Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение моноклональных антител к антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Получение моноклональных антител к антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота"

Зэг

российская акаделшя сельскохозяйственных наук отдрпрнир ветеринарной медицины

вссроссипшш иаучно-исследовательскии институт ветеринарнои вирусологии и микробиологии

На правах рукописи

ХИЖИНСКАЯ ТАТЬЯНА ПЕТРОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К АНТИГЕНАМ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

УДК 619:616-006.446-079.4:636.22/28

03. 00. 06 - вирусология

Автореферат

диссертации па соискание ученой степени

кандидата миологических па\к

Покров — 1995

Работа выполнена в лаборатории Гибридомной биотехнологии ВНИИВВиМ РАСХН. Научные руководители:

доктор биологических наук, заслуженный деятель науки

Российской Федерации, профессор

МИТИН Н. И.,

кандидат биологических наук РЕУТОВА Е. Г., кандидат биологических наук ВЛАСОВ Н. А.

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор ЛАГУТКИН Н- А. (ВНИИВВиМ).

кандидат биологических наук КРИКУН В. А. (МГА вет. медицины и биотехнологии).

Ведущее учреждение:

Всероссийский НИИ экспериментальной ветеринарии.

Защита диссертации состоится 30 марта 1995 года в —часов на заседании Специализированного Совета Д 120 61 01 на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук при ВНИИВВиМ по адресу: г. Покров, ВНИИВВиМ. . .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИВВиМ.

Автореферат разослан « ** »1995 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат ветеринарных наук

Г. П. Федоров

Маезггбы распространения лейнова катаного шглтпгл л«.-.-.-- а

..пяяяпппя I- •■*.......■'¿••у-т

опасность порахекия других, видов >:леотных и человека, контактиру-•?5?го с ййотнй® в процессе хозяйственной деятельности и пот^о-ляюлего продукты животноводства, требуют- разработки эффективных мер борьбы в том числе и диагностики этого заболевания.

■г:: 1.-!± и '-.*

ХВОЕЙ й СйКПЙТЯУ ЫГ»ЯЛ!«.-.й. мамаи

в низких;шраз. .По. этой причине очевидна необход!!}ость,еоЕэрпегг

' ЛТЛ ЛОВ, Г;рИЛ-ЛЛ:...ЛЛ ДЛЛ '.^¡¿¿лиШ приIИгисИСНыл змг'

верленствование виооко^стзптелькых и специфичных методов диагностики лейкоза и БЛКРС-инлекпНи, Для повьевзния чувствительности я специфичности диагностических пр^царатов.оказаьзюь^вое-о^Ум непзллзованиелюнсклональных антител, ''Услано^что белел ¿р51 ннлуцируе? в организме - потных образованно " ал-

тител, являясь иммунодошнантным антигеном вируса, мажорным гли-козилированным белок оболочки вирионов. Антитела к атому белку опосредуют защитные реакции, б том числе ьируснейтрализующую, и цитотоксическую, которые необходимы для элиминации вируса и разрушения инфицированных им клеток (Бигпу et al,, 1980).

Зтйми обстоятельствами обусловлен выбор поставленной цели-получить клоны гибридом, продуцирующих МА к антигенам вируса лейкоза КРС к определить их диагностическую ценность.

Для достишия намеченной цели необходимо -было решить следующие задачи;

- разработать методы получения препаратов антигена,, пригодных для иммунизации и скрининга гибридом;

- отработать методики скрининга шноклональных антител к вирусу лейкоза КРС; .

- получить устойчив® перевиваемые линии гибридом, продутфрушгке МА. к антигенным детерминантам вируса;

- определить диагностическую ценность полученных «А иммуноглобулинов и разработать тест-систему на их основе.

Б соответствий с . полученными результатами на защиту выносятся еледуюягйе положения:

- оптимизированные схемы и резшш культивирования линии клеток ГБО-ЛС, концентрирования и очистки вируса лейкоза КРС, шмуниза-ции мышей-доноров епленоцитов и система скрининга шноклональных антител позволяют получать, гибридош, стабильно прюдуциру-юще моноклинальные антитела специфичные к антигенам вируса лейкоза КРС;

- полученные моноклинальные антитела к вирусному стружурному белку gp5i пригодны для выявления вирусного антигена и сывороточных антител к вирусу лейкоза КРС;

- разработанная тест-система для диагностики лейкоза КРС обж-

- Л -

г ен-ЧИТ-ЛЬ-^й П?реД ЙСПОЛЬЗуеМНМИ В ДаСТСЯЕДе

•rrrrtn ср-дс^акй дйагнооткли -зШ: болезни.

использования моноклональных *нтитея к конфирмационной детерми-

™я>« ДМ^ПСС'ПП-Г "ИТ-" ä UlM»"»»« HIWM. HOUUSW -Л

способам культивирования клеток, латентно-инфицированных вирусом лейкоза К?С,

практическая ценность работы заключена в разработке тест-системы на основе моноклональных антител для диагжютики&ШгС и ряда технологических схем, позволяйдих эффективно получать моноклинальны? антитела к вирусу лейкоза К?С, а так т в разработке пакета научно-технической документации, включающего:

1. Методические указания по очистке и концентрированию вируса лейкоза KFC;

2. й?тодические указания по получению гибридом и МА к вирусу лейкоза К?С;

3. М.4 к Gp 51 рекомендованы для изготовления диетностикумов для выявления вируса лейкоза Кг? в ТФ иФА;

Предварительная апробация результатов работы проведена в. виде докладов на научных конференциях и заседании ученого совета Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии у шкробиологии в 1990,, 1992 гг., совещаниях сотрудников института в мае и июне 1994 г.

Публикация результатов исследований проведена'в.виде 7 ,тезисов работ в материалах научных конференций, проведенных во БШ-ЙБВйМ в 1990 и 1992 гг. '

Объем и структура диссертации. '-.Диссертация изложена на 104 страницах-'машинописного ; текста.

Данные илжетрируютея 16 таблицами и 5 рисунками. Список цитированной литературы включает 249 источников. Диссертация оформлена по традиционному плану и содержит-, описок использованных сокращений, введение, обзор литературы с заключением, собственные исследования, обоуддение, выводы, практические предло^ния, список цитированной литературы и приложения. «

СОБСТВЕННОЕ ИССЛЕдОЗАлЩ МТЕРИШ И МЕТОДЫ Материалы

Вирусы.

Использовали вирус лейкоза крупного рогатого окота, полученный из Ейруспродухуфующей культуры клеток почки эмбриона овцы (ISO-JE); вирус лейкоза крупного.рогатого скота полученный. Антигены.

Специфический антиген вируса чумы КРО (ЧК?С); антиген контагиозной плеврюпневшш.(КПП); специфический антиген B.antraeis mam Cm-, специфический антиген аденоматоза овец, специфический антиген вируса лейкоза KFC, антигены, норшльный из кулътур.н ® (почка овцы) культуральный, ннтактной культуры клеток CV, из культураль-ной жидкости интактной" культуры клеток 1521 БулЬТуТ'Ы клеток:

почки зеленой мартьшгки CV; перевиваемой почки поросенка ПИК; перевиваемая культура клеток тимуса эмбриона коровы (ТЭЕ-МВА. 76); перевиваемая линия клеток почки эмбриона.овцы ПЗО-ЛС; перевиваемая линия клеток почки овцы ПО миелошая линия клеток Sp 2/0 А* 14Л (Sp 2/0). Нмвотные

Мыши белые нелинейные, массой 20-30 г; мыпи линии B.ALB/c 3-4 не-

- -

«гльного возраста массой 10-15 г н вэрос*«^ ^шиш са*ки мвйюй

— лл _

Него ды -

- 1 л-и» 'инг (1тм.им -пл о '^'ш.'о т'

(.-■ходу ¡Зоо<1иг> ]. V, {1550}.

Шделение НА проводили методом еоавоЗ прещзштащи Еееызен-нш раствором сульфата натрия о посяедрц?а аффинной хроштогра-Фией на Рг-о1е1п А - Берпагозе 4В (РЬшама» Швеция).

йонь>огацию МА с п^рокскдазой хрена осуществляли методом дери-

ЙОЩГНОГО мим Й0 7-

- • -ценграци» белка определяв! микрометодом по 1о«гу.

Г л". ПОЛУчаЛН ПО чеГ'ОДУ 6. Ке:":2ег, С, Н; 1VI ё IГБ

цйй г0..

анализ. Тфи проведении экспериментов рс-ро-»-зовали неправа, "'сандвич* й койь^агнсг-ннгибищ-оннь^ варимт-н

В г^чзСТЬС Сйс1^йЧг«ййгО ЙНТИГвНа ЙОПОЛЬВОЕаЛН ОЧЙЦгНЫЙ вирус, приготовляемый согласно Методическим рекомендациям по полу-чйнир и очистк- рнруез Струйного рогатого скота ( авторы: Малого-ловкин С. А., л^-йнокая Т. И , Реутова Е. Г, /¿г-:»« £ Н. 193" г). Контрольный антиген из неинфщнрованкой культуры клеток готовили аналогично. ' 5

Злектронтш мнкгюсшшя

Злеьтрюнно-жкгкх-к<:'шгческ11е исследования проводили, используя методы негативного контрастйрювания и ультратонких срезов по 31аиегЬ.

?адиок?л>унсшг*т^^ для пределенке помпептидной специфичности МА проводили по методу описанному Аур1«1оп еЬ. а1.

РЕЗУЛЬТАТУ КССЛЕДОВАшш

Оптимизация режима культивирования клеток ПЗО-Ж? для получения вируса лейкоза KFC.

Для получения вируса использовали клеточную линию почки эмбриона овцы (ПЗО-ЛС), хронически инфицированную БЛКРС.

Б экспериментах сравнивали эффективность различных способов культивирования (стационарное в кулътуральных плоскодонных сосудах, роллерное-5-8 об/мин, на микроносителе), состава питательных сред (Игла УЕМ и ДМЕМ, 1-глютамин 0-2,5"=) и содержания в них Детальной сыворотки КРС (2-20%). Посевная доза клеток была равна 2х10е5. Смену среды проводили раз в трое суток. При оценке эффективности определяли урошй клеток, индекс пролиферации клеток, время их. переживания в длительных культурах, выход Физических частиц вируса с единицы объема куяьтуральной среды, титр концентрированного вируса как антигена в серологических реакциях.

При изучении метода культивирования клеток на ьсскроноеите-лях, сочетающего элементы мокослойного и суспензионного методов культивирования, использовали микроносители типа ДЗАЗ-гель ионообменный производства НШ "Енолар". Клетки выращивали в среде Кг-ла MSM с 10% эмбриональной сыворотки, 0,25% гшамина. Культивирование клеток на шкроносителях проводили, в стеклянных бутылях объемом 3 литра, на роллерных установках со< скоростью вращения 12-15 об/мин. Ва 400 ш питательной среды вносили 5 мл гидратнро-ванных микроносителей. Первую смену среды проводили на 10 сутки культивирования, в дальнейшем смену среды проводили каждые 3-4 дня б течение двух месяцев. Данные приведены в табл. 1

Теблщй. i. сфрзктивнооть различных способов культивиу-ования клеток ЛС

'CHOTO'.BB^aiBHBaHHH ; К- ВО ;Ур:каЙ ;КндеКО 2К-1

•КЛВТОК :'^ОИЙ!-"ЧВО-'КЛгТOK ;ИрОЛНО>3- jpvea vlO6 '

: i ' ;¿OpO-;XÍGs jpäüää {Hâ tí& i

_i (тки |кл/«л I ; I

[ ^ТВПИВН-ВВ'НЫг- --Л-ЛС'-I ■ " • ■ i • ' • ■ - f г.. ! •- м n— i n • ч > •

Роллерное культиви го&ерное культиви гвллерное культиви Роллерное культиви кование ;ование --звание рование i 10 7 i 0.3-0.8 1.0-1.7 kttl kl ti 9.0-1". 5 11.5-13.0 i iE«

Культивирование «я :с«^тюносйтеле 3 10 5.0-7.0 12.0-140 108- 10®

■ Выло обнарухено} что использование той ш® зной среды не влн-яло не урожай клеток и выход вирусных частиц в стационарных усло-

При рзллернсг. способе пульсирования клеток наблщали увеличение выхода вирусных чее~ин до 10" вирусных частиц и индекса пролиферации - дс '<,5 уоль-v при содержания сыворотки в среде не

й»э5е. чёй 10%. й:и егф8£?№1пгя «тупптнуптташпг ивйфпк нд^ыпи-

6

; -.г.-".- -- .. :: - ---'Л: урз-ал клеток 5,5x10 и

9

максимальное накопление BHpyess частиц - до 10 . йшшшшшание

клеток «a суХГетрате происходило а течение 3-х часов, шнешой -и-—V?" Кг 5-" •.•;".'•■*. кл-тки :ставалийь Физиологически активном? в т-чение "-х месяцев, чго hübeслило получать .'тногезфатно больпе? oSxts* г-ируссодерйалгго материала, чем с испораованиеы других методов.

Б втих вкепериаентах бшо о?мазено, *го ори ^лвтнвщюваннз на йскрс'нс'сйте ле время жив ни клеток С«ш вначительно выше. Дни проверки Это го заключения, а так ш- для ощйдегенш динамики за-ж-нженЕЯ н разрушения вирусного антигена в процессе длительного культивирования клеток был проведен отдельный цикл ВЕеперимантоБ.

- § -

Результаты суммированы в таблице ;?.

Таблица 2. Накопление ВЛКРС при длительном переживании клеток лижи IBO-Ж) на различных субстратах.

Культуральная поверхность Срок культивирования (сутки) 5 7 10 30 60

Микроноситель Стекло/роллер Отекло/матрас Л _ ГПЛЛ 4 П^ЛЛ Л 'Л Г-■'\-\r\ J ПЛЛА i ' лицу 1 ; £Ouu 1 ; оиии 1 ; оиии i : лицу х;£иии 1: ¿cw l'f.ovи liclwj - л 4 пллл л пялл i ; ¿uuu ÎÎÉLVU i: Î'A»J

Примечания; данные в таблице представляют собой модальные значения титров антигена ВЛКРС в концентрированной в 100 pas культура^ьной жидкости в Т<1-ИФА; прочерк - не определяли йз-ва гибели клеток.

Из представленных данных видно, при культивировании на микроносителе время жизни клеток значительно превышает таковое при других способах культивирования, однако, ожидаемы:*; преимуществ в плане выхода вируса повышение длительности культивирования не дает в результате того, что, после прохождения ш&щт накопления

вирусного антигена на 10-30 сутки, б дальнейшем наблюдается не

»

накопление вирусного антигена, а постепенное снижение его концентрации, видимо в р-ееультате его распада.

Таким образом, эксперименты по культивированию и пережванпю вируспродутщ!утйрй культуры шток 1330 выявили преимущество рол-лерного культивирования перед монослойным и на микроносителях по сравнению с двумя другими способами.

Разработка, способа очистки ВЛКРС б градиентах перколла.

Для препаративного выделения вируса использовали в опыте не менее 3-5 литров кушууальной среды, Культуральную едкость осветляли для удаления клеточного детрита центрифугированием при 5000-7000 об/мин в течение 30 минут.

Испытывали два метода концентрирования вируса; концентрирование ПЭГ-преципитацией к диф|еренраж»:ым ультрацентрйФугирюБанй-

В Е?увом опосоиг к осветленной культуральной лидкости добавляли 1*4-5000 из I нечета на 100 среды 7 г, и вьщермйвали 18-24

Г!

часа при ч~С. Преципитат осаждали низкоекороетным центрифугированием. =о втором способе из осветленной культуральной кидкости вирионы осаждали . с?.""" С

I 1~У1'4<г 7-19 ц^атркруги Беоккеп 1-65.

Затем и в первом и во втором способах фракцию еодержваую вирус переосакдали на сахарозной подушке при 27000 .об/мин 2 часа. $рак-цию, содержащую вирус,, осторожно отбирали и ресуспендировали в минимальном объеме физраствора. Б табл. 3 приведены результаты •"-то? по концентрированию антигена при различных способах куль-■г-;.гИ;_. - ^ния клеток ПЗО,

Тебячцз 3. Характеристика способов концентрирования вируса.

1 • ••0000 | получения Стационарное культивирование Роллерное культивирована Культ-ние | 1 на :^икроко | I сителях ]

1 1 1 ! ---- 1 -"С. т г* 1 1 т.» Г*» (. гяд т/«. 1 т\тггт 1 Щи | ГИЛ 1

1 I 1 : 2. 1: '¿'ООО 1 : 8 1:2500 1:3

Концентрирова ние ультрац-н Трифугир1'3?ни ........... 1 : ?500 1:4 ■ 1:5000 1:8 -1:16 1:5000 1:16

Препараты, концентрированные ПЗГ и ультрацентрнфугированием, давали специфическую линию преципитации в РИД с сыворотками больных лейкозом коров. Перед постановкой РИД очищенный вирус обрабатывали 17= раствором тритона л-100 в Физрастворе. Б качестве отрицательного контроля использовали нормальную сыворотку КРО, Очистку вируса проводили в градиенте плотности перколла, Оса-

док кояцен?рированного вируса ресуспендировали ъ забуференном- физиологическом растворе pH 7,2-7,4 в объеме меньшем в 300-500 раз исходного и центрифугировали в 45 % растворе перколла при 20000 об/мин в течение 30 минут, Б ходе отработки метода градиент Фракционировали и исследовали Фракции на предмет обнаружения вирионов •3лектронномикроекопически. Затем, после маркирования зоны г«аспо-ложения вируса в градиенте (плавучая плотность БЛ KFC в перколле составила 1,062-1,075 г/см), в ходе препаративных экспериментов, эту зону отбирали для проведения злектронножкроекопическо!^ определения концентрации вирионов и дальнейшего использования.

Всего в ходе этих экспериментов было приготовлено 20 серий антигена с активностью в гад 1:2-1:16 и непрямом ТФ й£А 1:2000-1:5(300.

Получение шноклональных антител к вирусу лейкоза KFC.

Задачами экспериментов на данном этапе работы были: подбор антигенов вируса лейкоза КРО для.иммунизации, отработка оптимальной схемы иммунизации мышей BALB/c, разработка системы скрининга шноклональных антител в ТФ-йш.

Определяли титр- каждой партии антигена в гад и непрямом варианте ТФ ИФА, степень очистки по белку, характеристики антигенов представлены в таблице 4

Таблица 4. йрактеристика препаратов очищенного вируса лейкоза ■ агС для иммунизации мышей Б.чЬВ/с.

Серия Объем Еонцентрация Титр в реакциях:

антигена в мл шш белка . * L - „ .

мг/ш ' ifcffi

1 2 л гл и,Ъс. 1:2000 1:2 . :

о л 0,1 . 1:2000 1:4 ;

J % л о 2 15 1:5000 1:16 :

5 1.5 0,75 Л ЛАЛЛ 1:<;ОиО 1:4 :

( л 18 1:2500 ____

при йг<?-!УШ"-:^ЦИй МЫЩеЙ Щ'НЫШВШ ЗффеКтйБНССТЬ [Гранения

дву.*: еюдходов - длителзньк- схе-ы по традиционным: протокола;! и ьнутриселезеночная ■^.•■у--П- первой схеме первичную иглгуни-"-е.циг г'роводил:: лул--.- под-.ол-'л о введения 100 «кл суспензии очн-згиного вируса в см~г;и г- гла-т.» ¡¡с-. м

втор:: шт^.'ппг МО ки еу<-пенсии очищенного вируса проводили на 14 сутки в смеси с равным объемом неполного адьюванта Фрейнда внутрибрюшивно, третье - на 30-е сутки внутривенно в той >:е дозе бее адьюванта, Вторая схема состояла в двукратном внутриселезе-ночном введении 100 мкл суспензии очищенного -вируса Сравнительная оценка уровня сывороточных-антител к вирусу у 6 мышей, имму-нив-товеннех по первой схема показала, что титры антител в ?Ф-ИтА аарнир0«йли от ?500 до 10000, а у иммуни-ировсшных по второй схе-'••-е 10 мышей - от "00" до 2500.

методы тестирования моноклона-«гннх антител, полученных к г-нам ВЛ Н?С, отрабать»»»!«, применяя непрямой метод ТФ-ЯМ и специфические мышиные сыворотки, получйккне донороз с&~~ноци-.гов нерабочую дозу антигена определяли шахматным титрованием со специфической и нормальной сыворотками мышей. Было обнаружено, что оптимальный уровень сорбции антигена (очищенный вирус) происходил из суспензий с концентрацией по белку от 0,5 до 18 мкг (100 мкл на лунку).

Отмечалось увеличение оптической плотности в пробах со специфической сывороткой и разности уровней сигнал-Фон при температуре инкубации антигена при +4 С по сравнению с +37 С. фи.сорбции антигена высушиванием наблюдалось интенсивное неспециФическое Фоновое окрашивание.

При определении оптимального -времени £заш>действйя антигена с

нормальной и специфической сыворотками мышей было установлено, что таковы»! является время 1-1,5 часа,

Б результате отработанная схема постановки реакции состояла в следующем. Сорбция антигена (100 мкл): Инкубация при +4*С, посадочная концентрация 2,0 мкг на лунку, в течение 15-17 ч. Отмывание: Приточной водопроводной водой (проводили после каждого этапа 3-5 раз). Забивка (блокирование свободны:«: сайтов связывания) -

0,5% раствор казеина на ФБР, 50мкл, 30 мин, при +18-37"С. йнкуба-

о

ция со специфической сывороткой (100 мкл) - 1 час, +18-37 С. Инкубация е антйшшинш пероксидаэным коныогатон'(100 мкл): 1 час о

при +18-37 С, рабочее разведение 1: 2000. Субстрат (100 мкл) 1 о

час при +22 С.

Чувствительность и специфичность непрямого метода I® йш позволила использовать: .его для скрининга шноклональных антител в-культуральных жидкостях гибридом.

При получении гибридом, в качестве доноров, спленоцитов, использовали мыпМ с йайвшшши титрами сывороточных антител. Всего было поставлено 5 серий экспериментов по получению гибридом в ходе которых было получено и проанализировано более 1000 гибридных клонов. Результаты двух из них показаны в таблице 5.

Таблица 5. Результаты получения гибридом к БЛ КРС.

Схема Титр в ОЬшО-' ротке Ееего обшее число клонов - ..--- ft-C-lW, 1-го Ът&Тм тес— К" во Вйрусспециф. гибридом

зации лунок ТИрш , цуй . - CJ <ания А§Ь 2 тестирование 3 тбст'и-рОВВйИб

длительная А ЛЛЛЛП 1: íuuuu 384 ооо (.ПЛ <00 Л ЛП 1ио 4 ЛЯ iuo ri i

В/селезеночная 1:2500 1.92 185 82 16 52 37

С.' -еррНЧНОГО ОКрННИрОЬчНИЯ ПОЛОЖИТе гибриды КЛОНИрОвали. чтобы зарк-генет его другпнн пйунд*ми или клетка-

"Г'ОДуцИр^^мМ иммуноглобулины. КуДЬТИгИрйВсШИв ГИОрИДНид

микрокультур, В КОТООЬй КЙ ШяпФайтги С^ЦйТ«-«-

ШЧ.ОТИ»'.я» I---" 7;

йз данных, приведенных в табл. 5> видно, что при тестировании

гибридом ,взятых после 3-х кратного клонирования, число клонов, положительно реагирующих со специфическим антигеном, значительно

сократилось и составляло, соответственно, в опыте, поставленном

по 1, - "4 гибрида* клона, - по схеме - клонов

8 гибридов с высокие титрами в Ж-А для

; 5 ИЗ б'ОШ ПОЛуЧеНЫ ПО'?,о: ЗНутрйС"?Де-е-О1^'"^

"•■■■д^ктнгн.че клоны пасоисовзли в т^'-^ние 3-4 меляц'?с

3': Ч-'.О^Ь КЛиНи В без ПОТ^Г^ ЧД-

40 пассажей), часть гибридом при длительном стдоимтпмтт

С целью сохранения отобранные гибридомы наращивали и замораживали как исходный матричный материал, клетки сохранялись в милком

--о-г^ у.}; 3 лет { сро^ ^лденин) без потери антйт?лопрод\.к:л:,.;'-

'[.-■учение ¡^оРотз моноклинальных антител. Определяли: кзс-пш, активность и. специфичность моноклональных антител шести наиболее перспективных клонов. Активность и специфичность изучали в РИД, ЕКФА, ММ, ТФ-йФА, радиошлМТяопг«цнпита-ции, иммуноблотинге. Данные суммированы в таблице 6.

При изучении в иммуноблотинге было обнаружено, что ни одно из изученных .антител не взаимодействовало с денатурированным в ходе электрофореза по Ьаюмйу антигенаыи, что свидетельствует о конформационнозавиеимой природе соответствующих им антигенных де-

^ ■ - 15 -

терминал?. Б радноим:^жшре1Шйтаций с очищенным вирусом, солюби-

Таблица б. Активность МА с антигенами ЕЛ К?0 в серологических реакциях

Гибриде ма Астщоеть в гйд НКФА Шт Кзо-тип Специфичность Активное-:1 ь в Щ'М Титр КОНЪгг гата в Шк

1 + 1 1 t 1 1 > + + + 1 1 1 1 + 1 1 н/у IIя ь III j 1

ЛИВйрОВаййЫм Тритоном л-100 (2%) ИЛИ ОКТИЛ-Ь-и-ГйЖОПпраНОЗвдОм (5%) в присутствии 1 М НаС1 при рн 8.2-5.6, маркированным йостсинтетически Н-зоюсиШкаиуН 2,3-А3ш ргорюпаи по свободным НН2-группам, удалось определить белковую специфичность только одного моноклонального антитела - 2?1. Специфичность его подтверждена радиоавтографией электрофореграмм (1аега1у) элюировакного с антительного сорбента (СКБг-актйвнрованн-ая сеФароза + МА РЛ) иммунного комплекса в сравнении с меченным исходным лизатом. На обоих треках радиоавтографа в зоне 40-60 -кДа огшиен только один полипептид - др51. Как видно из табл. 6, при. тж-ледавании б монопольных антител в Рад лишь МА клона 2Р1 давали слабую полосу преципитации; в реагировали только МА клона Е64. о МА давали реакцию в Ш®А. , ,

Таким образом, в результате исследований были .изучены свойства, полученных МА что позволило использовать их в дальнейших -исследованиях по разработке диагностических реакций.

Разработка диагностической тест-системы на основе моноклинальных антител.

В основу разрабатываемой тест - системы для диагностики лейкоза был положен конкурентный Ш. для выявления антител к вирусу лейкоза КРС.

______-Первым 5*аюм-йееэдов8йИй"бш5- получение иммунопероксидазных

коньюгатов на основе моноклинальных антител и определение возможности их использования для диагностики.

Для получения конь-агатов были отобраны моноклинальные антитела клонов 2НЗ; 20?; "г-; 2rl; 2G4,

Анализ активности и определение вабош? тл**?™™*

КОНЬй'*«»« »{-»r'VjO! в прямо« ?*Ък. да* атого полистироловые пластины сенсибилизировали специфическим антигеном (1: 500) и нормальным антигеном . (1: 200} и инкубировали в течение ночи при.

+4"и После обработки пластин 0,5 % раствором казеина в течение

о . . л ...

30 минут при +S7 С, готовили серийнш двутфатные равЕедения конь-югата (с 1:50 до It 50000). Гюсле инкубирования при комнатной температуре в течение i часа и 4-5 кратной промывки водопроводной водой добавляли субстратный раствор (АБТС),

Результаты опытов по получению пероксидазных коныогатов представлены в табл, б. Из них видно , что коньюга? на основе моноклиналь ных антител 2F1 оказался наиболее активным,

Пригмовденные коньюгаты были использованы для отработки "сендвич" -варианта ?Ш.

ш данном этапе задача состояла в отработке оптимальных условий проведения :с^ж«|йр№нтного бпределенш-чвирусншЕ антигенов с использованием моноклональных антител.

Определение, шш&яьной концентрации шнокюнальных ' антител, используемых для сорбции на твердую фазу, проводили в пределах доз от 0,01 до 20 мкг на лунку. Шеьшэние шшстироловьк панелей Шжшосъ при шцентращи Ш ОД ж на лунку» оотшшьной бала концентрация Щ1-2 ж-:"на лунку. =.;'•; Г '. . V :

При выборе оптимального т-емоературного режиш и сроков инку-бшщн-использовались следующие параметры : температура" от +4 С до

■о ~ - U -

+22 С,' вре«я инкубации от 1 до 24 шов .

Для оптимизации условий выявления антигенов были апробированы различные сочетания МА для иммобилизации на полистироле и приготовления пероксидазных коньюгатов.

Результаты исследований показали, что антитела клона SFi можно использовать и для захвата антигена и для приготовления конъюгата в одной и той ie реакции, Аналогичными свойствами обладали и антитела клона 2CS, но использование МА 2F1 позволяли выявить антиген в более высоких титрах, При оценке специфичности реакции исследовали антигены ВЛ КРС приготовленные различными способами и антигены других возбудителей (контагиозная плевропневмония КРС, болезнь Кбараки, аденоматоа и ряд препаратов из не-зараженных культур клеток). Специфичность реакции была абсолютной.

Резюмируя полученные данные, можно сделать вывод , что из шести изученных гибридом, секретируюших Ш к БД КРС наиболее активен клон Sri. Шноклональные антитела ¿Fi пригодны для выявления специфического антигена в. "сендвич"-варианте 1$ Ш , что поолушю основой при разработке конкурентного Шк для выявления антител в сыворотках крови инфицированных животных.

Для разработки конкурентного ТФ Шк необходимо было определить оптимальные параметры постановки реакции , оценить специфичность и чувствительность метода для обнаружения антител в сыворотках КрОВИ ЖИВОТНЫХ,

первым этапом была отработка условий сенсибилизации моноклинальными антителами твердой Фазы. При этом основными параметрами являлись доза специфических МА; состав буферного раствора; время и температура инкубации.

Выбор дозы МА клона 2F5 для сенсибилизации проводили в тех т

диапазонах что и при отработке "сендвнч"-варианта Щ Шк Анализ

тепленных даннь:-: показал, :ito оптимальной является концентрация

1-2 мкг на лунку. Специальной разработки состава. буйепнлгл

бога яяв f? гг^ргСоь«-««-«, ц ст^д^кйй карбо-

«атякя буфер, с pH 9,6 дал вполне удовлетворительные результаты.

Данные определения сроков инкубации и температурных режимов

ползали, что оптимальными параметрами являются время инкубации

о

16-18 часов и температура +4 С.

Рабочее разведение антигена определяли шашгнш титрованием

начиная с разведения 1:20, о двукратно шагом, сыворотки исследовали в разведениях начиная, с 1:10. Рабочее разведение коньюга-та -делили титрованием с заведомо положительными и отрицательными -ыаоротк.^.® ( о 1:10} методом ингибирования. Окончательный

вариант реакции представлял собой следуйте. Сорбция МА (2FD 100

о

мм/лунку: инкубирование при +4 С в течение 16-18 ч. в КЕБ. pH

9,6 (1-2 *кг/л<унну}. Промывка: 3-4 раза водопроводной водой

(после каждой операции). Инкубация антигена БЛКРО в рабочем раз-

о

ведении 100 мкл/лунку: +22 С в течение 1 часа рабочее разведенке 1:100. Инкубация исследуемых образцов сывороток - 100

••§\Л"'лунку: раститровка образцов е I; 10,инкубация 1 час при

о ^

•4 0. Инкубация с пероксидазным коньюгатом НА 2F1, 100 мкл/лунку;

и

. чао при +22 "С рабочее разведение 1:500. Субстрат: 30 минут

о - .. «

[ри +20-22 С.

3 этих экспериментах качестве исследуеьш были взяты заведомо оложительные (специфичные к ВЛ KFC} а отрицательные ( не содер-ащие антител к БЯ КРС) сывортки коров . Кон-ттюляш! служи;.™ асци-йческая жидкость клона 2F1 содержащая антитела к ЕЯ КРС и Фе-альная сыворотка коров. Было обнаружено, что применение описан->й системы в условиях лабораторных испытаний позволяет надежно

выявлять ееропозитивних е отношений Бл КРС ?иьотных, далее была изготовлена зксперишнтальная партия диагноешущ на основе ш-ноклональных антител, которая успешно ироЕаа комееионные испнга-низ в институте.

С целью определения пригодности атой тест-систем« для применения в условиях реального производства было проведено иселедова-ние 146 коров т колхоза Борец Раменокого р-на «зековской области» 30 коров хозяйства 01Ж МКС- штушгнекого р-на Бладимщюшй области (испшавия поведены на базе лаборатории Гибридошой биотехнологии ВЕйРшшМ} и 38 коров из различных* хозяйств Мх-ковской области (испытания проведены на базе Лзйгюзноп лаборатории МВА). Б ходе испытаний проводили ерввнительну» оценку РИД (двойная радиальная иммунодиффузия в агаровом геле), пр'именяешй в наетоя^е время для диагностики лейкоза КРО, к разработанной наш теса-системы (конкуЕ-ентный . имцуноаналнз в системе ДАС-Жй). 8а

ПОЛОШгеЛЬНУВ ПрЕйИМаЛй ТУ СЫВОРОТКУ % КОЕКУреНцкИ для шторой составлял более 502. Результаты сравнительной оценки пр«едотавлен-нн в табл. 7.

Таблица 7. Результаты производственных испытаний дпагноотйчесшй тест-сис-хеыы

___ [ '-.»ЛЦ*?1? | ЧИСЛО ¡йшОТНЫХ шложи-ге, "ПТГГТ- .. — "" Л"1 н ЙОйК. Ш'А 1йНЫХ В: ^.тгт. - гид только только^ КОаК. Шн Отрицателе-| НЫХ В ОбОЙх' тестах '

\л р (ап !--- 52 5 лл 00 21 |

1 ял ; аи 18 0 г* ( А ! (

( Л^л ' 1 »чл 1 .-.у 1 20 I — 1 0 л л II 1 '' \

Как следует из данных по колхозу Борец, приведенных в таблице 7, полоайзельныш во всех трех тестах оказалось 52 сыворотки, что составляет 33.7% от общего количества исследованных енворотак;

отрщательйык«! во'веёх тестах оказалась 21 сыворотка (14.4%); отрицательными в ВД и положительна в конкурентном МФА оказалось 68 сывороток (46.6%); дали положительную реакцию а Рад и отрицательную в конкурентном УМ. 5 *нв'-роток (3.4Г).

Из полученных в •: - - ".'/-Мн^ии на базе MEA данных следует, что все 20 оы-пгн-itmk tiü«nwv illl'j" pcoihülw d r„~. скатались ПОЛОЗйЬ^паг-л r rvKKy;*HTHQM Ш; из 19 сывороток отрицательных в РИД 11 оказались положительными в Шк-, негативный результат в обоих тестах дали 7 сывороток.

Данные по сравнительной оценке методов на животных ОНл-МИС показали, что, как и в пр-едьйущем случае, все 4 »азотных у которых антитела к БЯ KFO не были обнаружены в конкурентном Ж, были отрицательные и по данным РИД, Из II животных отрицательных в ?ИГ в конкурентном ИФА антитела к ВЛ К?С были обнаружены у 7,

Таким образом, во всех трех случаях новая тест-система пока-а-ла преимуон-ства по чувствительности и процент выявляемости с ее помощь^ инфицированных .тавотных был существенно выше, Негативные результаты определений.с этой тест-сиотнмоб пшга подтверждены негативными р—ультптами в РЯД Во случая/., кроме пяти сывороток коров колхоза Борец, Это расхождение мы склонны объяснить неспецифической реакцией в РКД, Однако доказать зтого нам по техническим причинам (выбраковка коров и т, п,) не удалось.

Таким образом, проведенные испытания показали, что разработанная нами тест-система для выявления серопозитивных в отношении ЕЯ КРС животных пригодна для практического использования и обладает преимуществам перед используемым в настоящее время тестом по: скорости обнаружения антител в пробах сывороток крови; специфичности; чувствительности; воспроизводимости и стандартности результатов. -.

• - - 21 -

tuiyyííli

m гт it n

1. ОййИИЗЩЮВаННай ТеХНОЛОГИЯ ВЫраЩИВаНИЯ Латентно Нйфй-цщюваншй вирусом лейкоза КРС клеток ШО-ЛО путем культивирования на шкроносителе - ДЕ«Е-се>±брозе в роллерном режиме, позволяй^ получать препаративные количества вируса с кон-

ТшычмиПмйи ЫиГ|Ш|йЛи ый MÛUÛÛ Í |П|^ I Í н

ЦСИ-ГУ-Ту yrcft ЕИуЕЬгйУй П" нспет; iU г- i I—L

2. Разработаный метод очистки вируса лейкоза КРС в градиенте плотности перколла, позволяет получать в препаративных количествах вирус лейкоза КРС, пригодный для использования в гииридомной технологии н содержащий иш-актный оболочечный гжкопрютеид gp5i.

3. Разработан метод скрининга - моноклинальных антител к ЕЛ КРС в культуу-альной и асцитической мдкостях, а так «з мышиных сывороточных антшелв ТФ Шк с использованием для сенск-бклизшгии твердой »азы очищенного вируса,

4 Шлучено й охарактеризовано по культуральным свойствам 6 стабильных линий гибридом, 'продухрирущих На к вирусу лейкоза КРС. ''."•■■

; 5, Научена агаивность полученных шноклональных антител в райиойымунопр«ецЕШэацш!, ЕШк, Рйд, ТчгМй, ДАС-КЗА. На основании -втих данных отобрана гибридош 2F1, продуцирующая монок-щшш антитела к gp5l, пригодна? для создания теет-енетем длн.выяБления вирусных антигенов и противовирусных антител,

б. Разработана тест-система для выявления сывороточных антител к вирусу лейкоза КРС, основанная на конкурентном взаимодействии моноклональных и сывороточных антител за связывание с Gp5í,

- £2 -

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРаД®ЗЕгЗт Рекомендуюетоя для внедрения в практику Набор препаратов на ^'ноклонасьных антител для диагностики лейкоза КРС твердоФазным иммуноферментным методом (Временная итмпиплпю п.-

^ой.. « п..н-г.«.я». "-"лра ПрСПйриГГЕ Па ОСПОЬе -".'яулл/аагшиах ШТИ~

тел для диагностики лекоза КРС твердофазным иммуноферментным методом утверждена 30.09.93; 1?зтодичеекйе указания по диагностике лейкоза КРС иммуноферментным методом с использованием моноклинальных антител утверждены 30.09.93 ) .

Для использования в практике научно-исследовательских работ -ндг/г'.-я ттзы очистки вируса лейкоза КРС (^тодические ре~ - --дни по получки*) и очистке вирусу лейкоза КРС утзерлденм

- 23 -

Список работ, опубмкоБ&йных по теме диссертации

1. Малоголовкйн С. А., Штин Ей., лижинекая Т.П., Перзашкевич Б. С., Реутова Е. Г., Власов а А., Малахова М, С, штоды очистки вируса лейкоза крупного рогатого скота в градиенте плотности пер-колла //Тезисы докладов конференции "Вопросы ветеринарной вирусологии , микробиологии и эпизоотологии", Г. ГЗОКРС'В, 1990,-с. 74-76,

2. Малоголовкйн С. А., лижнская Т. И, Малахова Е, С. Реутова Е. Г. Отработка методов получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота в культуре клеток при различны*: способах, культивирования // Тезисы докладов конференции "Вопросы ветеринарной вирусологии , микроб ИО Ли г ИИ и эпизоотологии", г. Покров, 1990,-е. 76-77.

3. Малоголовкйн С. А., йшнская Т. Е , Реутова Е. Г. Получение гибридом и моноклинальных к вирусу лейкова крупного рогатого скота вания // Тезисы докладов конференции "Вопросы ветеринаркой ВИРУСОЛОГИИ., ШфОб.ИОЛОГЙИ и эпизоотологии", г. Шкров, 1992,-е. 336-337.

4. Малоголовкйн С. А,, Штин Е К., Вшиская Т. Е Гфименение мо-ноклональных антител для диагностики лекоеа крупного рогатого скота // Тезисы докладов конференции "Вопросы ветеринарной вирусологии , микробиологии и эпизоотологии", г. Покров, 1992,-с. 337-336.

5. Реутова Е. Г., .Сургучева И.М., йшнская Т.Е, Соловкина ЕМ., Стришков А.&, Тмот ЕЕ Сравнительная оценка различных методов иммунизвциипри получении гибридом и ®ноклональкых антител к. антигенам вирусо возбудителей сельскохозяйственных животных// Ъ-зисы докладов конференций "Вопросы ветеринарной вируеодолш ^ мжробиологии и эпизоотологии", г. Покров, 1992,-е. 344-345.

"^нск-я Т.П.. Колосова У.: , Сидоров С. К. С>п<аботка условий

У;•е-гНИНГйбрйДОм И гибридных КЛЕТОК при НИЗКИХ температурах // Г-Г И'-в "ОН^е.'"НЦИИ "г вет-ринернои вирусологии ,

^.пКЮкилигий и эпизоотологии", г. Покров, 199?,-с. 349. " Реуто-

гг, 7.. 7 . .. _ л поддд^п^

клеток мыши // Тезисы докладов гон^ренций "Вопросы ветеринарной вирусологии , микробиологии и эпизоотологии", г. Покров, 199?,-с. 350-351.