151. Xu H.M., Zhang G.Y., Ji X.D. et al. Expression of soluble, biologically active recombinant human endostatin in Escherichia coli. // Protein Expr. Purif. -2005.-№41 2.-P. 252-258.

152. Xu R., Du P., Fan J.-J. et al. High-level expression and secretion of recombinant mouse endostatin by Escherichia coli. II Prot. Expr. And Purif. 2002. - №24. -P. 453-459.

153. Xu R., Yao Z.Y., Xin L., Zhang Q„ Li T.P., Gan R.B. NCI domain of human type VIII collagen (alpha 1) inhibits bovine aortic endothelial cell proliferation and causes cell apoptosis. // Biochem Biophys Res Commun. 2001. - №289. -P. 264-268.

154. Xu Y.K., Nusse R. The Frizzled CRD domain is conserved in diverse proteins including several receptor tyrosine kinases. // Curr Biol. 1998. - №8. - P. 405406.

155. Yamaguchi N., Anad-Apte В., Lee M. et al. Endostatin inhibits VEGF-induced endothelial cell migration and tumor growth independently of zinc binding. // EMBO J. 1999. - №18. - P. 4414-4423.

156. Ye C., Feng C., Wang S., et al. Antiangiogenic and antitumor effects of endostatin of follicular thyroid carcinoma. // Endocrinology. 2002. - №143. -P. 3522-3528.

157. Yin G., Liu W., An P. et al. Endostatin gene transfer inhibits joint angiogenesis and pannus formation in inflammatory arthritis. // Mol. Ther. 2002. - №5. - P. 547-554.

158. Yokoyama M., Okano Т., Sakurai Y. et al. Selective delivery of adriamycin to a solid tumor using a polymeric micelle carrier system. // J. Drug Target. 1999. -№7 3. - P. 171-186

159. Yokoyama Y., Green J.E., Sukhatme V.P., Ramakrishnan S. Effect of endostatin on spontaneous tumorigenesis of mammary adenocarcinoma in a transgenic mouse model. // Cancer Res. 2000. - №60 16. - P. 4362-4365.

160. Yoon S. S., Eto H., Lin С. M. et al. Mouse endostatin inhibits the formation of lung and liver metastases. // Cancer Res. 1999. - №59. - P. 6251-6256.

161. You W. K., So S. H., Lee H. et al. Purification and characterization of recombinant murine endostatin in E. coli. 11 Exp. Mol. Med. 1999. - №31. - P. 197-202.

162. Yu Y., Moulton K.S., Khan M.K., Vineberg S., Boye E„ Davis V.M., O'Donnell P.E., Bischoff J., Milstone D.S. E-selectin is required for the antiangiogenic activity of endostatin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. -№101 21.-P. 8005-8010.

163. Zhang L., Song A.Q., Wen J.X. Expression of recombinant human endostatin in Pichia pastoris and its inhibitory effects on the growth of human lungadenocarcinoma Astc-a-1 cells. // Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao. 2003. -№23 9.-P. 895-898.

164. Васильев A.E. Наноносители лекарственных веществ. // Новая аптека. -2003.-№1.-С. 7-11.

165. Введение в молекулярную медицину / Под ред. М.А. Пальцева. М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2004. - 496 с.

166. Дудниченко А. С. Новые возможности в лечении рака. // Провизор. 2000. - №7. - С. 16-23.

167. Завадская Е.С., Захарова Е.С., Кадулин С.Г., Кибардин А.В., Киселёв C.JI., Гнучев Н.В. Получение рекомбинантного эндостатина в молоке трансгенных мышей. // Генетика. 2001. - Т. 37 9. - С. 1207-1212.

168. Каплун А.П., Jle Банг Шон, Краснопольский Ю.М., Швец В.И. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ. // Вопросы медицинской химии. 1999. - №1. - С. 3-11.

169. Киселёв С.М., Луцеико С.В., Северин С.Е., Северин Е.С. Ингибиторы опухолевого ангиогенеза. // Биохимия. 2003. - Т. 68 5. - С. 611-631.

170. Пальцев М.А. Молекулярная медицина и прогресс фундаментальных наук. // Вестник Российской Академии Наук. 2002. - Т. 72. - №1. - С. 13-21.

171. Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.ebi.uniprot.org/uniprot-srv/uniProtView.do?proteinId=:COIAlHU MAN.

172. Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.expasy.org/cgi-bin/aligner?P39060.