Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Компьютерная оценка механизмов побочного действия лекарственных веществ на сердечно-сосудистую систему

ВАК РФ 03.01.09, Математическая биология, биоинформатика

Автореферат диссертации по теме "Компьютерная оценка механизмов побочного действия лекарственных веществ на сердечно-сосудистую систему"

На правах рукописи

1Ш-

Иванов Сергей Михайлович

Компьютерная оценка механизмов побочного действия лекарственных веществ на сердечно-сосудистую систему

03.01.09-Математическая биология, биоинформатика

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

13 НОЯ 2014 005554820

Москва - 2014

005554820

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича» (ИБМХ)

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Лагунин Алексей Александрович

Официальные оппоненты: Карягина-Жулина Анна Станиславовна,

доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации, главный научный сотрудник

Демин Олег Владимирович, кандидат физико-математических наук, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, отдел биоэнергетики, старший научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение

науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Защита состоится «_11_» декабря 2014 г. в _11_часов на заседании диссертационного совета

Д 001.010.01 при Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича» по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, д. 10, стр. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ИБМХ. Автореферат разослан ЬО £Ии.9а/(Л* 2014 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Карпова Е.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Побочное и токсическое действие лекарственных соединений является одной из важных причин смертности в развитых странах (Murphy S.L. et al., 2013) и одной из основных причин прекращения исследований лекарств-кандидатов на стадиях клинических испытаний (Ragan I., 2009). За последние 10 лет количество сообщений о побочных эффектах лекарственных средств и связанных с ними летальных исходах выросло более чем в 2 раза, при этом наиболее часто встречающимися побочными эффектами являются эффекты, связанные с воздействием на сердечно-сосудистую систему (Laverty Н. et al., 2011). Во многом сложившаяся ситуация связана с увеличением потребления лекарственных средств, неправильным их применением, а также с недостатками методов оценки побочного действия, которые используются при разработке новых лекарств. Доклинические исследования безопасности лекарственных соединений на экспериментальных животных не позволяют выявлять все серьёзные побочные эффекты из-за видовой специфичности действия веществ, ограничений по количеству лабораторных животных и времени исследований. Поэтому во многих случаях серьёзные побочные эффекты выявляются лишь на стадии клинических испытаний, что создает угрозу жизни и здоровью участвующих в них пациентов. Во многих случаях клинические испытания также не позволяют выявлять все побочные эффекты вследствие ограниченного количества участвующих в них пациентов и продолжительности приёма лекарственного средства. Серьёзные побочные эффекты, способные приводить к инвалидизащш и летальному исходу часто выявляются уже после получения разрешения и начала широкомасштабного применения препаратов в медицинской практике, что требует наложения запрета на их продажу регуляторными органами. За последние 10 лет только с рынка стран Европейского союза было отозвано 19 наиболее токсичных препаратов (McNaughton R. et al., 2014). Основной причиной отзывов являлось их побочное действие на сердечно-сосудистую систему.

В последнее десятилетие появились методы ранней доклинической оценки побочных

эффектов лекарств, основанные на понимании механизмов побочного действия. Основной

причиной побочного действия является неселективное связывание лекарственных соединений с

белками человека, большая часть из которых не связана с их терапевтическими эффектами.

Информация о взаимосвязях между действием лекарственных соединений на конкретные

белки-мишенн и индукцией серьезных побочных эффектов используется многими

фармацевтическими компаниями в скрининговых панелях in vitro (Bowes J. et al., 2012,

Whitebread S. et al., 2005). Эти панели включают белки, для которых известны связи с

серьёзными побочными эффектами, и используются для отбора наиболее селективных, а,

следовательно, и наиболее безопасных соединений-лидеров для дальнейшей разработки. С этой

3

целью также могут использоваться методы оценки взаимодействий лекарственных соединений с белками-мишенями in silico (Yang L. et al., 2009, Zakharov A.V. et al., 2012), что позволяет значительно сократить количество экспериментов in vitro. Основным фактором, снижающим эффективность этих методов, является недостаток знаний о роли белков-мишеней человека в этиопатогенезе побочных эффектов лекарств. Опубликованные ранее работы по оценке механизмов побочного действия основаны на сравнении предсказанных in silico профилей взаимодействия лекарственных соединений, проявляющих и не проявляющих исследуемый побочный эффект, с белками-мишенями (Bender А. et al., 2007, Matthews E.J. et al., 2009, Matthews E.J. и Frid A.A., 2010, Pan J.B. et al., 2014, Scheiber J. et al., 2009, Wallach I. et al., 2010, Yang L. et al., 2009, Yang L. et al., 2011). Однако в этих работах исследовалось либо небольшое количество соединений, либо сравнительно небольшое количество белков, а также не проводился анализ общих свойств идентифицированных белков-мишеней, включая их роль в патофизиологических процессах, лежащих в основе побочного действия лекарств. Эти недостатки существенно ограничивают объём и качество полученных результатов. Исходя из того, что побочное действие на сердечно-сосудистую систему является одним из наиболее опасных и часто встречающихся эффектов лекарств, а к настоящему времени недостаточно изучены связанные с ним белки и процессы, была сформулирована цель данной работы.

Цель работы: разработка и апробация системно-биологического подхода к компьютерной оценке механизмов побочного действия лекарственных веществ на сердечно-сосудистую систему на основе анализа профилей их взаимодействия с белками человека.

Задачи исследования:

1. Разработать системно-биологический подход к компьютерной оценке механизмов побочного действия лекарственных веществ.

2. Выявить ассоциации между белками-мишенями человека и побочным действием на сердечно-сосудистую систему при помощи анализа предсказанных профилей взаимодействия лекарств с белками человека.

3. Установить ключевые патофизиологические процессы, лежащие в основе побочного действия лекарственных веществ на сердечно-сосудистую систему.

4. Провести верификацию идентифицированных и поиск дополнительных ассоциаций между белками человека и побочным действием лекарственных веществ на сердечнососудистую систему при помощи моделирования поведения регуляторной сети кардиомиоцита, построенной с учётом выявленных процессов.

5. Классифицировать выявленные белки-мишени по вероятности их участия в этиопатогенезе побочного действия лекарственных веществ на сердечно-сосудистую систему.

Личный вклад автора. Все научные результаты, изложенные в диссертации, анализ, обобщение литературных данных и оценка полученных результатов выполнены лично автором под руководством д.б.н. Лагунина А.А.

Научная новизна. Разработан новый системно-биологический подход к оценке механизмов побочного действия лекарств. Разработанный подход интегрирует методы оценки белков-мишеней лекарственных соединений, основанные на использовании анализа взаимосвязей «структура-активность», с методами анализа сигнальных регуляторных путей, что не использовалось в подходах, опубликованных ранее. Многие из методов были применены к решению поставленной научной задачи впервые. Выявлены новые ассоциации между белками-мишенями лекарственных соединений и побочным действием на сердечно-сосудистую систему. Анализ участия выявленных белков в сигнальных регуляторных путях и процессах позволил определить основные патофизиологические процессы, лежащие в основе побочного действия лекарственных веществ на сердечно-сосудистую систему. Многие из выявленных связей между побочным действием и патофизиологическими процессами также являются новыми, ранее не установленными.

Научно-практическая значимость. Многие из выявленных ассоциаций между белками-мишенями и побочным действием на сердечно-сосудистую систему являются принципиально новыми и могут служить основой для соответствующих экспериментальных исследований. Результаты работы могут использоваться для ранней доклинической оценки побочных эффектов лекарств-кандидатов методами in vitro или in silico. Разработанный системно-биологический подход может быть использован для оценки механизмов побочного действия лекарств на другие системы организма.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на российских и международных конференциях и симпозиумах: 20tli European Symposium on Quantitative Structure-Activity Relationship, St-Petersburg (Russia), 2014; XIX и XXI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва (Россия), в 2012 и 2014; 7th International Symposium "Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources (CMTPI-20I3)", Seoul (Korea), 2013; 9th International Symposium on Integrative Bioinformatics, Germany, 2013; VI Московский Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва (Россия), 2011; 5th International Symposium "Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources (CMTPI-2009)", Istanbul (Turkey), 2009.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ в российских и международных научных изданиях, в том числе 5 статей в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень, рекомендованный ВАК, и 8 публикаций в трудах конференций.

5

Объём и структура диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, описания результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающего 289 источников, и приложения. Работа изложена на 199 страницах, содержит 29 рисунков и 24 таблицы. Приложение содержит 7 таблиц.

Информация о способности лекарственных соединений вызывать инфаркт миокарда, сердечную недостаточность и желудочковые аритмии была получена из следующих источников: SIDER (http://sideeffects.embl.de/), RxList (http://www.rxlist.com), CredibleMeds (https://www.crediblemeds.org/), Энциклопедии побочных эффектов лекарственных средств (Aronson J. К. Meyler's Side Effects of Drugs. The International Encyclopedia of Adverse Reactions and Interactions. Amsterdam : Elsevier, 2006) и публикаций в PubMed. В выборки не включались соединения, которые используются только местно, а также соединения, для которых нельзя было выполнить прогноз взаимодействия с белками человека при помощи метода, используемого в данной работе.

В результате были созданы выборки структур лекарственных соединений, включающих как положительные, так и отрицательные примеры по каждому побочному эффекту (Рисунок 1). Всего выборки содержали 848 соединений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

■ Вызывают эффект ■ Не вызывают эффекта

Желудочковые аритмии 124

Сердечная недостаточность

236

592

Инфаркт миокарда

574

О 100 200 300 400 500 600 700 800 900 Количество соединений в выборках

Рисунок 1 - Количество соединений в выборках, вызывающих и не вызывающих побочный эффект.

Оценка профилей воздействия соединений выборок на белки-мишени человека была выполнена при помощи специальной версии программы PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances) (Филимонов Д.А. с соавт., 2014), обученной на основе экспериментальных данных по

взаимодействиям «лигаид-белок» из баз даш1ых ChEMBLdb_16 (https://ww\v.ebi.ac.uk/chembl) и DrugBank 3.0 (http://\vww.drugbank.ca/) (Погодин П.В. с соавт.. 2013. Ivanov S M. et al., 2014).

Эта версия позволяет осуществлять прогноз взаимодействий с 1738 белками-мишенями человека со средней точностью (площадь под ROC кривой) более 97%. вычислегаюй на основе скользящего контроля с исключением по одному. Минимальная точность прогноза среди 1738 белков-мишеней составляет 85%. Результатами прогноза по каждой мишени являются величины: Ра — вероятность того, что соединение действует на данных белок, и Pi — вероятность того, что соединение не действует на данный белок.

Поиск корреляций между прогнозируемым действием на белок-мишень и индукцией побочного эффекта был выполнен при помощи статистики Манна-Уитни, вычисленной на основе величин Pa-Pi для соединений, вызывающих и не вызывающих побочный эффект. Белки-мишени со значением статистики при нулевой гипотезе больше 1,96 стапдартньк отклонений от среднего значения были отобраны для дальнейшего анализа.

Поскольку не все выявленные корреляции могут иметь причинно-следственный характер с индукцией исследуемых побочных эффектов, была выполнена оценка функционального сходства между генами, кодирующими выявленные белки-мишени, и генами, для которых известны ассоциащш с соответствующими заболеваниями. Информация о связях между генами и заболеваниями была получена из базы данных PROTEOME™ BIOBASE GmbH (http://mvAv.biobase-international.com/product/proteome): инфаркт миокарда - 130 генов, сердечная недостаточность — 224 гена, желудочковые аритмии — 40 генов. Оценка функционального сходства для каждого из выявленных генов с генами, для которых известны ассоциации с заболеваниями, вычислялась при помощи алгоритма случайного блуждания с возвратом (Le D.H. и Kvvon Y.K.. 2012) в сети функциональной взаимосвязи генов (Linghu В., et al., 2009), реализованного Ли и Квон в плагине GPEC Cytoscape. Оценка алгоритма случайного блуждания для исследуемого гена отражает количество и длину всех возможных путей в сети, соединяющих этот ген с генами, для которых известны ассоциации с заболеванием. Чем выше оценка алгоритма, тем более вероятно, что исследуемый ген (соответствующий белок-мишень) участвует в этиопатогенезе побочного эффекта/заболевания. Используемая в данной работе сеть функциональной взаимосвязи генов основана на интегращш 16 различных типов взаимосвязей между генами: белок-белковые взаимодействия их продуктов, взаимодействия белковых доменов, ко-экспрессия, ко-цитирование в литературе и др.. и включает 14230 вершин и 263884 ребер.

Оценка патофизиологических процессов, лежащих в основе этиопатогенеза исследуемых побочных эффектов, была выполнена на основе анализа обогащения сигнальных и метаболшюских путей и процессов (pathway enrichment analysis) выявленными генами и генами, для которых известны ассоциации с соответствующими заболеваниями. Анализ был выполнен при помощи

7

плагина ClueGO Cytoscape (Bindea G. et al., 2008) с участием сигнальных и метаболических путей из KEGG (http://\v\wv.genome.jp/kegg) и REACTOME (http://www.reactome.org), а также процессов Gene Ontology (http://www.geneontology.org). Сопоставление выявленных путей и процессов с литературными данными об этиопатогенезе заболеваний позволило установить патофизиологические процессы, лежащие в основе побочного действия лекарств на сердечнососудистую систему.

Выявленные процессы составили основу для построения регуляторной сети кардиомиоцита (РСК). Эта сеть была построена на основе интеграции сигнальных путей из KEGG, MetaCore™ (http://Isresearch.thomsonreuters.com/maps/) (общедоступные пути) и данных о биохимических реакциях и межмолекулярных взаимодействиях из PROTEOME™. РСК включает сигнальные пути специфичные для сердца, пути, которые были выявлены в ходе анализа обогащения, а также пути, необходимые для нормального функционирования большинства типов клеток. РСК состоит из 1026 вершин, представляющих собой белки, гены и низкомолекулярные соединения, и 2952 рёбер двух основных типов: активация и ингибирование.

Идентификация ассоциаций между белками РСК и сердечной недостаточностью/желудочковыми аритмиями осуществлялась при помощи алгоритма дискретного дихотомического моделирования (Koborova O.N. et al., 2009). В дихотомической модели вершины сети могут находиться в двух состояниях: 1 (активна) и 0 (неактивна). На каждом шаге моделирования состояние вершины вычисляется как функция состояний вышележащих вершин на предыдущем шаге: если количество активирующих воздействий больше количества ингибирующих, то вершине присваивается состояние 1, в противном случае - 0. В качестве начального состояния модели значения 1 были присвоены 60 вершинам РСК, которые соответствуют генам домашнего хозяйства. Информация о генах домашнего хозяйства была получена из базы данных ExPlain™ BIOBASE GmbH (http://www.biobase-international.com/product/explain). Алгоритм дихотомического моделирования позволяет осуществлять поиск вершин, ингибирование которых способно приводить к наступлению ключевого события в сети — активации или инактивации отдельных вершин или фрагментов сети. Идентификация ассоциаций между белками РСК и сердечной недостаточностью/желудочковыми аритмиями была выполнена на основе поиска вершин, ингибирование которых приводит к инактивации/активации других вершин, для которых известна связь с соответствующим заболеванием. Данные об известных связях между белками сети и заболеваниями были получены из литературы.

Информация об участии идентифицированных белков-мишеней в выявленных патофизиологических процессах и их роли в РСК была использована для создания классификации

белков-мишеней по степени достоверности их участия в этиопатогенезе инфаркта миокарда, сердечной недостаточности и желудочковых аритмий.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе выполнения диссертационной работы был разработан системно-биологический подход к оценке механизмов побочного действия лекарств (Рисунок 2).

Лекарственные соединения, выбывающие побочный эффект !

--'уО^

Лекарственные соединения,не I вызывающие побочный аффект

Предсказание профилей воздействия на белки-мишеничеловека

Статистжески значимые отличия

Случайное блуждание в сети Функциональной взаимосвязи генов

Анализ обогащения биолоттеских путей и процессов, анализ литературы

Белки-мишени и биологтеские процессы, связанные с этиологией побочных эффектов [

Сигнальные и метабол»«еские пути из

КЕв С и Ме1аС оге™ +

Биохимтеские реакции и межмолекулярныевзаимодействия из РЯОТЕОМЕ™

! Регуляторная сетькардиомиоцита

1—--------------------------------*

• *

• • • • • - •• • • • < •

. ... _ _

-». 'СУ ■*•

Моделирование поведения сети +

Ингибирование вершин

Белки-мишени, сея занные с этиологией побочных эффектов

Классификация белков-мишенейвсоответствиис их участием в выявленных процессах

Три категориидостоверностиотносительноучастия выявленных белковв этиологии исследуемых побочных эффектов

Рисунок 2 - Разработанный подход к оценке механизмов побочного действия лекарств Системно-биологический подход включает следующие этапы:

1. Создание выборок структур лекарственных соединений с информацией об их способности вызывать инфаркт миокарда, сердечную недостаточность и желудочковые аритмии.

2. Компьютерная оценка профилей воздействия соединений выборок на белки-мишени человека.

3. Выявление наиболее значимых отличий по прогнозируемым взаимодействиям с белками-мишенями между соединениями, вызывающими и не вызывающими исследуемый побочный эффект.

4. Оценка функционального сходства генов, кодирующих выявленные белки-мишени, с генами, для которых известны ассоциации с соответствующими заболеваниями.

5. Идентификация патофизиологических процессов, лежащих в основе этиопатогенеза исследуемых побочных эффектов.

6. Создание регуляторной сети кардиомиоцита (РСК), описывающей выявленные процессы.

7. Идентификация ассоциаций между белками РСК и индукцией сердечной недостаточности и желудочковых аритмий при помощи дискретного моделирования поведения РСК при условии ингибирования её вершин.

8. Классификация выявленных белков-мишеней на три категории достоверности относительно их участия в этиопатогенезе исследуемых побочных эффектов.

Для 848 соединений выборок, содержащих информацию об их способности вызывать инфаркт миокарда, сердечную недостаточность и желудочковые аритмии, был выполнен прогноз взаимодействий с 1738 белками-мишенями человека. Статистический анализ позволил выявить наиболее значимые отличия по прогнозируемым белкам-мишеням между соединениями, вызывающими и не вызывающими исследуемый побочный эффект: инфаркт миокарда - 155 мишеней (159 кодирующих генов), сердечная недостаточность - 362 мишени (363 гена), желудочковые аритмии - 203 мишени (209 генов). Среди классов выявленных мишеней наиболее представленными являются GPCR рецепторы и киназы (Рисунок 3).

Поскольку не все из выявленных ассоциаций могут иметь причинно-следственный характер с индукцией исследуемых побочных эффектов, был выполнен дальнейший анализ. Сопоставление генов, кодирующих выявленные белки, с генами, для которых известны ассоциации с соответствующими заболеваниями, выявило лишь небольшое количество общих генов: инфаркт миокарда — 6 генов из 159 генов, выявленных в ходе работы, сердечная недостаточность - 24 гена из 363, желудочковые аритмии - 2 гена из 209.

Для генов, кодирующих выявленные мишени, были вычислены оценки алгоритма случайного блуждания в сети функциональной взаимосвязи генов, отражающие их функциональное сходство с

10

генами, для которых известны ассоциации с соответствующими заболеваниями Гены, кодирующие выявленные белки-мишени, в целом получают более высокие оценки сходства, чем остальные гены сети (Рисунок 4).

■ Инфаркт миокарда В Сердечная недостаточность Желудочковые аритмии

Рисунок 3 - Классы белков-мишеней, предположительно ассоциированных с индукцией инфаркта миокарда,

04

0

1 0,2 &

в 0,15 ё

о од £ 0,05

сердечной недостаточности и желудочковых аритмий.

— 159 генов —13938 генов

а 10 12 14 1С 18 20 22 24 2С 28

-1о(2(Оценка сходства)

Рисунок 4 - Сравнение оценок функционального сходства 159 генов, кодирующих белки-мишени, предположительно ассоциированные с индукцией инфаркта миокарда, и остальных 13938 генов сети в отрицательной логарифмической шкале. Наиболее низкие оценки в логарифмической шкале соответствуют наиболее высоким оценкам функционального сходства. 159 генов получают более высокие оценки, чем остальные гены сети. Аналогичная картина наблюдается для сердечной недостаточности и желудочковых аритмий.

Это означает, что большинство из выявленных белков-мишеней участвуют в этиопатогенезе исследуемых побочных эффектов.

С целью выявления ключевых патофизиологических процессов, лежащих в основе этиопатогенеза инфаркта миокарда, сердечной недостаточности и желудочковых аритмий, индуцируемых лекарствами, был выполнен анализ обогащения сигнальных и метаболических путей из KEGG и REACTOME и процессов Gene Ontology. Анализ обогащения выполнялся отдельно для генов, кодирующих выявленные белки, и генов, для которых известны ассоциации с заболеваниями. Сопоставление обогащенных путей и процессов проводилось при помощи построения сетей их сходства, в которых вершины представляют собой пути или процессы, а рёбра отражают процент общих генов между ними (Рисунок 5).

I/

neutrophil :henWaxi

endothelial

cell- epithelial migration

migration

regulation

Wvte P°*UiVe iKocyte r_Qutallon

positive regulation

angiogenesis

collagen regulation blosynthetic

negative regulation

Chemotaxis

regulation

M

. J leukocyte

regulation chemotaxls

macrophage

chemotaxls leukocyte regulation migration ^

cytokine-mediated negative lymphocyte signaling regulation migration

pathway of O

srr^th muscle cell-matrix adhesion

positive regulation

endothelial

cell apoptotic process

\

protein secretion

epidermal growth

factor-activated regulation

process collagen blosynthetic regulation process

cellular positive resoopse regulation №

off lnterleukin-6 cell

activation positive regulation

Çf) lymphocyte activation

0"

lipid ssynthei process

calcium blosynthetic ¿TJ^ МАРК cascad

positive

regulation •

blood O coagulation negative

regulation regulation

m m

blood fibrinolysis coagulation

ImmmU

metabolic scld

process metabolic prostaglandin f process

metabolic

process unsaturated'

lipase activity

potassium homeostasis

vasocojistriction

regulation ®

vasoconstriction

pOS,,ive MARK

cascade regulation MARK or V cascade ERK1 \p

ERK2

cGMP positive cascad€

blosynthetic regulation process

phosphatktylinosilol biosynthetic process

growth factor receptor signaling pathway

biosynthetic process

low-density lipoprotein

extrinsic apoptotic signaling pathway

regulation

'^f" Ж of

phosphatidylinositol ox,tfat,on blosynthetic macrophage 3-kinase Q Process

cholesterol

cascade

efflux

derived foam cell

differentiation

Ó

phasic smooth muscle contraction

Cfe;

. \ .. С

regulation

Ш apoptotic signaling pathway

chole»terol transport

• О

very-low-density

lipoprotein triglyceride

particle cat^lic

remodeling P«**»*

Рисунок 5 - Сеть сходства биологических процессов Gene Ontology, обогащенных генами, которые кодируют выявленные в ходе анализа белки-мишени, и генами, для которых известны ассоциации с инфарктом миокарда. Зелёные вершины представляют собой процессы, специфически обогащенные выявленными генами. Красные вершины представляют собой процессы, специфически обогащенные генами, для которых известны ассоциации с заболеванием. Белые вершины - процессы, неспецифически обогащенные генами из обоих списков. Интенсивность цвета отражает специфичность обогащения.

В целом белки-мишени, выявленные для каждого из исследуемых побочных эффектов, участвуют в тех же путях и процессах, что и белки, для которых известны ассоциации с соответствующими заболеваниями. Анализ построенных сетей в сочетании с анализом литературы позволил установить ключевые процессы на уровне клетки, ткани, органа или организма, нарушение которых под действием лекарств потенциально может приводить к индукции инфаркта миокарда, сердечной недостаточности и желудочковых аритмий (Таблица 1).

Таблица 1 — Биологические процессы, нарушение которых под действием лекарств может приводить к индукции инфаркта миокарда, сердечной недостаточности и желудочковых аритмий. В ячейках таблицы указано количество выявленных мишеней, предположительно ассоциированных с побочным эффектом, которые участвуют в данном процессе.

Процесс Инфаркт Сердечная Желудочковые

миокарда недостаточность аритмии

Ангиогенез 32 26 -

Апоптоз кардиомиоцитов " 60 17

Апоптоз эндотелиальных клеток 2 шшш^шш ^ШШШШШ

Воспаление 47 - -

Гипертрофия миокарда - 45 11

Зашита от активных форм кислорода - 14 5

Метаболизм и транспорт стероидных гормонов 14 16 -

Метаболизм и транспорт холестерина и липопротеинов 9 - -

Окисление жирных кислот ПИЯ 6 -'ШШ

Парасимпатическая активность - 9 9

Пролиферация гладкомыщечных клеток 22 НИШ! ^■■¡ршжшвян

Регуляция артериального давления 39 41 -

Регуляция ионных токов 36

Регуляция коронарного кровотока 13 -

Регуляция межклеточных контактов - - 14

Регуляция функции митохондрий - 18 12

Регуляция синтеза оксида азота - 8

Регуляция сокращений сердца 20 28 -

Регуляция транспорта глюкозы "

Регуляция функций почек - 15 -

Регуляция целостности эндотелия артерий 9 -

Регуляция цитоскелета - 4 -

Секреция инсулина/резистентность 30 52 30

Симпатическая активность - 12 28

Фиброз миокарда ¡99Н 29 -

Экскреция и метаболизм желчных кислот 4 - -

Электролитные нарушения - - 1

Выявленные в ходе работы белки-мишени были вручную проаннотированы по этим

процессам на основе информации, полученной из литературы. Также был выполнен

13

дополнительный поиск в литературе относительно связи белков-мишеней с соответствующими заболеваниями.

На основе этой информации выявленные белки-мишени были классифицированы на три категории достоверности относительно их участия в этиопатогенезе исследуемых побочных эффектов (Рисунок 6).

Сердечная недостаточность

Желудочковые аритмии

Инфаркт миокарда

1-я категория

2-я категория

3-я категория

60 80 100 120 140 160 180 200 Количествомишеней

Рисунок 6 - Распределение белков-мишеней, предположительно ассоциированных с индукцией инфаркта миокарда, сердечной недостаточности и желудочковых аритмий, по категориям достоверности.

Первая категория включает белки-мишени, для которых в литературе удалось найти непосредственные данные об участии в этиопатогенезе соответствующих заболеваний.

Вторая категория включает белки-мишени, для которых в литературе не было непосредственных данных об их участии в этиопатогенезе заболеваний, но были данные об участии в выявленных процессах.

Третья категория включает белки-мишени, для которых в литературе не нашлось никаких данных. Для белков-мишеней из этой категории, имеющих высокие оценки функционального сходства, полученные при помощи алгоритма случайного блуждания, связь с соответствующим побочным эффектом наиболее вероятна.

Поскольку киназы являются основным типом выявленных мишеней для сердечной недостаточности и желудочковых аритмий (Рисунок 3), то дополнительным способом оценки их участия в этиопатогенезе этих эффектов является анализ сигнальных регуляторных сетей. В ходе выполнения работы была построена регуляторная сеть кардиомиоцита (РСК), описывающая процессы, для которых были выявлены ассоциации с этиопатогенезом сердечной недостаточности и желудочковых аритмий, индуцируемых лекарствами (Таблица 1).

Информация об известных связях между белками сети и соответствующими патологиями была получена из литературы: 57 белков для сердечной недостаточности и 26 белков для

желудочковых аритмий. Дихотомическое моделирование поведения РСК позволило идентифицировать белки, ингибирование которых по одному или в комбинациях по два может приводить к изменению активности 57 и 26 белков с известными связями. В результате было выявлено 96 таких белков для сердечной недостаточности и 97 белков для желудочковых аритмий. Выявленные в ходе моделирования белки, вместе с белками, для которых известны ассоциации с соответствующими патологиями (всего 128 белков для сердечной недостаточности и 119 белков для желудочковых аритмий), и кодирующими их генами соответствуют 167 и 152 вершинам сети. Сто шестьдесят шесть вершин из 167 для сердечной недостаточности и 151 вершина из 152 для желудочковых аритмий формируют единые связные фрагменты сети (Рисунок 7).

♦

гв >

1. •

J Т

МУС ----#-----в

« .

ousP4 j äm:«^- --- А

4 ©' ;«" ♦ -ф

Рисунок 7 - Фрагмент РСК, включающий белки, предположительно ассоциированные с индукцией сердечной недостаточности. Вершины, обозначенные ромбами, являются генами, а вершины, обозначенные окружностями, являются белками и белковыми комплексами. Голубым цветом обозначены вершины, для которых известны ассоциации с сердечной недостаточностью. Вершины с темно-синей границей обозначают белки, которые были выявлены в ходе статистического анализа прогноза PASS как связанные с индукцией

сердечной недостаточности. 15

Эти фрагменты содержат белки, имеющие большее число взаимодействий, чем в среднем по сети, и представляют собой функционально значимые модули, регулирующие процессы, нарушение которых потенциально может приводить к индукции сердечной недостаточности и желудочковых аритмий. Среди белков идентифицированных фрагментов содержатся белки-мишени, выявленные при помощи статистического анализа прогноза PASS. Наиболее вероятной является связь с исследуемыми побочными эффектами для тех белков-мишеней, которые были выявлены обоими методами: при помощи анализа прогноза PASS и дихотомического моделирования поведения РСК. Дихотомическое моделирование позволило также выявить дополнительные белки, воздействие на которые не может быть предсказано с помощью PASS.

Тем не менее, белки-мишени, выявленные при помощи анализа прогноза PASS, имеют преимущество перед белками, выявленными при помощи дихотомического моделирования, поскольку прогнозируемое действие на белок коррелирует с индукцией побочного эффекта у пациентов в клинике. Белки, выявленные при помощи дихотомического моделирования, влияют на активность белков, для которых известны связи с заболеваниями, но эти связи были в основном получены при помощи экспериментов на животных. Поэтому классификация белков-мишеней, входящих в состав построенных фрагментов регуляторной сети (128 белков для сердечной недостаточности и 119 белков для желудочковых аритмий), на категории достоверности, основывалась на пересечении с данными о белках-мишенях, выявленных при помощи анализа прогноза PASS.

Первая категория включает белки РСК, которые были выявлены в результате статистического анализа прогноза PASS (22 белка, ассоциированные с сердечной недостаточностью, и 7 белков, ассоциированных с желудочковыми аритмиями). Для этих белков было найдено прямое подтверждение в литературе относительно их роли в этиопатогенезе сердечной недостаточности и желудочковых аритмий.

Вторая категория включает белки РСК, которые были выявлены как при помощи дихотомического моделирования, так и в результате статистического анализа прогноза PASS, но для них отсутствовало прямое подтверждение в литературе. Вторая категория также включает в себя белки РСК, для которых связь с индукцией сердечной недостаточности и желудочковых аритмий напрямую подтверждена в экспериментах на животных, но эти белки не были выявлены в результате статистического анализа прогноза PASS (47 белков, ассоциированных с сердечной недостаточностью, и 46 белков, ассоциированных с желудочковыми аритмиями).

Третья категория включает оставшиеся белки, которые были идентифицированы при помощи дихотомического моделирования, но не были выявлены в результате статистического

16

анализа прогноза PASS (59 белков, ассоциированных с сердечной недостаточностью, и 66 белков, ассоциированных с желудочковыми аритмиями). Связь с сердечной недостаточностью и желудочковыми аритмиями наиболее вероятна для тех белков третьей категории, моделирование ингибирования которых приводит к изменению активности наибольшего числа белков РСК, для которых известны связи с соответствующими патологиями.

Всего в ходе исследования при помощи предложенного системно-биологического подхода было выявлено 658 белков-мишеней, ассоциированных с тремя исследуемыми побочными эффектами, из которых 358 мишеней относятся к первой и второй категориям достоверности (Рисунок 8). Связь белков-мишеней первых двух категорий с индукцией инфаркта миокарда, сердечной недостаточности и желудочковых аритмий наиболее вероятна.

Сердечная недостаточность

Желудочковые аритмии

Инфзрктмиокарда

■ 1-я категория

■ 2-я категория 3-я категория

О 50 100 150 200 250

Количество белков-мишеней

Рисунок 8 - Распределение белков-мишеней, предположительно ассоциированных с индукцией сердечной недостаточности, желудочковых аритмий и инфаркта миокарда, по категориям достоверности.

Значительная часть из 358 белков-мишеней ассоциирована с индукцией нескольких побочных эффектов (Рисунок 9). Среди них 23 мишени ассоциированы со всеми тремя побочными эффектами, что демонстрирует их важность с точки зрения побочного действия лекарств на сердечно-сосудистую систему (Таблица 2).

Многие из 23 выявленных ассоциаций являются принципиально новыми. Например, нетривиальной является связь галаниновых ОАЬК1 рецепторов и рецепторов 1-го типа для меланоцит-стимулирующего гормона с индукцией трёх исследуемых побочных эффектов, поскольку их роль в функционировании сердечно-сосудистой системы в настоящее время недостаточно изучена.

Рисунок 9 - Количество белков-мишеней из первых двух категорий достоверности, ассоциированных с одним, двумя и тремя побочными эффектами. Цифры обозначают количества белков-мишеней.

Таблица 2 - Белки-мишени, ассоциированные с индукцией трёх исследуемых побочных эффектов.

Белок-мишень Ген

Alpha-la adrenergic receptor51^ ADRA1A

Alpha-Id adrenergic receptor ADRA1D

Alpha-2a adrenergic receptorCH,HM ADRA2A

Alpha-2b adrenergic receptor ADRA2B

Alpha-2c adrenergic receptorCH'им ADRA2C

Dopamine D3 receptor DRD3

Fibroblast growth factor receptor 2 FGFR2

Galanin receptor 1 GALR1

HERG1"" KCNH2

Homeodomain-interacting protein kinase 1 H1PK1

MAP kinase p38 beta МАРКИ

Melanin-concentrating hormone receptor 1 MCHR1

Mitogen-activated protein kinase 7 MAPK7

Muscarinic acetylcholine receptor M4 CHRM4

P-glycoprotein 1 ABCB1

Potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel 4 HCN4

Serotonin la (5-HTla) receptor HTR1A mm

Serotonin Id (5-HTld) receptor HTR1D

Serotonin 2a (5-HT2a) receptor HTR2A

Serotonin 2b (5-HT2b) receptor™ HTR2B

Serotonin 2c (5-HT2c) receptor HTR2C

Serotonin transporter SLC6A4

Sigma opioid receptor SIGMAR1

ИМ - белок-мишень, для которого связь с инфарктом миокарда, индуцируемым лекарствами, была известна ранее; СН - белок-мишень, для которого связь с сердечной недостаточностью, индуцируемой лекарствами, была известна ранее; ЖА - белок-мишень, для которого связь с желудочковыми аритмиями, индуцируемыми лекарствами, была известна ранее.

Важным также является идентификация ряда киназ, поскольку они обычно хуже функционально охарактеризованы по сравнению с рецепторами (Bowes J. et al.. 2012). Таким образом, выявленные белки-мишени представляют значительный интерес для соответствующих экспериментальных исследований.

Выявленные в ходе работы белки-мишени были сопоставлены с мишенями, для которых ранее были известны ассоциации с исследуемыми побочными эффектами (Bowes J. et al., 2012, Ji Z.L. et al.. 2003, Whitebread S. et al., 2005, Zhang J.X. et al.. 2007). Среди выявленных ассоциаций было обнаружено значительное количество известных ранее, что свидетельствует в пользу применимости разработанного системно-биологического подхода к решению поставленной научной задачи. Кроме того, разработанный подход позволил выявить большее количество известных ассоциаций по сравнению с подходами, опубликованными ранее (Рисунок 10).

■ DuraivFrigola М. and Alov P., 2013

■ Kuhn M.etal.. 2010 Lounkine E. etal.. 2012

■Matthews EJ. and Frid A.A., 2010

■ Выявленные

■ Известные

Инфаркт миокарда Сердечная

недостаточность

Желудочковые аритмии

Рисунок 10 - Сопоставление данных о белках-мишенях, выявленных в ходе работы, с данными о белках-мишенях, для которых ранее были известны ассоциации с инфарктом миокарда, сердечной недостаточностью и желудочковыми аритмиями, и белках-мишенях, выявленных другими авторами.

Информация об идентифицированных белках-мишенях из первых двух категорий достоверности может быть полезной для объяснения механизмов индукции лекарствами инфаркта миокарда, сердечной недостаточности и желудочковых аритмий. Индукцию исследуемых побочных эффектов многими лекарственными соединениями можно объяснить экспериментально определённым или предсказанным воздействием на белки-мишени, для которых соответствующие ассоциации были известны ранее. В то же время индукция этих побочных эффектов значительным количеством соединений может быть объяснена только воздействием на белки-мишени, которые были выявлены в ходе данной работы (Рисунок 11).

Таким образом, выявленные ассоциации между белками-мишенями и побочным действием на сердечно-сосудистую систему потенциально могут использоваться для ранней доклинической оценки побочных эффектов лекарств-кандидатов методами in vitro и in silico.

Инфаркт миокарда

Сердечная недостаточность

Желудочковые аритмии

59

46

18 18 2

■1

31

■ Известныемишени (мел) Известные мишени (предск) Выявленные мишени Еэксп} ^Выявленные мишени (предск) ■Нет мишеней

50 100 150 200 250

Количество лекарственных соединений

300

Рисунок 11 — Доли лекарственных соединений, вызывающих инфаркт миокарда, сердечную недостаточность и желудочковые аритмии, для которых известны или предсказаны воздействия на соответствующие белки-мишени. Известные мишени (эксп) - количество соединений с известными мишенями, для которых ранее были известны ассоциации с исследуемыми побочными эффектами;

Известные мишени (предск) - количество соединений с предсказанными взаимодействиями с мишенями, для которых ранее были известны ассоциации с исследуемыми побочными эффектами; Выявленные мишени

(эксп) - количество соединений с известными мишенями, для которых ассоциации с исследуемыми побочными эффектами были выявлены в ходе данной работы; Выявленные мишени (предск) - количество соединений с предсказанными взаимодействиями с мишенями, для которых ассоциации с исследуемыми побочными эффектами были выявлены в ходе данной работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе выполнения диссертационной работы был разработан системно-биологический подход к оценке механизмов побочного действия лекарственных веществ на сердечнососудистую систему. Этот подход основан на выявлении корреляций между прогнозируемым действием лекарственных соединений на белки-мишени человека и индукцией побочного эффекта. Оценка ассоциаций с белками-мишенями была выполнена для ряда наиболее опасных для жизни пациентов побочных эффектов: инфаркта миокарда, сердечной недостаточности и

желудочковых аритмий. Оценка роли идентифицированных белков-мишеней в сигнальных и метаболических путях, а также биологических процессах позволила выявить патофизиологические процессы, лежащие в основе этиопатогенеза исследуемых эффектов. Эти процессы были использованы как основа для построения регуляторной сети кардиомиоцита. Дискретное моделирование поведения этой сети при условии ннгибировапия её вершин позволило провести дополнительную верификацию выявленных мишеней и идентифицировать дополнительные мишени, которые могут быть ассоциированы с индукцией сердечной недостаточности и желудочковых аритмий.

Разработанный подход позволил выявить 658 белков-мишеней лекарственных соединений, которые могут быть ассоциированы с индукцией инфаркта миокарда (155 мишеней), сердечной недостаточности (455 мишеней) и желудочковых аритмий (312 мишеней). Анализ данных по связи выявленных белков-мишеней с соответствующими заболеваниями, их участии в идентифицированных патофизиологических процессах и роли в регуляторной сети кардиомиоцита позволил выполнить классификацию мишеней на три категории достоверности относительно их участия в этиопатогеиезе исследуемых эффектов. Триста пятьдесят восемь нз 658 белков-мишеней (54%) были отнесены к первым двум категориям достоверности, для которых наличие такой связи наиболее вероятно.

Многие из идентифицированных ассоциаций между белками-мишенями и исследуемыми побочными эффектами являются принципиально новыми и могут служить основой для соответствующих экспериментальных исследований.

На примере различных групп соединений с известными или предсказанными мишенями первых двух категорий достоверности было продемонстрировано, что данные, полученные в ходе работы, могут быть использованы для объяснения механизмов побочного действия лекарств, использующихся в клинике. Таким образом, результаты исследования потенциально могут использоваться для ранней доклинической оценки побочного действия лекарств-кандидатов методами in vitro и in silico.

Сопоставление данных о белках-мишенях, выявленных в ходе работы, с данными о мишенях, для которых ранее были известны ассоциации с побочным действием на сердечнососудистую систему, а также мишенях, выявленных другими исследователями, продемонстрировало применимость разработанного системно-биологического подхода для решения поставленной научной задачи. Разработанный подход может использоваться для оценки механизмов побочного действия лекарств на другие системы организма.

выводы

1. Разработан системно-биологический подход к компьютерной оценке механизмов побочного действия лекарственных веществ на сердечно-сосудистую систему. Показано преимущество разработанного подхода по сравнению с другими подходами, опубликованными в литературе.

2. Созданы выборки структур лекарственных соединений с информацией об их способности вызывать инфаркт миокарда, сердечную недостаточность и желудочковые аритмии. На основе анализа прогнозируемых взаимодействий соединений выборок с белками-мишенями человека выявлены известные и новые ассоциации между мишенями и индукцией исследуемых побочных эффектов.

3. Идентифицированы ключевые патофизиологические процессы, лежащие в основе этиопатогенеза исследуемых побочных эффектов: инфаркт миокарда — 13 процессов, сердечная недостаточность - 16 процессов, желудочковые аритмии - 12 процессов.

4. Моделирование поведения регуляторной сети кардиомиоцита, построенной с учётом выявленных процессов, позволило провести дополнительную верификацию белков-мишеней, выявленных при помощи анализа предсказанных взаимодействий лекарственных соединений с белками человека, а также идентифицировать новые ассоциации между белками и исследуемыми побочными эффектами.

5. Всего выявлено 658 белков-мишеней, ассоциированных с индукцией исследуемых побочных эффектов. Белки-мишени классифицированы на три категории достоверности относительно их участия в этиопатогенезе исследуемых побочных эффектов. Триста пятьдесят восемь белков-мишеней из 658 отнесены к первым двум категориям, для которых участие в этиопатогенезе инфаркта миокарда, сердечной недостаточности и желудочковых аритмий наиболее вероятно.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Ivanov S.M.. Lagunin А.А., Pogodin P.V., Filimonov D.A., Poroikov V.V. Identification of Drug-Induced Myocardial Infarction-Related Protein Targets through the Prediction of Drug-Target Interactions and Analysis of Biological Processes. // Chem. Res. Toxicol. 2014. Vol. 27, №7. P. 1263-1281.

2. Иванов C.M.. Лагунин A.A., Захаров A.B., Филимонов Д.А., Поройков В.В. Компьютерный поиск молекулярных механизмов ульцерогенного действия нестероидных противовоспалительных средств. // Биомедицинская химия. 2014. Том 60, № 1. С. 7-16. Ivanov S. М.. Lagunin А.А., Zakharov A.V., Filimonov D.A., Poroikov V.V. Computer Search for Molecular Mechanisms of Ulcerogenic Action of Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs. // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry.

2013. Vol. 7, № l.P. 40-45.

3. Lagunin A.A., Goel R.K., Gawande D.Y., Pahvva P., Gloriozova T.A., Dmitriev A.V., Ivanov S.M.. Rudik A.V., Konova V.I., Pogodin P.V., Druzhilovsky D.S., Poroikov V.V. Chemo- and bioinformatics resources for in silico drug discovery from medicinal plants beyond their traditional use: a critical review. // Nat. Prod. Rep. 2014. DOI: 10.1039/C4NP00068D

4. Погодин П.В., Лагунин A.A., Иванов C.M.. Конова В.И., Филимонов Д.А., Поройков В.В. Компьютерный прогноз взаимодействия низкомолекулярных органических соединений с белками-мишенями. // Вестник РГМУ. 2013. №4. С. 69-74.

5. Koborova O.N., Filimonov D.A., Zakharov A.V., Lagunin A.A., Ivanov S.M.. Kel A., Poroikov V.V. In silico method for identification of promising anticancer drug targets. // SAR QSAR Environ. Res. 2009. Vol. 20, № 7-8. P. 755-766.

6. Ivanov S.M.. Lagunin A.A., Pogodin P.V., Filimonov D.A., Poroikov V.V. Identification of drug targets related to the induction of ventricular tachyarrhythmia through systems chemical biology approach. // Abstr. 20th European Symposium on Quantitative Structure-Activity Relationship. St-Petersburg (Russia). 2014. P. 126.

7. Lagunin A.A., Ivanov S.M.. Pogodin P.V., Filimonov D.A., Poroikov V.V. Chemical systems biology identification of drug targets related with cardiovascular adverse effects. // Abstr. 20th European Symposium on Quantitative Structure-Activity Relationship. St-Petersburg (Russia).

2014. P. 53.

8. Иванов C.M.. Лагунин A.A., Погодин П.В., Филимонов Д.А., Поройков В.В. Компьютерная оценка нежелательных мишеней лекарственных соединений, связанных с индукцией инфаркта миокарда. // Материалы XXI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Москва. 2014. С. 250.

9. Ivanov S.M.. Lagunin A.A., Pogodin P.V., Filimonov D.A., Poroikov V.V. In silico identification of drug-induced myocardial infarction related antitargets by drug target interactions prediction and analysis of biological networks. // Abstr. 7th International Symposium "Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources (СМТР1-2013)" Seoul (Korea). 2013. P. 90.

10. Lagunin A.. Ivanov S., Pogodin P., Rudik A., Gloriozova Т., Gavvande D., Goel R., Poroikov V. In silico estimation of interactions between the phytoconstituents of medicinal plants and human regulatory pathways. // Abstr. 9th International Symposium on Integrative Bioinformatics. Germany. 2013. P.160.

П.Иванов C.lVf.. Лагунин A.A., Захаров А.В., Филимонов ДА., Поройков В.В. Компьютерный поиск молекулярных мишеней, связанных с развитием пептических язв, индуцируемых нестероидными противовоспалительными средствами. // Материалы XIX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Москва. 2012. С. 508.

12. Иванов С.М. Компьютерный поиск возможных молекулярных мишеней, связанных с побочными эффектами нестероидных противовоспалительных средств. // Материалы VI Московского Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва. 2011. С. 403.

13. Koborova O.N., Filimonov D.A., Zakharov A.V., Lagunin A.A., Ivanov S.M.. Poroikov V.V., Kel A. In silico method for identification of promising anticancer targets. // Abstr. 5th International Symposium "Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources (CMTPI-2009)". Istanbul (Turkey). 2009. P. 60.

Подписано в печать 28.10.2014 г. Формат А4/2 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 Экз. Заказ № 4902-10-14 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39