Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунохимическое изучение кортиколиберина человека с использованием моноклональных антител

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммунохимическое изучение кортиколиберина человека с использованием моноклональных антител"

АКАДЕМИЯ НАУК РОССИИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А. Н. БАХА

На правах рукописи УДК 615.357.37.

КРАВЧЕНКО Ирина Валерьевна

ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ КОРТИКОЛИБЕРИНА ЧЕЛОВЕКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

03.00.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994

Работа выполнена по Всероссийском Научном Центре молекулярной диагностики и лечения МЗ РФ.

Научные руководители: член-корреспондент РАН, профессор Северин Е. С., доктор биологических наук Свешников П. Г.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Гусев Н. Б. кандидат биологических наук Чередникова Т. В.

Ведущая организация: Московская Государственная Академия Тонкой Химической Технологии им. М. В. Ломоносова

Защита диссертации состоится ¿¿^ку1994 г_ в 10 час. на заседании Специализированного Совета К 002. 96.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А. Н. Баха РАН (117071, г. Москва, Ленинский проспект, 33, кор. 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (117071, г. Москва, Ленинский проспект, 33, кор. 1). ,

Автореферат разослан и^о^угп ^—^"994 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета

доктор биологических наук М.И.Молчанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальности темы.

Изучение? механизмов действия нейропептидов, выделяемых гипоталамусом и регулирующих деятельность периферических яепез внутренний секреции через гипоталлмо — гиповизпрную систему, является одной из наиболее актуальных задач ссЕременной биохимии. Кортикотропин — релизинг — »актор заслуживает в этой связи особо пристального внимания, поскольку он, регулируя уровень адрвнокортикотропного гормона, оказывает определяющее влияние на секрецию глюкокортикоидов — ключевых гормонов стресса, вызьшаюцих ц^лый ряд негативных изменений в различных Функционалпных сиотемах организма, в том числе в иммунной системе, в условиях длительного стресса.

Весьма актуальной является проблема установления взаимосвязи между структурными особенностями пептидных гормонов и их функциональными характеристиками. В отношении кортикоЛиберииа имеется значительный грагресс в изучении его отруктурных характеристик, тогда как установление

Оункциональной роли выявленных структурных особенностей потаетея пока малоисследованним.

Весьма удобным инструментом для решения вышеуказанных задач являетоя использование момоклональных антител. Моноклональные антитела олаиифичнеки связываются о определенным эпнтопом на молекуле пягстида, позволяя идентифицировать этот эпитол. Сопоставление биологимаоких аффектов монокленпльных антител о их специфичностью к определенным антигенным детерминантам позволяют побиться оущэотвен и ого прогресса как в изучении механизма действия данного белка, так и в изучении «го структурно — Функциональных характеристик.

Монокгюнальныа антитела позволяют успешно решать и другу» ватную проблему, возникающую при изучении биологически активных пептидов, действующих в чрезвычайно малых концентрациях! они дают возможность создания

высокочувствительных иммуноферментных теот - систем, позволяющих точно определять концентрацию данного гормона в биологических образцах.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось! (а) — получение клона» гибридом, секретирующих моноклинальные антитела к различным эпитопам на молекуле человечеокого кортиколиберина; <В> — соозяанив высокочувствительной иммуноферментной тест - системы для определения концентрации человеческого кортиколиберинв; (в) — характеризацня антигенных детерминант полученных моноклональиых антител; (г) — исследование типов клеток, секретирующих кортиколиберин, и определение факторов, стимулирующих его секрецию, с помощью разработанной теот — системы. В соответствии с этим в план р г. йоты входило! гибридизация соматических клеток а целью получения гибридом, оптимизация условий имиуно»ермзнтного диагностирования человеческого кортиколиберина, химическая модификация аминокислотных остатков кортиколиберина, измерение

концентрации данного пептида в культуральных жидкостях первичных и перевиваемых культур в ответ на различные стимуляторы.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Были получены моноклональныа антитела к кортиколиберипу человека, определен характер антигенных детерминант и константы связывания для дьух клонов антител и показано отсутствие конкуренции меяду ними за участки связывания о антигеном. Впервые было обиарук£?но, что опоесбяоотью оекретировать кортиколиберин обладают В — и Т - лимфоциты человека, ко не макро<аги и не грпнулециты. Впервые было показано, что секреции кортиколиберина отимулируит не только активаторы пролиферации лимфоцитов, но и «акторы клеточного стресса.

Практическая ценность работы состоит в том, что впервые Была создана иммуноверментная тест — система для определения кортиколиберина на основе моноклональиых антител, позволяющая определять антиген в концентрациях до 50 пг/мл. Поскольку изменения концентрации кортиколиберина являются характерным признаком таких патологий, как синдромы Кашинга и Нельсона, болезнь Аддисона, то данная тест — система является ценным инструментом для их ранней диагностики.

Апробация работы.

Материалы диссертации были доложены на международной

конференции "Структуре и функции регуляторных пептидов" ( Москва 1992 > и на лаВораторном семинаре департамента биотехнологии ВНЦ МЯЛ МЗ России ( декабрь 1993 ).

Структура и объем работы.

Пиосертационная работа содержит оледуютие разделы! »ведение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы и список литературы, изложена на 103 отраницах машинописного текста и включает 25 рисунков и 4 таблицы. Библиография включает 131 источник, из них 3 руооких и 148 иностранных источника.

Спиоок сокращений.

CRF - кортикотропин - релизинг - «актор, PBS - заВуференный физиологический раствор, PBS-AT - PBS о 0,5Х бычьим сывс.ооточным альбумином и 0,05Х Tween-20, ИФА -иммуноферментный анализ, П — оптическая плотнооть.

СОДЕРЖАНИИ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОПЫ.

Для получения гибридом использовали мышинум миелому Sp'2/O ч клетки селезенки мышей линии Balb/c. Слияние клеток проводили полиэтилнгликолем о добавкой диметилсульфоксида I Borrebalck С. et.al., 1981 ). Полученные клоны гиОридом реклонировали дважды в полужидком агаре, - поолв чего замораживали в криоэащитиой среде, содержащей 10Х диметилоульфокоида, понижая температуру оо скоростью 1 градус в минуту. Пля получения аоцитичеоких жидкоотей мышей линии Balb/c сеноиВилизировали внутрибрюшинным введением приотана и через непели вводили по Ю^клеток гибридом внутрибришинно. Асцитичеокие жидкости Врали через Ю-lfe дней.

Иммуноглобулины из аоцитичеоких жидкоотей выделяли с помощью ионообменной хроматографии ( Брок й.,1997 >.

Все варианты иммуноферментнаго анализа проводили на 96-луночных планшетах из поливинилхлорида по описанной ранее метопике ( Волков Д.В. о соавт., 1984 >. В качеотве оуботрата для пероксидазы использовали АВТС или ортофенилендиамин. Пероксидазные кон-ывгаты моноклональных антител готовили периодатным методом < Tijmaen P., Kuratak Е., 1984 ).

Конотанты связывания моноклональных антител о кортиколиВерином определяли о помощь» иммуноферментного анализа ( Frigvet В. et al., 19S5 , Stevens F., 1987 ) используя формулы Скэтчарда.

Кортиколиверин модифицировали цитраконовым ангидридом (Fredman N., 1970 ) и диэтиллирокарВонатеи (Grillo F.B., Aronson P.S., 19В6 ).

Выделение лимфоцитов из крови здоровых доноров проводили стандартным методом о использованием градиента Фикол — гипак ( Клауо П., 1990 ). Разделяли лимфоциты на Т- и Б- клеточные Фракции о использованием найлоноиых волоксн ( СримеЛь Г.,1987).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1. Получение моноклональных антител.

Пля иммунизации было взято 7 мышей линии BalЬ/с весом 16-18 г. Для получения гибридом выла взята мышь о наибалишим титром антител в сыворотке < титр антител определялся методом ИФА ).

После удаления эритроцитов оуопензия клеток селезенки

8 7

содержала 10 клеток. Их слили о Ю клеток ииеномы Бр2/0.

После двухнедельного культивирования в селективной среден,

содержащей аминоптс-рин, гип оксанти.ч и тимидин, провопи

инмунзферментный анализ появившихся клонов и отобрали 2 клона,

даваших наибольший dtbot при наименьшем количестве клеток. Из

них отобрали по 10"* клеток и реклонировали в 0,37.—ном агаре.

50-70/1 вторичных колоний продуцировали моноклональные антитела

к кортиколиберину человека. При последующем рекламировании

выход специфических клонов составлял 1004. Асцитические

жидкости, взятые у мышей на 10—16 пень после введений клеток,

очищали о помощью центрифугирования при 1000g 10 мин. Пооле

трехкратного высаливания сульфатом аммония до 40У. насыщения и

ионообменной хроматографии на ДЭАЭ - трисакриле М получили

Фракции моноклональных антител, содержащую по данным

электрофореза в додецилсульфате натрия только иммуноглобулины

G, выход моноклональных антител составлял 2 мг из каждого мл

асцитической жидкости.

2.

Опредэление констант связывания о антигеном.

Пля определения констант связывания в комплексах антиген -антитело пользовались метопом, включающим инкубацию различных аликвот антигена о постоянным количеством антител в гомогенной фазе до установления равновесия и последующее определение концентрации свободных антител, не связавшихся в комплекс, методом ИФЛ. Согласна процедуре, использованной авторами данного метода, оптическая плотность в реакционной смеси пересчитываетея непосредственно в концентрацию свободных антител пооле установления равновесия. Однако, поскольку о сорбированным на твердой фазе антигеном связываются как свободные антитела, так и антитела, имеющие свободным лишь один сайт < второй связался о антигеном при инкубации по установления равновесия ), то рассчитанные концентрации "свободных" антител не являются истинными концентрациями свобод)<%1Х сайтов связывания. Ф.Стивено разработал метод, позволяющий преодолеть это ограничение вышеупомянутого метода и рассчитывать истинные конотанты связывания. Типичный график Скэтчарп», построенный о учетом поправки Стивэнса, приведен на риоун ке 1.

Расочитпниыэ методами Стиэенса и Фриг-вета конотанты циоооциации представлены в тьОлице 1.

ТаОл.1. Хпрактсризтики полученных монокленальных антител к ксгу-ТиколиВарину человека.

Клон

Под к лг. со

Константа диссоциации, М метод Фригвета метоп Стиьенса

4Н? 5ЦЗ

□ 1 Б1

2x10 -8

-9

3,3x10

1хЮ 1,ЗхЮ~

-9

3. Определение взаимной конкуренции антител и разработка тест-системы для измерения концентрации кортиколиберина. Для исследования взаимодействия антител о их конъюгатами проводила* конкурентный анализ < рис 2 ).

Антитела 4Н9 не конкурировали о антителами 5ПЗ,а антитела 5ЦЗ - с 4Н9, но пероксидазные кон-ыогвты антител каждого клона

в/т

1,0 •

0,5

3,3 3,8 . 4?2 4,6'В,нМ

Рис.1. Кривая связывания моАТ 4Н9 о нативным СЯЯ

по данным непрямого ИФА в координатах Скэтчарда о использованием метопа Фригвета. Концентрация моАТ 4Н9 равна О,7 мкг/мл. Р-концентрация свободного СЯР, В—концентрация связанного СЯР.

конкурировали о некон-ькгированными антителами того же оамого клона. Отсутствие конкуренции между антителами, продуцируемыми двумя кланами гибридом, показывает, что антитела направлены к двум различным антигенным детерминантам.

Высокая аффинность антител, а также отсутствие конкуренции между ними за связывание с антигеном позволили создать теот .-систему на основе иммуноферментного сэндвич аврианта ИФА. Из двух испытанных вариантов теот — системы на основе сэндвич варианта наилучшим оказалось сочетание моноклонвльных антител 4Н9 в качестве сорбента и антител клона 5Д5 для приготовления кон-ьигата. Этот вариант давал достоверное отличие сигнала от фона при концентрации кортиколиберина 50 пикограмм в миллилитре < рис.3 ).

4.Локализация антигенных детерминант моноклональных антител.

I 1 1 I I ■ ■ 1 V» ■ I ■ ■ I I I 11 I »

3 6 9 12 25 50 3 б 9 12 25 50

Концентрация немеченых антител, мкг/мл

Рио.2. Конкуренция перокяидазныч кон-кчгатоо ипЛТ ЗПЗ (А) и моЛТ 4Н9 <В> о нонпскииИи коЛТ АН? и ЗПЗ за ■ связывании о миоЕитпоямишм ксртиколиЯериком. Обозначения« в - Ш, а - ЗДЗ. ____

Концентрация кортиколиберина, пг/мл_

Рио.З. КолиСроаочиый график опредэлэния концентрации

кортикояиВвринш двухсайтнкм с»нДЕ**ч-вариантой ИФА. Ссрб»нт-моАТ 4Н9 (10 мкг/мл), кон-ызгат-моАТ 5Д5 (1 мкг/ия>.

При инкубации кортиколиберина о цитракомовым ангидридом мацмгицироэзлоя единственный яизиновый остаток Н_уа .

Антитела клона 4Н9 прпктичеоки не связываются о модифицированным па лизиновому остатку кортиколиОсри^ом ( рио 4 ), что однозначно соидатеиьотеус-т о пользу предположения о присутствии ванного остатка в антигенной детерминанте, узнаваемой антителами данного клона.

1.5-

Ä4I4

' 1.0.

0

а

Рис.4.

4Я9 5D5

влияние лиэииовой мсдификсции на оэл-зьшание CRF о антителами. Кон-ногат инкубировался Еаз CRF ( Q !, с модифицированным CRF в концентрации 5 мкг/мл С □ >, о нативнык CRF ю той—

ХС КОНЦЕНТРАЦИИ,( ¡j)

В пользу этого предположения говорят также данные о влиянии кортиколиБерин -• сзвзыванцгго В^лкз на взаимодействие внтигенп о антителами этого клона. Как видно из рис.5 нормальная человеческая сызоротка полностью попэвляет связывание о

антителами клена 4Н9.

Для Гюлее точного огф£ явления компонента человечеокой сыворотки, тормозящего связывание кортиколиберина с антителами , была проведена гель - еильтрпция сы^срот>-и не, саеаисжср 3-200 с последующим анализом отдельны»; фракций на способность ингибировать - заимсщгйствие СЯР с антителами. Такой способностью сЗладала оракция с молекулярным весом около 40 кЦ ( рис. 6 ).

Кгак Было покаччно ранее, учэсток аминокислотной •,топлг?яоватал?.иаоти 34-41 явлпется определявший для »зпимодейотвия кортиколибсрина о сывороточным белком, им?нно там и локализован Воя совокупность описанных выви

данных подтверддагат предположение о том, что лиэинопый остаток входит я осота» антигенной детерминанты моноклинальных внтитил 4Н9, следовательно, эти антитела направлены к С-концевому учлатку »молекулы кортиколибсрина.

1.5 — %4 il

1.0 —

0.5 - 0 ____ ЁЖ- л

4Н9 5D5

Рио.5. Влияние нормальной человеческой сыворотки

на овязывание антител о CRF. ' Планшеты сорбировали БСА, овэльбумином, инсулином, гсрмонсм роота ( П и, s ; ) или нати&ным корти ко Либерии ом ( д. иП ) и татем обрабатывали человеческой сывороткой ( ГЗ ), 0,25% желатином ( О • ) или PBS-AT ро всех других случаях.

Исследование антигенной детерминанты клона 5ПЗ проводилось о использованием таких модификаторов как цитраконопый ангидрид и диэтиттирокврВонат. После инкубации кортиколиберина ■ о иитраконовым ангидридом связывание антитип клона ЗПЗ заметно ухудшилось , причем отсутствие конкуренции этих антител о моноклинальными антителами 4Н9 позволяет исключить участие лизиновых остатков в связывании антител клона 5ДЗ о антигеном. При модификации яиэтилпирокарОонатом саяэнвание

450 650 850 1050 V,мл

Рио.6. Ингибирование различными фракциями

нормальной человеческой оыворотки ааязьшания антител о CRF. Обозначения! * - моАТ 5Д5, • - моАТ 4Н9. А - профиль »литии, В - процент ингиОирования связывания антител о CRF различными фракциями сыворотки.

кортиколиЗерина о ванными антителами возросло. Использование метода Скэтчарда позволило определить конотннту овязыввния антител о • модифицированным _ диэтилпирокэрбонатом

кортиколиВерином и сравнить ее о константой, полученной для нативного релизинг* - «актора. Оказалооь, что антитела 5Д5 связывают кортиколиВерин о модифицированными гиотидиновыми остатками с Польшей конотантей ( тобл 2 ).

что на

Это вполне согласуется о ранез полученными данными

13

гиотидинов, особенно His , влияет

модификация

конформпииониое соотояние белковой глоЗулы. Перечисленный выше наблюдения, а также вызываемое кортиколибарин - свяэызающим Белком блокировании в 3,5 раза связывания антитол НД5 о антигеном позволяет предположить что антигенная детерминанта

антител клона 5П5 является конформшдионной.

ТеОл. 2. Измзнвнил конотзнт связывания моноклсналиных снтитеп посла модификации кортикогиберима ди»тияпирок:арВснатом.

Клон Константа циссоци&ции, М

мэтод Фригг<-,?та мэтод Стиеснса

4Н9 1,1х10~9 2,3х10~9

-9 -9

заз 2x10 3,9x10

5. Секреция кортиколиберина клетками иммунной системы.

Разработка вышеописанного метода определения концентрации кортиколиВерина пезполила вплотную подойти к пробгтггм*; опрекзЛ!Зкия тилоз клеток, ся^ретирусцих данный пептия при риэтпных иммуиогсгичзакнх реакциях- D первую очг;рг?дь была исглецорг-ни опс.собясоть ссмсрет|'рстати хортикогиберил суммгрной Фракцией лейкоците-.» периферической крови "Г?ясв:?ка, а такяг? но^ракционирпганными спленсцигами пыхи я птгот на ксн кпнаЕ'т-лин Л и липополисахарид клеточных отснок ¿.coli oo£4i?oti»l> о дэкстрансульоатсм. Как видно из рисунка 7 оба агента визывз-.ат секрецию кертикотропин — релизинг — Фактора как лейкоцитами кроси человека, так и спленоцитами мыши.

Из сбоих клеточных суспензий легче всего отделить макрофаги и моноциты по их способности к адгезии на пластиковые чашки Петри. Удаление макрофагов из обоих клеточных суспензий никак не влияло на синтез кортиколиНеримп оставшимися клетками. Сами макроеаги и моноциты но секретировали данный релиэинг — Фактор ни в ответ на вышеупомянутые стимулы, ни в ответ на ФарСоюяый эфир! как сам по со5с?, так и совместно о кальциевым ионо^^сом А12387.

После разделения гимооцитоо и гранулоцитов как в градиенте "лимфопрепа", так и в градиенте перкола получаитоя сходные результаты! лимфоциты < как совместно с макрофагами, так и 0г*з них ) сакретиругат кортикотропин — релнзинг — «актор п ответ нп ебп вышеупомянутых стимула, тогпа как грпнулоциты нп обладают

r: w

Р. о

(¡v : i 1С cu

Ч S

о

ёъ

в и

о \ к

* ä

га Р-,

Ен

g" О

150

75

Г

Рис.7. Cc.-феии« кор т и ко n»iBepn' i а нееракционированныия

лимфоцитами человеческой кроои г» ответ иа асйатгя« рахитичных

«сктсрса.

1 - 1,5-кратнь;й растсор СКНИа, Г. - двукратный ПЖМ, 3 - 41°С, л - липоп'олиаахарид <50 мкг/ил) и нккотр;>ноу/1ь»ат <20 нкг/n/i), 5 - конканавални А <50 икг/мл), 6 - контрольная проба.

такай спаооСноатью. Иззиотно, чта »тч два отимуияторг. воздействуют h¡, разные типы компетентных клеток! конканаеалии Л при ИСПОЯЬЗОЗЬННЫХ В »копкриизнто условиях »чппятоя активатором Т-лимфоцито», тогда как >1и;гополиоахг.р«п П.со) i ooemgotho о пекотраноульфатом опаии^ичвокы »кгивируит лимфоциты.

Не 'олетдунщем »тппе иссликовоний Т— и В— лимфоциты Выли разделены о ¡.опояьаованием нейлоновой ват.|, и об? оуСХ^рзкции С!нли изследоовмы на спсссБнооть оскротироватг.. кортикалиЗерин в ответ на оба отимул». Как »идио из рио. В, фракция 7-пимфоцитоз обладала опоооЬнсотью сиакротиравпть данный рплиаииг-— Фактор только откат на кон капаш>лин А, тогда как Фракция &— лимфоцитов оекретировала его только в ответ на липополиоахарид оозмсотно о н«чотраноуяьФато>1.

Таким образом, Выло уотанозлшю что и Т-, и В-яимфоциты, но не макрофвги и не гранулоцмты, обладают опоооОноотьи овкретирзхатъ кортиксли&арии i¿ ответ не ооотыртотвующий

я! Ж

си

5> «

о Г'

ч (В О Г!

НЮ № О о нч М X СЧ!

роз

и -v,

ж с-(В с а о

100

50

Б-лимфоциты

9 10

Т-лимфоциты

Гис. £3. Секреция кс.ятмкс-::ь£г*р»а« а ^амираис-п«* м *

Ч.?ЛОПеЧ2СКИМИ ГТИМфОЦИ Г5ИГ. 73 на г'.-'

«актеров.

1,6 - двукратный ДМ£М, 2,? — лппополисамгрил г,'--гс

покстрансульоптсм (50 мкг/мтг) , 3,7 — --

А (50 мкг/мл)} 5,10 — контрольные пробы.

данкому клеточному типу стимул.

Извсстно> • ЧТО Э-ттимфоцит ы сЗладают способностью секретиршэать адренокортикотропный гормон. С другой стороны, было показано, что они несут рецепторы кортикотропин — релизичг — фактора. С учетом этих данных и полученных результатоп модно сформулировать гипотезу о наличии р иммунной система иерархической взаимосвязи гормонов, альтернативной гипоталамо — гипо$иэармсй системе. Согласно предлагаемой гипотезе адренокортикотропный гормон, вызывающий секрецию таких типичных гормонов стресса как глм-кокортикоиды, образуется не только э гипофизе а ответ на нервный стрегзс, опосредованный гипоталамусом' си может серазааатьси и г> огг»ет на "иммунологический отреоон, гызиьаемъ>:й появлением чуг/ггролнего антигена и актиэаиией клеток иммунной системы. В данном случае адрр?:-ю1'сртикотрсг:ин бупут сотретировать Г; —

лимфоциты, а регулирующим »ту секрецию атинулом Судет служить кортикотропин - релизииг — фактор. Он будзт выделяться как Т— лимфоцитами, так и Е— лимфоцитами в ответ на специ|ичаскую стимуляцию данного типа клеток, и будет оти.чулировать секрецию адренокортикотропного гормона в первом случае по паракринному механизму < за очнт тесного контакт!» T—хэлперов о В— лимфоцитами ), а во втором — по аутокринному механизму I В— лимфоцит оам секретируат кортиколибарин и сам несет рецептор к нему ).

Выдвинутая гипотеза предполагает, что иммунная сиотема моыэт олужить альтернативой гипоталамо — гипофиэ^рксй, сеиретирук кортиколибэрин а отгает на различные Стимулы клеточного отрео^а, воздействующий на клитки иммунной оиотоны. Поскольку эти клатки широко раопроотрюнаиы по лариферичиоким тканям, стимул, вызывающий локальный кпеточний стресс, благодаря предполагаемому механизму мог L-ызывать отвот в

виде общего физиологического отрсссг, что было Бы затруднительно сделать., попользуй только гипотплано — гипофизнрную систему. Таким образам, можно ожидать, что Т— и В- лимфоциты будут секретировать кортиколиберин в отьат на рвзличныа факторы клеточного стресса. В ходе работы Выло показано, что как суммарная фракция лейкоците» периферической крови человека < рис.7 > и опло-сцито» мыи.и, так и выделенные т— и В— лимэоциты человек» ( рпа.О >, но не макрофаги и . на гранулоциты, обладают опоооГкшстью оскротираоЕТь кортикстропим - релизинг - фактор ь> отппт на гипераомотичиооть окрувоэлэй среды и на гипиртврми», что напяотия хорошим поитверкаиииам предлагаемой гипотезы.

Пальнийшио исследования пэ регуляции секреции исолэдуемого пептида значительно увоВкзо проводить на клзточных линиях, поскольку они обладает Ваоконвчным потенциалсм делония и овеопвчиавют большую стандартизацию полученных реаультвтоп. Однако известна, что рвапроотр&иенная ми;?ломнвя линия Бр2/0 сырабатываот сутокринн^е: факторы роота, способствующие ее пролиферации, и »ти факторы могут олужить активаторами секроцми ксртиколиОерина. Линия Sp2/0 cü/гвдает высокой ¿зальной активностью продукции кортикотрспин - релизинг -Фактора, тогда как макрофвгпльнвя лини г. РЗВ9 Ц1 лиюгнь

опоообнооти секретировать этот пептид как спонтанно, так и в ответ на различные отимулы. Эти наблюдения служат дополнительным подтверждением приведенных выше данных, полученных на овежевыделенных лимфоцитах и спленоцитах.

Э результате проведенных исследований были получены клоны гибридом, оекратиругещие моноклональные антитела к

кортиколиВерину человека. Они прошли несколько реклонирований о полужидком агара, обзопечивамщих монокланзльнооть полученных колоний, причем выход специфичных колоний на последних этапах рекламирования соотввлял 100%. Подтверждением нон о клон а ль н ости секретируемых гибридомами антител являетоя их' способность реагировать только о кортиколиберином в иммуноФерментном анализе. В пользу предположения об их моноклональности говорит также тот факт, что в выделенном препарата антител определяется о помощь» специфических антисывороток лишь один подкласо иммуноглобулинов. Наконец, еще одним доказательством моноклонельнооти полученных антител являетоя линейность графиков Скэтчарда, поотрсеных для определения конотант связывания антител о чэловечеоким кортикоЛибериисмI отсутствия перегибов на »тих графиках связывания антитала о лнтигеном означает наличие антител только о одной константой связывания.

Вышеописанные моноклонвпьные антитела узнавали различные внтигенныэ детерминанты но молекуле антигена. Таким образом, впервые Выла получена пара клонов гибридом, секретнруищих антитела к разным эпитопвм на молекуле кортикоЛиберииа. Конотанты связывания этих антител о кортиколиберином оказались весьма высокими, что открывало возможность создания тест — системы для определения концентрации антигена сэндвич — вариантом ИФА. Оба клона гибридом секретировали антитела подклаоса 61« '

Созданная на основе полученных внтител иммуноферментная теот — система позволяла определять кортикоЛиберии в концентрации до 30 пг/мл. Применение оэндвич-метода ИФА позволило обойтись без использования меченного

кортиколиберина, что была неизбежно во всех созданных ранее теот - системах, так как все полученные до сих пор

моноклональные антитела к кортиколиВерину уэнааали лишь одну антигенную детерминанту.

С помощь» модификации лизиновых и гиотидиновых остатков остатков молекулы антигена, а также экспериментов о блокировкой корти ко Либерии — связывающим (Залком нормальной человеческой сыворотки взаимодейотвия антигена с антителом, было установлено, что антигенная детерминанта клона 4Н9 имеет секвенационнмй характер и локализована на С—конце пептида, а клона 5ДЗ конформодионный характер.

Благодаря использованию созданной тсог — системы впервые Вьи.а показано, что человеческие Т— и В— лимфоциты, ко не макрофаги и не гранулоциты, обладают способностью секретировать кпртиколиберии в ответ на такие фпкторы клеточного стресса, как гипертермия и гипероомотичнооть среды, а также На различные митогсннме отимулы. Аналогичной спосоВнооть» обладают мышиные опленоциты и клеточная линия БР2/0, но не Р308П1. В качестве объяснения »того явлания выдвинута гипотеза, предполагающая пар алла ль ног?

Функционировании иммунной и гипотгламо — гипофизарной системы в секреции адренокортикотропного гормона: еоли гигютвлкмо г Гипофиэарная оиотема , а основном, отвечает на фмзиаЯсгичиокий отраоо, то икмунная — на клеточный.

ВЫВОДЫ. -

1. Получено два клона мышиных гибридом, продуцнруы'л-хх моноклональные антитела к кортиколиВерину чк>ша>ека1 4Н9 и 5ЦЗ.

2. Константа диосоциации мсноклональнмх антител 4Н9 о

—9

кортиколиВерином составляют 1x10 M, а антител ЗДЗ — —8

1,3x10 М. Оба клона антител принадлежат к понклаосу Q1.

3. На основе полученных маноклоивльных антител разработана диагностическая нммунофермгнтная теот - система для определения кортиколиБерина о чувствительностью 50 пг/нл,

4. Определена структура антигенных детерминант моноклональных антител на молекуле человечеокого кортикокиВерина! для антител клонх. 4Н9 ьто саквенационная детерминанта о локализацией на С-кснце пептида, для антител 5ДЗ - конформационная

детерминанта.

S. Обнаружена опоообнооть человвчоских Т— и Б- лимфоцнтсга, а также сплемоцитов мыхи секретировать кортиколиВорин в ответ на отииуляторы пролиферации и на Факторы клеточного отресоа и предложена гипотеза, объясняющая функциональную роль обнаруженного явления.

Спиоок работ, опубликованных по теме диссертации. l.V.A.Furalyov, I.V.Kravchenko. The monoclonal antibodies to human corticoliberin and their properties. Symposium "Structura & function of pequlatory polypeptides", M, 1992, Abstracts, p.19.

2.I.V.Kravchenko, V.A.Furalyov. Monoclonal antibodies directed against two different corticotrcpin-releaeing factor determinants.-Hybridoma, 1994, v.13, Ho 1, p.59-64.

Подписано в печать Л8. СД., 1994г. Формат 60X84/16 Бум. офс. М<чать офс.

Тираж /о о Заказ /-2 3 МП «ПЕТИТ» 107564, Москва, Богатырский мост. 17, корп. 5