Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение рекомбинантного белка MTS-1 и его биохимическая характеристика

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение рекомбинантного белка MTS-1 и его биохимическая характеристика"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТБИОЛОГИИ ГЕНА

На прагэх румписи УДК 577.2:577.1! 2

НЕЙРА КАРДЕНАС МАУРИСИО АЛЬФРЕДО

ПОЛУЧЕНИЕ Г'ЕКСМБИНАНТНОГО БЕЛКА МТБ - 1 И ЕГО БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

Специальность 02.00.03 - молекумиргая биология

Агтсрефграт

диссертации на соискание у&иой егг.епечи кандидата биологянггких наук

Моо-уч 1У?3 гсд

) ■ •

Работа выполнена в лабораториях Биосинтеза нуклеиновых кислот Института молекулярной бгологин им. В.А. Экгельгардта, зла. Лабораторией аылсыих РАН Г.П. Георгиев и в лаборатории молекулярной пеяетики рам Института Биологии Гена, зап. лабораторией академик РАЕН Е.М. Лукаяияин.

Научный руководитель - доктор биологических наук,

академик РАЕН Е.М. Луканидин

Официальные оппонента - док-гор биологических нгух Габибов А.Г.,

Аоктор бмалогмчес*** ^а'^Про*

РобороЯй 0-0.

Ведущая организация - Институт биоортапической ху.муи

им. ЩемЕкши ¡1 ГО.А. Овчшшикова РАН

Защита состоятся 43 -¿/ЩЛ 1993 г. в ' О члеоз на заседании Специализированного Совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Эагслыартг РАН по адресу: 117954, Москва, ул. Вавилова, 32

Автореферат разослан " п " ОшЛ^Х 1993 г.

С диссертацией моаско ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. ЭнгельгардрЛАИ»

Ученый Секретарь Специализированного Созета-^ А.М.Крицыи

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Мег.гстазирогание опухолевых клеток - это сложный процесс, включающий прорастанн; опухоли через стенки сосудов и проникновение опухолевых клеток в кровеносное русло, способность вы-yjDizать в услозшзх атаки амхунной системы организма и, наконец, прикреплекге и ргзмнохеяиг клеток и возникновение опухоли в новом меоге.

Образование Бтср:тчных опухолей свлзется одной из наиболее частых причин смерти при раковых забояешниях и арляется важной медицинской проблемой, однако мало известно о молекулярных механизмах, приводящих к метасгазироватпо опухолевых клеток.

При попытхе идентификации гепоз, отгетствениых гз Метаста-тичесхкй фсаоткд, в вашей лаборатории было проведено дифференциальное исследование экспрессия генов в мегасгазирующей (KCMJI - ICO) и родственной ей Неметзстагшруюшей (КСМЛ - 0) линиях клеток, полученных в результате различных условий пас-скрзгакня стзятапной адгнокаргсякэмы Молочной железы мышей л скпгеглых хсхвотных. В результате был кяонкросан кДНК гена mts-l, специфически тргнсхрябируеыого только в метгстгзирую-пхюс клетках.

Изучение транскрипции гена mts-l з 27 опухолевых линиях клеток показало, что этот ген преимущественно транскрибируется в

метастазирующкх опухолях. Транскрипти гена обнаружены в шести из семи метасгазирующих линий, а в иеметастазгсруюшнх линиях клеток не обнаружена транскрипция этого гспа.

Определение нуклеотидной послелога-хяьнссти гекзтв-! показало, что он кодирует белок, состоящий из 101 смкноккслот, и, исходя из его аминокислотной последовательности:, относится к S- 100 семейству кальцийсвязивакнаих белков.

Ко времени написания диссертации :'ысла рзбота (Davies B.R. et. at.,1993) в которой метастатнчесхкй фенотип был индуцпросан при трансфекцки эпителиальных клеток Rama 37 молочной келезы крысы, крысиным аналогом гена шк-1. В контрольном эксперименте при трансфекцни тех же клеток онкогеном EJ ras-l такого эффекта не наблюдалось.

Таким образом, возможно продукт reí a rr.ts-1 каким-то образом вовлечен в формировании метастатического фенотипа опухолей. В связи с этим получение продукта гена пда-1 и его изучение представляет ссбой актуальную задачу.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

OcHGEzas дель пасторшей работы состояла в получении экспрессии рекембкьаятного пш-1 в Е. Coli, его очистка для последующей биохимической характеристики и его использование а качестве инструмента для дальзгйппх исследогаш'Г: по выяснению биологической релм белха mts-1.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ

В нгстолшей работе был получен и очкшен рекомбмкантиый продукт гена га!5-1 з достаточном количеств:, позволяющем изучать некоторые его свойства. Показано связывание хальакя реком-бкнантным тв-1 и его взаимодействие с полилелтидом пчелиного яла мелиттином, что указывает на возможное структурно-функциональное сходство с другим белком 5-100 семейства, 510С(3 и с кал-моду лином, которые также способны связывать мелитпгя. С помощью 15-членного С-концевого синтетического пептида белка гак-1, а также с помощью рекомбинантаого тв-1 были получены моноклояалькые антитела НМ-4 и Л8/7, соответственно СЛукани-дин Е.М. и др.. Датское общество исследования рака). С их помощью было получено подтверждение присутствия белка тк-1 в клетках ХСМЛ-100 и ею отсутствие в клетг-ах 1ССМЛ-0, методом иммукоблоттянга.

Имг "упопрециютация экстракта белков из глегск КСМЛ-100 с 1|0:лотьк5 мовоклоналъиах антител НМ-4 и А8/7 (Краевсхая М., Датсгое общество ксслздовглжт рака) приводят х специфической гопр-цпптлщ::! белхогых полос 200 Кда, 22 Кда, 18 Кда и-полосы 10 Кда, ссотпггствугащгй белку пш-1. В аастояцгй ргботе показано иеяоергдстггкяое рзгзиолексгссг полосы 700 Хдя с рекомби-нангкык белым т1н-1 при ккгубают гслу с; к':анчм иодом

» Т"

'I - г№-1 в гтрпсл'тстБ::!: 1 ;-.'М НОТА и Солее слабое ззакаодейст-вне в присутегзчи 1 мМ Сг .

Быяо пок'оглко также взак^сдейспже этой же полосы

-6- Calmodulin в присутствии 1 мМ Са и отсутствие взаимодействия в присутствии ! мМ ЕСТА.

Эти результаты указывают на то, что полоса 200 Кда представляет собой миозин, тах как его молекулярная масса 200 Кда и из-вгстно его взаимодействие с калмодулином.

С помощью полаклональных антител к миозину в настоящей работе показано специфическое окрашивание полосы 200 Кг.а в им.чуноблотшгс иммунопреципитировскного материала. Имму-нопреципитадн* тою же экстракта с помощью политональных антител к миозину прводит к той лее карткае коиммунопрециннти-рованяих полос (Краевская М.).

'Гакчм образом, впергые получены данные, показывающие взаимодействие rais-i с миозином. Это са=но с точки зрения понимания механизмов .функционирования белка mS-l. Возможно, по-ерздегвом миозина гак-1 участвует б регуляции клеточной подвижности и, таким образом, mts-1 сказывается вовлечен в проявлении метастатического фенотипа опухолевых клеток.

Практическое значение настоящей работы определяется тем, что в ней внесен вклад в выяснение возможной роли белка mts-1 в метастатическом иоведешш опухолевых клеток, что может иметь далеко идущие послсдсгсля в прогнозе и терапии метастатического фенотипа.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации были прлдстаглелы на "22-nd Meeting of the Federation of European Biochemical Societies" (Stockholm, 1993) к на езеегодном симпозиуме Датского общества ксследова-

ния рака (Copenhagen, 1993). Опубликована одна работа в журнале "Биоорганическая химия" и готовится еше одна публикация для зарубежного журнала.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Работа изложена на m страницах машинописного текста, она включает: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, выводы, материалы и методы и список актированной литературы (всего 165 ::зззаний). Диссертация содержит 14 рисунхоз, гоме-шепкых в тексте.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. З.сгтрессия рекомб:;нантнсго Mts-1 а клегдах ЕСоН.

Par.ee, с помощью дифференциального скрсникя хДНК библиотек, полученых из линий клеток КСМЛ-1СЭ и 1ССМЛ-0, была клонирована кДНК - хспия ге::а ir.ts-1 мыши и пелупенп плгзмзда pUC19/fflts-l (см.рнс 2)

В качестве вггтора для экспрессии pexoMfo/mimroiT? mts-1 в работе была кспользэвана плазмида pMAL-c (N=-.v England Bio Labs, Англ«*), представленная яа рисунке 1. Она содергзтген ша!Е, кодирующий бг.яок свя?ызгющкй Мальтозу (МБР), под сильным "faс" промотором, а также ггп bcl, зкещзгеггрукщий рег.рессор "кс" прочотэра.

Су.:: ¡а голучепня зк:прессирующгй плазтлда pVAL-c/mts-1 п"хг?ана и?, писунхе 2. Рекомбикатяые клечы шлупегтные при сг.рипмнгс англизировали с помещыо электрофореза в SDS-ПААГ. После ¡¡."лую;:-.и ИПТГ .'изопропил-тио-j? -D-галаг.то^зд) появляется пслосз 55 кДа, по размерам соотБетствукшэя гибридному белку МБР/rolj-I (см. рис.3)

- I— Sac! —I I—Kpnl—I I—EagI-. ,—BamHi-

mal E...TCG AG С TCG GTA CCC GGC CGG GGA —! I—StuI—J r-EcoRI—j

ТСС АТС GAG GGT AGG COT GAA TTC AGT Ile Glu Gly Arg »-Factor Xa cleavage

j—BamHI-| j—Xbal—| pSa!I-

AAA ACC CTC GAT GGA ТСС TCT AGA GTC

-. j—Pstl_( j—Hind III—j

GAC CTG CAG G CA AGC TTG LacZa

Рис.1. Схема вектора pMAL-c

Вектор содержит иядуцибелъный промотор Рис, находящийся под контролем Lac репрссссра, кордируемого геном lacl. Полилинкер обеспечивает различные сайты рестрикции для ннсерони интересующего гена и его сливания с геном та!ЕД2-2б. Этот ген кодирует белок, связывающий мальтозу, имеющий делецию сишально-го пептида, обеспечивая таким образом его цитоплазматнческую локализацию. Полилинкер также кодирует тетрапептид Ile-GIu-Gly-Aig, который узнается фактором Ха, способным расщеплять пептидную связь после Arg.

рв^ИлксГ

!зс 2*

'трг

Ц тО-Г

У

Агпрг

1 £ с » г е яр тг

|1С8РЕГРТГ

сса сс\ тсс хтс слс.г.ст лсс.сст г.л* ттс см »ч !6»:<гччссм0 1тм»ет«*се«о.Т

с г С К С в

.гсс

т и л я т т 1: к р

гсс ."Лг *зь с-с...

Ркс. 2. А. Схема конструирования плазмтаы рМ/Х-с/ш1ч-1. Указаны сайты ргстриктаз : Н-КнкПИ. К-Крп1, Е-ЕтоЗ!.

Б. Нухлготидкая послгдовртельчость места стта гехтора рМАЬ-с (проп::сн:-:е бухпь>) ¡: фрагме.тга, содерлжего :еи ик-1 (строчные буквы); пог-чза::о соотрг.спше крд:груашх гминокис-лст с з:хп;р:::.'.г:ггзл!>".:о опрелсле:;ьоГ; а:кно~иа;отясй посяелооа-т?л1>::ость:о (стр;::а сверху), а такле ;»к.та <*якт;«чес::гсо и теоре-■пгчсгкего расделлсния фактором Ля.

А Б В Г

Рис. 3. Экспрессия и очистка рекомбипанткого белка тс-1.

Электрофорез в 15% БПХ-ПААГ (А) лпзата клеток получена до индукции, (Б) через 2 часа после индукции ¡ГТв, (В) счищенного с помощью афишой хроматография гибридного белка МЗР/лК-1, (Г) у. этого хе белка после расиеплеиЕВ фактором Ха. Окраска ку-масси К-250.

2. Очистка рехомиинантнзго тВ-1 из клеток Е.соП и определение К-кокаевой аыянокнслотнсй последовательности.

Очистку гибридного белка проводили с. помодсыо афиннсй хроматографии, используя СЕ0ЙСТ20 МБР сгязызать мальтозу. При пропускании через колонку с амилозой гибридный белок созывается с колонкой и затем зяюкруется с нее 10 мМ Мальтозой.

Особенностью вектора рМАЬ-с «зляетсв наличие в линкерном

участке последовательности кодирующей тетрапс;гтид Ile-Glu-Gly-Arg, узнаваемый фактором Ха.

Дальнейшую очистку рекомбинантного белка ims-1 проводил» расщепляя белок МВР/mts-l фактором Ха с последующим разделением белков МВР и mts-1 электрофорезом в SDS-ПААГ п элект-роэллюцией полосы соответствующей рехомбннантнэму mis-1 (см. рис.3)

В экспрессирующей плазмняе pMAL-c/mis-1 последовательность кодирующая тегграпептид, узнаваемый фактором Ха, расположена на расстоннии 21 нуклеотида от ATG старт кодона mts-1, поэтому в отличии от природного белка, рекомбинанттлй mts-1 долхен был иметь семь дополнительных аминокислот на N- r.otme.. Три пгряие кодируются pMAL-c веггтором, а четыре последующее нетранстиругкэй in vivo последователь!!остью r.-на mts-1, непос-ргдстггяпо прилегающей к иницирующему ATG- кодоиу.

Однако, кг.к показало прямое определение ÎJ-кондевой амино-::ислэтЕгй после,-сгггсльностк ргксмбкиаиткого nts-I, разрыв петг.тсласй свазн з белке МЗГ/nts-l происходит не я онидаемом i:£cre ерту за Лгс тетрапгптидз, а на две змкиохиоюга влево от тетрапептзща кепзду Arg н Gly (см. рчс.2).

Эти данные указывают на тс, что фактор Ха не обладает абсолютной специфичностью.

Тахим образом, полученный реком6:пшш>ьм mt.--l оказывается на 13 гмянокислотгшх остатков длиннее своего природного аналога.

3- Связывание 45Са2+ с рехомбинантным гт5-1 Характерной особенностью кальций-связывающих белков является наличие в их составе консервативных полипепт;щов, образующих цетлевыс кальций - связывающие домены или так называемые ЕЙ - структуры.

Анализ нуклестидной последовательности гена гав-1 показал.

А

4 М

зм 2».» 24.0

1«.«

Ссеэ <5S>

I 4.Z

еэ

1 2 3

1 2 3

Рис. 4. Связывание 45Са2+ с рехомбинантным mts-1. Электрофо-регичееккк анализ продуктов расщепления гибридного белка фактором Ха (2) : окрашивание амидо черным 10Б (А) и радиоавтограф нитроаедлюлозного фильтра после инкубации с 43Са1+ (Б). 1 - Маркеры молекулярного веса (Sigma MW-SDS-70) 3 - калкодулин.

что mts-I имеет два EF-доменл. Полученный в настоящей работе рсхомокнантный mts-l отличается от природного присутствием ¡3 дополнительных аминокислот на N-Ko:mt белка. Мы исследовали способен ли такой белок свягывать Са2* in Vitro.

Гнбрядньгй белох после обработки фактором Ха разделяли глектрсфорсзом в ПААГе, переносили на нитронетлюлозную мембрану и инкубировали с радгоагткгным кальцием.

Было похдзаио, кальцпк сзязысзется с рекомбинаахшм mts-l (ш. ряс. 4). Следовательно, наличие доползительних аминокислот в согтагг ргкоибинангаого mis-1, ьо видикому, ве меиагт значительно трагичную структуру белка и не влияег на его способность сгязызать калщгз in vitro.

4. Снизывание мелчттина среком5ипянтнымт«-1

Мелитгин - зго небольшой полипептед, содержащий 26 аминокислотных остатков, являющийся основным компонентом пчелиного ада.

Калмодулин связывает мелитгин и такое взаимодействие используется как модель, страгягощая взаимодействие калмодулина со своими белковыми мшденами.

Один из белков, принадлежащих к S-100 семейству, белок S-iOO/? также обладает способностью связывать мелитгин.

В этой работе было показано, что рекомбинаптный mts-l (mts-l также принадлежит S-100 семейству) обладает способностью связывать мелитгин в кальций независимой форме (см. рис.5).

Этот факт указывает на возможное структурно-функциональное сходство между этими тремя белками.

I А I Б !

««I —с» ' МВГ/MTS 1

Рис. 5. Связьпинце малилп-а с рекомб^вгнпшм mts -1.

15% электрофорез в SDS -ПАЛГ онша, прозгде;шого в присут-2+

сгвии 1 мМ Ca (А) и е прчсутсгзия5uM EGTA (Б).

1,3. Суперкатакт, по^гзыиаюшнй ш^сриал, нгсвязавшлкси с ыеллктиа-сефарозой.

2,4 Материал, mjsíwtscr. с ю^-птгпк-счфарозой. 5. Продукты расщгллснчп гибридкэт} бглга МЗГ"/с^-1 Окраскг. ку..:ассп R-25C.

5. Ими:унсблс-.1лкг приредкех» mis-1 Нрисутстзье природного белка mts-1 б клетке/. КСМЛ-100 ¡i его

отсутствие с клетках КСМЛ-0 было показано методом нммуноб-лоттинга, гепользуя разные мышиные (^скоклоналвные антитела.

Это МАЬ НМ-4 иолу:еннь:е синтетическому ::ептиду, состоящему из 15 С-концевых аминокислот белка жК-1 и МАЬ А8/7,

6446-

М-

7.1.5-

К.1-

1

Ркс. б. Ихлмуиоблотгинг природного пЧ5-1 с использованием моноклепальных аатктел НМ-4 (А) и с использованием мококло-нальных антител А8/7 (Б).

15% электрофорез в 505-ПААГ и перенос на мембрану !тшоЫ:оп Р. Дсгехши с помощью системы ЕСЦ АшепЬат.

Экстрактхлего^КСМЛ-100 (1) и КСМЛ-0 (2).

полученные к рекомбинантному белку mts-1.

Как показано на рисунке 6, специфически окрашивается полоса, соответствующая размеру 10 кДа в экстрактах клеток КСМЛ-100 и полностью отсутствует в экстрактах клеток КСМЛ-0.

6. Анализ иммунопреципитированного материала из слеток КСМЛ-100.

6.1. Иммунопрецишггаиия с помощью копоклэналькь:* оптител НМ-4 и А8/7.

Иммунопреципитация экстракта ^-мгтиония-меченных бел-кос из клеток КСМЛ-100 мсноклональньии антителами ÍIM-4 г. А8/7 специфически присолит к одинаковой картоне ксиммукспре-ципитированных полос: 2001Сда, 22 Кда, 18 Кда и полосы 10 Кда,

1 2 3 4 5

Ркс. 7. Рсдасапгограф 8% и 15°;, стуиенчгтого элекхрефореза ь SDS-ПлЛГ. Иммунопреи^гк/атов ^З-мепгонЕл-мечешшх балков, окстратз клеток КСЮЫ00, порученных с помощью ¡.¡опоха-иальпых ?ю7ггсл НН-? и А8/7 (1, 5), D/.KO Х931 (2). Sera-bb MAS 37Ср СЗ) и полигленальных &йттггел SlGIviA - М7648 (4)

соответствующей белку mts-1 (рис. 7, I, 5). В качестзе отрицательного контроля проводили иммукопреципитацию того же клеточного .эксграта с помощью монсхлональных антител DAKO Х931, направленных к ферменту глюхозооксидаза из Aspergillus Niger, который не встречается в тканях млекопитающих, а также с помощью мококлснальчых антител Sera-lab MAS 378р, напраглен-ных к рибояуклеоткд редуктазе (рзс. 7, 2,3).

6.2. Ge! overlay I25I-mts-l и 1Í5I-calmodulin цммунопреципитировалного материала.

ИммунолргаилитлроЕааный материал, полученный из немечец-ных клеток КСМЛ-100, разделали 5-20% градиентным электрофорезом в SDS-ПААГ. При окрашивании кумасси R-250, помимо тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, присутствующих в положительных так п в отрицательных иммунопреципитатах, выделяются еще две полосы : это полоса, соответствующая белку mts-1 (10 хДа), и полоса-гриплет, имеющая электрофоретичссхую подвижность 200 кДа (рис. 8 А,Б).

Возможность непосредственного взаимодействия mts-1 с полосой 200 кДа была оценена проведением инкубации геля с мечен-

125

ным рекомбингнтным белком I-rats-1 (Gel overlay) в присутствии кальция или в присутствии EGT А.

125

Результаты опыта показывают, что I-ints-1 взаимодеиствует с полосой 200 кДа в присутствии 1мМ EGTA и значительно слабее в присутствии 1мМ Са2+, также наблюдается взаимодгйствиие с полосами, соответствующими тяжелым цепям и легким цепям иммуноглобулинов, а также с полосами на уровне 14 кДа обоих имму-

Рис. 8. Gel overlay ш1-тй-1.

5-20% градкентклй электрофорез с SDS-ПААГ продуктов им-мунопреамитации 1.ю:;с::зк,чл1гьц*!< еететслсмя DAKO Х?31 в качестве отпиизтсгыюго (I) и монсклоналышми антителами IIM-4 (3) ьз 1--етс:: КСМЛ-1С0, £ тапле триеров но;о сгса (Rninbow MWi 1ÎIFM '/¿6, Лпайапз) (M). OxpanniBanue Kytr.cos R-250 (А,Б) ргдясавгсгрсф тех гелей пгсле кнхубг ил с IiSI-mts-! з пр:;сутст^;: 1кМ EGTA (В> и 1мМ Сг2+(Г).

ь В

» ' SS3

""^л^ТЭ /rxft-a

--—v-----^

<

2 1

1

1

Рис. 9. Gel overlay ,2JI-Calmodulin.

12-5% градиентный электрофорез в SDS-ПААГ продуктов им-мунопреплпитации монохапальными антителами НМ-4 (1) и мо-ноканалышми антителами DAKO Х931, в качестве отрицательного контроля (2), из клеток КСМЛ-1С0. Окрашивание кумасси R-250 (А.Б) и радиоавтограф тех же гелей после инкубации с 12JI-mts5-l а присутствии 1мМ Сг}* (В) и 1мМ EGTA (не показано кз-за полного отсутствия сигналов).

нопреципитатов и опять взаимодействие снльнее в присутствии 1 мМ EGTA, чем з присутствии 1мМ CaJ+.

Заметим, что полосы ш уровне 14 кДа не видны при окрашивании геля кумасси R-250.

В присутствии 1мМ EGTA наблюдается также взаимодействие с некоторыми из маркеров молекулярного веса (Amersham, Rainbow MWM RPN 756), это фософорилаза b на уровне S7.4 Кда и лизэ-лим на уровне 14.3 Кда (см. рис. 8 В,Г).

Полоса 200 Кда также взаимодействует с 1Z5I-Calmodnlm в прн-сутствии 1 мМ Са и не взаимодействует в присутствии 1 мМ EGTA (рис 9).

б.З.Кдаггкфикация белковых полос нхгмунопреципити резанного материала.

Описанные выше результаты указывают на то, что псшсса 200 Кда представляет собой ниозин, так как его молекулярная масса 200 Кда и известно его взапмодействие с кдлмодулином.

С помощью кроличьих поликлональных антител к гпюзину (M-764S, SIGMA) било показано специфическое схрашкванзс полосы 200 Кда (рис. 10, 1) в иммунобдотгинге иммунопреципитиро-глнмого материала. Икэ^уиоблэттинг с помощью кроличьи;: поли-клокальных антител к мыс^шь::: гашунэглоЗулшзам (DAI'O Z2S9), е качестве отрицательного контроля, не пс.^азигап окра-¡зжвмя эте« цоло ü (рас. !0,2).

И:.шз'нопрсцшшт7:рсвгю«1Й матзригл был тестирован так^с на c:cj-.CTB;ie кросс-рсакцил полосы 200 Кда с моноклси2льны;л' ач-тктелами ИМ-', с помощью ккмуиоблоттиста (p:¡c. 10,3).

I 2

Рис. 10. Иммунсблолинг иммунопреципитированпого материала, полученного моноканальныки антителами к rats-1 ЯМ-4 (1) из клеток КСМЛ-100 с помощью кроличьих поликлональных антител к миозину SIGMA - М7648 (1), кроличьих поликлональных антител к мышиным иммуноглобулинам DAKO Z259 (2) и монокло-лальных антител к mts-1 НМ-4 (3).

8% электрофорез в SDS-ПААГ и перенос яз мембрану Immobilon Р. Детекция с помощью системы ECL, АпжЬзп с использованием вторичных антител конъюгпрованных с персксида-зой : козьи антитела к иммуноглобулинам кролика SIGMA А-0545 (1,2) и кроличьи антитела к иммуноглобулигам мыши DAKO Р260

Икмунопрециттация ^-метионии-мечеккого бипсозого экс-трата из клеток КСМЛ-100 с помощью по-тлтлонглыго. гнтител к миозину (M-764S, SIGMA) показывает ту же картину коиимуиип-рец:гаипф2ванных полос (рис. 7, 4). Дополнительно к зтону анализу, во зсех иммунопрештитгтах было показано спгпифическог окрашивание полос 22 Кда и 1 ? Кда антителами к легким цепям

миозина и полосы 10 Кда моноклональньши антителами НМ-4 и AS/7 (Краевская М. Личное сообщение).

Таким образов, анализ икмунопрешшитированного материала привел к идентификации всех белковых полос и установил факт взаимодействия mts-1 с миозином.

ВЫВОДЫ

1. Полу чена экспрессия рскомбиинтиого б^-жа mts-1 в клетхах E.Coli и проведена его очистка.

2. Показано взаимодействие рекомбанадтного sits-1 с меипти-ном

3. Показано связывание каяыжя ре^с:(5яаактным гаВ-1

4. Показано присутствие природного mis-¡ в клетках КСМЛ-100 и его отсутствие в клетках KCMJI-0 с помощью моаоклосгльпых антитгл НМ-4, пелучелных к С-кснцсиоыу синтетическому пгпти-ду mts-1 и с моноклональными антителами А8/7, полученными х рекомбянантному шв-1.

5. Идентифицирован белок щггоскелета - миозин как белок, взаимодействующий с mts-1 в экстратах клеток KCMJI-100. Возможно, посредством миозина mts-1 участзует в регуляции клеточной подз'ссносги и таким образом гоалечен в формировании метастатического фенотипа опухолевых клеток.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В » СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ

1. М.А. Нейра Кзденас, М.Ф.. Бсрошэт, А.К.Эйраяздге, О.Ю, Чертов, Е.М. Jlyua»uuEH. Получение р^ок&злггкого Мгтгстам-

на и его характеристика. Биоорггииче;кая Химия. 1993. V59, N4, стр. 420-426

2. Neira М.А., Voro^ilch M.F., Gabrielian А.Е. and Lukanidin E.M. Expression of recombinant Prolein гси-l and search for Protein targets. 22nd Meeting of the Federation of European Biochemical Societies, Stockholm, 1993, crp 150.

3. Kriajevski M., Grigorian M., Neira M., Lukanidin E. Study of the

2+

biological features of the Ca binding Protein isolated from a highly metastatic mouse adenosarcoma ceil line. Dausk Selskab for Cancerforskning, Copenhagen, IS93, crp 7.