Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение пригодных для диагностических систем моноклональных антител к тиреотропному гормону человека

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение пригодных для диагностических систем моноклональных антител к тиреотропному гормону человека"

РГЗ №

,11". 1 научно-iiссл едовател ьский

проектно-конструкторский

институт прикладной биохимии

На правах рукописи

Корязова Лилия Камиловна

ПОЛУЧЕНИЕ ПРИГОДНЫХ ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ СИСТЕМ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ТИРЕОТРОПНОМУ ГОРМОНУ ЧЕЛОВЕКА

03.00.23 — биотехнология

автор еферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

Москва 1993

Работа выполнена в лаборатории гибридом НПО «Биотехнология».

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор биологических наук Р. Г- Василов, кандидат химических наук Г. И- Ковалевская

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук С.С. Афанасьев

доктор химических наук А- М. Егоров

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Эндокринологический научный центр РАМН (ЭНЦ РАМН)

Защита состоится. « » , . . 1993 г.

в ./О часов на заседании специализированного совета Д 098 09.01 в Научно-исследовательском проектно-конструк-торском институте прикладной биохимии по адресу: 125299, Москва, ул- Клары Цеткин, д- 4/6

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского проектио-конструкторского института прикладной биохимии-

Автореферат разослан «

» ^¿- X-Ci/y^S , . 1993 г-

- Ученый секретарь специализированного совета, у^}

кандидат биологических наук *' И- И. Гусева

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В настоящее время во всем мире заболевания щитовидной железы являются наиболее распространенной эндокринной патологией после сахарного диабета. В связи с этим методы их диагностики вызывают особый интерес. В случае одной из наиболее тяжелых патологий новорожденных, первичного гипотиреоза, своевременно поставленный диагноз является первоочередным условием эффективности лечения. Во всех развитых странах в качестве первичного или скринирущего теста при оценке тироидного статуса используют измерение уровня тиреотропиого гормона гипофиза (ТТГ). Обнаружение повышенных или пониженных концентраций тиреотропина свидетельствует о вероятности гипо- и гипертиреоза соответственно и является основанием для более углубленного обследования функции щитовидной железы пациента. Из-за отсутствия отечественных диагностикумов, у нас применяют дорогостоящие радиоиммунологические, шмунофермектные и шмунофлюоресцеитные наборы зарубежных фирм Pharmacia, LKB-Wallac, Hoffman la Roche. В результате обследование сосредоточено в единичных центрах, кото-, рые не могут обеспечить существующие потребности, составляющие около 5 млн анализов ежегодно. Исходя из этого, разработка высокочувствительных диагностикумов для определения уровня тиреотропина с целью их внедрения в практику отечественного здравоохранения очень актуальна.

Наиболее эффективной основой создания таких тест-систем являются высокоаффинные моноклональные антитела (МкАТ). Высокая специфичность ЫкАТ делает их идеальным инструментом для дальнейшего изучения иммунохимии тиреотропиого гормона человека в норме и при патологии, использования при приготовлении иммуносорбен-тов. Еще одним перспективным направлением применения антител к тиротропину является получение антиидиотипических антител, с помощью которых проводится изучение строения рецептора ТТГ на клетках щитовидной железы.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью работы является получение . монокдонапышх антител к тиреотропному гормону человека и конструирование на их основе высокочувствительного метода иммунофер-ментного анализа (ИФА) для количественного определения тиреотропина. При выполнении работы были поставлены следующие задачи:

1. Создание гибридом, продуцирующих, высокоаффинные „моноклональные антитела к тиреотропному гормону человека.

2. Характеристика полученных моноклональных антител -(специ-

фичность, константа аффинности, изотил).

3. Выбор пары ЫкАТ различной эпигопной специфичности, перспективной для использования в диагностической иммуноферментной системе.

4. Разработка иммуноферментного метода для количественного определения ТТГ с чувствительностью не более 0,1 мМЕ/л.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Выли разработаны оригинальные способы иммунивавди мышей тиреотрсшшом и тестирования первичных кланов гибридом, продуцирующих мояоклональные антитела к ТТГ.

Впервые в отечественной пракгике получена и охарактеризована панель высокоаффинных ыоноклональных антител к тиреотропному гормону человека, не дающих перекрестной реакции с родственными гликопротеидндаи гормонами гипофиза (лютеинизирующим, ЛГ, и фол-ликулостимулируювдш, ФСГ) .

На основе выбранной пары МкАГ различной специфичности разработаны два иммунсферментнык метода для измерения концентрации ТТГ в диапазоне 0,02-6,00 мМЕ/л и 0,2-40,0 мМЕ/л. Подобраны оптимальные условия иммунохимической реакции и синтеза,проявляющих конъюгатов антител с пероксидазой хрена и биотином. Изучены линейность, воспроизводимость, специфичность определения тиреотро-пина с помощью двух вариантов ИФА.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Метод одностадийного ИФА для определения ТТГ в диапазоне 0,2-40,0 мМЕ/л по своим техническим параметрам пригоден для широкого клинического применения и в настоящее время подготавливается к прохождению межведомственных испытаний в учреждениях Ш России.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ: 1. Разработка схемы иммунизации мышей препаратами ТТГ человека и способов тестирования первичных клонов гибридом. 2. Получение гибридом, стабильно продуцирующих высокоаффинные моноклопальные антитела к ТТГ. 3. Характеристика антител и подбор пары МкАТ, перспективной для использования в иммуноферментной тест-системе для определения ТТГ. 4. Разработка на основе выбранной пары ЫкАТ методов ИФА для количественного определения тиреотропина с чувствительностью не более чем 0,1 мМЕ/л.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Диссертация апробирована 16 декабря 1992 г на заседании секции молекулярной и клеточной биотехнологии ученого совета НПО "Биотехнология". Материалы диссертации были представлены на Международной конференции "Медицинская биотехно-

логия, иммунизация, СПИД" (Санкт-Петербург,12-18 ионя 1992 г.), II Всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов" (Москва,1990), I Съезде иммунологов России (Новосибирск, июль 1992 г.).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи, 3 тезисов.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка литературы из 120 работ. Работа изложена на 103 страницах, содержит 10 рисунков и 5 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Разработка схемы иммунизации для получения высокоаффинных моноклональных антител к ТТГ человека При выборе оптимального способа иммунизации необходимо учитывать особенности строения антигена. Поскольку молекула ТТГ- I представляет собой гликопротеид с молекулярным весом окйло 30 кДа, содержит на своей поверхности в общем не менее 12 кластеров эпитопов и вызывает интенсивный иммунный ответ как у мышей', так и у кроликов, нет необходимости усиления иммуногенности тиреот-ропина с помощью белковых носителей.

Отличительная особенность тиреотропного гормона человека, так же', как и других представителей семейства гликопротеидных гормонов - значительная гетерогенность. С целью увеличения вероятности получения МкАГ, "узнающих" эпитопы, присутствующие у различных естественных изоформ тиреотролина,'для иммунизации мышей и последующего тестирования клонов гибридом использовали несколько препарагой ТГГ. Для всех иммунизаций, кроме двух последних, применяли препарат ТТГ высокой степени очистки, полученный в лаборатории препаративной хроматографии и ультрафильтрации НПО "Биотехнология". Перед гибридизацией животных иммунизировали препаратом тиреоТропина фирмы "Sigma". Большинство моноклональных антител, , продуцируемых первичными (слонами гибридом, и все наиболее высокоаффинные антитела, секретируемые отобранными стабильными клонами, специфичны к антигенным детерминантам,"содержащимся. в препаратах тире'отропина НПО "Биотехнология"'ЭНЦ РАМН и "Sigma". ; '■-• : '•

При разработке схемы иммунизации мышей учитывалась необхо-

димость получения высокоаф&инных МкАТ. Известно, что повторные . введения антигена в течение длительного времени способствуют увеличению числа антитело-образующих клеток и аффинности продуцируемых ими антител (Herbert &. Krlstensen, 1982). Исходя из этого, было разработано несколько вариантов длительной иммунизации (Рис.1) Сравнение титров сывороток иммунных мышей показало, что оптимальным является подкожный способ введения антигена. При

, са внутрибргашшное введение ТГГ в дозе 30 икг, и подкожное введение ТТГ в дозе 30 мет, □ подкожное введение ТТГ на латексе в дозе 20 мкг

о о

1280 I2Q0

1120 1040

960 680 800

720 640 560 480 400 320

240 160

80

А

3 4,6,8 12

Длительность иммунизации, мес.

I

2

Рис.1 Титр сыворотки иммунных мышей при разных способах им-■ мунизации '(в каждой серии использовали Б животных).

этом титр сывороток иммунных мышей к ГТГ' достигал 1 : (1,3 -106) после 4 месяцев иммунизации. Увеличение титра иммунных сывороток наблюдали при удлинении сроков иммунизации до четырех месяцев Более длительная иммунизация не приводила к дальнейшему повышению титра, а через 12 месяцев иммунизации происходило снижение иммунного ответа. Очевидно, результат объясняется появлением ан-тиидиотиличеисих "вторичных" антител в сыворотке иммунных животных. О целью повысить количество антитело-образующих клеток за счет усиления фагоцитоза, антиген иммобилизовали на твердофазном носителе - латексе. Это позволило снизить дозу и частоту введения иммуногена, а также отказаться от применения адъювантов. Использованный нами способ иммунизации сорбированным на латексе ТТГ прост в осуществлении и не оказывает отрицательных эффектов на выживаемость животных и их иммунный статус. Наиболее эффективными инъекционными дозами оказались 30 мкг для: подкожного введения ТТГ в виде эмульсии с адъютантом фрейнда и 20 мкг для иммобилизованного на латексе тиротропина, что практически не отличается от оптимальных значений, приведенных в работе Odell с1 соавт. (198В)

Необходимо отметить, что молекула тирестропина содержит один высокоиммуногенный район, к которому вырабатывается большинство антител (Benkírane и др., 1987). Эти данные подтвердились в нашей работе, когда в результате серии гибридизаций были получены МкАТ к близко расположенным зпитопам ТГГ. Однако, для конструирования тест-системы необходимы МкАТ, специфичные' к пространственно удаленным антигенным детерминантам. Исходя из этого, использовали схему иммунизации, за1Ш>чающуюся в применении в качестве иммуногена комплекса тиреотропного ^гормона с МкАТ. Две последние.иммунизации мышей проводили комплексом ТТГ: с полученными-нами высокоаффинными МкАТ Т2-8, что привело к маскированию иммунодоминантяого района на поверхности Т,ТГ и повысило вероятность образования МкАТ к другим, менее кммуногенным, зпитопам на поверхности молекулы гормона. Количество таких МкАТ составило около 70Z от общего числа полученных антител, что следует из результатов анализа эпитопной специфичности МкАТ.

Выбор оптимального способа тестирования МкАТ

в культуральных супернагантах

Учитывая необходимость получения МкАГ для тест-системы, где они должны .реагировать с антигеном в растворе, необходимо было

разработать адекватный способ первичного скрининга МкАТ в куль-, туральных суперкатантах (КС).

В литературе описывается отбор пригодных для диагностикумов МкАТ к тиротропину в культуральной жидкости с помощью различных радиоиммунных и иммуноферментных методов. Чаще всего исследователи применяют РИА с меченным I125 препаратом гормона, в котором преципитация моноклопальных антител осуществляется в полиэтилен-гликоле (ПЭГ) за счет образования множественных иммунных комплексов при добавлении поликлональной антисыворотки к иммуноглобулинам мыши. Такой способ тестирования достаточно длителен, поскольку его чувствительность повышается пропорционально удлинению времени инкубации на протяжении 3 ч при комнатной температуре.

В иммуноферментном варианте анализа МкАТ, содержащиеся в КС, связывают с иммобилизованными на твердой фазе антителами к мыши, с последующим проявлением комплекса МкАТ с тиротропи-ном конъюгатом ПХ с подиклональными антителами к ТТГ. С нашей точки зрения, последний способ тестирования более пригоден для отбора моноклональных антител, использующихся для сенсибилизации твердой фазы. ■

Нами в качестве оптимальных способов тестирования МкАТ к ТТГ применялись двухбайтовый ИФА и непрямая радиоиммунопреципи-тация. При этом в обоих случаях антиген находился в растворе. В случае ИФА для связывания комплексов ТТГ с МкАТ использовали по-ликлональные моноспецифические антитела кролика к ТТГ человека ("Гормон"), иммобилизованные на полистироловых планшетах (МТП). Это обеспечивало сохранение нативной конформации реагирующих антител и гормона, и протекание иммунологической реакции в растворе. Для иммунопреципитации в качестве твердой фазы применяли се-фарозу 4В, насыщенную подиклональными антителами кролика к иммуноглобулинам мыши. Использование аффинного сорбента позволило сократить время инкубации по сравнению с обычным вариантом иммунопреципитации, где используется ПЭГ, до 1 часа при 37°С и проводить анализ в одну стадию (одновременное внесение КС, меченного 12Б1-ТТГ и аффинного сорбента).

Таким образом, применение этих двух методов гарантировало отбор антител, реагирующих с тиротропином в растворе, еще на стадии первичных клонов. Выбранные способы тестирования имели дополнительное преимущество экономии дорогостоящего препарата ТТГ высокой степени очистки по сравнению с ИФА, в котором аити-

ген непосредственно иммобилизуется на ЫТП.

В результате наш были отобраны МкАТ, которые связываются с антигеном, находящимся как в растворе, так и в иммобилизованном на твердой фазе виде. Очевидно, что нам удалось получить антитела к эпитопам, сохраняющимся при иммобилизации ТТГ. В работе Зегв! и др. (1991) приводятся данные, что часть конформационных эпитопов тиреотропина сохраняется даже при переносе препарата с акриламидного геля после электрофореза в нативных условиях на нитроцеллюлозную мембрану. Это говорит о достаточно жесткой структуре молекулы, и сохранении строения некоторых эпитопных районов тиреотропного гормона при иммобилизации. Сравнительный анализ эгштопной специфичности МкАТ с использованием культуральных супернатантов Для сравнения эпитопной специфичности МкАТ Т2-8 и антител, продуцируемых первичными клонами гибридом, полученных в результате иммунизации комплексом ТТГ - Т2-8, пользовались двумя подходами: исследованием конкуренции МкАТ в культуральном суперна-; танте (КС) с меченными пероксидазой хрена МкАТ Т2-8 (конкурентный ИФА с конъюгатом Т2-8 - ИХ) и наблюдением эффекта аддитивности при одновременном добавлении к иммобилизованному на МТП тиреотропину МкАТ в КС и очищенных Т2-8 (аддитивность в непрямом твердофазном ИФА). Был подобран диапазон концентраций МкАТ Т2-8, при котором получаются достоверные результаты в первом и втором методах. Для первого метода МкАТ Т2.-8 лучше всего использовать в концентрации, при' которой достигается 50% максимального связывания его с тиреотропином. При концентрации последнего 50 нг/мл эта величина составляет 150-200 нг/мл. Во втором случае нужно использовать МкАТ Т2-8 в избыточной концентрации, ¡которая составляет при данных условиях эксперимента более 2 мкг/мл. С помощью этих методов показано, что среди МкАТ, полученных при иммунизации . комплексом ТТГ - Т2-8, только антитеза Т2-З.И ТЗ-З конкурируют с Т2-8 за связывание с ТТГ. Применение очищенных МкАТ впоследствии подтвердило полученные с КС результаты.^, Действительно, МкАТ, конкурирующие с Т2-8 за связывание с иммобилизованными ТТГ, не образовали "пару" в двухсайтовом ИФА, Получение МкАТ и их характеристика ,

После длительной иммунизации (около 4 мес) было«проведено несколько независимых гибридизаций спленоцитов мышей Ёа1ЬУс, им-

- е -

ыуниаированных препаратом ТТГ человека, с клетками мышиной мие-ломы ХбЗ Аг8.653. Эффективность слияния составила около 80£, доля положительных клонов - приблизительно двадцать пять процентов. В результате на основании данных двусайгового ИФА и непрямой радиоиммунопреципитации было отобрано около пятидесяти первичных клонов гибридом, продуцирующих высокоаффинные монокло-надьные антитела к ТТГ.

Двенадцать стабильных гибридом с наиболее хорошими ростовыми качествами были дважды реклонированы, наращены в виде асцит-ных опухолей. Выделенные из асцитных жидкостей антитела, по данным ДСП-фореаа в полиакриламидном геле по ЬаепгаН (1970), содержали не более 51 примесей других белков. Выход чистых антител составил около 5 мг/мл асцитной жидкости. Продуцирование антител сохранялось на протяжении не менее 3 пассажей при культивировании в организме мышей.

Характеристика полученной панели моноклональных антител к ТТГ представлена в табл.1.

ТаОлица1 Основные характеристики моноклоналышх алгнтол и гиреогропному гормону человека

№ МкАТ Изотнп Кафф •10'9. Перекрестная реактивность МкАТ,X

М 1 ЛГ «СГ бета-ТТГ

1 Т2-2 1вв1 1.0 (0.1) 0,08 (0,02) 0,06 (0.01) 1.8 (0.1)

г Т2-9 1еШ г,г (0.1) 0,07 (0,02) 0,06 (0.01) 5.7 (0.5)

3 ТЭ-5 1еШ 2,5 (0.1) 0,07 (0.01) 0,08 (0.01) 7.9 (0,7)

4 Т4-5 1гв1 1.5 (0.1) 0,05 (0.01) 0,06 (0,01) 4.5 (0.3)

6 Т4-6 1вв1 1.7 (0.2) 0,08 (0,02) 0,07 (0.01) 6,0 (0.4)

б Т2-8 1вв1 12,0 (1.4) 0,06 (0,02) 0,06 (0.01) 1.7 (0.2)

7 Т2-3 1е02Ь 6,6 (О.б) 0,31 (0.03) 0,28 (0.03) 2,5 (0.2)

в тз-з 12Ш 6,0 (О.б) 0,09 (0.02) 0,08 (0.01) 5,1 (0.3)

в Тб 1еа1 6,6 (0.5) 0,11 (0.02) 0,09 (0,02) 19,7 (1.4)

10 Тб 1е01 5.2 (0.6) 101.6 (5.8) 102,5 (8.5) 1.1 (0.1)

11 Тв-2 8.2 (0.7) 0,08 (0,01) 0,06 (0.01) 1.2 (0,1)

12 Т8-3 1*31 ?.б (О.Б) 0,07 (0.01) 0,06 (0.01) 1,5 (0,1)

В тнйл. 1 представлены усредненные результаты 3 независимых вксюрдонтоа . каждое намерение проводилось в дублях. В скобках указдшы величины стандартных отклонений

Определение субклассов полученных антител показало, что МкАТ Т8-2 имеют изотип IgG2b, все остальные антитела принадлежат к изотипу IgGl. Константа аффинности, рассчитанная по методу Friguet с помошью ИФА, составила не менее 1,0 *109 М-1.

Все полученные МкАТ, за исключением Т6, не обладают перекрестной реактивностью с родственными гликопротеидными гормонами гипофиза человека (процент перекрестной реактивности составляет не более 0,3% в мольном соотношении), и проявляют слабое сродство к свободной бета-субъединице ТТГ. По-видимому, они специфичны к антигенным детерминантам, расположенным либо на интактном тиреотропине, либо на бета-субъединице в Koiiформации, ■ которую она приобретает при рекомбинации с альфа-субъединицей, и могут рассматриваться как антитела к пространственным детерминантам. Наиболее вероятно, что МкАТ Тб'специфичны к альфа-субъединице гликопротевдных гормонов человека. Однако, нельзя исключить возможность их взаимодействия с одним из обших канформационных зпи-топов тиреотропного, лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов.

Определение специфичности МкАТ

Специфичность очищенных МкАТ определяли в конкурентном твердофазном ИФА. Для этого были подобраны концентрации для каждого из антител, в которых они связывают около 50% иммобилизованного на МТП тиреотропина. В экспериментах использованы высо-коочвденные препараты гликопротевдных гормонов гипофиза (ТТГ, ЛГ, ФСГ) ЭНЦ РАМН и "Sigma".

Процент перекрестной реактивности (ПРД) МкАТ рассчитывали по формуле:

ПР.» - §°L .100 » В

где Во -концентрация ТТР в растворе, при которой достигается 50% ингибировашш связывания тестируемых антител с иммобилизованным антигеном;

В - концентрация других гликопрогеидных гормонов гипофиза и бета-субъединицы тиреотропина, в которой их нужно внести в раствор для достижения такого же эффекта ингибирования.

Оказалось, что МкАТ, представленные в табл. 1, за исключр-

нием Тб, практически не обладают перекрестной реактивностью с родственными гликопротеидными гормонами (ЛГ и ФСГ). Большинство МкАТ преимущественно взаимодействуют с интактным тиреотропином, хотя проявляют слабое взаимодействие со свободной бета-субъеди-ницей. Очевидно, эпитопные районы всех МкАТ, кроме Тб, расположены либо на альфа-бега дямере ТТГ, либо на бета-субхединице в составе интактной молекулы гормона.

Эксперименты с иммобилизованным на МТП денатурированным ТТГ (в соответствии с работой Pierse & Parsons, 1981 - обработка 8М мочевиной или 20 мин инкубации при 100°С в 0,01 М HCL) показали, что МкАТ Т2-3, Т2-8, Т8-3 "узнают" только нативный ТТГ, т.е., их антигенная детерминанта, по всей видимости, информационная (или она маскируется при повреждении интактной третичной структуры тиреотропина). Антитела Тб связываются одинаково как с нативным, так и с денатурированным ТТГ. Остальные МкАТ преимущественно связываются с нативным антигеном, хотя взаимодействуют и с тиреотропином после обработки. Эпитопную специфичность очищенных МкАТ оценивали в двухцентровом и конкурентном ИФА, используя меченные ПХ и немеченные МкАТ и тиротропин "Sigma".

Были выявлены антитела, которые образуют "пару" в "сзнд-вич"-варианте ИФА и не конкурируют между собой при связывании с иммобилизованным на МТП тиреотропином. На основании полученных результатов МкАТ в соответствии с эпитопной специфичностью можно отнести к 4 различным группам. Антитела, принадлежащие к различным группам, узнают различные неперекрывающиеся кластеры эпито-пов ТТГ человека. К первой группе относятся МкАТ, "узнающие" эпитопы, перекрывающиеся с иммунодоминантным конформационным районом на поверхности альфа-бета димера ТТГ. Сюда входят все полученные на первом этапе работы МкАТ (Т2-2, Т2-8, Т2-9, ТЗ-5, Т4-5, Т4-6) и Т2-3, ТЗ-З. Вторую группу составляют МкАТ, реагирующие с эпитопом, также расположенным на интактном ТТГ. Это ЫкАГ Т8-2. В третью группу воили МкАТ Т5 и Т8-3, также специфичные к димеру тиреотропина. Почти все вышеперечисленные МкАТ специфичны к пространственным, или конформационным зпитопам натив-ного ТТГ, т.к. проявляют лишь незначительное взаимодействие с отдельной бега-субъединицей тиреотропина и денатурированным антигеном. МкАТ Т5 и Т8-3 реагируют с денатурированным ТТГ, хотя в меньшей степени по сравнению с нативным гормоном. Возможно, часть антигенной детерминанты, узнаваемой этими антителами, име-

- и -

ет линейный характер. К последней группе относятся МкАТ Т6. По всей видимости, их антигенная детерминанта расположена на альфа- субъединице гликопротеидных гормонов человека, или является общей для интактных ТТГ, ЛГ, <1СГ.

локализация эпитопа

1. альфа-субъединица или димер (общий эпитоп ТТГ, ЛГ, ФСГ человека)

2. альфа-бета димер (иммунодоминантный)

3. альфа-бета димер

4. альфа-бета димер

название МкАТ, специфичных к кластеру эпитопов

Тб

Т2-2, Т2-3, Т2-8, Т2-9,

ТЗ-З, ТЗ-5, Т4-5, Т4-6 Т8-2

Т8-3, Т5

Оптимизация условий конъшгировалия МнАТ к ТТГ с пероксидазой хрена и биотипом

При конъюгировании антител с пероксидазой хрена (ПХ)' по Nakane & Kawaoi (1974) были подобраны оптимальные концентрации периодата натрия и соотношение МкАТ к тиротропину и пероксидаз!: хрена. С помощью ИФА и сравнения профиля гель-фильтрации конъюгата на сефакриле S-300 было показано, что при использовании 0,01 Ы концентрации периодата натрия и мольного . отношения МкАТ: ПХ 1: 2,5-3,5 (1,5-2,0 : 1 по весу) количество непрореаги-ровавших иммуноглобулинов было минимально, а выход низкомолекулярного конъюгата, в котором на 1 молекулу антитела приходится 1-2 молекулы лероксидазы (OD 280/OD403 " 1,50-2,68), составляет ■60-707. от общего количества конъюгата. При этом достигалась максимальная чувствительность анализа, не требовалась предварительная очистка конъюгата от свободных антител. Примеси свободной пероксидазы и высокомолекулярных полимеров были незначительны и не оказывали отрицательного влияния на эффективность определения ТТГ в двухцентровом одностадийном ИФА.

Биотинилирование поликлональных и моноклональных антител к ТТГ проводили по методу Wilchek & Bauer (1988). Использование в качестве модифицирующего агента N-гвдроксисукцинимидного эфира

биотина с двумя спенсерами (остатками Е-аминокапроновой кислоты) обеспечивало более высокое отношение специфического сигнала к неспецифическому по сравнению с реагентом, содержащим один спей-сер. Очевидно, этот результат объясняется большей Гибкостью био-тинилированного производного и понижением стерических ограничений для взаимодействия комплекса биотинилированных антител и стрептаввдин-пероксидазы с гиреотропином. Биотинилирование проходило наиболее эффективно при молярном соотношении антител к М-гидроксисукцинимидному эфиру биотина 1:80 для моноклональных антител и 1:320 для поликлональных моноспецифических антител кролика к ТТГ. При этом не наблюдалась потеря иммунологической активности ни у одного исследованного МкАТ. Были подобраны оптимальные концентрации использования биотинилированных производных антител в ИФА, при которых' достигается наибольшее соотношение специфического сигнала к фону (0,25 мкг/мл для поликлональных антител и 0,50 мкг/мл для МкАТ, и выбран буфер для разведения биотинилированных антител, эффективно понижающий неспецифическое связывание . Им оказался IX раствор казеина в забуференном фосфатом физиологическом растворе с 0,01% твином-20.

Конструирование лабораторных вариантов тест-системы

для определения ТТГ человека

Семь из полученных нами МкАТ, обладающих наивысшей аффинностью, были проанализированы с целью подбора комбинаций антител, реагирующих с различными эпитопами молекулы ТТГ, которые могут быть использованы в двухцентровой иммуноферментной тест-системе.

В результате скрининга всех возможных комбинаций ЫкАТ, было показано, что в ряде сочетаний МкАТ (Т5/Т8-3, ТЗ/Т2-8, Т2-3/Т6, . Т2-3/Т2-8) МкАТ конкурируют за центры связывания с ТТГ, в других (Т2-8/Т5, Т2-8/Т8-3, П-ВП8-г, Т5/Т8-2, Т8-2/Т8-3) интенсивность связывания очень высока. Для всех комбинаций ЫкАТ были построены калибровочные кривые. На рис.2 приведены калибровочные кривые, полученные при иммобилизации на фазе МкАТ Т2-8. Максимальное значение оптического поглощения наблюдается при исполь-зо: 1нии комбинации МкАТ Т2-8/Т8-3, несколько более низкое - для комбинаций МкАТ Т2-8/Т8-2 и Т2-8/Т5. ЫкАТ Т2-8 не образуют пару с МкАТ ТЗ и Т2-3. Отмечается несомненное сходство калибровочных

ТТГ, кг/ид

Рис.2 Калибровочное кривые, полученные на планшетах с иммобилизованными МА Т2-8 в концентрации 10 мкг/ыл, с конъюгатаыи ИХ с различными антителами: 1-18-3, 2-поликлональ-ные антитела кролика к ТТГ, З-ТВ-2, 4-15, 5-Т6, 6-Т2-8, 7-ТЗ, 3-Т2-3.

криЕих, полученных при использовании в качества вторых антител ЫкАТ Т8-3 и подиклональных антител к ТТГ, объясняющееся, видимо, высокой аффинностью как тех, так и других антител. Сравнение чувствительности определения тиротропина в ШК при использовании различных комбинаций КкАТ к ТТГ привалено в тайл.2.

ТаОлица2 Чувствительность определения ТТГ в двухсай-товоы КФЛ с помощью различных пар КкАТ

МкАТ, иммобилизованные на твердой фазе Антитела, когсшгкрозанныэ с ПХ

пАТ" Т5 Т6 Т2-8 Т8-3 Т8-2

Тк:-8 0,10** 0,25 1,65 X 0,10 0,20

ТБ 0,70 X 2,65 0,70 X 0,45

ТВ 0,Е5 2,15 X 1,80 1,30 0,90

Т8-2 0,20 0,40 3,50 0,95 0,30 X

Т8-3 0,50 X 2,20 0,45 X 0,35

ТЗ 1,15 1,40 3,80 X 2,40 0,00

Т2-3 3,60 4,50 X X 3,80 3,50

Политональные моноспецкфические антитела к ТТГ. Минлмальнач определяемая концентрация ТТГ, - 0,05 ¡Ж/л х Моноклокальные антитела нв образуют пару

С целью повышения чувствительности анализа ТТГ в качестве вторых антител пытались использовать сочетание различных ЫкАТ, конъюгированных с ПХ. Характер кривой при этом, однако, обусловлен одними иг МхАТ, обладающими большей аффинностью, а усиления ответа не наблюдается. Исходя из этих результатов, при разработке тест-системы для иммобилизации на фазе выбраны МкАТ Т2-8, . в качестве вторых антител - Т8-3 или Т5, при использовании которых достигается максимальная чувствительность.

Подбор оптимальных условий ИФА проводили в серии экспериментов. В первую очередь определяли необходимую концентрацию и объем наносимых на планшеты антител, а также буфер для их разведения. На рис.3 приведена зависимость оптического поглощения от концентрации ИкАТ Т2-8. Оптимум насыщения рабочей поверхности

полистироловых планшетов антителами наблюдали в диапазоне 10-20 мкг/мл. Нанесение МкЛТ Т2-8 в различных буферных системах с pH от 4,0 до 9,В не влияло на интенсивность адсорбции антител. В дальнейшей работе иммобилизовали МкЛТ Т2-8 в ЗФР, pH 7,2, используя концентрацию 10 мкг/шг.

А492

ПГ, нг/ил

Рис.3 Влияние концентрации иммобилизованных МА Т2-8 на чувствительность определения 1ТГ: 1-20 мкг/ мл, 2-10 мкг/мл, 3-5 мкг/мл, 4-1 . мкг/ил. В качестве вторых антител использован конъюгат МА Т5 с ИХ.

■ Изучение влияния времени инкубации на чувствительность ИФА (рис.4) показало, что с увеличением длительности инкубации возрастает и степень связывания ТГГ, однако чувствительность анализа мало изменяется после 2 ч. По результатам анализа калибровочных кривых выбраны следующие параметры: объемы реагентов 100 мкл, время проведения ИФА 2 ч. При этих условиях минимальная определяемая концентрация ТТГ составила 0,3 мкМЕ/мл (0,05 нг/мл) при Использовании Т5-ПХ и 0,1 мкМЕ/мл (0,02 нг/мл) при использовании Т8-3-1К. Этого уровня чувствительности достаточно для диф-ферекцировкн здоровых людей и гшертиреоидных больных (с концентрацией ТТГ менее 0,3 мкМЕ/мл).

Увеличения чувствительности ИФА можно достичь с помощью авидин-биотиновой системы. При этом используются вторые антитела, меченные биотипом, для проявления служит конъюгат ПХ с ави-дином или стрептавидином, имеющими чрезвычайно высокое сродство к биотшу. Конструирование тест-системы по этому принципу проведено для комбинации МкАГ Т2-8 (иммобилизованных на фазе), МкАТ Т6-3 и моноспецифических поликлональных антител анти-ТТГ (конъ-югированных с биотином). При последовательном введении в лунки сенсибилизированных планшетов стандартов ТТГ, биотинилированных антител и контюгата стрептавидина с полимерной ПХ (трехстадийный ИФА) наилучшие результаты получены при использовании иммобилизованных МкАТ в концентрации 10 мкг/мл, биотинилированных антител • в концентрации 0,25 мкг/мл для поликлональных и 0,50 для МкАТ, кснъпгата стрептавидина с полимерной ПХ - в разведении 1:20 ООО (рис.5). Оптимальный объем всех реагентов - 100 мкл. Чувствительность ИФА в таком варианте возрастала до 0,01 мкМЕ/мл (0,002 нг/мл), диапазон измерений - от О до 1 нг/мл. Продолжительность каждой из первых двух инкубации составила 1 ч, третьей - 0,5 ч, в целом анализ длился около 3 часов. Попытка сократить число-стадий, совместив первые две инкубации (двухстадийный ИФА) и все 3 инкубации (одностадийный ИФА), привела к снижению чувствительности ИФА до 0,04 мкМЕ/мл (0,006 нг/мл) и 0,2 мкМЕ/мл (0,003 нг/мл) соответственно при одновременном уменьшении регистрируемого оптического поглощения, особенно значительном в одностадийном ИФА. Помимо этого при одностадийном ИФА требуется в 4 раза Солее высокая концентрация биотинилированных антител и в 20 раз - конъюгата стрептавидина с полимерной ПХ.

Таким образом, разработаны 2 метода ИФА для количественного определения ТТГ на основе пары МкАТ Т2-8 и Т8-3 (рис.6) Их основ-

ТТГ, кг/ил ■

Рис.'4 Влияние времени инкубации на чув-' ствигельность определения Т1Г для пары антител Т2-8/Т5-ПХ: 1-3 ч, 2-2. ч» 3-1,5 ч, 4-1 ч, 5-0,5 ч.

ИГ, их/ид

' Рис.5, Калибровочные кривые, полученные ' для одно- (3). двух- (2) и трех-стацийного (15 И2А с использованием стрептазицин-биотннового комплекса.

492 2,5

2,0 1,5

1,0

0,5

2

2;о ' 4,0 ' 6,0 ' е;о

0,05 , 0,10 0,15 .0,20

0,005 0,010 0,015 0,020

\

ТГГ, нг/мл

Рис.6 Калибровочные кривые для 1-стадийиого (2) и З-ста динного (I) методов Шк на основе МкАТ Т2-8.И 18-Графики построены по данным 5 экспериментов.

ные характеристики отражены в табл.3. Одностадийный иммуноанализ технологичен, требует минимальных затрат труда, времени и реагентов, пригоден для промышленного выпуска и использования в клинической практике. Трехстадийннй иммуноанализ обладает высокой чувствительностью, что лает возможность диагностировать степень тяжести гидартиреоза, однако из-за повышенной сложности применим только для лабораторных и научных исследований.

Та б л ицаЗ Основные характеристики разработанных методов нммунофермептного анализа для количественного определения ТТГ

Название ТИРЕОТРОШШ-ИФА ТИРЕОТРОПИН-ИФА Л

Возможная область применения

Принцип анализа

Диапазон измерения

Твердая фаза

Время анализа Объем проби Чувствитель носгб

Специфичность (процент связывания) Воспроизводимость (ГШ, 2)

Линейность

кхишксскии анализ

лаборатории© исследования

2-стадийный 3-стадийпий

двухсайтовый ИФА на основе пары моноклона-лышх антител, одно из которых конъюгировано с пероксидазой хрена с биотипом

0,2 -40,0 мМЕУЛ 0,02 - 6,00 мМЕ/л

полистироловые планшеты

2.5 часа

0,1 «А Ж/л

ЛГ - 0,0003 ОСТ- 0,001 ХГЧ- <0,0001

5.6

02,5-100,6

100 мкл

3,5 часа

0,01 нМЕ/л

0,003 0,003 0,0001

8,3

90-110 X

Высокодозовий хук-эф$ект

не наблюдается при концентрациях ТТГ ниже 1,3 МЗ/Л

В ы в о д ы.

1. Разработаны оригинальные схемы иммунизации мышей препаратами тиреотропина человека и методы тестирования ЫкАТ, продуцируемых первичными клонами гибридом.

2. Получены 12 стабильных клонов гибридом, . продуцирующих высокоаффинные моноклональные антитела с тиреотропному гормону человека.

3. Моноклональные антитела охарактеризованы и проведен сравнительный анализ их эпитопной специфичности.

Показано, что одно из МкАТ взаимодействует со всеми гипофи-зарными гликопротеидными гормонами (ЛГ, ФСР, ТТГ), остальные антитела специфичны к интактному ТТГ и узнают три неперекрывающихся кластера эпитопов на альфа-бета димере. При этом перекрестная реактивность данных МкАТ с другими гликопротеидными гормонами гипофиза (ЛГ и ФСГ) не превышает 0,3%.

Подобраны 6 пар МкАТ, пригодных для конструирования иммуно-ферментной тест-системы.

4. Разработан метод твердофазного иммуноферментного анализа ' на основе комбинации МкАТ разной специфичности для определения ТТГ в сыворотке крови в одну стадию в диапазоне концентраций 0,2-40,0 мМЕ/л. По своим техническим параметрам метод пригоден для создания на его базе медицинского диагностикума.

5. Разработан метод 3-стадийного двухцентрового ЙФА с использованием авидин-биотиновой системы, который позволяет определять содержание ТТГ в диапазоне 0,02-6,00 мМЕ/л и может служить основой высокочувствительного подтверждающего теста на ги-пертиреоз, а также применяться в научных исследованиях.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Корязова Л.К., Ковалевская Г.И., Самойлова В.Е., Василов Р.Г. /Иммуноферментный диагностикум для определения ти-реотропного гормона человека на основе моноклонадьных антител. 1.Получение моноклональных антител, специфично взаимодействующих с тиреотропным гормоном человека. //"'Биотехнология".-1992 г.-№б.-стр.30-32

2. Сигал Е.Р., Корязова Л.К., Ковалевская Г.И., Позднякова Т. А., Волобуева Е.Е., Самойлова В.Е., Василов Р.Г. /Им-

муиоферментный диагностикум для определения тирео-тропного гормона человека на основе моноклональных антител- 2. Конструирование иммуноферментной тест-системы для определения тиреотропного гормона человека.// «Биотехнология»- — 1993 г- — № 3- Стр- 31—343. Кандыба, Е. И., Лавренова Г. Н., Корязова J1. К., Членов М. А-, Василов Р- Г./Получение тиреотропного гормона человека.//Тезисы докладов «Современные направления, развитая биотехнологии»- — Москва, 10—12 дек- 1991 г- — стр- 564. Ковалевская Г. И., Корязова Л. К., Петрова Е. Н., Кандыба Е- И., Василов Р- Г./Сравшггельная характеристика методов тестирования моноклональных' антител для диаг ностикумов.//Там же, стр- 255- R- G- Vasilov, A. A. Bulatov, Е. R. Sigal, Т. A. Osipova, I. Yu. Vturina, К- Yu. Vaijle, L- К- Koryazova, A- V. Marti-nov, N. G. Smirnova & A. L. Liozner/Enzyme immunoassay for TSH screening in newborns.//Abstracts of Internationa! • Conference on Medical Biotechnology, Immunization and AIDS. — Leningrad, june 12-18- — 1991- SO—5.