Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунохимическое изучение кортиколиберина человека использованием моноклональных антител

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммунохимическое изучение кортиколиберина человека использованием моноклональных антител"

АКАДЕМИЯ НАУК РОССИИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А. Н. БАХА

На правах рукописи УДК 615.357.37.

КРАВЧЕНКО Ирина Валерьевна

ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ КОРТИКОЛИБЕРИНА ЧЕЛОВЕКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

03.00.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994

Работа выполнена по Всероссийском Научном Центре молекулярной диагностики и лечения МЗ РФ.

Научные руководители: член-корреспондент РАН, профессор Северин Е. С., доктор биологических наук Свешников П. Г.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Гусев Н. Б. кандидат биологических наук Чередникова Т. В.

Ведущая организация: Московская Государственная Академия Тонкой Химической Технологии им. М. В. Ломоносова

Защита диссертации состоится ¿¿^ку1994 г_ в 10 час. на заседании Специализированного Совета К 002. 96.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А. Н. Баха РАН (117071, г. Москва, Ленинский проспект, 33, кор. 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (117071, г. Москва, Ленинский проспект, 33, кор. 1). ,

Автореферат разослан и^о^угп ^—^"994 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета

доктор биологических наук М.И.Молчанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальности темы.

Изучение? механизмов действия нейропептидов, выделяемых гипоталамусом и регулирующих деятельность периферических яепез внутренний секреции через гипоталлмо — гиповизпрную систему, является одной из наиболее актуальных задач ссЕременной биохимии. Кортикотропин — релизинг — »актор заслуживает в этой связи особо пристального внимания, поскольку он, регулируя уровень адрвнокортикотропного гормона, оказывает определяющее влияние на секрецию глюкокортикоидов — ключевых гормонов стресса, вызьшаюцих ц^лый ряд негативных изменений в различных Функционалпных сиотемах организма, в том числе в иммунной системе, в условиях длительного стресса.

Весьма актуальной является проблема установления взаимосвязи между структурными особенностями пептидных гормонов и их функциональными характеристиками. В отношении кортикоЛиберииа имеется значительный грагресс в изучении его отруктурных характеристик, тогда как установление

Оункциональной роли выявленных структурных особенностей потаетея пока малоисследованним.

Весьма удобным инструментом для решения вышеуказанных задач являетоя использование момоклональных антител. Моноклональные антитела олаиифичнеки связываются о определенным эпнтопом на молекуле пягстида, позволяя идентифицировать этот эпитол. Сопоставление биологимаоких аффектов монокленпльных антител о их специфичностью к определенным антигенным детерминантам позволяют побиться оущэотвен и ого прогресса как в изучении механизма действия данного белка, так и в изучении «го структурно — Функциональных характеристик.

Монокгюнальныа антитела позволяют успешно решать и другу» ватную проблему, возникающую при изучении биологически активных пептидов, действующих в чрезвычайно малых концентрациях! они дают возможность создания

высокочувствительных иммуноферментных теот - систем, позволяющих точно определять концентрацию данного гормона в биологических образцах.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось! (а) — получение клона» гибридом, секретирующих моноклинальные антитела к различным эпитопам на молекуле человечеокого кортиколиберина; <В> — соозяанив высокочувствительной иммуноферментной тест - системы для определения концентрации человеческого кортиколиберинв; (в) — характеризацня антигенных детерминант полученных моноклональиых антител; (г) — исследование типов клеток, секретирующих кортиколиберин, и определение факторов, стимулирующих его секрецию, с помощью разработанной теот — системы. В соответствии с этим в план р г. йоты входило! гибридизация соматических клеток а целью получения гибридом, оптимизация условий имиуно»ермзнтного диагностирования человеческого кортиколиберина, химическая модификация аминокислотных остатков кортиколиберина, измерение

концентрации данного пептида в культуральных жидкостях первичных и перевиваемых культур в ответ на различные стимуляторы.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Были получены моноклональныа антитела к кортиколиберипу человека, определен характер антигенных детерминант и константы связывания для дьух клонов антител и показано отсутствие конкуренции меяду ними за участки связывания о антигеном. Впервые было обиарук£?но, что опоесбяоотью оекретировать кортиколиберин обладают В — и Т - лимфоциты человека, ко не макро<аги и не грпнулециты. Впервые было показано, что секреции кортиколиберина отимулируит не только активаторы пролиферации лимфоцитов, но и «акторы клеточного стресса.

Практическая ценность работы состоит в том, что впервые Была создана иммуноверментная тест — система для определения кортиколиберина на основе моноклональиых антител, позволяющая определять антиген в концентрациях до 50 пг/мл. Поскольку изменения концентрации кортиколиберина являются характерным признаком таких патологий, как синдромы Кашинга и Нельсона, болезнь Аддисона, то данная тест — система является ценным инструментом для их ранней диагностики.

Апробация работы.

Материалы диссертации были доложены на международной

конференции "Структуре и функции регуляторных пептидов" ( Москва 1992 > и на лаВораторном семинаре департамента биотехнологии ВНЦ МЯЛ МЗ России ( декабрь 1993 ).

Структура и объем работы.

Пиосертационная работа содержит оледуютие разделы! »ведение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы и список литературы, изложена на 103 отраницах машинописного текста и включает 25 рисунков и 4 таблицы. Библиография включает 131 источник, из них 3 руооких и 148 иностранных источника.

Спиоок сокращений.

CRF - кортикотропин - релизинг - «актор, PBS - заВуференный физиологический раствор, PBS-AT - PBS о 0,5Х бычьим сывс.ооточным альбумином и 0,05Х Tween-20, ИФА -иммуноферментный анализ, П — оптическая плотнооть.

СОДЕРЖАНИИ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОПЫ.

Для получения гибридом использовали мышинум миелому Sp'2/O ч клетки селезенки мышей линии Balb/c. Слияние клеток проводили полиэтилнгликолем о добавкой диметилсульфоксида I Borrebalck С. et.al., 1981 ). Полученные клоны гиОридом реклонировали дважды в полужидком агаре, - поолв чего замораживали в криоэащитиой среде, содержащей 10Х диметилоульфокоида, понижая температуру оо скоростью 1 градус в минуту. Пля получения аоцитичеоких жидкоотей мышей линии Balb/c сеноиВилизировали внутрибрюшинным введением приотана и через непели вводили по Ю^клеток гибридом внутрибришинно. Асцитичеокие жидкости Врали через Ю-lfe дней.

Иммуноглобулины из аоцитичеоких жидкоотей выделяли с помощью ионообменной хроматографии ( Брок й.,1997 >.

Все варианты иммуноферментнаго анализа проводили на 96-луночных планшетах из поливинилхлорида по описанной ранее метопике ( Волков Д.В. о соавт., 1984 >. В качеотве оуботрата для пероксидазы использовали АВТС или ортофенилендиамин. Пероксидазные кон-ывгаты моноклональных антител готовили периодатным методом < Tijmaen P., Kuratak Е., 1984 ).

Конотанты связывания моноклональных антител о кортиколиВерином определяли о помощь» иммуноферментного анализа ( Frigvet В. et al., 19S5 , Stevens F., 1987 ) используя формулы Скэтчарда.

Кортиколиверин модифицировали цитраконовым ангидридом (Fredman N., 1970 ) и диэтиллирокарВонатеи (Grillo F.B., Aronson P.S., 19В6 ).

Выделение лимфоцитов из крови здоровых доноров проводили стандартным методом о использованием градиента Фикол — гипак ( Клауо П., 1990 ). Разделяли лимфоциты на Т- и Б- клеточные Фракции о использованием найлоноиых волоксн ( СримеЛь Г.,1987).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1. Получение моноклональных антител.

Пля иммунизации было взято 7 мышей линии BalЬ/с весом 16-18 г. Для получения гибридом выла взята мышь о наибалишим титром антител в сыворотке < титр антител определялся методом ИФА ).

После удаления эритроцитов оуопензия клеток селезенки

8 7

содержала 10 клеток. Их слили о Ю клеток ииеномы Бр2/0.

После двухнедельного культивирования в селективной среден,

содержащей аминоптс-рин, гип оксанти.ч и тимидин, провопи

инмунзферментный анализ появившихся клонов и отобрали 2 клона,

даваших наибольший dtbot при наименьшем количестве клеток. Из

них отобрали по 10"* клеток и реклонировали в 0,37.—ном агаре.

50-70/1 вторичных колоний продуцировали моноклональные антитела

к кортиколиберину человека. При последующем рекламировании

выход специфических клонов составлял 1004. Асцитические

жидкости, взятые у мышей на 10—16 пень после введений клеток,

очищали о помощью центрифугирования при 1000g 10 мин. Пооле

трехкратного высаливания сульфатом аммония до 40У. насыщения и

ионообменной хроматографии на ДЭАЭ - трисакриле М получили

Фракции моноклональных антител, содержащую по данным

электрофореза в додецилсульфате натрия только иммуноглобулины

G, выход моноклональных антител составлял 2 мг из каждого мл

асцитической жидкости.

2.

Опредэление констант связывания о антигеном.

Пля определения констант связывания в комплексах антиген -антитело пользовались метопом, включающим инкубацию различных аликвот антигена о постоянным количеством антител в гомогенной фазе до установления равновесия и последующее определение концентрации свободных антител, не связавшихся в комплекс, методом ИФЛ. Согласна процедуре, использованной авторами данного метода, оптическая плотность в реакционной смеси пересчитываетея непосредственно в концентрацию свободных антител пооле установления равновесия. Однако, поскольку о сорбированным на твердой фазе антигеном связываются как свободные антитела, так и антитела, имеющие свободным лишь один сайт < второй связался о антигеном при инкубации по установления равновесия ), то рассчитанные концентрации "свободных" антител не являются истинными концентрациями свобод)<%1Х сайтов связывания. Ф.Стивено разработал метод, позволяющий преодолеть это ограничение вышеупомянутого метода и рассчитывать истинные конотанты связывания. Типичный график Скэтчарп», построенный о учетом поправки Стивэнса, приведен на риоун ке 1.

Расочитпниыэ методами Стиэенса и Фриг-вета конотанты циоооциации представлены в тьОлице 1.

ТаОл.1. Хпрактсризтики полученных монокленальных антител к ксгу-ТиколиВарину человека.

Клон

Под к лг. со

Константа диссоциации, М метод Фригвета метоп Стиьенса

4Н? 5ЦЗ

□ 1 Б1

2x10 -8

-9

3,3x10

1хЮ 1,ЗхЮ~

-9

3. Определение взаимной конкуренции антител и разработка тест-системы для измерения концентрации кортиколиберина. Для исследования взаимодействия антител о их конъюгатами проводила* конкурентный анализ < рис 2 ).

Антитела 4Н9 не конкурировали о антителами 5ПЗ,а антитела 5ЦЗ - с 4Н9, но пероксидазные кон-ыогвты антител каждого клона

в/т

1,0 •

0,5

3,3 3,8 . 4?2 4,6'В,нМ

Рис.1. Кривая связывания моАТ 4Н9 о нативным СЯЯ

по данным непрямого ИФА в координатах Скэтчарда о использованием метопа Фригвета. Концентрация моАТ 4Н9 равна О,7 мкг/мл. Р-концентрация свободного СЯР, В—концентрация связанного СЯР.

конкурировали о некон-ькгированными антителами того же оамого клона. Отсутствие конкуренции между антителами, продуцируемыми двумя кланами гибридом, показывает, что антитела направлены к двум различным антигенным детерминантам.

Высокая аффинность антител, а также отсутствие конкуренции между ними за связывание с антигеном позволили создать теот .-систему на основе иммуноферментного сэндвич аврианта ИФА. Из двух испытанных вариантов теот — системы на основе сэндвич варианта наилучшим оказалось сочетание моноклонвльных антител 4Н9 в качестве сорбента и антител клона 5Д5 для приготовления кон-ьигата. Этот вариант давал достоверное отличие сигнала от фона при концентрации кортиколиберина 50 пикограмм в миллилитре < рис.3 ).

4.Локализация антигенных детерминант моноклональных антител.

I 1 1 I I ■ ■ 1 V» ■ I ■ ■ I I I 11 I »

3 6 9 12 25 50 3 б 9 12 25 50

Концентрация немеченых антител, мкг/мл

Рио.2. Конкуренция перокяидазныч кон-кчгатоо ипЛТ ЗПЗ (А) и моЛТ 4Н9 <В> о нонпскииИи коЛТ АН? и ЗПЗ за ■ связывании о миоЕитпоямишм ксртиколиЯериком. Обозначения« в - Ш, а - ЗДЗ. ____

Концентрация кортиколиберина, пг/мл_

Рио.З. КолиСроаочиый график опредэлэния концентрации

кортикояиВвринш двухсайтнкм с»нДЕ**ч-вариантой ИФА. Ссрб»нт-моАТ 4Н9 (10 мкг/мл), кон-ызгат-моАТ 5Д5 (1 мкг/ия>.

При инкубации кортиколиберина о цитракомовым ангидридом мацмгицироэзлоя единственный яизиновый остаток Н_уа .

Антитела клона 4Н9 прпктичеоки не связываются о модифицированным па лизиновому остатку кортиколиОсри^ом ( рио 4 ), что однозначно соидатеиьотеус-т о пользу предположения о присутствии ванного остатка в антигенной детерминанте, узнаваемой антителами данного клона.

1.5-

Ä4I4

' 1.0.

0

а

Рис.4.

4Я9 5D5

влияние лиэииовой мсдификсции на оэл-зьшание CRF о антителами. Кон-ногат инкубировался Еаз CRF ( Q !, с модифицированным CRF в концентрации 5 мкг/мл С □ >, о нативнык CRF ю той—

ХС КОНЦЕНТРАЦИИ,( ¡j)

В пользу этого предположения говорят также данные о влиянии кортиколиБерин -• сзвзыванцгго В^лкз на взаимодействие внтигенп о антителами этого клона. Как видно из рис.5 нормальная человеческая сызоротка полностью попэвляет связывание о

антителами клена 4Н9.

Для Гюлее точного огф£ явления компонента человечеокой сыворотки, тормозящего связывание кортиколиберина с антителами , была проведена гель - еильтрпция сы^срот>-и не, саеаисжср 3-200 с последующим анализом отдельны»; фракций на способность ингибировать - заимсщгйствие СЯР с антителами. Такой способностью сЗладала оракция с молекулярным весом около 40 кЦ ( рис. 6 ).

Кгак Было покаччно ранее, учэсток аминокислотной •,топлг?яоватал?.иаоти 34-41 явлпется определявший для »зпимодейотвия кортиколибсрина о сывороточным белком, им?нно там и локализован Воя совокупность описанных выви

данных подтверддагат предположение о том, что лиэинопый остаток входит я осота» антигенной детерминанты моноклинальных внтитил 4Н9, следовательно, эти антитела направлены к С-концевому учлатку »молекулы кортиколибсрина.

1.5 — %4 il

1.0 —

0.5 - 0 ____ ЁЖ- л

4Н9 5D5

Рио.5. Влияние нормальной человеческой сыворотки

на овязывание антител о CRF. ' Планшеты сорбировали БСА, овэльбумином, инсулином, гсрмонсм роота ( П и, s ; ) или нати&ным корти ко Либерии ом ( д. иП ) и татем обрабатывали человеческой сывороткой ( ГЗ ), 0,25% желатином ( О • ) или PBS-AT ро всех других случаях.

Исследование антигенной детерминанты клона 5ПЗ проводилось о использованием таких модификаторов как цитраконопый ангидрид и диэтиттирокврВонат. После инкубации кортиколиберина ■ о иитраконовым ангидридом связывание антитип клона ЗПЗ заметно ухудшилось , причем отсутствие конкуренции этих антител о моноклинальными антителами 4Н9 позволяет исключить участие лизиновых остатков в связывании антител клона 5ДЗ о антигеном. При модификации яиэтилпирокарОонатом саяэнвание

450 650 850 1050 V,мл

Рио.6. Ингибирование различными фракциями

нормальной человеческой оыворотки ааязьшания антител о CRF. Обозначения! * - моАТ 5Д5, • - моАТ 4Н9. А - профиль »литии, В - процент ингиОирования связывания антител о CRF различными фракциями сыворотки.

кортиколиЗерина о ванными антителами возросло. Использование метода Скэтчарда позволило определить конотннту овязыввния антител о • модифицированным _ диэтилпирокэрбонатом

кортиколиВерином и сравнить ее о константой, полученной для нативного релизинг* - «актора. Оказалооь, что антитела 5Д5 связывают кортиколиВерин о модифицированными гиотидиновыми остатками с Польшей конотантей ( тобл 2 ).

что на

Это вполне согласуется о ранез полученными данными

13

гиотидинов, особенно His , влияет

модификация

конформпииониое соотояние белковой глоЗулы. Перечисленный выше наблюдения, а также вызываемое кортиколибарин - свяэызающим Белком блокировании в 3,5 раза связывания антитол НД5 о антигеном позволяет предположить что антигенная детерминанта

антител клона 5П5 является конформшдионной.

ТеОл. 2. Измзнвнил конотзнт связывания моноклсналиных снтитеп посла модификации кортикогиберима ди»тияпирок:арВснатом.

Клон Константа циссоци&ции, М

мэтод Фригг<-,?та мэтод Стиеснса

4Н9 1,1х10~9 2,3х10~9

-9 -9

заз 2x10 3,9x10

5. Секреция кортиколиберина клетками иммунной системы.

Разработка вышеописанного метода определения концентрации кортиколиВерина пезполила вплотную подойти к пробгтггм*; опрекзЛ!Зкия тилоз клеток, ся^ретирусцих данный пептия при риэтпных иммуиогсгичзакнх реакциях- D первую очг;рг?дь была исглецорг-ни опс.собясоть ссмсрет|'рстати хортикогиберил суммгрной Фракцией лейкоците-.» периферической крови "Г?ясв:?ка, а такяг? но^ракционирпганными спленсцигами пыхи я птгот на ксн кпнаЕ'т-лин Л и липополисахарид клеточных отснок ¿.coli oo£4i?oti»l> о дэкстрансульоатсм. Как видно из рисунка 7 оба агента визывз-.ат секрецию кертикотропин — релизинг — Фактора как лейкоцитами кроси человека, так и спленоцитами мыши.

Из сбоих клеточных суспензий легче всего отделить макрофаги и моноциты по их способности к адгезии на пластиковые чашки Петри. Удаление макрофагов из обоих клеточных суспензий никак не влияло на синтез кортиколиНеримп оставшимися клетками. Сами макроеаги и моноциты но секретировали данный релиэинг — Фактор ни в ответ на вышеупомянутые стимулы, ни в ответ на ФарСоюяый эфир! как сам по со5с?, так и совместно о кальциевым ионо^^сом А12387.

После разделения гимооцитоо и гранулоцитов как в градиенте "лимфопрепа", так и в градиенте перкола получаитоя сходные результаты! лимфоциты < как совместно с макрофагами, так и 0г*з них ) сакретиругат кортикотропин — релнзинг — «актор п ответ нп ебп вышеупомянутых стимула, тогпа как грпнулоциты нп обладают

r: w

Р. о

(¡v : i 1С cu

Ч S

о

ёъ

в и

о \ к

* ä

га Р-,

Ен

g" О

150

75

Г

Рис.7. Cc.-феии« кор т и ко n»iBepn' i а нееракционированныия

лимфоцитами человеческой кроои г» ответ иа асйатгя« рахитичных

«сктсрса.

1 - 1,5-кратнь;й растсор СКНИа, Г. - двукратный ПЖМ, 3 - 41°С, л - липоп'олиаахарид <50 мкг/ил) и нккотр;>ноу/1ь»ат <20 нкг/n/i), 5 - конканавални А <50 икг/мл), 6 - контрольная проба.

такай спаооСноатью. Иззиотно, чта »тч два отимуияторг. воздействуют h¡, разные типы компетентных клеток! конканаеалии Л при ИСПОЯЬЗОЗЬННЫХ В »копкриизнто условиях »чппятоя активатором Т-лимфоцито», тогда как >1и;гополиоахг.р«п П.со) i ooemgotho о пекотраноульфатом опаии^ичвокы »кгивируит лимфоциты.

Не 'олетдунщем »тппе иссликовоний Т— и В— лимфоциты Выли разделены о ¡.опояьаованием нейлоновой ват.|, и об? оуСХ^рзкции С!нли изследоовмы на спсссБнооть оскротироватг.. кортикалиЗерин в ответ на оба отимул». Как »идио из рио. В, фракция 7-пимфоцитоз обладала опоооЬнсотью сиакротиравпть данный рплиаииг-— Фактор только откат на кон капаш>лин А, тогда как Фракция &— лимфоцитов оекретировала его только в ответ на липополиоахарид оозмсотно о н«чотраноуяьФато>1.

Таким образом, Выло уотанозлшю что и Т-, и В-яимфоциты, но не макрофвги и не гранулоцмты, обладают опоооОноотьи овкретирзхатъ кортиксли&арии i¿ ответ не ооотыртотвующий

я! Ж

си

5> «

о Г'

ч (В О Г!

НЮ № О о нч М X СЧ!

роз

и -v,

ж с-(В с а о

100

50

Б-лимфоциты

9 10

Т-лимфоциты

Гис. £3. Секреция кс.ятмкс-::ь£г*р»а« а ^амираис-п«* м *

Ч.?ЛОПеЧ2СКИМИ ГТИМфОЦИ Г5ИГ. 73 на г'.-'

«актеров.

1,6 - двукратный ДМ£М, 2,? — лппополисамгрил г,'--гс

покстрансульоптсм (50 мкг/мтг) , 3,7 — --

А (50 мкг/мл)} 5,10 — контрольные пробы.

данкому клеточному типу стимул.

Извсстно> • ЧТО Э-ттимфоцит ы сЗладают способностью секретиршэать адренокортикотропный гормон. С другой стороны, было показано, что они несут рецепторы кортикотропин — релизичг — фактора. С учетом этих данных и полученных результатоп модно сформулировать гипотезу о наличии р иммунной система иерархической взаимосвязи гормонов, альтернативной гипоталамо — гипо$иэармсй системе. Согласно предлагаемой гипотезе адренокортикотропный гормон, вызывающий секрецию таких типичных гормонов стресса как глм-кокортикоиды, образуется не только э гипофизе а ответ на нервный стрегзс, опосредованный гипоталамусом' си может серазааатьси и г> огг»ет на "иммунологический отреоон, гызиьаемъ>:й появлением чуг/ггролнего антигена и актиэаиией клеток иммунной системы. В данном случае адрр?:-ю1'сртикотрсг:ин бупут сотретировать Г; —

лимфоциты, а регулирующим »ту секрецию атинулом Судет служить кортикотропин - релизииг — фактор. Он будзт выделяться как Т— лимфоцитами, так и Е— лимфоцитами в ответ на специ|ичаскую стимуляцию данного типа клеток, и будет оти.чулировать секрецию адренокортикотропного гормона в первом случае по паракринному механизму < за очнт тесного контакт!» T—хэлперов о В— лимфоцитами ), а во втором — по аутокринному механизму I В— лимфоцит оам секретируат кортиколибарин и сам несет рецептор к нему ).

Выдвинутая гипотеза предполагает, что иммунная сиотема моыэт олужить альтернативой гипоталамо — гипофиэ^рксй, сеиретирук кортиколибэрин а отгает на различные Стимулы клеточного отрео^а, воздействующий на клитки иммунной оиотоны. Поскольку эти клатки широко раопроотрюнаиы по лариферичиоким тканям, стимул, вызывающий локальный кпеточний стресс, благодаря предполагаемому механизму мог L-ызывать отвот в

виде общего физиологического отрсссг, что было Бы затруднительно сделать., попользуй только гипотплано — гипофизнрную систему. Таким образам, можно ожидать, что Т— и В- лимфоциты будут секретировать кортиколиберин в отьат на рвзличныа факторы клеточного стресса. В ходе работы Выло показано, что как суммарная фракция лейкоците» периферической крови человека < рис.7 > и опло-сцито» мыи.и, так и выделенные т— и В— лимэоциты человек» ( рпа.О >, но не макрофаги и . на гранулоциты, обладают опоооГкшстью оскротираоЕТь кортикстропим - релизинг - фактор ь> отппт на гипераомотичиооть окрувоэлэй среды и на гипиртврми», что напяотия хорошим поитверкаиииам предлагаемой гипотезы.

Пальнийшио исследования пэ регуляции секреции исолэдуемого пептида значительно увоВкзо проводить на клзточных линиях, поскольку они обладает Ваоконвчным потенциалсм делония и овеопвчиавют большую стандартизацию полученных реаультвтоп. Однако известна, что рвапроотр&иенная ми;?ломнвя линия Бр2/0 сырабатываот сутокринн^е: факторы роота, способствующие ее пролиферации, и »ти факторы могут олужить активаторами секроцми ксртиколиОерина. Линия Sp2/0 cü/гвдает высокой ¿зальной активностью продукции кортикотрспин - релизинг -Фактора, тогда как макрофвгпльнвя лини г. РЗВ9 Ц1 лиюгнь

опоообнооти секретировать этот пептид как спонтанно, так и в ответ на различные отимулы. Эти наблюдения служат дополнительным подтверждением приведенных выше данных, полученных на овежевыделенных лимфоцитах и спленоцитах.

Э результате проведенных исследований были получены клоны гибридом, оекратиругещие моноклональные антитела к

кортиколиВерину человека. Они прошли несколько реклонирований о полужидком агара, обзопечивамщих монокланзльнооть полученных колоний, причем выход специфичных колоний на последних этапах рекламирования соотввлял 100%. Подтверждением нон о клон а ль н ости секретируемых гибридомами антител являетоя их' способность реагировать только о кортиколиберином в иммуноФерментном анализе. В пользу предположения об их моноклональности говорит также тот факт, что в выделенном препарата антител определяется о помощь» специфических антисывороток лишь один подкласо иммуноглобулинов. Наконец, еще одним доказательством моноклонельнооти полученных антител являетоя линейность графиков Скэтчарда, поотрсеных для определения конотант связывания антител о чэловечеоким кортикоЛибериисмI отсутствия перегибов на »тих графиках связывания антитала о лнтигеном означает наличие антител только о одной константой связывания.

Вышеописанные моноклонвпьные антитела узнавали различные внтигенныэ детерминанты но молекуле антигена. Таким образом, впервые Выла получена пара клонов гибридом, секретнруищих антитела к разным эпитопвм на молекуле кортикоЛиберииа. Конотанты связывания этих антител о кортиколиберином оказались весьма высокими, что открывало возможность создания тест — системы для определения концентрации антигена сэндвич — вариантом ИФА. Оба клона гибридом секретировали антитела подклаоса 61« '

Созданная на основе полученных внтител иммуноферментная теот — система позволяла определять кортикоЛиберии в концентрации до 30 пг/мл. Применение оэндвич-метода ИФА позволило обойтись без использования меченного

кортиколиберина, что была неизбежно во всех созданных ранее теот - системах, так как все полученные до сих пор

моноклональные антитела к кортиколиВерину уэнааали лишь одну антигенную детерминанту.

С помощь» модификации лизиновых и гиотидиновых остатков остатков молекулы антигена, а также экспериментов о блокировкой корти ко Либерии — связывающим (Залком нормальной человеческой сыворотки взаимодейотвия антигена с антителом, было установлено, что антигенная детерминанта клона 4Н9 имеет секвенационнмй характер и локализована на С—конце пептида, а клона 5ДЗ конформодионный характер.

Благодаря использованию созданной тсог — системы впервые Вьи.а показано, что человеческие Т— и В— лимфоциты, ко не макрофаги и не гранулоциты, обладают способностью секретировать кпртиколиберии в ответ на такие фпкторы клеточного стресса, как гипертермия и гипероомотичнооть среды, а также На различные митогсннме отимулы. Аналогичной спосоВнооть» обладают мышиные опленоциты и клеточная линия БР2/0, но не Р308П1. В качестве объяснения »того явлания выдвинута гипотеза, предполагающая пар алла ль ног?

Функционировании иммунной и гипотгламо — гипофизарной системы в секреции адренокортикотропного гормона: еоли гигютвлкмо г Гипофиэарная оиотема , а основном, отвечает на фмзиаЯсгичиокий отраоо, то икмунная — на клеточный.

ВЫВОДЫ. -

1. Получено два клона мышиных гибридом, продуцнруы'л-хх моноклональные антитела к кортиколиВерину чк>ша>ека1 4Н9 и 5ЦЗ.

2. Константа диосоциации мсноклональнмх антител 4Н9 о

—9

кортиколиВерином составляют 1x10 M, а антител ЗДЗ — —8

1,3x10 М. Оба клона антител принадлежат к понклаосу Q1.

3. На основе полученных маноклоивльных антител разработана диагностическая нммунофермгнтная теот - система для определения кортиколиБерина о чувствительностью 50 пг/нл,

4. Определена структура антигенных детерминант моноклональных антител на молекуле человечеокого кортикокиВерина! для антител клонх. 4Н9 ьто саквенационная детерминанта о локализацией на С-кснце пептида, для антител 5ДЗ - конформационная

детерминанта.

S. Обнаружена опоообнооть человвчоских Т— и Б- лимфоцнтсга, а также сплемоцитов мыхи секретировать кортиколиВорин в ответ на отииуляторы пролиферации и на Факторы клеточного отресоа и предложена гипотеза, объясняющая функциональную роль обнаруженного явления.

Спиоок работ, опубликованных по теме диссертации. l.V.A.Furalyov, I.V.Kravchenko. The monoclonal antibodies to human corticoliberin and their properties. Symposium "Structura & function of pequlatory polypeptides", M, 1992, Abstracts, p.19.

2.I.V.Kravchenko, V.A.Furalyov. Monoclonal antibodies directed against two different corticotrcpin-releaeing factor determinants.-Hybridoma, 1994, v.13, Ho 1, p.59-64.

Подписано в печать Л8. СД., 1994г. Формат 60X84/16 Бум. офс. М<чать офс.

Тираж /о о Заказ /-2 3 МП «ПЕТИТ» 107564, Москва, Богатырский мост. 17, корп. 5