Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение взаимодействия белка MTS1 с белками-мишенями

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение взаимодействия белка MTS1 с белками-мишенями"

г

На правах рукописи УДК 577.122

ЛОМОНОСОВ МИХАИЛ ЮРЬЕВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БЕЛКА МТЯ1 С БЕЛКАМИ-МИШЕНЯМИ

Специальность 03.00.26 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА

1997

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики рака Института Биологии гена РАН

Научные руководители: академик РАН Георгиев Г.П.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, член-корреспондент РАН Рысков А. П. доктор химических наук Габибов А.Г.

Ведущая организация:

Биологический факультет Московского Государствегшого Университета им. ALB. Ломоносова

Защита диссертации состоится ". ..Ш......« (^М^Ш^р^..... 1997

года в ....." часов на заседании Диссертационного совета Д.200.30.01

при Институте биологии гена РАН по адресу: 117334, г. Москва, ул. Вавилова 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Знгельгардта РАН по адресу: 117984, г. Москва, ул. Вавилова, д. 32.

, .. АWl

Автореферат разослан ".../..г/.......'• .¡.Tr^rf.h .......... 1997 года

Ученый секретарь

Диссертационного совета __>

кандидат фармацевтических наук ¿С 0 Грабовская JI.C.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность задачи

Экспрессия reua Mtsl коррелирует с метастатическим фенотипом многих опухолей и клеточных линий. Показано, что в определенных видах опухолей экспрессия гена mtsl в несколько раз увеличивает вероятность образования метастаз. Ген mtsl экспрессируется также в некоторых нормальных тканях и органах. В норме наиболее высокий уровень экспрессии обнаружен в Т-лимфощггах, нейтрофилах и макрофагах. Данные типы клеток обладают определенными свойствами сходными со свойствами метастатических клеток, такими как инвазивность, включающую высокую подвижность и способность разрушать клеточный матрикс. Таким образом, изучение фупкшш белка Misl являс1ся необходимым этапом для более полного понимания механизмов метастазирования.

Ген mtsl колирует белок, относящийся к семейств)' S-100 -небольших Са2+-связываюшпх белков. Функция многих белков лашюю семейства, включая белок Mtsl. в настоящее время ло конпа не ясны. Наиболее важным этапом в изучении механизма действия любого белка является определение иелков-мишенеи и исследование их шаимодейепшй.

Ранее было показано что белок Mtsl взаимодействует с тяжелой цепью немышечного миозина. Как" молекула, способная создавать механическую силу, миозин пришшае! учасше во многих процессах, связанных с клеточным движением и изменением формы клеток. Б настоящее время, кроме хорошо охарактеризованного) обычного, формирующего филаменты миозина, экспрессирующегося в мышечных и немышечных метках, обнаружено по меньшей мере десять дополнительных типов миозина. В позвоночных экспрессируется семь из одиннадцати типов. Несколько разных типов миозина может экспрессироваться в одной клетке и принимать участие в выполнении

разных функций. На амебе Ок1уоз1е1'шт было продемонстрировано, что немышечные миозиньт создают механическую силу для таких процессов как фагоцитоз, рост псевдоподий и движение клетки, включая направленный хемотаксис. В связи с этим представляется весьма вероятным участие немышечного миозина в процессе инвазии, осуществляемом метастатической клеткой при проникновении в ткань из кровяного русла. Таким образом, детальное изучение взаимодействия белка М[51 с тяжелой цепью немышечного миозина может существенно конкретизировать наше представление об участии М151 в метастазировании.

Цель работы

Основная цель настоящей работы состояла в обнаружении новых и изучение взаимодействия с известными белками-мишенями белка М1з1.

В ходе исследования предполагалось решение следующих экспериментальных задач:

1. Картирование участка взаимодействия М^ 1 с тяжелой цепью немышечного миозина.

2. Исследование влияния белка \1tsl на свойства тяжелой цени немышечного миозина.

3. Выделение новых белков-мишеней из клеток линии КСМЛ-100.

4. Изучение влияния новых белков-мишеней на кальций-связываюшие свойства и конформашпо белка МЫ.

Научная новизна и практическое значение работы

В настоящей работе определен участок тяжелой цепи немышечного миозина, взаимодействующий с белком ¡Укх1. Изучено влияние М1$1 на фосфорилирование и растворимость миозина. Найден новый белок, являющийся мишенью белка ¡\ltsl и исследовано его влияние на кальций-связывающие свойства и конформацию белка М151. Полученные в данной работе результаты позволяют глубже понять механизм действия и функцию белка и, соответственно, механизм развития метастазирующих

опухолей.

Практическое значение данной работы заключается в изучении мехатпма действия оелка Mtsl, принимающего участие н развитии метастатического фенотипа многих видов опухолей. Основанное на полеченных результатах воздействие па фуиюппо данною белка на молекулярном уровне может привести к значительному замедлению и остановке развития метастаз для некоторых типов злокачественных опухолей.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на симпозиуме Bio - Тек (Denmark, 1995), Энгельгардтовские чтения (Москва, 1996), Второй съезд биохимического общества РАН (Москва, 1997).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 3 печатные работы.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на .............. страницах машинописного текста

и состоит из следующих частей: обзор литературы, материалы и мех оды исследования, результаты, обсуждение результатов, выводы и список

литературы. Библиография включает в себя .............. источников. Работа

проиллюстрирована 10 рисунками и 1 таблицей.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Взаимодействие Mtsl с хвостовым участком молекулы тяжелой цепи немышечиого миозина.

Ранее было показано взаиуодепствие белка Mtsl с тяжелой цепью немышечного миозина (ТЦНМ). Для определения функции и значимости данного взаимодействия представлялось необходимым определение участка ТЦНМ, взаимодействующего с белком Mtsl, в связи с тем, что каждая из функций миозина (связывание с актином, взаимодействие с регуляторными белками, образование филаментов) связана с определенным доменом ТЦНМ.

Для определения участка ТЦНМ, взаимодействующего с белком Мтб!, был выделен миозин из клеток линии КСМЛ-100. Выделенный миозин обрабатывали трипсином или химотрштсином, фракционировали в градиентном ПААГ и переносили на фильтр. На рис. 1А - показано расщепления миозина трипсином. Фрагменты миозина разделялись по размеру на две труппы: первая - в пределах 100 - 200 кДа и вторая - от 50 до 65 кДа. Сходное распределение фрагментов описано для протеолпза

А В

250-

986450-

1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5 6 7

165 — 130~

98 —

363016-

Рис. 1. А: Расщепление трипсином миозина из клеток КСМЛ-100. Окрашенный Кумасси градиентный ддц-пааг. Дорожки 1-7 - увеличение времени расщепления миозина трипсином.. Миозин выделили из клеток, обработали трипсином и разделили в градиентном ДДЦ-ПААГ.

В: Связывание белка Мгя1 с протеолитическими фрагментами миозина на фильтре. После разделения протеолитических фрагментов миозина в градиентном ДДЦ-ПААГ, белки переносились на фильтр (Р\'ОР). Фильтр инкубировали в растворе белка МЫ, места связывания КШ! с фильтром детектировали по процедуре Вестерна, с помощью лоликлональных АТ к М1$1 и реагентов ЕС1. (Амершам). С левой стороны обозначен мол. вес. в кДа.

миозина из мозга. Известно, что фрагменты от 100 кДа и выше относятся к хвостовой части ТЦНМ, а фрагменты 50 - 65 кДа - к головному домену ТЦНМ.

Эксперименты по взаимодействию белков на фильтре показали (рис. 1В), что в присутствии Са-'*" белок Мк1 взаимодействует только с тжедыми

протеолитическими фрагментами, более 100 кДа, относящимися к хвостовой части ТЦНМ. В отсутствии кальция (1мМ ЭДТД) взаимодействие не наблюдалось.

Картирование участка взаимодействия Mtsl с тяжелой цепью немышечного

миозина.

Для точной локализации участка ТЦНМ взаимодействующего с Mts.1 было получено методом RT-PCR 14 перекрывающихся клонов, несущих кДНК, покрывающие всю кДНК ТЦНМ. Соответствующие фрагменты ТЦНМ были экспрессированы в Е. coli. На рис. 2 показана схематическая карта полученных фрагментов ТЦНМ. Полученные пептиды имели ожидаемый размер при разделении в ПАДГ (рис. ЗА) и узнавались поли- и моноклональными AT к миозину.

Взаимодействие рскомбинантных пептидов с белком Mtsl проверялось метолом взаимодействия на фильтре. Как показано на рис. ЗВ, в присутствии Ca2' белок Mtsl взаимодействует с пептидами М4 (1384 -1961 аминокислоты ТЦНМ), М4-3 (1762 - 1961). М4-ЗС (1762 - 1946), М4-3G (1762 - 1937). Более слабое связывание происходит с пептидами М4-ЗВ (1762 - 1930) и M4-3D (1762 - 1937). Her взаимодействия с пептидами М1 (2 - 355), М2 (318 - 768), МЗ (746 - 1433), М4-0 (13S4 - 1435), М4-1 (1426 -1606), М4-2 (1580 - 1768) а также с М4-ЗА (1762 - 1914). В отсутствии Ca-взаимодействия не было.

Рекомбинантный Mtsl с делегированными 1В аминокислотами на С-конце (fle^iMtsl) (всего Mtsl состоит из 101 аминокислоты) не взаимодействовал с фрагментами ТЦНМ.

Из подученных результатов следует, что для взаимодействия Mtsl с ТЦНМ необходим участок ТЦНМ с 1915 по 1937 аминокислоту.

Первичная структура данного участка, включая прилегающие последовательности (по 30 аминокислот в обе стороны) была проанализирована на предмет максимальной гомологии с помощью программы BLASTA. Было обнаружено, что первичная структура данного

участка консервативна у человека, крысы, мыши и некоторых видов простейших.

2

. hmyo Ml С

head

tail

1961

mJ

m2 с

•МЗ С

м4

1384 Ытгуо4

м4-0

192Вр 1961 1 t

м4-1 с

м4-2 1 м4-3 •

1762

м4-3

1917 1928 1944

м4-за с ' м4-зв е •м4-зс ■

_19l£V

193^

194 6-у

m4-3d

m4-3g вш

1927-У

1937-у

Рис. 2. Схематическая карта рекомбинантных подипептидов, перекрывающих всю молекулу тяжелой цепи немышечного миозина. На полиА-РНК, выделенной из клеток человеческой линии ОШ. проводили ИТ-РСЯ с праймерами к тяжелой цепи немышечного миозина человека НА. Полученные кДИК экспрессировали в Е.соИ. Незакрашенные прямоугольники - фрагменты ТЦНМ, с которыми белок МШ не взаимодействовал, заштрихованные прямоугольники - фрагменты ТЦНМ, с которыми детектировалось слабое взаимодействие N1(51, закрашенные прямоугольники - фрагменты ТЦНМ, взаимодействовавшие с белком М1й1 . Цифраими обозначены аминокислоты ТЦНМ.

А

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

кйа

- 43.0

- 29.9

- 18.4

В

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

- 43.0

- 29.9

е»

- 18.4

Рис 3. А: Рекомбпнантныг ос.и: фрагменты ГЦШ1 Разделение и »р-доиеншом ЛДС-ИЛЛК окрами ¡::нмс Кум.-кси

В: Взаимоденсшис белка Ми) с фрагментами ТПНМ Рекочйичпнт.чме

белки. ■ фрагменты ТЦНМ. ::ерсн-?с.:с фа:мр ¡¡'ХОР) :: филыр инкубировали в раствор: белка Мг-.!. Меча счяшьзния МЫ с белками детектировали но процедуре Вестерна с использованием поликтонхльных АТ к Мгв1 и реагентов ЕСЬ (АтегеЬат). С левой стороны - маркеры молекулярного веса в кДа.

Влияние Mtsl на фосфорилирование С-конкевого фрагмента молекулы

миозина.

Существуют данные, что ТЦНМ фосфорилируется протеинкиназой С (ПКС) по серину-1917 и казеин киназой II (KKII) по серину-1944. Посколько определенный нами участок взаимодействия ТЦНМ с Mtsl находится в непосредственной близости от сайтов фосфорилирования, нами было проверено влияние Mtsl на фосфорилирование ТЦНМ.

На рис. 4 показана авторадиограмма фосфорилирования С-концевого фрагмента ТЦНМ М4-3, размером 22 кДа, протеинкиназой С (рис. 4А) и казеин киназой II (рис. 4В) in vitro. Обе протеинкиназы с высокой эффективностью фосфорилируют пептид М4-3 в отсутствии Mtsl (рис. 4А,В; дорожка 1). В случае ПКС добавление белка Mtsl приводило к ингабированшо фосфорилирования ТЦНМ. Уровень ингибирования был пропорционален количеству добавленного Mtsl (рис. 4А, дорожки 2-4). При этом добавление делетированного белка Mtsl не влияло на фосфорилироваие ТЦНМ (рис. 4А, дорожки 5-8).

В случае казеин киназы II добавление Mtsl или делМ1$1 не влияло на уровень фосфорилированности ТЦНМ (рис. 4В). Все реакции проходили в присутствии Са2+ (4мМ), необходимого для активности данных протешшшаз.

Влияние Mtsl на растворимость фрагмента молекулы миозина.

ТЦНМ целиком или только ее хвостовая часть в физиологических солевых условиях (150 мМ NaCl) in vitro собирается в биполярные филаменты, выпадающие в осадок . С-концевой неспирализованный "хвост" молекулы (аминокислоты 1928-1962) инициирует данный процесс самосборки. Участок взаимодействия Mtsl с ТЦНМ был локализован нами между аминокислотами 1914 - 1939, в связи с чем было проверено возможное влияние Mtsl на самосборку фрагментов молекулы ТЦНМ. Были использованы "хвостовые" фрагменты М4-3 (аминокислоты 1762 -

А

В

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6

— )нпуо4-ЗВ

«ы» — ПШ 1

—ДПИБ 1

1"!туо4-ЗВ.

1 2 3 4 5 6 7 8 г*» тгт&ш:шшгвт -250

"64 ~ 36

л . _ __ -__.«■» -30

- , - 16

т!з 1 ^

'ис 4. Влияние белка МЫ ш фосфорилироваиис ' -чопнгв!» о ^ршмент молекулы ТЦИМ

А: Аьюрадио!римма фосфоршшроьания С-кондсыло фрагмент ТЦНМ М4-3. размером 22 кДа. прогепнмиш-юй С и присуюшш МЫ и лел\1Ы Разделение и градиентом ДДЦ-ПЛАГ

В: Авюрадио1рамма фоофорилировании М4-3 казеин киназои II и присутствии тех же белков. Разделение в градиентном ДДЦ-ПАЛГ. С: Тот же гель, окрашенный Кумасси. Справа - маркеры мол. веса в кДа. Д щЦ1 - делМ^ - рекомбинантный белок М1.ч1 с делецией 18 аминокислот с С-конца (натинный М151 состоит из 101 аминокислоты). Дорожки: 1 - Рекомбинантный белок - С-концевой фрагмент ТЦНМ М4-3, размером 22 кДа, фосфоршшрованный в отсутствии М1$1; 2-4 -фосфорилирование в присутствии возрастающей концентрации М151; 5-7 - фосфорилирование в присутствии возрастающей концентрации лелМ151; 8 - фосфорилирование в присутствии избытка делМ1*1.

1962) размером 200 аа и М4 (1384 - 1961) размером 577 аа. Все эти фрагмента полностью растворимы в условиях бООмМ ЫаС1. В отсутствиии или присутствии эквимолярного количества концентращпо КаС1

понижали диализом до определенной величины и замеряли количество оставшегося в растворе миозина. На рисунке 5 показано, что пептид М4-3 в 400 мМ №С1 растворим менее чем на 25%, а в 200 мМ ЫаС1 -только на 3%. При добавлении белка \ftsl, в присутствии кальция, растворимость пептида М4-3 значительно увеличивалась - в 200 мМ КаС1 50% пептида оставалось в растворенном состоянии. Однако М4 фрагмент молекулы ТЦНМ, почти в 3 раза больший по размеру, чем М4-3, в чистом виде был более растворим чем М4-3 и его растворимость изменялясь в гораздо меньшей степени при добавлении МШ (Рис. 5). Добавление белка делМсх1 не влияло на растворимость фрагментов ТЦНМ. % растворимость

150-1

100-

50-

0-+—®—Т"=-1-1-1-1-1-1

О 100 200 300 400 500 600 700тМоГКа<

Рис. 5. Влияние белка Мк1 на растворимость С-концевых фрагментов ТЦНМ. В растворах, содержащих рекомбинантный фрагмент миозина или миозин с М151, диализом понижали концентрацию ЫаС1 от 600 мМ до определенной величины. Раствор центрифугировали и количество оставшегося в растворе фрагмента миозина измеряли спекгрофотометрически и денситометрически по окраске ДДЦ-ПААГ Кумасси.

М4-3 - С-концевой фрагмент ТДНМ (аминокислоты 1762 - 1962) размером 200 аа (22 кДа). М4 - С-концевой фрагмент ТЦНМ (1384 -1962) размером 577 аа (65 кДа).

М4-3+МС51

М4+М181

li

Была исследована зависимость растворимости фрагмента М4-3 при 250 мМ NaCl от когагснтрацпи Mtsl (рис. 6). В присутствии кальция растворимость миозина возрастала пропорционально увеличению концентрации белка Mtsl. При этом в 5 мМ ЗДТА, т. е. в отсутствии взаимодействия между МЫ и 1ЦНМ. при повышении концентрации Mtsl растворимость пептида М4-3 не изменялась.

Не смотря на то, что с увели jchíicm размера фрашенча молекулы ТЦНМ влияние Mtsl на его растворимость in vitro уменьшалось, белок Mtsl вполне может влиять на процесс самосборки ТЦНМ в филаменты и, возможно, играет какую-то регуляторную роль в этом процессе in vivo. Кроме того, ингибирование белком Mtsl фосфорилирования серина-1917 протеин киназой С также связано а процессом самосборки ТЦНМ в филаменты. Но данным литературы, фосфорилирование С-концевою фрагмента ТЦНМ размером 46-47 кДа протеин киназой С существенно влияет на самосборку данных фрагментов в филаменты. Также было продемонстрировано, что обработка клеток лейкимип крысы антшелами. стимул ируюшим и активное гъ ПКС, приводит к фосфоршшровашпо тяжелых и легких цепей немышечною миозина и к перестройке миозиновых филаментов в клеточном кортексе. Используя флуоресцентный аналог миозина и микровидеофпльмирование в одной из работ была показана миграция шаровидных структур, содержащих мнолш, в движущихся клетках . Можно предположить, что белок Mtsl связан с формой или подвижностью клеток через регуляцию состояния миозина.

Белки, взаимодействующие с Mtsl на колонке.

Для обнаружения новых белков - мишеней Mtsl была приготовлена аффинная колонка с белком Mtsl в качестве лиганда. На колонке анализировали лизат клеток линии КСМЛ-100, экспрессирующей Mtsl. В наших условиях в присутствии Са24 с Mts - Sepharose связывалось несколько белков. При электрофорезе в ДДС-ПААГ размер элюированных белков составлял около 32, 37 и 65 кДа (рис. 7). В соответствии с молекулярной массой белки были названы р32, р37 и р65. В 2 мМ ЭДТА, 2

5тМ СаС12 1 2 3 4 5

Итуо4-3 т!з1 сПтег

гтИэ!

5тМ ЕвТА 1 2 3 4 5

кОа -43.0

-29.9 -18.4

Рис. 6. Зависимость растворимости С-концевого фрагмента ТЦНМ М4-3 от концентрации МЫ при 250 мМ N301. 15% ДЛЦ-ПААГ, окрашивание Кумасси. В растворах М4-3, содержащих разные количества МЫ, диализом понижали концентрацию ЧтаС! от 600 м.М до 250 мМ. Растворы центрифугировали, аликвоту из супернатанта наносили на форез. Дорожки: 1 - количество оставшегося в.растворе М4-3. в отсутствии МЫ; 2-4 - то же, при возрастании концентрации МЫ; 5 - максимальное возможное количество М4-3 в растворе (аликвота из раствора без МЫ при 600 мМ №С1).

12 3 4

116 -66 -

45 -25 -

-р37 -р32

Рис. 7. Окрашивание Кумасси 12% ДДЦ-ПААГ с белками, полученными на аффинной колонке с МЫ из лизата клеток КСМЛ-100. Дорожки: 1 -маркер мол. веса (и кДа); 2 - 0,5 мкг БСА (маркер количества); 3 - белки, связывавшиеся с МЫ на колонке е отсутствии Са2"1" (в ЕДТА); 4 - белки, связывавшиеся с МЫ на колонке в присутствии Са2+.

мМ ЭГГА практически никакие белки из клеточшно лизата не связывались с Mtsl - Sepharose.

Влияние белка р37 па аффинность Mísl к кальцию.

Взаимодействие белков на колонке не »bjíhcic» достаточным основанием для вывода о гам, что данные белки могут взаимодействовать in vivo или в измененых условиях, in vitro. С целью исследования взаимодействия выделенных белков с Mtsl нами было изучено влияние данных белков на аффинность белка Mtsl к кальцию. Определение аффинности к кальцию проводилось с помощью определения кривых насыщения белка кальцием на основе конкуренции с флуоресцентным зондом Fluo-З. При взаимодействии с Са2+ у зонда Fluo-З значительно возрастает интенсивность флуоресценции, что позволяет точно определять количество зонда, связанною с кальцием. И i всех выделенных белков только р37 достоверно изменял аффинность Mtsl к кальцию. При лом сам р37 Са21 не связывает. На рисунке 8 показаны кривые насыщения кальцием белка Mtsl и комплекса Misl-p37. Кривая насыщения для комплекса p37-Mtsl сдвинута в область меньшей концентрации катьция и более крутая. Это показывает увеличение аффинности Mtsl в комплексе с р37 к кальцию и возрастанию степени кооперативное™ r связывании кальция двумя Е1;-центрами белка Mtsl. Рассчитанные величины коэффициента Хилла показывают что в связывании кальция одним белком Mtsl полностью отсутствует ¡-»оперативность (коэффициент Хилла яц=0.98). а в комплексе с р37 кооперативное! ь блика к максимальной (лн=1.91).

Для белков, у которых больше одного центра связывания кальция, для количественного выражения аффинности белка к кальцию используется средняя геометрическая равновесная константа диссоциации. Рассчитанная величина данной константы для Mtsl составила 2,6 мкМ. При добавлении белка р37 эта величина изменялась до 0,2 мкМ. Таким образом в комплексе с р37 аффинность белка Mtsl к Са2+ увеличивалась на порядок. Изменение Са-связывающих свойств при взаимодействии с белками мишенями в

настоящее время известно для нескольких белков Х-100 семейства.

Рис. 8. Изотерма насыщения белка Мк! кальцием в отсутствии (/) и в присутствии (2) белка р37 в эквимолярном количестве. По оси абсцисс -логарифм концентрации свободных ионов кальция в пробе; по оси ординат - количество Са2+. связанного с М1.ч1, моль/моль. Построена по конкуренции за связывание Са2+ с флуоресцентным зондом ИШо-З.

Влияние белка р37 на флуоресценцию комплекса ТНС - ¡УШ!.

2-толуидишшшфталино-6-сульфокат (ТНС) - гидрофобный флуоресцентный зонд, практически не флуоресцирующий в растворе в отсутствии белков. В присутствии белка зонд взаимодействует с гидрофобными участками белка и его флуоресценция значительно возрастает. Таким образом ТНС может использоваться для детекции конформационных изменений белка, приводящих к изменению доступности для зонда гидрофобных участков на белке.

В присутствии белка Мг$1 флуоресценция ТНС возрастает в 3,5 раза, а в присутствии МГ51 в комплексе с Са-+ флуоресценция ТНС возрастает в 8 раз по сравнению с чистым ТНС (рис. 9). Это говорит об изменении конформации белка \ltst при присоединении кальция, приводящих к увеличению доступности для ТНС гидрофобных участков белка.

Белки р32, р37, р65 практически не изменяли аутофлуоресцепции ТНС как в присутствии так и в отсутствии Са2".

Для летектш возможных конформационных изменений при взаимодействии Muí с бедками р32, р37 и р65 исследовалось влияние данных белков на ТНС-флуорешенцию Mtsl в присутствии кальция. На рисунке 10 показано, что возрастание коиенграшш белка р37 приводит к уменьшению ТНС-флуоресценнии комплекса белка Mtsl с кальцием почти до уровня Mtsl без кальция. При этом выраженное уменьшение флуоресценции наблюдалось при возрастании концентрации р37 до момента когда молярная концентрация р37 становилась равной молярной концентрации Mtsl. Это показывает, что с каждой молекулой Mtsl взаимодействует одна молекула р37. Наблюдаемое при добавлении р37 уменьшение флуоресценции ТНС от уровня комплекса Mtsl с калыпгем до уровня Mtsl без кальция позволяет предположить что белок р37 вытесняет молекулы ТНС с тех гидрофобных участков белка Mtsl, которые доступны для ТНС только когда Mtsl и комплексе с Са-+. Похожее иншбирование взаимодействия гидрофобного зонда с некоторыми S-100 белками под действием белков-мишеней в присутствии кальция описано в литературе.

Влияние остальных белков, выделенных на аффинной колонке, на I НС-флуореепегшию белка Mtsl, значительно слабее.

Таким образом из полученных данных следует, что белок Mtsl может влиять на подвижность клеток через влияние на состояние миозина и, соответственно на его функционирование как молекулярного мотора. Какой из механизмов вносит больший вклад во влияние Mtsl на сотояние миозина - прямое влияние на самосборку миозиповых филаметгтов или ингибирование фосфорилирования ТЦНМ — в настоящее время не ясно. При этом взаимодействие с белком р37 может играть важную роль, повышая на порядок аффиность Mtsl к кальцию. Наиболее часто принимается, что средняя концентрация Са2+ в клетке около 1 мкМ. Среднегеометрическая константа диссоциации белка Mtsl с кальцием 2,6 мкМ, а в комплексе с р37 - 0,2 мкМ. Таким образом, при наличии белка р37 доля Mtsl, связанного с Са2+ in vivo, возрастает многократно. Вопрос о

200 180 160

140

01 О

£ 12|) о

«о

О 100 6

3 СЛ

■г.

М18-1 \ 1

/ / * / / \ / / ^ \ Ч \ --..л. О^ - • 4

.....:

420 440 460 160

УЛлгйепдМ (пгп)

Рис. 9. Флуоресценция 2-толувдиннафталино-6-сулъфоната (ТНС) в чистом виде (кривая 3), в присутствии МЫ (2) и в присутствии комплекса МЫ с кальцием (1). Ось ординат - спектр излучения флуоресценции, ось абсцисс - интенсивность флуоресценции ТНС в условных единицах.

100

о о с

(I)

о

V>

О

о

3

РфШеаопсепЬэЙэп {¿Г.1)

Рис. 10. Ингибирование ТНС-флуоресценции комплекса М 1x1-кальций белками, выделенными на аффинной колонке с МЫ. 100% -интенсивность ТНС-флуоресценции комплекса МЫ-Са2+, 0% интенсивность ТНС-флуоресценшш одного МЫ, без кальция. Концентрация МЫ 5 мкМ. В раствор МЫ-Са2+-ТНС добавляли белки в возрастающей концентрации. Интенсивность ТНС-флуоресценции измеряли при 440 нм.

зги

том, увеличишь! ли р57 аффили.пль МЫ к миозину щи миояш и »37 связываются с одним участком на M'si и. пким образом, конкурируют, на данный момент но зыленен.

ВЫВОДЫ

1. Впервые определен участок вчаимодейсиыя МЫ с :до>£Лои iu ua-а не.\шшг,шого миозин?. com не ильук^шиГ. ¡915 IÇJ7 оминокпслотчмм остаткам тяжелой цепи человеческого немышечною миозина Ил.

2. Показано увеличение растворимости С-кониевых фрагменюв тяжелой цепи немышечного миозина. а также ингибирование фосфорилирования данных фрагментов протеинкиназой С по остатку серии a (Ser-1917) при взаимодействии с белком MtsL

3 Показано узе.г.пеиие <р-тсва Г>г.:ка Mi?1 к нолям кальция и позьпкнопение коопер..' ; naatva : a ,. с ■>. я..'Va ни а ь па и;л , а-д \:а !: Г . г |-аа белка \1Ы в i i р 11 с у т с I î ; £ ; ; !î.>..î чпа^'Пр. ~

4. Установлено, mi.i Гкмик ¡>37 н sali моле! ¡аа i ьу.л i пи;юфоС>пы\т участками белка М;Ч. j.vaaH'Ä Е: ЗЛК^ I.j.aclti.. : fci;?l только а комплекс: белка Mtsl с кклышгм.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Lomonosov M.Yu., Krjaevska M.V., Gcorgicv G.P., Lukanidin E.M. Possible function of metastasis-associated calcium-binding Mtsl protein. Pharmacology and Toxicology, 1995, v.77, suppl. II, p.38.

2. Духанина E.A., Духанин A.C., Лолюносов М.Ю., Луканидин Е.М., Георгиев Г.П. Кальцийсвязывющие свойства и конформационные изменения метастазина - представителя семейства S-100 белков. Биохимия, 1997, т. 62, вып. 5, стр:621-б28.

3. Dukhanina ЕА, Dukhanin AS, Lomonosov MY, Lukanidin EM, Georgiev GP Spectral studies on the calcium-binding properties of Mtsl protein and its interaction with target protein. FEBS Lett 1997 Jun 30;410(2-3):403-406