Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПОЛУЧЕНИЕ, ОЦЕНКА КАЧЕСТВА, КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ГЛУБОКОЕ ЗАМОРАЖИВАНИЕ ЭМБРИОНОВ КРОЛИКОВ И КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "ПОЛУЧЕНИЕ, ОЦЕНКА КАЧЕСТВА, КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ГЛУБОКОЕ ЗАМОРАЖИВАНИЕ ЭМБРИОНОВ КРОЛИКОВ И КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА"

ft-230S¥

вгшжятИ ордена тигдавого красного эйамвш

НАГШО^ОТВДа1ТЕДЬСМ10 ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА (НИ)

В* spun рукопжс*

■к

W fiie.646.02

I, (№К1 КАЧЕСТВА, кшлишкодяа К ГХГБОЯСЖ ЭАИОРАДШАНД ЭМБРИОНОВ КРОЛИКОВ К КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Сащшыьнооть 03.00.13 - Inauoiw шоиа ■ квьотша (•»■ологтя сшвяахмяйесминых. жжвотяых) -

ilt«pi|lftT

voeipiiqn n оожсхашя* п«м1 от«п«п бвологгоожах ялзл

О

П. ДуврОИМЦМ, Московской обл., 1968 р.

-V Работа выполнена во Всесоюзном.ордена Трудового Красного ■ ' Знамени научно-исследовательском институте животноводства с

1979 по 1966 год. . ; ^ '. ". ' "- ' .

Научные руководителя - доктор биологически наук, професоор

•• г' • . . . н.и.ситаЕв,

* ' доктор йиологическнх ваук И.Я.ШИХОВ.

Официальные оипонентн! -докторСвологшческжх наук А.Д.БУГРОВ, ; ../ .'кандидат ыедидансккх наук \

Ведущее учреждение: Пуаяин-Лвнинград (ВНИИРЛ) ВсесоюаюД: идучно-нсследоватальскнЯ институт разведенжя^генетжки свльскохо-эяйствешшх животных.' '■Ь.'.й

- - ^Зашита диссертация состоятся

-Ч в час.

гтоя " т

г.

на заседании спешилкзирогавного Совета Д.020.16.02 по ^ ааште Чдиссерташш на соискаахе ученой степей;доктора наук у при Всесоюзном ордена Трудового Красного Знамен» научяо-иослвдова т ель ском институте животноводства. г^.':;^"'■'■'^---Г' "■' ■■'■■

' ^ г Адрес- янстатута:■142012, - Московской области , Подольский р-и, г. • .'•"• \ ••• вое. Дубромцм.

С диссертацией можно ознакомиться ж бжйхжотеке института. Автореферат разослан . г.~

- ; Ученый секретарь \ специализированного совета: каядидат биологических.наук

И.И.НШПШ-

• - ' • - ' V ;V - ' • ч

-- ^"Ъ— : ' . -А .. '

■'г-:.-':'::!« ОВЦАЯ ХЛРАКГЕШСШКА РАБОТЫ !;

; т;Основщ*мивапрам винями экономического; я социального развития СССР на 1986 и 1990 гг. н на период до.2000 гола, предусыот~ рано ^ об а спечжть; дальнейший рост проиэводствапродуквдшживотно-г водства и*довести среднегодовое производство 'молока в Ш пятилетке до 106-110 млн. ТОНН. V. ; - ■..-^Ч ;' .и радионадьный подход- к пройд шлам интенсификации животно вод ст:*" ьа в настоящее вреш.:^ невозможен •без использования всех резервов производства. В молочном ^скотоводстве 'среди факторов* влияющих"на е^фективность отрасли большое значение имеет воспроизводство'высокопродуктивного скота х его сохранность. Одкии из;прогрессивных методов управления воспроизводством племенного скота яаляется ^ трансплантация »мбраонов;- . •.. . ч. - - ."..' - .'■■

Актуальность теин." Натод трансплантации эмбрионов повсеместно вошел в свлекпвовно-генетическув практику -работы о выдающими-", ся животными в странах о развитый молочным скотоводством. Генетики считает, что получаяот одной коровы-донора 3 теленка в год . достигается;ускорение ежегодного племенного прогресса в направлении иать-сш до 5^, в ваправаешш мшь-дочь до 10£. При получении 10 телят-трансплеитатов на-доноре ати показатели возрастают.соответственно на 9 и 18*. С точки зрения племенного скотоводства ■■:. возшжности трансплантата позволяв?, при наличии.вибрионов от~г чистопородных мятных коров, «а один год'превратить" имеющееся , -стадо в та стопо родное материнское стадо воров.- - -;

" Одним иа главных; факторов перевода метода трансплантации на практжческу|) основу, являвтся разработка методов глубокого замораживания аародшей, который позволяет осуществлять транспорта- . роьку зародышей на дальние расстояния и веоти первсадкув залла-

~ ; . • " - ..,. .

, К***;мыма. : •' • •

1 \ г '1 ■ • Л»». й Ы'Фда >т««1 ■ вилва

сель к.ч, г": Де:-**»

нлрованкых стадах. " '.'.:.; .'V' ' : ' . *. ' .

■ Большую актуе^ностьипрактичбскуювЕачнмоеть имеют1 вопросы оценки жизнеспособности зародышвй,таж как"от ах качества в ос- " новном зависит успех пересадка. Поэтому» в проблеме транспланта-: цяи придается исключительно е - значени е научению врышвляемостж : ' : эмбрионов в зависимости от ах качества и стадии развитая. ' .•, - ' К" . -1 Цель и задачи исследований.": Основная:цель исследований зак- :

■ лючается в усовершенствовании методов оценки качества эмбрионов,; \ юс кратковременного араменля.заиоражкьакЕЯ и оттаивания., а также

в изучении ьлтякия условий хранения на их пркхнвляёиость прнае- у',-хирургической пересадке. V, ■■ :

\ В' задачи исследований входило; • •••*•;. \ ... ; • • : -С' - разработать т^нологив гормонального выэываяия суперовуляции, измеченая, оценки качества, культивирования и замораживания . вибрионов кроликов;' * 'У.;-- '.. 'ц ■ ■■.

':■•■'-■ - на основе анализа собственных исследований и известных литературных данных определять тесты морфологической оценки жкэне-способноот зародышей* обеспечивающие максимальный.процент сталь- . кости от пересадки культивированных и заморожевно-оттаякных эмб-- ряоков крупного рогатого скота; • • .. , \ . • ' : - определить влияние ва жизнеспособность эмбрионов разных.

■ концентраций криопротектора,< контейнеров для размещения эмбрионов . ири. замораживании. '.; ■ > ■• '.Г..;■■■-:.■;- . Ч.". г .;. ■•о'.Х

■ V Поставленные задача решались оугем предварительных опытов на лабор&торшлсживоткыг (кролики)и даитштос экспериментах на ко-'

'■■ ровах а телках черно-пестрой.породы. .' . • \ " . ' • ... • *- г

. ; . Научная новизна. Усовершенствованысуществующее* разработа- ^ , нн вовне способы гормонального вшивания суперовуляции и взвлече- -

г'ч I -

I *••

нжя вибрионов у кроликов. Предложены новые иетодическиа в тахта- ■ . Л ческм решения в процесс кудьгжваровашя, замораживания в оттаивания вийрионов. ОБрвдвлем овтит^ше рмшш охлелшвщм в ото- " -Г'-.", грева эмбрионов, концентрация хриопротектора, насыщения- им эмб- , '

Г. ' рновов верея замораживанием и удаления его после оттаивания пе-■ . v ред культивированием или пересадкой, Выявлен« наиболее подхода' щи* среди и энергетические добавки при-культивировании и замора-' V жжванки. Изучено влияние некоторых факторов на приживляемость. ' - ^ V ; * аамороженно-оттаякных вибрионов после нехирургической пересадки.' .: "■■'■о Практическая ^ндчимодт^ работы заключается в том, что предлагаемые методы повышения эффективности гормонального вызывания^ J суперовуляции у кроликов дают возможность индуцировать, суперову-- дяцию у 64,8Jf кроликов, получать эмбрионы у 93,2? животных при , V , % яасие овуляций от 9 до 60 ж выходе нормальных'эмбрионов в сред-s -' ■ v new 14,5 на донора. Материалы могут выть использованы в научных " ' •••. исследованиях по биотехнология, а такие в практической трансплан- Ч. * . тации по увеличению числа в улучшению продуктивных качеств кро-

: ' Разработанная технология кратковременного хранения, замора» '.' 'кивания я оттаивания »мбрнонов создает предпосылки для широкого ' V: внедрения метода трансплантация» практику^; разведения высокопро- ' ' дуктавных хивотша.^^ л,; —-.у Л." „; Г

; ■ ! Реализация' результатов исследования, Предложения исподьэу-

втся в научных исследованиях института' в .в практике работы цент-' ров к пунктов по трансплантата эмбрионов крупного рогатого скота. '■ Они включены в инструкшш по трансплантации эмбрионов крупного

■рогатого скота (1987) в методические рекомендации по крноконсер- - * -вироьанаю вмбрионов крупного рогатого скота,- овец .икроликов '

Адробашя "работа,.- Результаты исследований докладывались на :: . ежегоднкхнаутаа - конференциях центра по трансплантации ембржо-- -• "нов сйльскоюэяйствэнных животных, Ученых Советах ВИХа. яа koh-V-" ферекпии молодых ученых Blia (1979), на 6-м Всесоюзном Совещании эмбриологов (Москва,'1981), на симпозиуме но трансплантат гый-' ржонов .крупного рогатого скота (Тарту» 1986). ... v .:. ii'ivVi

! ■■ - .. .• рбъем работы. Диссертация изложена на 'ill' страницах маяино-" : писного текста»' иллюстрирована 21 теОлкцаш ж II рисунками. Сое-' тоит из: введения,обзора литературы,.материала и методики, р»- . эультатов собственных исследований, выводов »^практических пред- " ■..' локекий. Список использованной литературы включает 126 источников, в том числе 90 иностранта.:-,; v.. . ••• " • > ^ . ••.'

л : •"-•.2. штниш ИЫЕГШККА кссхиоваюш.С;. , "¿1-

v - Исследования по' получению, оценки качества, культивированию ;. ; - ж глубокому замораживанию эыбрионовкроликов в'крупного. рогатого .;

■ скота были проведении лаборатории : тахндгкя; трансплантации и крио-; ■ консервирования: вибрионов сельскохозяйственных * животных ВИХа в<. *. -V период;о 1979 по X966 год. Эмбрионы получали от суперовулировав- ;v шхх - самок кроликов и крупного рогатого скота. ; -'^-'v'

Рога натки-кроликов промывали хирургическим, методом с . . - пользованием фосфатно-солевого раствора Дюлъбекхо (4БС). , ••••;. iV'r.:-Vi 'г'».. Свеиеполучевные.зародыша подвергалиморфологической оценке -с учотом стадии развитияГи качества под световым'инвертированию* микроскопом Ш1-ХЗ; при IOO-кратном увеличении л ifiwr

Все эмбрионы кроликов и часть крупного рогатого скота-после ; морфологической оценки ставили на'культивирование (до 48. часов) fc" палью изучения,влияния питательных- сред' и различных биологических^ / ■:добавок на их жизнеспособность. ' .• ' ' ; : -

' 7 - ' ■ :

Схема исследований

'".■■■;-'.'■. " . Объем исследований

Изучаемые вопросы : --—

' : кроли- : крупного рога— — — __— ___ _ _ £рв _ _ï_ того_скота__.

Гормональное вызывай» сулеровулядаи .

j кроликов (годов) 159 -

Морфологическая оценка качества эыбрн- »

онов к определение щустадия! развития 1496 955

Изучение влияния сред я различных добавок нажиз неспособность эмбрионов

ври куль нитровании 530 124

Замораживание вибрионов с использова-* нхем различных криопротекторов к

контейнеров 403 ; 289

Оттаивание, оценка качества к пересадка ааиорожешю-оттаянши вибрионов 403 289

- Заморажжвакже вибрионов проводили на программном заморадива-теле ЗП 00.00,00 * "УОТ-1" Харьковского опытного производства ж. английском заморажжватаде "Планер",-Б качестве крнояротекторов. использовал* ДИЗО (диметилсульфохсид) я глицерин в различных кон-■ ценграциях с применением сахарозы. Для усовершенствования техники аамораживания испытывали различные контейнеры (стеклянные пробвр-- ки» пластиковые коротки» трубочки в паетта). Использовали медленный а ускоренный режим охлаждения. Г Полученные данные подвергали статистической обработке на « » микрокалькуляторе "Электроника БЭ-21".

3. ГСЭТЬТАХЫ ВССШЮНАНИЙ

3.1. Гормональное вызывание суперовуляции у кроликов

Из общего чвола159 крольчих суп а ровудяп» ей реагировало 103 нля 64,0$ про среднем числе овуляций16,1±0,92(от/л5мй?а| 4 до 60 \ / н коэффициенте изменчивости 58,,

Отмечена IOOS оплодотворяемость кролжков с суперовуляцией, а также жх яйцеклеток (95,¿t). Низкий процент дегеверированвш эмбрионов я высокая степень оплодотворяемостж яйцеклеток свидетельствует о тем,.что гонадотрошш СЖК, обеспечивая высокую ре- ; ашшо яичников, вероятно! не влияет в значительной степени жа -гормональный статус. :■ :

.Прослеживается наличие инднвидуальной'чувствительностж1,кро-: : • ликов на гонадотрошгя,-что характеризуется относительно высоким ■■,;

коэффицаентомяэменчивости (58,6?) ж лимитом в среднем.чясле - овуляций на положительного донора? Чдсло дегенёрированных эибржо-нов било небольшое ж составило всего 2% от общего числа получен-^ . вых зародшей, Одлодотворяемость яйцеклеток сравнительно была . высокой с минимальным числом неоолодотворенных яйцеклеток-(4,7 . - на донора). Коэффициент" изменчивости-по этим показателямбы* вы-' соким ж составил 75,0 и 73,9i соответственно (табл. I). :• , -

Число овуляций ж зародышей у самок кроликов .

■ V" ■- * 1 ■■»■■■ • ' Показатель s U + т : •Процент: : • • • : Коэффициент ■* изменчивости -

Число : овуляций на докора . 16,1+0,92 \'7У."~: 1 - 58,6 •-.- - .

зародышей • • - - 14,5+0,10 • 90,0 . 71,4-

В Т.Ч. нормальных - 13,5+0,84 . 93,1 52.9,

дегенерированию; 0,29+0,07 2,0 . 75,0 . ; ' ■

. неоплолотворенныс;; яйцеклеток- : 0;б8+0,08 "4,7 73,9 ,

Установлена некоторая зависимость уровня суперовуляциж ж качества эмбрионов от типа и серия гонедотроплва СЭК: L Так,'очищенный./ отечественный препарат*пронзюдства'ВсемюзнЬгЬ'научно-иеслвдо--;^ ват ель с кого и технологического института йдологической прошаиен-

Г :. '■■ V -

иости СВШИ1ИШ)'по члс^ кявотща, р№1ру1щ»с суперонудяциеа, не уступал сташюртноцг ^пада^ числу

овухяцма аа донора преьосходвл его (13,0 против 10,6овуляцвй).

■■ Нативный ^препарат СХКв тон числе и^нативный сухой преда-; рат Покровского бвокоыбината по числу реагнрупцих'кивотных су-перо вуляцней также по своецу действию не уступали стандартному -препарату.СХК:-.фмйягон (табл. 2),/■• ■■ • - J

':v " : * *y.; •• '^У',..- Таблица 2 -

; Реакция яичников кроликов в зависимости о'т серии •

■г ш тяоа гонадотрошша CIK." S--.*"* • - г

'-.,.• • : ' : Число : Реагировало [ 4j!cjl¿

' Серия говадотроаина • ■ - : кроли- 1 5y5S?eB7JU,~ : овуляций -

. " ков . г- - —' на донора ^

- - _ _ _ J'___ _ -í ♦ п.%

етет ^^^ ' Эг Л 6 ~л66,6 10»8+1,4

ОХ производства ВДШИШ ' 15 . 10 I3,8¿I,3

Наивный препарат CIK ©ера»:

;. ^ -Тагара* - ^ 65 ' 43 66,6 15,7+3,0. ^ -."Тали*' /^зо;' -; 17 " 56,6 . 22,6*3,1

."V^'r." - 26 ^ ; 16 v; 6i,5 15.0*2,о -

Серея З-Покровского биокомби- JV/ '

вата . v. : - . : 14 ' 8 \67,I ? 15,0|+3,2 •

>Число реагирующих животных в етих грутшах колебалось от 66,6 !'до66 .ejC5 при'оредием числе овуляций на донора от 15 до 22,

гормонального

вызывания суперовуляци кроликов, о равной'доле! успеха можно жспользовать;как стандартиые, та* и иативлые'препараты ОК.

¿'< По'числу, зародышей наилучшие результаты Омяв получены в группах хивотныс, обработаняых натившш препаратом СХК и составило' 92j¡ от 'шсла~ овуляций ;: При s том''выделялась группа животных обработанных вативным препаратом СХК серии ."Типш"' (табл;

■ >:: '-г. i ■ ■;' -v-.«"••' •. '. • '•--•.• Таблица 3 ,■;'-.■

Число в качество зарошшей у к рол им вв зависимости ' .

" от сери гояадотропина > • .--ух..-«.;:/ •' ■

■'.-с-. ••■•""'~" ~~•""~~ "*^л*"~~~

;.■ ' - « Число : цент ; v .. J -ftrtU :неошо-

Серия CXK : зародышей :от чис-: ' ',,nru(in. J Sam" :дотво-' . '.'"С:: х - - : на донора:ла ову-s нормаль- : Е?Р?Г^:ренных -

_ „ _ _ ¿__; _ i j. - _ _ i -TZr- jAaeios .

.. • Фоллигон ; 9,5±2,0" 87,9 9¿+I,3l ,. - -0,16

.f., . СХК(ВНЮШШ).11,0+1,5 • • °'10 -

.. Нативный препарат - , .-/r-.^-'■■"V-:

- серии:... 'v/>■■'■"■"' ■ -■■■■■■ -'.

' . "Гагара" 14,5+1,4 .92,9* , I4,4¿I;4 0,02 . Ó ill . ,

- "Типа" : '21,0+3,3 - - 92,9 19,9+3,5 - 0,29. 2,8 -у -

S V- 19/45 - 13,9+1.8 : 92,6 .13,3+1,6 " - 0,56 / ..

"" Серая Э-Покров- - -- :■ --V'-v-^-

; ' .. СКОГО биокомби-:/: ; ¿--^ V ÍÍ;?. ^^ - ■.

; ната • - 7,1д1,5 ; 47,3 6,6+1,4 . 0,5..д, -

' ~ Коэф^щиент изменчивости в числе овуляций составил 32,7; <-; -

30,3; 54,3; 57,2; 54,3 ж 60'соответственно'и он,был более чем^',.' в 1,5 раза выше,в груслах.животных,' обреи^отаяша.нативнын препа> . 'ратом СЕК, особенно серией З-Оокровского бюкомбината (60í). ;> '

■: ' Результаты извлечения эмбрионов оказались ниже в групп* • .: • , крольчих,' обработанных стандартным гонажотропнном (87,9Í). Пок- ;" ровсгаьй концентрированные сухой препарат серк» 3 оказывал нега- -ч О ~ тивное влияние на выход зародышей. При.хирурпче<жом извлечении

было получено только 47,32 зародышей от числа овуляций. Уставов- • лено,'что^гонадотропин С1К разных серий не оказывал столь значи-V тельного" влияния на качество зародышей в оолодотворяемость яйце- ,

■ ; клеток у животных с суперовуляцаей. \ . :: . . •-. ' ; ; ; -^По числу нормальных' эмбрионов различия между 'пуппами жевот-

.'• ' ных были незначительными. Исключение составила группа крольчих'. .

■ -л/ ^ •„. .. 1 -.'и у^г-• .

■. -^.ч-.^ - -

с обработанных СХК'серия 3-Покровского биокомбината (6,6 нормальных:" Л :

■ * ^ V ■ : : ■.-/.^..^.-■о> ■■■.■ .■■.

.вибрионов на донора)..Заметно наделялась груша крольчих, обра-/ . V. -

° .V ' •*•1 : » Т. - V"-1'«- ■> V'. V-':

: боталных гонадотрошшом.СЖК сериж "Т»шГ,уо* которых было полут^ • ?^.^;чеао"всраднви поДЭИЭ нормальных вибрионов"на самку при - относи- - ^ "-/■* У" 'Г*: '. тельно. низком числе дегевервровашшх'вмбрионовЧО ,29 и неоплодот- '

V**Ь : -?^г?V:^V:.V''

>••'•=.'• СЧ . ■ :У * 'Ч - -ГЛ ■

ч ■ -„ус -т-^-.- ■ ,■■ ■■■:: ••*.•«».•• -

,N3.2. Мор$ологическая; оценка качества вибрионов кроликов/Г /

ч'1:'-- * крупного рогатого скота .•< • * • ■'ч; . V1

;; '• г':.и ■ ' ■■ *

. ч „ '■ '; Результаты морфологической оценки качества свежепаду ченша'ч- -'»' V Ч1* '■' ''■ • -'-V •*••:••• .•••••' • - .-.гУ п -у'='' А -¿г.:

> ' ¡вмбрионов у самок кроликов показали, что из общего числа 1496 хю~ -

Л)^ улученных.зародышей 1381 были нормальными(92.3^)^и только 152 за- '

¿ » родыша (7,7*) были веоолодотвореншши и' дегенерированннци,' Из. ч: •: вбсего числа' 956' сввхеполтче&ных выбшпонов коуоного Богатого' ско- ^ . -

. ч >422,5?) и неою1одотворенных яйдеклвток -164; (17.1?) ; , - ' - V.- Выявлено,' что амбрионов отличного качества на разных стадиях

, ' ■■■ -' . - I,. ^.ч т-' » . _ .^ - ч. . _ г- ^ _ % ' 1 ■., - - .• ■. - - \

' к . _ _ _ . . _ _.. А ~ А II ■■■ I II ..Л .4 ..л мт Л . ■ НА А ' -9Ф Л. . " ^ ^ 1 ^ ' .

•• лгшвается ва*. стадии: ранней и поздней. Оластоцисты от12до ч \ . . • Более-поздние'■ота^Ы хараатешзуптся^наяк^ш большого-числа'"

,• ;.. У- ;; . 'У;' •• '. -. •• - т-.\ ". ^ " .• -.

-.-л хороаоа.■ удовлетворительных и дегенержрованннх ембрионов. ' Ддя -

> Дополнитальным теотом оценки качества эмбрионов является ме-; ^. - -

« А ш

••. Ч : •'• • 1

: ■ ■■ ;'.. '■' .'Г- 'л,Таблица;;

Качество к стадия развития вибрионов крупного рогатого * ■ / . г.'

' : •: • • ' скота (а - *> 1 т'-'.г;>■ "■

- - • • : - - •*■•" "»Стадия развития ' -у-:-"^-

. -Качество вибрионов'„к ; ■ жютлн "бластоиистм

. ' • ранние : поздние :.ранние : поздние

; Исследовано эмбрионов : 42 .: 388. ; 337 .-V 25

Отличные 1-2.4', 16-4,1 - . 43-12,7 -13-62,0

Хорошие: ; -2-4,8 127-32,7 154-45,6. 7-28,0

' "Удовлетворительные 10-23,8 : 153-39;4 49-14,5 . ,2-8,0 г ;.

Дегенерированкы« : ; »29-69,0 92-23,7' " 91-27,0 I'' 3-12,0

применяемой концентрации,(1:300000) в' течение до 20 минут не .оказывали негативное влияние на качество эмбрионов кроликов оря

. последующем культивировании в течеш»е24 часов без удаления жра-

7 сителя.;; V-

Влияние УСмэблучения и продрлжат<ш>ности инкубации'.

на жизнеспособность эмбрионов кроликов • ' .. \

,> Число"'

- Группа 4 " • эмбри-•

'■\-> • • •:онов .'"

Продолжатель-': Морфологическая

ность воздай- :■ оценка ' ■ ,г

■- , <;твия - :■■■ _ .:послв ок_:

Уй : эв - ;. мхива- : рашивания (сек) *- (ш) * » культ»-

\.сек; : ^мин; : ния варивания :

МоП++ 4 ' ..р БлП++ МсЛ-м- "' .С БЛП++

- . " Контрольная ' .' ' 3 . '. О I

Опытные: .¿чг^-^^ 10 . ; 5 '■ 1

' ' .. '' '2 - >*-* . 3* .10^ /10 1

хо".--го иоп-н-... -.ш-»-' .; _

Примечание; поздняя морула отличного качества: : _/ . ч- . ^

-- л.. ""Л ■ --- ' '- ^^т г т^_л Г". ■ — м1.——____- : ^ ; -

: ЕаХ+, ЕШ+ч- - раявяя и поздняя Сластоциста хорошего

>3.; и отличного-качества.'

■; т.::*-,;-

■ ^ V; / : ; г 13:--Г .. ■ у.у

■■■■-.* ¿у:. Оценка качества эмбраонов методом --г-.уУг:У " '

^'■■'УУУ"' ■ *«А'. *- ■ - --КуЛЬГИВИрОваШМ.''-УУУУ ... ■

¿?етод ^льтлшрова^шя эмбраонов'явшется одннм иэ основныхУ* V ; • ч дополнительных;"методов к морфолопгческой оценке-качества с но- ••'• лУУ пользованием различных питательных сред ж биологических добавок» -У},- '.Случается, что от момента получения эмбриовов до пересалки вх

реципявктам али глубокого ваморахжьакия манипуляции у с эмбрионами *У У' УУУ,- занимают от 3-х'до 5 часов» Для поддержания жизнеспособности емб-;

. . рионов в течение этого" времени необходимо создавать оптимальные .••.-. . условия» которые бы обеспечивали их жизнеспособность. Цетод куль- .. г. тивярования позволяет дополнит» ^гироскопический метод оценки .'-■У7'■-■'..< жизнеспособности как свехвх, так-я эашрокекногбттаялшх шЗряо-У * У:ЧУ ' вов по морфологическом показателям. Наде бцло прокультивировано уУ.У'г* ■■■/462 свежеполученных наразных маДОП^ развитая и бв эаморожвнво-

оттаяшшх'ембрнона кроликов'. : ■ / .';"■* ¿■.•V'.!"';./ 'А'-1-^' V1;:'1У. ' • я Иа"462 эмбрионов 366 (79»23) продолжат свое развитие, 96^ •• .

' (20,8$) остались интактшши. Одинаково успешно развивались каж^ ; , " -ранние, так я поздние иорулы (табл^'б).' ^л'/У.У'А*-УУУ -■-'-у.;' ~У ~ ■".,.'■..';■. . Из'таблицы 6 видно, что 2-4 клеточные зародыша (17 жз 150) .'^

;;-.У доели'незначительней процент развития до стадии ранней в поздней "У" "морулм при высоком'таследегенбрвровавннх' зародышей (3250 »"Лучше У .".Л- У'У' 'УУ.:-; развивалась' эмбрионы на" стадииклеток, которые/достигли ста-У-' ■' • да ранней морулы 41 ,7£'в поздней - 26,в£,- стала'равней бласт^» •: .■-" ;7УУ; аисты 10,32» Хорошие результаты развития отмеченн'при продолжи- .■'•'/,

"'. тасьностн культивирования до 48 часов. С увеличением времени <•" • • • -С-Ку.. куд гавирр вания, повышается' проце ат дегеяергровавных "эмбрионов,' : который составил по 10-12 клеточным зародышам 1в,8? * до 16-кд»-^ ■'

- ;■•>йВыяьсеноПчто'процёсс.'куль'тивирования зародшей кролика про- :

: ■ Конечная стадия я ■ Начальная стаджя развития (клеток) Г

'«. — — — — — — — — — —г— — — —-а. —

, : культивированные в среде СБС + 20% фетальнойсыворотгаг крови те- ,. _ V-. • .'ленка в течение 24-26 чаоов практически все продвинулись в сто«* ' „% * * ^ развиты, Однако «з-эа нвдостаточного числа вибрионов взятых, на .'„•'

--'Ч г " '*удьтиварс>ваыие сдел&ть окончателЪтЛ вывод ой еЙвктиваост* етоЙ . .~

... •• . • .'••,.>• •••••.-• = » - ' •ч..?. •

' . ■ ;добавки на представилось,возможнын.В делом хе культишровалже в „у.

^ "; 1-1сподьауе»шх нами средах о разными добавками обеспечивало высокую * V*

¿> •• - ижэнеспособиосл. амбриоао» о» 77,5 до 100*. Для ^культивирования

~; * ? »аморожеын^ттаяяниг амбриояов лучз* «спольаовать фетальную «н лй"- "

' ;Таблица 7'

Развитие зародыш«а кроликов в зависимости от состав« - * •- - -' среды > вида сыворотки. •'•''•'•'

^Продолжи- t т] do культи— * Раэвитиеааро-: тедьность ; fflnteft , -

Питательная среда î : вировано

" • - . "'Т*..-: : кудьтнва- : :

V. : • рования . : эародию"-, •

' ФБС ♦ ZOf 'сыворотки '■ ' ч '.. . v^i & '

- крови оваа (СКО) .-/'.чу- 24-48 , : г 128 , - 107 83,5 - •

' . ш; ♦ 30Î сыворотки- - - - '

, крови кролика (СКК) ' 148 • ::;• 128 . 86,4 ч.:- v

199 ♦ 30* СКК •. ' • ••'.•'•* V .•'• 103 ,'•..'•'• 90 \ ' 87,3 • . "

199 + EGA • • . •' : " - 58 ','.45 77,5" • \

. " фбс 3ojc.4ckt ..... ,24-26,v Л12 ioo.o /V,.

Среда ÇI - 335 Л'1'- '.24-26 / 13. •.-'•' II .84,6 v4 ч -

^ "развитие эмбрионов крупного рогатого скота снизилось до 56,5Î по < сравнение с использованием для атой целиЗО^сыворотк* крови теленка ■ среды Д4-335при которых эмбрионы развивались да 87,1% ■ и 75? соответственно. При этом было получено 45.7Î стелыюстей " . (16 из ч35} от пере<идаи культивированныг на ,разных стадиях рае- 'J ' • витняэмбрноков крупного рогатого скота, . : J .'-■■

- .3.4. Криоконсервяровшхе эмбрионов кроликов ж крупного/

1 рогатого скота ' Ч:Лг";ч ч чч'-fr.ч-; ^:;ч

...Чч. Исследования показали, что более низкие температуры (+4®С • или 0°С).д0ль&е сохраняют жизнеспособность эмбриовов.Условжя ^ глубокого замораживания в жидкой азота прж -196°С требуют приме- • - ' некиякриозапщтннгвеществ, обладающих"евойотвок проникновения в Д-г клетки. При сравнит&льной оценке вшшваемости вибрионов кроетков ; ч ж крутого рогатого скота использовали 2 ражюса замораживания} ■ медленный в ускоренный ,т Установлено i : что ira' 262. эамороженио-от- '-таянных .эмбрионов кроллков в медленном режиме только 63,7? ока^

? > »шпсь нормальными, После йнотрого оттаивания вибрионов, ааморо- г .".. - л .женнцхпо усвдреншму спо<^у о крнопротектором гдвдерин. нор-

мадьныхзароддаейироджков било.а крупного рогатого ско-. • . • та - 63,7<;; дегвнврировая1шх 28,4 ■ 16,3^ соответственно (тайл.в). •

' .-У'--^ X"^: . ^'л.-^-'':-'Таблица 8 :-

■ . .' ¿Еизнеспособяость вамороженно-оттаяных вибрионов - Л1.,;-';

'<■/' в зависимости от скорости охлаждения в криопротектора-

~ ~ ~ "Т.'" • • ' • ЭмбОКОНЫ ~

■ ^ '■"■ '-Г: ; »•• / ; • ''..- '-5 ■ :крупного . • . кроликов. . :рогатого ., ' _■■;■,. , V, ...-,--■..-»■.■ - . :-„->■■ : скота

'/.Показатель ■' ■ , ./■;■:':■■ Рйяиы охлаадения г *■■ '■■■■■•

медленный : тскйоенный тскоренньгй

'4 Коиошютектом

ДХО ;,;";-.; г чглицвряя''-': глицерин :;

Заморожено и оттаяно эмбри-' ' .'>,'■ ---' --У-,*'. '-

■..'V-::'.;«нов^.. . •... ^л7..-' . . г.. * 141 :у. гад.:«; • у,

..• • Из них-нормальных-'... - .С.; '; 167. .. ' .101 • ,242 , ; .

•.. . • • Дегенерировашшх '' : • " •. 95 '40 •;. ' '.; 474 Щ

", Процент от общего числа >.• ЭХ,5 ^ ..28,4 "■>•'. л 16,3., * "••

■■■■ ■: V * Рр» ааморажавании ембриовов использовали в качестве ковтей- **. ' "1 . , неров стекляшшепробнрю^'шастиковнеукороче и ' . ,

^ ; :"■ ?■*-■ г- паетгн.~.Яучишй - процент сохранения жизнеспособности »мбрионов кро-.■.-■:■> лзвшв бш подучен ори зАмораххьанжи в стекляавых вробжрках (67,4>)

а оаеттех (68,9^), При »аморакиваыиа вибрионов в плаотхховшс ;' ; трубочках жизнеспособность их снижалась до 54,5? и повышался про- • ' . "■: Нвнт' дегенерации. вибрионов' до '45 Аналогичные - результаты были | получены при эамораяаванин »мбрионов крупного рогатого скота.' ' * ' ч При зшорахиваххк >мбрноыов в паеттах создаптся более жест-;

- . • - • • •". иве условия для сохранения хх.'жхзвеспозобности; Ори »том-снжкь- -

лось число вибрионов отличного и хорошего качества с 11.9 к ^ . 73,8* до 0,8 я 30,2% соответственно, возрастало число вибрионов удовлетворитела ного качества до"48,45С и дегенерированных - до 20.6S. TeM не менее, замораживание эмбрионов в паеттах является ; наиболее.практичным способом, так как после оттаивания вибрионы ; сразу же можно' использовать дня пересадки. '" " '.'•'.•.'.:""•<• . Почти равные результаты по качеству эмбрионов йьши подучены . и прх замораживании их 'в пробирках, но они были несколько'ниже* -'чем при замораживании в паеттахГ' ;'Уг';, V--,

. При низкотемпературном задоралшванииэмбрионов необходима ; . определенная защитная среда (кржопротекторы). Вид криопротектора ; и концентрация его имеет важное эначение для сохранения жнзне-■■ способности эмбрионов. 'Ч' - -' ':■:■'■ *'''' " V'"'-.

; - Механизм защитного действия криопротектора сводится в оо- • иовном х »(Кенту растворения содей и внутриклеточному заыоражи-ваша),;стабилизация клеточных мембран. Однако точный механизм защитного действия криопротекторов все еще до конца не выяснен. . Криопротекторн хотя иограничивавт и предотвращают краоповрежде-.; „^ -ния.'но могут и сами повреждать кдётки эмбриона посредством осмотических изменений. « • : ^

; Поэтому целевая программа нашей работы заключалась в опре- ' делении влияния кокцентрапш криопротектора на жизнеспособность эмбрионов.после замораживания, оттаивания и нехирургической пе-; ресадки их телкам-реципиентам (табл.-9).' • ч . ■'■...■',■■■■'■'■■;..;' :,■•.;

.Данные „таблицы. 9 показывает, что качество эмбрионов^ при ио-. . падьэовании глицерина в концентрации 1,4 М иесколько выше. При- . . менение сахарозы (0,25 Н) не улучшало качество эмбрионов после ' замораживания "и Ьттанваякя.-На/бшю существенных различил в ре-. .. зультатах' нехирургической цересадки эмбрионов телкам реципиентам

Таблица 9

Качество в жизнеспособность вибрионов крупного рогатого - скота в зависимости от концентрации-глицерина

. Показатель

Морфологическая оценка

iöaW .

Концеитряч^д тчгидергна (моль)

1,0

1.4

íI.4+0,25 ¡ сахароза

Заморожено-оттаяно эмбрионов:

•Качество эмбрионов цйораживдния -

оттаивания

Пересажено эмбрионов Стельных реципиентов Процент стельности

4

3

„6.

4 3

228

61-23,4 145-64,6 32-14,0

7-3,1 78-53,8 109-47,8

187 . 86 45,9

44. *

2-4,5 37-72,3 8-18,2

19-43,2 16-40,9 33 ;

16 .,: 48,4

17

Г II

5

4-23,5 7-41,2 : 9 3 33,3

при замораживании их с хриопротекторамг глицерин в 1,0 и 1,4 молярной концентрации. Разница в показателе стельности составила всего 2,5*. Из 229 пересаженных заморожеино-оттаянных эмбрионов получено 105 стельностей. Стельность от общего числа замороженно-оттаянных эмбрионов составила 36,от общего числа пересаженных - 45,8*. - " ■

: Для замораживания необходим строгий отбор вибрионов по их качеству. Из общего, числа 112 поздних морул и 127 ранних бласто-цист 64,3 а 77,2* до замораживания бшж отличного и хорошего ка' чества. / ."'ч.';.' ■ : ;. После оттаивания число из заметно уменьшилось. Возрастала доля удовлетворительных х дегенерированных эмбрионов (табл. 10).

Поздние бластоцкстн имели морфологическую оценку "отличные"

. у ; 19-:.. у , с •

У' •: ^ СУ.-УУ_"; . Г У; .У' : •-' . Таблица 10 у,;У -У "ч '

Качество вмбряонов крупного: рогатого 'скота до и после;,, *

-;_- ' л-Л- земораижвания к оттаивания * • •■*'•.' '

■ .■-!■ Морфодо-: ■ • - - ■ Стадия развития '" ■■ ../::

1" Показатель СУг ' :" "цр^а*; но рулы блаотодисты •••*••'' ••■• СС-' . % г. . • ': (баллы);: поздние": ранние.-: поздние. . У . ■■

До замораживания (п-*) " 5 :'С 10-8,9 14-11,0 30-60,0

-УУУу.- ■ ■.. - ••• 4 ; 72-64.3;: 98-7?,2 20-40,0 -С/У С'-У ч У * • . ::;-7'-;У''УуЗ>Уу- 30-26,8 15-И,8 у Л . -

:После замораживания а -' V. - -V^ 1-г. ;,■:■ *■-,;..,■■■.■.■.... '

ОТТаиванияЧп-*) • 4 ' . 29-40,3 47-47,9 25-12,5

.• ' ■>-'■*:::/■ 1 3 ,У у 68-26,6 . 60-33,3 : 16-16,0 У /

• ,'у --/У' , : у' " •;у. .2. -.;' 14-12,5 • 26-20,5 7-7,0 • С

' - 60£ ■ и "юроялв"40?, ■ Среди поздних; морул; в ранних йластоцист * • отмеченных по качеству; было небольшое количество (8,9-П>).* .У > Эмбрионы, оцененные ках.посредственные нецелесообразно под-. * вергать криоконсервироъанио;"ибо после оттаивания большой процент их оказывается непригоднш* для трансплантации. : "' •. '. 7 •'

-'.. -В таблице1II;приведены результаты приснвляемости эемороженно- -, оттаянкьа экОржоиов в заваскиоств от стадин развития и качества. ^УУУС ' "С' У'У:~' УуУ: У: ^У/УУ.-'-Ц' У,-,/*:;С, С У 5 ^ -ТабЛИЦа И - . * - - У;-СУ Прихнваяемость. эамороженяо-оттаянкых вибрионов' в. зависимости . ■} * Сд.У-уУ: У::"-; "Уот'стадии:кх развития и качества -;-у 'уСС

Стадия развития . .' :Пересаиено : Стельных . : Процент .

- и качество эмбрионов : эмбрионов ¡реципиентов:' стельности

Морулы поздние У ' . .' 89 С^-'.-'43 У . . '.' 48,3 , ■ '' :-.<У.:.

Еяастохдасты:' -ранние' >:у . '. 97 - " У::46' .• 47,4 • • >

..; •; ." СУ'поздние . - 43 У; ; 16 ,. .37,2. ' -С.'-С

Качество акбрнонов:: .. ,.■ -.У..,;.: ^ .

\ ; ' .'СУ, ," отличные- У у .'~ \;7" , ^у • 4 * ' 57,1- . .

.57 ' ; 56,4 •. : • ^ удовлетворительные .^ .121- . • .. : У,-" 36,3 \ - , * : ■■*■■

г Установке но'.что вибрионы, получившие оценку "отличные *ло 1 , «вмораживания не" имелк после оттаяваяияоцеики "плохие". 7 эхб-: ржонов более высокого качества до замораживания в после оттаява-вия наблюдался" высокий уровень приживляеиости при' нехирургической пересадке; Стельность к отелы от пересадок отличных к хороших вибрионов были'получены У 57,1 ж 56,42 телок-реципиентов,' а от пересадок посредствекншс эмбрионов только 36,3?. . > ; '

-г • .. 4. в ы в од'ы^-^г;

- ;'';1.'Дяя горюнальяюго вызывания суперовуляцин у крольчих целесообразней использовать нативнне препараты СЕК, которые обее-печжвают высокую реакция яичников ж ошюдотворяемость яйцеклеток . (95,Уровень суперовудяцин к качество эмбрионов зависит от . V типа1 и сериж гонадотрошна." -и;'. -- .у-'.*У^У''^-Учу У

- .У 2. Извлечение эмбрионов у кроликов через-вентральный разрез ' о применением приборов -ж приспособлений нашей конструкции обео- . : У печжвает высокий.процент получения, зародышей (от .78 до 93) от -общего числа овуляций. •:• ;' -уУ • V у ' У ...',^'УУУУ'-У'. /- 3, Ультрафиолетовое облученже'вибрионов"5-60 секунд к ви- V : . тадьный краситель - этидиум бромад в концентрация 1:300000 при ' Л' инкубации в течение 20мннут,ве оказывают отрицательного влжянжя ; на качество вибрионов кроликов, . ' - !"

4. Двух' ж четырахклеточные зародьшж кролдов мало пржгодны ~ . для культивирования. Наиболее подходящей стаджей раэввтжя являот-ся 6-16 клеточные зародыш при продолжительности инкубация до 24 часов,.в..среде 199 а Дюльбехко с добавками•бычьего альбумина, фетальвойсывороткж кровж теланка ид* сьторотки' кровж овцы. обес- : печнваише 78-100< выживаемости вибрионов., ' . ; ' ...

V Наибольшее число жотнеспособюа »мбрионов крупного рог»-..

того скота ыожно получить при культивировании «х' а. среде - И>С о * -. -- . V Детальной сывороткой крови теленка (87,1*) к в среде ДО-335 : ; - ' " : / ' • (75,0*). Врв добавлении в ереду ШЗ сыворотки крова северного О'-:': ■ оленя жизнеспособность вибрионов снижается до 56,5*. ^'■г-'^'".-

; ' ' б.Применение ускоренного режима охлаждения вибрионов обеспечивает высокий процент (71-84) сохранения их жизнеспособности. и.'':'-"■■ Эмбрионы лучше замораживать в стекдяшосс: пробирках и ааеттах, чей. ' -■■■ ;.ув укороченных'пластшсов1а трубочках..Для : использовать эмбрионы отличного и хорошего качества на стадив д развития поздней морулм и ранней бластоцнсты, обеспечивавшие ■ \г

: " • Л стельность у 48 в 56* животных-реципиентов после нехирургкческой

пересадки*^■У^ч'ДлУУ;^-'"!^ V -

^./- г УУ'-'р,^-'-.5* ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРВДЮШШ . .. | '

I. Дая гормонального вызывания суперовуляции у самок-кроли- ■■'» ' ковследуетнспольэовать нативный препарат СХК в сочетании о хо-; риогонином иди стандартные очищенные препараты гонадотропина;У ■ ^Г '2. Культивирование эмбрионов необходимо проводить в среде "V.

- 4БС о добавлением феталъной сыворотки крови теленка, заморажи- '

вать их в стекаянных пробирках - или паеттах по ускоренному режиму ■--■=."•„■"охлаждения с использованием криопротектора глицерина - в 1,4 мо-^ лярной концентрации. У'- ':.'■■■:' V -.у

-; ■ , Основное содержание диссертации опубликовано в следржнх-'.■У' работах: . "л.-"'./" ■' VV ' ' "■'■■V У- ;; "■■ '.■ -■.'.'

I. Е1реыова К.Н.'Получение и культивирование зародышей кро~ -; лика •//• Эндокринология в трансплантация зигот' с.-х. животных.' - .'■ ■;: . и.: Колос, 1982*. - С. 28-102. • '.4 • • • • :: V. ^

* ■ " ; 11 ликов// Трансплантация эмбрионов в молочной скотоводстве в ов-- . ; ; ■д,: . цеводствеУ- Дубровиш,•ISÖ5..- С. 37-39. ' v-' ; : .У ■

, ••.. ' З.^Выявлегае^ морфологическая оценка х глубокое заиоражнва--. -;; ае эмбрионов крупного рогатого скота.;/ Шихов ИЛ.,. Сергеев Н.И., Букарова В .И., Ефремова М.Н. /Л Эндокринология в трансплантация ' ; . „_ зигот сельскохозяйственных, животных: М., 1982. - С. 7S-S9. ■ - 4. Ефремова М.Н. Криоконсервирование эмбрионов кроликов и ; крупного рогатого скота //. Тезисы докл. симп.:- Тарту, 1986. сост. 22-23 октября 1986. - С." 52-54. »••'•:; - ' ^

5. Шихов ИЛ., Букарова В.И., Ефремова U.H. Морфологическая оценка свежих а глубоко-задоропенных эмбрионов крупного рогатого скота при трансплантации // Тезисы докл; УТ Всес. совещ. эмбрно-логов. - ц., 1981. - С. 204. w

6. Нетеча В Л Г, Ефремова U.U., Букарова В.И. Прижизненная /окраска витальный предателями вибрионов животных дня быстрой

оценки их жизнеспособности // Трансплантация эмбрионов-в молоч-: ном скотоводстве и овцеводстве. - Дубровицы, 1985. С. 31-33. S;

7. Методические рекомендации по кряоконоервированн» эмбрио-' 4 . иов крупного рогатого7скота, овец и кроликов. Сергеев НЛ,, Ма-

..".' эепкян O.A., Ефремова!!.^, ТараспкН.Н. - Дубровицы, 1987. -

Подписано в печать 9.to.38r. Л - 38519 Формьт 60x64/16 . , ..• Заказ 1992" * Тира* 100 '' '''

Ллографм ШЗНИС. Москва, Б,Харитоньевский лор., 21 '■'-'