Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение куриного гормона роста методами гетерологичной экспрессии и изучение его свойств

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение куриного гормона роста методами гетерологичной экспрессии и изучение его свойств"

рг8 од

2 5 апр 1994 ' Российская Академия наук

Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта

На правах рукописи УДК 577.214.62

ДЕБАБОВ ДМИТРИЯ ВЛАДИМИРОВИЧ

ПОЛУЧЕНИЕ КУРИНОГО ГОРМОНА РОСТА МЕТОДАМИ ГЕТЕРОЛОГИЧНОИ ЭКСПРЕССИИ И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО СВОЙСТВ.

ОЗ.ОО.ОЛ. - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 1994

Работа выполнена в лаборатории гормонов и рецепторов Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгарлта Российской Академии Наук.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор П. И. Рубцов.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, С. И. Леев (Институт молекулярной биологии им. £. А. Энгельгарлта РАН);

кандидат химических наук, В. П. Вейко (Институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов ).

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:.....• .. ■

Инженерный центр "Биоинхенерия" РАН.

с •

Зашита состоится » ГОда в- № часов на

заседании диссертационного совета Д.002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской АН по адресу: 117964, Москва, ул. Вавилова, дом 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской АН.

Автореферат разослан С*лл.п£Л-Э\ 1д94 г>

ОБЯАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

•улльность работы. Соматотропины (гормоны роста. ГР) представляют !оп гормоны полипептидноя природы, синтезируемые передней дслеи юфиза. ГР состоят из 190-191 аминокислотного остатка 1а. о.) и !*>т молекулярную массу 22 кД. Сомгтотропины выполняет множество 1кция в организме. Их оснозная Функция - стимуляция соматического :та. Кроме того, ГР обладают диабетогенноя. инсуотлюподобноя, 1бодической и другими активностями. В отличие от большинства ргих гормонов пептидной природы они видоспецифичнн.

Гормоны роста были одними ¡¡э первых белков, полученных методами ютическоя инженерии. Это было связано с необходимостью наработки ¡огенных препаратов этих белков в значительных количествах как для широкого изучения, так и для применения в недишше и сельском )яястве. Так, использование ГР человека гает возможность !ечивать карликовость, или гипофизарный нанизи. Введение ГР ¡ьскохозяйственным животным позволяет увеличивать привесы при ювречеиноя экономии кормов,' а также повышает лактгнкю у коров. 1чительныя интерес представляет получение гормонов роста птиц. :кольку птицы обладают двумя лимфоидными орггнакя. тимусом и !рициевоя сумкой, продуцирующими соответственно Т-лимфоииты и жмфециты, они являются уникальными объектами для изучения влияния на иммунный статус (Marsti et al., 1984).

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования !ялось получение гормона роста кур (ГРК) методами гетерологичной :прессии в Е. coll, очистка и изучение сеоястз реетмбинантного >мона. В хога выполнения работы били поставлена и решены следующие

задачи: 1. Конструирование ялазмид, содержащих нуклеотидны*. последовательности зрелого ГРК и его делеционных вариантов, находящихся вод контролем триптофановсго промотора и промоторг уридинфосфорадазы Е. coll.,2. Создание ряда конструкция с различным! регуляторкыыи элементами и сигнальными пептидами, предназначении» для изучения секреции ГРКв с. coll.3. Получение штаммов, содержащие полученные пяазмиды. и выявление экспрессии генов гормона роста кур и его делеинокных вариантов электрофоретическим м иммунологические методами. Подбор оптимальных условия индукции. 4. Очистка рекомбинантного гормона роста кур. Секвенирование N-концезоя части молекулы. 5. Тестирование рост-стимулируоюэи я лактогенноя активности полученного препарата.

Научная новизна и практическая ценность работы. Создан ряд экспрессиснншс и секреторных конструкция, где экспрессия^ ГРК нахоаится под контролем различных регуляторных элементов. Получены штаммы Е. coll. обеспечивавшие достаточно высокий уровень экспрессии гормона роста кур (около 10 мг/л культуры, вышедшей на насыщение). Отработана методика очистки ГРК. Показано, что рекомбинантныа ГРК обладает биологической активностьо. Это дает возможность выделять гормон роста кур в препаративных количествах, достаточных для биологических испытания, что необходимо как для изучбния гормональной регуляции у птиц, так и для возможного последующего применения в сельском хозяйстве. В ходе работы получены также штаммы, обесдечиваяаие значительные уровни экспрессии делеционных вариантов ГРК. Они могут быть использованы для изучения структурно-функциональных соотношения в ряду соматотропных гормонов. Кроме того, в связи с имеющимися данными о влиянии структуры

N-концевой области белков на их секрецио I Model et al., 1990), полученное делеиионные варианты могут быть использованы для изучения секреции гормонов роста в Е. coll.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены ка Всероссийской конференции "Новые направления биотехнологииПугаино, 1992 на семинаре отдела генетической инженерии ИМБ РАК, г. Москва, 1С94.

Структура работы. Диссертация состоит из сведения, обзора литературы, посвященного гормонам роста позвоночных згкотных, а также метода« оптимизации экспрессии чухерэдных генов в бактериях Е. coll, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы 1131 источник). Она излохена на 118 страницах, содержит 22 рисунка 3 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. 1. Создание конструкция, поелназначенныу для изучения экспрессии ГР

курицы и его делеичонных вариантов в Esherichla coll.

Ранее в нашел лаборатории была клонирована кДНП.. кодирующая ГР

курицы я определена ее полная нуклеотидная последовательность,а

также сконструированы векторы, . давшие возмо^яссть получать

значительные уровни экспрессии сома~отропких гормонов (Euttsov et

al., 1591). Е литературе имелось большое количество данных о влиянии

различных факторов на экспрессии ГР в Е. coll . В частности, было

показано влияние последовательности, кодируопзея П-концевые

аминокислоты,' на эффективность экспрессии гормоьов роста свиньи и

быка (Tonlch et al., 1ES9, Movva et al., 1984). В связи с этим мы

решили сконструировать рекокбинактнае плазккды. колпруош^е синтез

Рис. 1. Схеиа удаления 5 -Концевой и части 3*-концевой области кЛНК ГРК.

полноразмерного ГР курицы (ГРК) и его делеиионньпс вариантов под контролем ряда регуляторных злементоз и исследовать синтез этих белксз в ргзлччних пггаммах Е. coll.

На pise. 1 показана схема удаления кз кДНК TFK 5 -нетранслируемои области, сигнальной последовательности и части 3 -к&транслируемой области. Плазмиду pCGH2 12вирблис и др.. 19В7) расщепляли рестриктазами Hlr.dlII и BanHI и вчдсяялм фрагмент размером 479 п. я., содерташмя 5 -концевус часть и ВИС ГРК. Данный фрагмент имьет в своем составе два сапта для рестркктага HlnlII !изошизомер HlalII), один кз которых локализован в районе колона Hete; ГРК, а другой находится ближе к середине кДНК. Поэтому фрагмент подвергали частичному гидролизу HinlII в предварителъао подобранных условиях и выделяли из ПААГ фрагмент размером 34-" п. н.

Параллельно.проводили удаление большей часты 3 -яетранслируемой области к ДНК ГРК, т. к. при работе с ГР быка било показано, что эта часть кДНК прегятствует ее эффективной экспрессии в Е. coll. Для этого плазмиду рССН2 расщепляли рестриктазой Ncol, присоединяли к ней линкер HlndlII и после обработки рэстриктазаим HlndlII и BaaHI выделяли фрагмент размером в 236 п. н., представляющий собой укороченнуа 3 -концевуо часть кДНК ГРК. Этот фрагмент встраивали в pUC 19 по сайтам BanHI и HlndlII. Полученная в результате плазмида р5ССН2 была использована в дальнейшем для созданпя конструкции кДНК ГРК., способной к экспрессии в Е. coll. Плазмиду рбСОЙ. растепленную no EcuHI и BanHI сайтам, лигировали с фрагментом "344" и с алаптором, солержашм липкий конец EcoRI и кодопы ядч первых пяти аминокислотных остатков зрелого ГРК (последовательность адаптера см. sa рис. !).

Такоя лигазноя смесью трансформировали клетки Е. coll TG-1,

среди которщ с помощью рестриктного анализа и последующего

секвенировашш были найдены клоны, несущие плазииду рССНех.

Полученная таким образом плазмида рССНех содержит

последовательность, кодирующую полноразмерныя зрелыя ГРК.

В литературе имеются данные о том, что делеция нескольких

аминокислот в 5 -концевоя части кодирующей последовательности ГР

приводит к погашению уровня их экспрессии в Е. coll. Для выяснения

влияния таких делеция на экспрессию ГРК сконструировали делеционные

варианты кЛН£ ГРК с использованием нуклзазы ВаШ. Плазмиду рССНех

гидролизовали рестриктазоя EcoRI. Несколько аликвот линеяноя формы

плазмиды обрабатывали экзонуклеазоя ВаШ в течение различных

промежутков времени. Далее смесь обрабатывали фрагментом Кленова

ДНК-полимераэа -*1 •• в- присутствии • смеси четыре»

дезоксинуклеотждтрифосфатов (dNTP) и "пришизали" к концам молекул

EcoRI линкер. содержащий EcoRI-сайт и ЛТС-кодон:

, _ ,

5 -САТАСА ATTCKTG—3 . Смесь молекул обрабатывали рестриктазами EcoRI

и BamHI, продукты гидролиза анализировали в 82-ном ПААГ и оценивал!

изменение длкш EcoRI/BamHI фрагмента.

Для препаративного растепления выбрали условия, приводящие i

делеции приблизительно 15 п. н. Продукты гидролиза после

^— 32

соответствую®» обработки и "пришивки" Р-линкера фракционировали !

SX-ном ПААГ ■ выделяли из геля радиоактивную зону, соответствуюшу!

длинам фрагментов 340-360 п. н. Полученные фрагменты клонировали i

плазмиде pUCJ9 по сайтам расщепления EcoRI/BamHI, выделяли и:

нескольких ионов • плазмидную ДНК и определяли границы делеии!

секвенированаем учаспса, прилегающего к EcoRI-саяту. В результат!

доведенного анализа была получена серия плазмид рССНэх. __plLZC&.'îex

риССёНех&З

ptlEC¿HexZ7

>Т6 TTC ССГ GCC A TG ССС СТС ТСС ;t Pht Pre Ata -let Pro Len £er

s •••-••- ■

Рис. 2. Границы делеиии последовательности, кодиругвея N-концевую часть кДНК ГРК.

На рис. 2 приведена часть куклеотиднол последовательности кДНК ГРК и показаны границы делеция 5 -концавоя области в отдельных плазмидах серии рССНэх. В двух плазмидах ATG-кодон, следующий за EcoRI-галтом, находится в рамке считывания с кодчрушея последовательностью ГРК. Это плазыиды, кодирудае ГРК без трех Н-кониевых аминокислот 1рССНехЗЗ) и без семи N-концевых аминокислот (pCGKex67 ). EcoHI/HIndIII фрагменты из этих плазмид, содерзаае делеаионные варианты кДНК ГРК, были переклонированы в вектор яля экспрессии, содержащий промотор trp, по тоя жэ схеме, что и кПКЬ ГРК из рССНех.

Для изучения экспрессии ГРК и его делеционных вариантов в Е. со 11 мы использовали вектор с промотором и эффективным участком инициации трансляции 1гр, сконструированный и успешно применявшийся

источника кДНК ГРК использовали полученную нами плазмиду рССНех . Ее гидролизовали рестриктазами Klndlll и EcoRI, выделяли фрагмент размером 650 п. н., лигировали с вектором, растепленным по тем жэ сайтам, и полученной рекомбинантноя плазмидой ptrpCGH, а такзв полученными аналогично плазмидами ptrpCGH63 и ptrpCGH57, трансформировали штамм Е. coll DH-1. Схема плаэмиды ptrpCGH представлена на рис. 3.

ранее в нашей лаборатории для экспрессии ГР человека . В качестве

EcoRI

'ind Mi

Рис. з: Схема слазимды ptrpCGH.

При изучении экспрессии ГРК в полученных штаммах нами было установлено, что индукция ИАК практически не. замедляет роста клеток по сравнение с контрольным штаммом, не содержащим плазмиду.

По-видимому, в количестве нескольких процентов от суперного белка ГРК не является токсичным для клеток Е. coll. Кроме того, в нашей лаборатории был получен штамм, даюшия внеости уровень конститутивного синтеза ГР быка. Исходя из этих данных представляло интерес проверить возможность синтеза ГРК по* контролем конститутивного промотора. В качестве системы, содержащей такоя ip0M0T0p, мы выбрали вектор рШЛ8, сконструированная в лаборатории Зиоорганическоп химии ЕНИИГенетика и любезно предоставленный нам »вторами. Данный вектор представляет собоя плазмжду pUClB с {локированным по сайтам SacI и BamHI участком длино» 169 п. н., :одержашим регуляторные элементы уридиифосфорилазы Е. coll. Ранее на )Снове этого вектора был получен высокий уровень экспрессии (до 130 (Г на 1 л среды) белкового ингибитора лротеаз эглинз С б Е. со 11 Велко и др., 1994 ).

HlndlII АВ586 5'-ТААССТТТСССТСССАТСССССТСТСС-3 ' -

в П1 5 -BglIIATCcGH 5'-TTTTAGATCTATCCCTCCCATCCCCCTC-3 '

ис.4 Структура олигонуклеотидов АЕ-586 и 5 -BglIIATGcGH, спользованких при получении экспрессионных конструкпир.. Выделены асти последовательностей, комплементарные гену ГРК.

Ген ГРК амплифкцировали, используя в качестве матрицы плазмиду сСНэх I рис. )), а в качестве праямеров - олигонуклеотжд АВ586 (рис.

41 и универсальный праймер. При этом получали фрагмент размером около 600 п. и., в котором ген ГРК фланкирован сайтами HlndlII. Фрагмент гидролизовали рестриктазой HlndlII и клонировали в вектор pUCia, расщепленный по тому же сайту. Ориентацию гена ГРК определяли с помошыо ашшфикации. используя две пары праямеров: АВ586 -универсальный и AB58S - реверсивный. Далее проводили амплификацию, используя в качестве матрицы полученную плазмиду pUC18cGH, где ген ГРК находится в обратной ориентации по отношению к PLac, а в качестве праямеров - олигонуклеотид 5 -BglIIATGcGH (рис. 41 и универсальный праямер.

Вот HI

Рис. 5. Схема илазхиды pudpcGH.

В результате получили фрагмент, содержащий ген ГРК,

начинающийся с

олона АТС, фланкированный с 5'-конца сайтом BglII я с з'-кониа актом HindIII. Полученный фрагмент клонировали в вектор pUU18 по аятам ВашН1 и HindIII. В результате была получена плазиида pudpcCH рис.5), в которой расстояние между последовательностью SD и ГС-кодоном составляет 6 п. н., что соответствует оптимальному ^сстоянию при экспрессии эглина в данной системе . Полученной лазмидоя трансформировали штамм Е. coli С-600. Первичную структуру :ех фрагментов, полученных амплификацией, подтверждали гквенированием.

Ранее для секреции ГР человека и быка использовались шструкции с различными сигнальными пептидами (Gray et al., 1985; lang et al., 1987; Hslung et al.. 1986; Klein.et al., 1992). Уровни жреции, полученные в этих работах, значительно различались, [стоматических -исследований, . оценивающих, одновременно несколько кторов, влияющих нг уровень секреции ГР (промотор, участок ициации трансляции, сигнальный пептид, N-кэнцевгя часть гена, лбвия индукции и культивирования )' не проводилось. В- связи с этим решили сконструировать ряд плазмид, кодирующих синтез ГРК с гкальными пептидами щелочной фосфатазы (PfcoA), белка внешней мбраны (ОпрА), белка AS. aureus(ProtA) под контролем промоторов р, tac, lac и 1pp.

Плазмиду pUC18cCH гидролизовали рестриктазоп HlndlIII, выделяли агмент размером 600 п. н. и клонировали его в векторы ptrpPhoA, kPhoA и pkkProtA, полученные в нашей лаборатории. Ориентацию ределяли с помогы рестрикционного анализа по саятам BamHI. В ?ультат° были получены плазыиды .ptrpPtoAcCH, pKKPhoAcCH и CProtAcCH, показанные на рис. 6. В этих плаэмивзх кодирующая

последовательность гена ГРК находится в раша считывания

Рис. 6. Схема плазмид рггрРЬоАсСН, рККРЪоАсСН, рККРгогАсСН и рН^отрАсСН.

с соответствую»«« сигнальными пептидами. Последовательности мест стыка между' сигнальными пептидами и-ГРК показаны на рис. 7.

Для получения плазмиды р1ЯопрАсСН плазмиду рггрРЪоАсСН

гидролизовали рестриктазами ЕсоЩ и Н1псШ1, выделяли фрагмент размером 600 п. н. и клонировали его в вектор р1НошрА2 по сайтам ЕсоИ и Н1п(1111. Затем гидролизовали полученную плазмиду

рестриктазоя ЕсоЩ , и обрабатывали экзонуклеазоя Б1 для удаления »

выступающего 5 -конца. Концы затупляли фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I, лигировали и трансформировали полученноя ЛИК штамм ТС-1. Среди полученных клонов отбирали содержащие такие плазмиды, у которых отсутствует сайт ЕсоМ. Затем плазмиды из отобранных клонов гидролизовали рестриктазами ХЬа! и ШпсПП, выделяли фрагменты размером около 700 п. н., содержащие сигнальный пептид-и ген ГРК, и клонировали эти фрагменты в риС18 по сайтам ХЬа1 и Н1пс11П.

рГНотрАсСН

рггрРЬоАсСН рККРЪоАсСН'

рККРтАсОТ

А О А ССС САС ССС

Т N А АСА ААА ССТ

А N А ССА ААА ССТ

А М Р Р А ССТ АТС ТТС СТТ ССС

Р Р А М Р ТТС ССТ ССС АТС ТТС

Р Р А М Р ТТС ССТ ССС АТС ТТС

Рис. 7. Последовательности мест стыка между сигнальными пептидами и ГРК в соответствующих плазмидах.

Полученные плазмиды использовали для определения последовательностей мест стыка сигнального пептида и гена ГРК секвенированием. На основе данных ¿еквенирования отобрали клон, где последовательность гена ГРК

находится в рамке считывания с сигнальным пептидом ошрА. Схема плазыиды plttompAcCH показана на рис. 6, а последовательность места стыка сигнального пептида с геном ГРК - на рис. 7.

2. Изучение экспрессии ГРК и его делеционных вариантов в coll под контролем различных регуляторных элементов■

В -результате выращивания культур на богатой среде YT и минимальной среде М9 синтез ГР обнаружить не удалось. В то лее время добавление fl-индолилакриловой кислоты к штаммам, содержащим плазмиду ptrpcCH, приводит к индукции синтеза ГРК. Электрофорез лизатов всех полученных штаммов Е. coll представлен на рис. б, А. Как видно из рисунка, при электрофиретическом разделении суммарных белков штаммов В. coll DH-1, несущих рекомбинантные плазмиды, выявляется - дополнительные полипептиды, отсутствующие в дизате штамма-реципиента. Электрофоретическая подвижность этих пелипептидов соответствует ожидаемой для ГРК и его делеционных вариантов. Обычно полосы на геле, предположительно принадлежащие чужеродному белку, идентифицируются методом иммуноблотинга с антителами к соответствующему белку . В нашем распоряжзнии не было очищенных препаратов ГРК и, следовательно, не было возможности получить антитела к нему, поэтому для выявления ГРК и его делеционных вариантов методом иммуноблотинга мы использовали поликлональные и моноклональные антитела к ГР быка, которые, как нами было показано, дают перекрестную реакцию с гипофизарными препаратами ГРК (см. рис. 8, 5). Видно, что в каждой дорожке геля выявлялась одна полоса, соответствующая по подвижкости исходному

а" В

Рис.б. А. Электрофореграмма в 12Х ПААГ лизатов штаммов Е. coll, несущих плазмиды: 1-рЬСН' (контроль); 2-ptrpCCH; 3-ptrpCCH63; 4-ptrpCGH67; 5-штамм, не несушия плазмиды.

Б. Фотография нитроиеллолозного фильтра после иммуноблотинга лизатов штаммов, несущих плазмиды: 1-рЬСН (контроль); 2-ptrpCGH; 3-ptrpCCH53; -4-ptrpCCH5?. . гормону и его делеционным вариантам.

Условия индукции подбирали, измеряя относительное содержание ГРК в клеточном лизате по данным сканирования геля. Для количественной оценки экспрессии ГРК использовали метод иммуноферментного анализа. Оптимальные результаты были получены при проведении индукции в диапазоне оптической плотности D550=0.1-0.2. При этих условиях относительное содержание ГРК и его делеиионных вариантов составляло приблизительно 7-1 OS от суммарного клеточного белка.

Для количественной оценки синтеза ГРК использовали также сравнение интенсивности полос на геле со стандартом. На гель наносили лизаты штаммов Е. coll, содержащих плазмиды ptrpCCH, ptrpCGH53 и ptrpCGH57, а также ряд раззедений контрольного препарата ГР быка известной концентрации. Интенсивность окраски полос сравнивали визуально.и по данным сканирования гелей. По результатам этой оценки и по данным иммуноферментного анализа уровень синтеза ГРК составляет около 10 мг/л.

Оценить уровень экспрессии ГРК под контролем промотора udp и в секреторных конструкциях не удалось, т. к. он не превышает пределов чувствительности разработанной нами тест-системы, основанной на антителах к ГР быка.

Результаты работ по конструированию экспрессирующих векторов для синтеза ГРК и оценке их эффективности суммированы в таблице 1. Как следует из таблицы, наиболее эффективный синтез ГРКнаблодался при использовании плазмиды ptrpcGH. Б связи с этим в дальнейшей работе использовали стаммы, содержащие эту ллазмиду.

Таблица 1. Экспрессионные векторы, предназначенные для синтеза ГРК и оценка их эффективности.

Название Используемый Сигнальный Ожидаемый Эффективность

плазмиды промотор пептид продукт синтеза ГРК

экспрессии мг/л

ptrpcGH trp - МетГРК (1-191 ) 10

ptrp53cGH trp - МетГРК (4-191 ) 10

ptrp67cGH trp - МетГРК (8-191) 10

pudpcGH udp - МетГРК (1-191 ) <1

pKKPhoAcGH tac PilOA ГРК (1-191 ) <1

pKKProtAcGH tac ProtA ГРК (1-191 ) "<1

p.trpPhoAcGH trp PhoA ГРК (1-191 ) <1

pINompAcCH lpp, lac OrapA ГРК (1-191 ) <1

3. Очистка рекомбинантного ГР курицы.

Основные стадии очистки ГРК приведены в таблице 2. После разрушения клеток ультразвуком и центрифугирования суспензии ГРК тестируется во фракции, содержащей нерастворимые Оелки и фрагменты клеточной оболочки. По-видимому, как и в большинстве описанных случаев экспрессии гормонов роста в клетках Е. col 1, и в нашем случае ГРК входит в состав нерастворимых телец включения. Белки нерастворимой фракции были подвергнуты электрофорезу в редуцирующих и нередуцирующих условиях. Независимо от условия полипептид, соответствующий по молекулярной массе ГРК, не менял своей подвижности (рис. 9, дорожки 1, 10). Это свидетельствует о том, что

ГРК в тельцах включения находится в неактивной, восстановленной форме.

Поэтому нами била предпринята попытка получения ГРК в активном, растворимом состоянии. Для этого фракцию нерастворимых белков и остатков клеточных стенок обрабатывали сначала раствором 1 М сахарозы, а затем буфером, содержащим лкзоцим, тритон Х-100 и ЭДТА. При этой обработке удаляются остатки клеточных стенок, нуклеиновые кислоты, липидные компоненты и большинство белков. Полученный после центрифугирования такой суспензии осадок содержит ГРК в составе телец включения. Результаты электрофореза белков, содержащихся в этой суспензии до центрифугирования, представлены на рис. 9 (дорожки 2. 9). Еидно, что подвижность ГРК на этой стадии не зависит от присутствия В-иэркаптоэтанола, т. е. гормон находится в восстановленной форке. Для перевода ГРК в водорастворимое состояние нами был использован 5 М гуанидин-НС1 в присутствии ТУЕЕЫ 80, как

Таблица 2.

Выход ГРК и степень его очистки на основных стадиях выделения.

Стадия выделения ГРК Выход ГРК,г Содержание ГРК, 2 от суммарного белка фракции

Осажденная биомасса 100

Фракция телец включения 100 40

Растворимая фракция

после диализа 30 >90

это было сделано для растворения ГР угря (Suglmoto et al.., 19911.

Для ренатурации ГРК его раствор.в 5 М гуанидин-HCl подвергали диализу против 10 ыМ трис-HCl буфера, рН 3.2. Как известно, диализ представляет собой мягкую .процедуру, способствующую окислению растворенным в воде кислородом воздуха восстановленных форм белков. Ео время диализа часть белков опять переходит в нерастворимую форму. После центрифугирования белки растворимой и нерастворимой фракция анализировали с помощью электрофореза. Как видно из рис. 9' (дорожки 3, 4, 7, 8) в нерастворимую фракцию перешли белки мембран и приблизительно половина ГРК, в то время как во фракции растворимых белков не менее 952 составляет ГРК. Кроме того, при нередуцируюгох условиях вес», ГРК как в осадке, так и супернатанте представлен одной полосой, соответствующей молекулярной массе 21 кД. При"переводе в редуцирующие условия полоса ГРК перемещается в зону, соответствующую молекулярной массе 25 кД. Это свидетельствует о том, что в результате диализа весь ГРК переходит из восстановленной в окисленную форму, т. е. происходит образование дисульфидных связей в молекуле белка, обусловленное наличием двух пар остатков цистеина . Таким образом, в результате приведенноя схемы выделения и ренатурации ГРК из клеток £. coli приблизительно 301 искомого белка переходит в окисленную растворимую форму.

Соответствие первичноя структуры выделяемоя из Е. coll формы ГРК структуре природноя формы было подтверждено секвенированием N-концевоя последовательности белка по методу Эдмана . Определенная последовательность Mst-Phe-Pro-Ala-Met-Pro... полностью идентична соответствующей последовательности природного ГРК за исключением N-концевого метионина. Его наличие обусловленно тем, что для

создания участка инициации трансляции вместо первой аминокислоты ГРК был встроен инициирующий кодон АТС.

Рис.9. Злектрофореграмма " в 122 ПАЧ~, не содержащем В-меркаптоэтанола (1,2,3,4,5) и содержащем В-меркаптозтанол (6,7,6.9,10):

1,10 - Фракции телец включения. 2,9 - Фракции телец включения после промывки. 3,В - Нерастворимых белков после диализа. 4,7 - Растворимых белкоэ после диализа. 5,6 - Маркеры молекулярной массы.

Стрелками отмечено положение полос', соответствующих восстановленной • и окисленной формам ГРК.

4. Биологическое тестирование ГГК.

По данным тибиа-теста на гипсфизэктомированных крысах .ростстимулируюшая активность ГРК, содержащегося во фракции растворенных белков после диализа, составляла 0.4 МЕ/мг (табл.3).

Известно, что гормон роста человека обладает лактогенной активностью, тогда как ГР других млекопитающих не обладают таким свойством. В связи с этим интересно было проверить способность ГР кур взаимодействовать с рецептором пролактина. С помошью стандартного теста на клетках пВ2 лимфомы было установлено, что ГРК, так же как ГР других животных, не обладает лактогенной активностью.

Таблица -3. ■ •

\

Результаты исследования биологической активности рекомбинантного ГРК..

Группа животных Количество Лоза препа- Ширина зпифизар

животных рата, мкг ного хряща, мк

Отрицательный контроль 5 - ■ 152 ; 7.1

Стандартный ГР человека 6 ' 20 224 - 3.7

Стандартный ГР человека 8 60 263 - 12.0

Рекомбинантный ГРК • 5 20 " 221 8.Э

Рекомбинантныя ГРК 6 60 227 ; 4.0

ВЫВОДЫ

1. Сконструирована серия плазмид, содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие зрелая гормон роста кур и его делеционные варианты под контролем регуляторних элементов триптофанового оперона и уридинфосфорилазы Е. coll.

2. Получена серия конструкция с различными регуляторнымн элементами и сигнальными пептидами, предназначенных для изучения секреции гормона роста кур.

3. Изучена экспрессия генов гормона роста кур и его делеаионных вариантов в штаммах Е. coll, трансформированных полученными плазкидами. Показаночто наибольшип уровень синтеза -гормона роста (около 102 от суммарного белка кльтки) наблюдается в штампах, содержащих последовательности, кодирующие гормон роста кур и его делеционные варианты под контроле;.;" триптофанового промотоЬ'а.

4. Проведена очистка рекомбинантного гормона роста кур. Соответствие выделяемой из Е. coll формы гормона природноя форме подтверждено секвенированием -N-концевой части молекулы. Показано, что в случае гормона роста кур N-концевоя метионин не процеесируется клетками Е. coll.

5. Показано, что выделенный из клеток бактерий гормон обладает биологической .активностью. ■ .