Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение иммунобиологических препаратов с антимикробной активностью на основе лейкоцитов человека

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Получение иммунобиологических препаратов с антимикробной активностью на основе лейкоцитов человека"

научбаисслщоватечьсюй институт эпидемиологии и микгобиологаи 1м. н.ф.гамалеи рамн

дамский научнаисспщоваттьсигй институт вакцин и сывороток им. ИЛ мечникова

гул «иммунопрепарат»

На правах рукописи

ХАФИЗОВА Лариса Губаевна

ПОЛУЧЕНИЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ С АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТЬЮ НА ОСНОВЕ ЛЕЙКОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа 1998

Работа выполнена п Уфимском научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова ГУП «Иммунопрепарат» и научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН

Научные руководи!ели: доктор биологических наук, профессор, член-коррепондент РАМН В.П.Кузиецов доктор медицинских наук, профессор Е.В.Бобкова

Официальные оппоненгы: доктор медицинских наук Н.Н.Ворошилова, доктор медицинских наук, профессор Ю.А.Медведев

Ведущая организация: Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарассвича Министерства здравоохранения РФ

Защита диссертации состоится «_»_1998 г. в_часов на

заседании диссертационного Совета К 084.71.01 Уфимского НИИВС им. И.И.Мечникова ГУП «Иммунопрепарат» по адресу: г. Уфа, ул. Новороссийская, 105.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского НИИВС им. И.И.Мечникова ГУП «Иммунопрепарат».

Автореферат разослан « - »_1998 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических наук

В.П.Головин

ОЕГЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Значительное место' з патологии человека, ежегодно унося по данным мировой, статистики более 22 кяллионоз жизней (Каззипин С. М. 1997), занимают инфекционные заболевания.

Развитие устойчивости к антибиотикам и другим химиспрепаратам, шзрсхо прикеняекшг 15 качестве эткотрспнггх средств (Карпоз В. А. с оогвг. 1985, Кузнецов В. И с соазг. 1539, Сгтазх Ы Я. с ссглг. 1993), - не единственная пэкгекеа неэффективности проводимой тератжя. Развитие дксбахтериозов вследствие подазления нормофлоры, з также итяхуносупсесскрукнцее воздействие лекарственных химконрепгратоз, нередко длительно иркксн£ею£х з высоких дозах, усугубляет иммутюсузрессизный эффект юо-робаых тсхжнга и гнззшз (Слезен IIЯ с ссгзт. 1927, Гансза Л. А. с ссевг. 1996), что ведет к фсршхиаккю вк^ешк йюдкздвфкц игоа, прээдг всего по гшегснБому типу (Рггпидзза Р. А 1982, Ускчзпю ЕМг ооззт. 1932), обужоагрзгютсдх сетжлие уровня азшглщзсб1юй защигш.

В связи с этим внимание исследователей з последние годы направлено аа разработку и пржеЕшгяге при иафанзшных заболеваниях юг/зтежкй терапия, Еозотгкщей гдалунсбиолспкзские прекЕрать! С аЕггамкфоб'Ем эффектом, обусловленном кия прямым зсздсйстзкзк на зззбупзгаля, зг:с и аккуепояашым дексшаем, стаиутздкхшм заданные механизм и вед/щм к огиккигзг-^ вззбудеган нз игагйе

Клетей зрош человека мсгуг язжъся сырьем ля пагсучк'жя разлосбгазнкх Ёшшш гшзаах. вродугст. Тех, з цгашазвве нйЬрсфялшкх гранугазцягав ждер>кпся мэпоперог-осщзза, лахгоферрин, лгзсгзм, различные гггаишме бзлхя сбйдасв® сильными антодгафобныш сшжлпзамя. В тяфющгх, нсшрофешах, бгзсфзсзх, эозикофилах, лсопскупнх, касофаггх содержатся леГэгяризвы - мгзгбслгяы петвдажзсй кззкгск, озезквеешцз влияние на тсжнне иъшувгкх процессов (Соо&га I 8. 1985) и аккмииЕцгю возбудапаля из гаганизма йзхшопскулярзне фракции лсы-социЕргтого /г-злижга еодсрнат трансферфгктор, обпаггюаэет, согласно зтжримеигашаьм (Уш В. с! а1 1986) и мзокниспевньм юинкческям (1>луег 1 М 1923, Уш О. !.й ± 1933, О., А 1985, РасжЬаз Н Н. 1987, и йЗяа 1987) ягйиоданЕШ, тккгжвгачвгаой зффешэнсско цра инфеггционг-юи шгатпги.

Было зьжвлйш прогекшнсе действие ншкачых, сяицзнных и режбйкгншмх тцрфканоз з огеопкяии г^ккхпл! Ье^р (ТаЫ К. е£ е1 1970), Тохайкта ¡ркй, Онгпзу'йа {гасЬсю££в ( Бклёкжяв! Р., К.у(е1 М. V/. 1973), СосеЗа Ьахей (Ткгш 1.& а1 1934), Шске&га ргоадажка (Тихо I, МегЬгй П. V/. 1984) и д-зужх. БЬзддее позшзано, что пвсквгрзпалыгое ¡ведение а- или [З-ж-жрферог-з заязгщало жжхлеых от ¡инфжцяи, зьпзглкой За&оооеЗа йвз (Фаичаксз И В. с соазг. 1986,1987), 8. агав (Зуева В. С. г ссеиг. 1985, СпивахИЯ. сссазт. 1983,1984).

Акшиикроблью эффекты в^хшзвгов кжкрффона, окгзазассз« влияние ьа раззжиз ккфащгонэого процесса, рёиечкыми 6сшришк, обусловлены

СЕкгезяругощймсж в процессе юЕфффоаож-кщюгшпзкгом щпгсхиюв (Моисеев Э. А, Кшаш Е. В. 1971, Д. Л Esшз с ссазт. 1983, IIК Скзгх с соазт. 1933, Евгнш Б. А 1S33,Зуеза Б. С. с соазг. 1585, Бзжныккй С. Н. с ооазг. 1983, Degree M В., RMîoim G. 1988, Sdrnfe 1983). В часпкети, ашибгжгсриашкЕС зффегаы альфа-, бега- и гамма-ЕнтерфероЕоз саязываюг с гаэдукцг-кй ФКО -a (Vet. Danse et al 1937, С&a et allS87, KchasectaL 1986, EduaiibBcâîtidss, Young L. 1988).

ФНОа катается одним m клкужзьк цшгохкноз, участвующих в заэдяппых р££Щдях в оошг на бакщкатшую шжрекцшо (Iviasdl D. N. et si. 1%5, Waam 1986, Kindamri d. al 1988), рггулйзтующнх безскрацдарке функции навдрофклоэ, Езетгруювцих к усиливающих их фуисщжшЕную акнзгюсп. (Sullivan G. W. et al 1922, СашрЬей P. A d al 1990).

MfiŒTOKK-ïse актершенты понаши, что ФНСкх зггщиЕгт or кафкцжовгння С. гЬхсааз (YeodaiscEi A eî е1 1939), Mycofcaciaiira avium (Birk С. M. et d 1990), L. mcaoqytegsnes (Havel E. A 1989), ираводат к унйчюжашо матярииньк ппзжодкг (GiiFcn: G. E, i-î:ck D. A 1983), гозьясзег кишкнг st/ipKcxio'nic; возбудителей, ширвмф Tiypmasraa câà, может окнмвзгь шнищрусный зффекг (Ку1жцозВ.1Х 1989,MestenJ.eiaL !988),зьш!В2ясглешнзноецкг1ток№^ га кпкшнепши, шфицаразгниые ДНК- и ИЖ-вирусаьш (feo M., СЩаЕеу J. А 1987). Мшгае тииы кгсеиж, инфицированные багофиши, становятся шетет^гстзжкъньас! к цтотшскчзским эффектам ФНОа, Ешофздашззо разрукшвш шв^щювгжьк кяепки (ГраСненко H. И. с совет. 1995,HswdIE. А 1987,1989).

Высокая биаигаичсская ахшвжхяь ФНОчх в реахщях за^пы

от инфжцшнньк анщ его спошбноеть к сшфтчесхому дгкегы-зо с <x-, ß-, у-инкрфсраяЕми (Бтарат Бхасаи Anupja;: с соазг. 1997) и Еедасгаиявзе сэдчЕюканж: s коммерческих препаратах шперфераги доагаг актуальной задачу дакшипизнаго пса^еа жяакшашетаФНОчх. ,

Для производства человеческого вирусиндуцирэвакнсго лейкоцитарного интерферона иамк^от дорогое и дфпщкее сырье-лейкоциты периферической крови доноров. После сишеа шгерферога «слрйбопшшьге» лекхоклпы сохраняют высекло (до 80 % ) жщнееаособзкхль (В. II Хуг::г;оз с ссезт. 1988), однако по технология производства после сняия интерферона ж считают отходом праязквдява и батывз не используют. Поэтому поиск возможных путей более полного .изшльэованая такою дорогого и дефицитного шрш, как лакшиш оериффичесюй гехжа человека, яншется весша аиуальпым.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Целью настоящей работы явилась разработка новых методических подходов к комплексному использованию лейкоцитов периферической крови человека для полученная лекарственных лренгргтов саяшмифо0:юЗ

глсгезкосшо.

ЗАДАЧИ ИССЩДСВ АКИЯ:

1. йяпадозаиЬ воаазкааль баоскзпзг ФКО-а з щххзссе нЕЗзхЬерошгсгггза с

испжьзозгнхем свежих и «сгргбстЕшгкх» че.юзгха

2. Ййучеть вжмскшагпь пдагсажзго использования лгйкгаципюз после з?г^2?су15фазгнного сягзсза а-ипесфгсонг дж тгсучяния лечебного срепагша с ЕЯЕзносЕьгс фасгера пергюса

3. Ракрабогггъ метод контраст сжцнфнежом гкшвнйст цсгшргяа с гкгхнгзссога ¿>?:<тср.1 пераюсг.

НАУЧНАЯЕСБЖНАРАБОТЫ :

Впервые кзучгш вет»юкЕоспз. ЕЕГ^равпдаххо бисск-пен ФЫО-а «01рйб£ла?ж!ымк» (гоше бзосингсза (х-ггпгф-Р^к) вейкощпгми челозгка с цгпыо тпусотм г^гщхтесодфшгЕдего пршгшга с г2пи5эхгдх»шшкн ахкзюсгао.

ЕЬхгкж зашншосхь Есгальзозаг-к в зоивсгве идожтааз гака ФИО-а мэдвшддагаэгщда (МДП) и его СЕЛпетческшо прсззволзюго - лигзкянройя-К-гЕ^гшгосстзгет^-мдаалзд^етгЕда (.'л/7,1 :-1~\Тг>.£). Определены уокозяя бяожнтеза ФЕО-о. «зхрабшгшнжя» лейксципагяа с елжпьзсззегш грймкга и осчэтеенэй шщухнки глурж.оэдшатшдзгги и ищссм БШ, очжцезюым ргцрЕбахгзЕьм нами способом (патент Роосимокей Федзраащ № 1705615,1993), позжвшсщим шфггзгЕЬ его

Иссседавана летебяня и прогехжшгя зффгшсжюгяь п^гйрага, папучгнкога по ркрабоганой технолога! на основе повторно гтадаьзуемък леймвдпхв, на зксгЕримеэтапзЕых моделях сяпьмсзегкззрюй, кщщдсзжй и грзпгкггси кзфскцгй. Р<Ерсбс1нн метод контроля жившетг полученного вргзрэга с

еюкзносшо фактора герзюса

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ:

ПЬкайяа возможность имшекспсго истльзозгшия лейкоцитоз ид2-«фйржса«й крови дгтотоз и авдвнкя безотжднзй технжзпки ггрошзодства кетерфжска Дано гжспсримешалшсе обоажзйЕиг способа получения на ;юйтщпах после жфусэдлувдровшпюш синтеза ишерф^р013 плйокешзснх) прегарзпга, содфжащгш ФНО-а, обздйющего аншмжшобаой гхтвнсстыо.

Разработана тскшкяпя ;кгу;сг;з; иммунойаолопг-гэст-ето препгргпа с гнпаоЕдх&гыми своиявами, ссдеретцепо ахпЕзюяь фактора переноса, га союзе «офабогеЕшх» лейюцитоз, исЕ^пъзуемкх псскг жзужс^щмшгяхзго сикгеа жгагрферогш.

По результатам кшвдозашй сформлки Еармякшю-тждашяя документация

рПР и ВФС) т. «Тражфоккн чапкжгазасЕЙ сухой для аньасгй».

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на рссяублкхансхой научной конференции «Иммунобголзгкчесже препараты» (Уфа, 1985), на республиканской научао-пргхгичесхой конференции «Вопросы медицинской биотехнологии и иммунопреяарагоз» (Уфа, 1988), на научной конференции «Итоге научных исследований биологического факультета БггЕХкрсхого государственного университета за 1995 год» (Уфа, 1996).

Структура к объем диссертация

Работа изложена на 107 страницах машинописного текста, иллюстрнрозана 15 тгблиЕами и 2 рисунками. Она состоит из взедення, обзора литературы, собственных исследований, заключения, еыводов. Список литературы содержит 141 источник отечественной литературы и 274 - иностранкой.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы ксследозання

В работе ишальзозавы шргбопсаяные леиизцдаы доясрскш крови, юяшг госте синтеза инщрфарона, лгйккзеы свежей донорской гоози, перевиваемые кшвные клгг;<к1-г929. Использованы мкше белые беспородные весом 14-16, 19-21 г, мъшш линия БаГЬ/с весом 14-16 г, кролики породы Шиншилла весом 2-2,5 кг, морские саинки белобокие зоссм 200-250 г.

Для кхарагазедгЕИЕ ксдхькьк к-йгеск кгкизжшзы шекм № 415 (музей культур П1ИИСК »г. Л. А Тарешжа), вирус хрипш А/Викюрая КЗ № 2 (ВШИ гриппа АМН СССР), вирус баяезки Шквата (ВБН) шеем. "И" (ГНЖСК т. Л А Тарасеж-на), везккугацжго сгоздлиш (ВВС) епшк "Иул^ез!' (ШйлСК им Л. А Тдвсешга).

В качестве ашигешз испагаьзозгны: агашек из СажМг аЬхгщ (кавдвдан) (ШйЭМ, г. Казгаь), гриппозная: вгвдана МТБ (НПО 'Иммуггог^-Ергг'', г. Уфа), РРД (ГКИИСК ем. Л. А Т^ехнйче), гергаичогкгя вакцина (Одесские предприняв го нра-нзодству баюрешрегов).

Окзсфофоот^стритас^о хЕреетерикшу кргнараш. проводили на епкарофоюомеаре СФ-26 по соотношению ошезосхой пинносга 1512 длинах волн 260 и 280 нм, обищй балок определяли методом Лоури (Ьсму О. И А й. 1951).

ХрсмЕтаграфркс-гик профкль' прзжрага с гкгавносгаю фактора петеазса получали гугсм хрэ&!Еззграф2и его га колонке с ультрагелем АСА-202. Высока колошей 650 мм, дааыетр 20 мм, рабочий объел 136 мл, свободный объем 50 мл. Ба шпгд'

шзхявася: 1,5 uz срэзрЕГЕ ; хскцещидаей батка Ю ш/мк. Згвдео преводасн нето^-фссфгззалл буфером со скоростью 4 гск/сгу.3 Ai . Контроль за разделением прегврза по фреюкям проведали на хротлвотрзфг с самописцам (ффсде 1KB ).

¿mzrcssrssgtessscyr-o гкзезсзь пргпгргэ. с гжжэнокко фактора sspœoœ сагадик з рггзвди ГЗГ z МИФ. Сазздзпапа ггст<з?:ссги нрозодкли

модигфйцфовгякым методом (Гсясзкн В. П, 1589 ), а&этзкзгя нэдгве термояетия миграции ( ИМ %) ео формуле :

S 2 опыт

Hfv4=--х 1 СО %, где S2 - гажида гжращо!

В2юшропь

ьекрофегез.

рбэуззлнт стжиеи

При постановке реаквди гиЕдадшЕигаы-кхлж замрджакош таги (ГЗГ) использовали в ха^зегзе гяжгена sprapoic-irsi бгрела (ЭБ). Ptex^so всспро-сж>даз1 у мкевй кутей вауджакшей (в<в) ккмуювецги ОД ш 0,025% реотзера 2Б. Одновременно с кщуняхцЕЗСл, го 2-е и 4-е супа поддо-шо (в/к) вэсдага каокЕушый проперат в объеме 0,5 мл. Рйзргпзакяцую дозу ЗБ (0,05 мл 10% взвеси) вводам нкуфкможно (й-с) з шдушечхи зздзкх лат на 5-° л 7-е сунет, едгзджегаго кзздя з про:гакжат:ожнь;е жзан в таких >ж обьемгх физжкзетчззи^ растор. Учет рзгзцжг ГЗГ презодалк через 24 '¡asa жопе ззадг=кя рззраиотзгй дозы ЗБ. Резулынг оцлззага по увсяизшио веса дики с вычжлшием ищжеа реакции (ИР) по формуле (РД 42-28-1090).

Для пзгггзенхй сж^фичегзесй регшгя ГЗГ к зивдашу Еретзгяювш пролегая выбор ашмниих доз эпитета и срскоз учета резуньтанв. Реалию ГЗТ сшили ка белых беспородных мшпах шссой 15 ± 1 гремм, распредахзшьк в три группы по 10 мъзией з кЕХ-дай. Жгэопгым двух групп вэащст подкожно з область хошя ш 0,75 мл препграла в pasедегга 10 "3 к 10 А , эхкзекным третьей rjTynnbi (ккпраль) гналежш ззодали 0,9 % pscisop xnopira кзаппия (ф:®алспихэжн рзлзер). Через 24 часа мышам всех групп в годушечки зздивх лап вводили по 0,04 мл с 50 мкг гЕпигеа из Candida aifciœrs. В щиуятяхя тдугах задних лап еэсдшгя по 0,04 мя рагпюра Через 24- часа после ззэдения азпигена

(разргхжгг) окредаили г¿носу йдгих лап, стеечеЕЕаых сгропэ по гсленсетошюму суставу и вычисляли идакс отечной реакции (ИР %) по фортлуле :

Р опыт - ? г-ехпроиь р= _---- X 100%, где

Ркошроль

Р cisït - esc лапы, з кзгарую был взгден элитен ; Р козяраиъ - вес лапы, в кищруга нзедкга фсетсшогжезЕЙ рт.стзаг

Из аанаций гввят опжчеой ркгкш у каждой кошта группы зычкспели ергивий шдасс в группе, предпавшзющ и! собой арадаее арифмегкгееског зшченге.

бгкщвшщю гхоазогаь х^лплозпеккэто нага Ерепгргга с елееззсшо фохгора переноса сцгкизаля в системе пфкггонеашще макрофаги мышей ВгМ> З/^тзегкй! (№|ег V. А 1587) с нычинтгази азшмжфобноло ивдгкса (АМН). Г-С5/:ЗТГ.Т сжгли АМй <^70%.

С&таашэтаг-гук) иЕфгэд^о всспраиэвсекпи путем зфанзния бгспфшшьк белых мыши весом 16-18 г зз/б введением клеток 5 • 105 БаЬюаеЛа Иу^ктшиш

Эдахфимешалшкй хрипи у белых мышей юсом 16-18 г вызывали лугом ешре22епы5аго веэдекия под легким эфирным кепкою,: 10 ЬД 50 вируса шаиа А в объеме 50 мхп.

Цжераг ТФК езодеш Х1ри зетх^римапальньк шфекцяях по ейгадтап^м огат: при салшошшезшй гафащш - ыодкгахеэ по 0,5 мл сооаотдвующзгт) резэздгнзя аа 2-4-6«з супя гжхж заразная; при гране у мьзгай с прсфалакшческой цзлъю хтргсграх взодага по 0,5 кп пздкошю за трог сухсх до ххизашых, при

изучении язчебного деялвия - 4-крЕпю ш 2-, 4-, 7-, 9-е суп® после зараякакг в таи хс обнме. Зф|ж1кш10С1ь терапии ТФК оценивали при летальных к-фаздиях по Быхошекосш на день полной габзли засизопшх з иежпрелыгых группах при сальшкажзнзмзЕЖ псрлЕ-шв и григаозной 1жвшзк-:.

Дои<пшнчеаяос нзучяаие рзакгогашосш и иммушлхкчзгкж бзззрэджети поведаю в шлветехзки с ргюмэздадаки РД 42-2Е-8-89 и РД42-28-10-90.

Использовали отедющгв ирггЕретк итдзферозЕ: для енынцкй,

Ергйягаташрй собой ерзшрег кггезффаск альфа и Егвшинаа, при

¡получении которого кешльзгааи вдцяодй способ снясш-; (шшшигя ишужабдарбхщи, >дкмгогрефия на сефвдассс С-25), чешзотескжй лзщшдагирный интерферон (ЧЛИ) для вшрсигшяшго иркмеягни», ижке^кзоей препгрег, Еьзсускаемый разными 1ргжпрекзнши стрены, в технологии которого (язетка не предусмотрена, рааферан - ржзм&ванизый шш|&2-к-1тфффзн, прокззодлвг "ЗИЗЙМ" (гВашыноо), в техкшзган изэтхезлкиая которого используется хиглкажая и ИММуНСССйрб15К5Н32д <НИСТ2.

Исковьзоваь! шпееейш сгс^х Кг 199, Ила (НПО "Вектор", Козсеибарк), сопеаке расгоорьх Хеикса, Эрзи.

Ижщьзованы сызорсма единого рошего скота и эмбрионов коров произюдсхва моакозаано мжхжокбизааа и НПО "Вектор".

Для кццукций синтеза фе-сгора некроза опухолей (ФНОа) иеттьззаапи МЦП (мурамвдажтвд - ГМДП-1у&-й. (лш'г

спфсиьН-а1ршжш<жпжЕ!ь№му^ тпучнзкые в ижппуге

бкоорггжчгесг-сой хешш ем. м ii швдяккж г^ьэхфсг/. ащх):квзй Тахьгяой а 'шкхз вирус бзлезнл НькзкггЖ (ЗЕН), очищяшый от алпаыхшжых 6эж»ра^бсгагншмЕа\и(х<хх^м(1ззшгРФ№ 17(6615,1993).

В работе вшользоваш 1юписульфдаоиь!е таиа Р1МК 00005, РТСС 00005 с пактом отсекания га кагнсуп^кЕё махе 300 - и 10 кДа соохвеюташно фир?л>: «Мипещ») (США).

Куииизаракний вкруса балез-ет Быокаш (ВЩ), н^уса везж^отрюго снжапса

(ВВС) и биосинтез кгярффсаг трсждили по Ратаяопу прсялодсгег чаш&аахго лейкоцитарного иягерфЕрга-а № 231-90. Дня ицду1<ц?зя ишерффаидхисза использовали ББН, очищеяннй от кснтжинирзтацж ¡примесей акшпсжЕЮй жадта™, разрабаташгкм нами способом (ХлеЬюязэ Л. Г., Есбкога Е. В., Патент РФ № 1709615, 1993 г.).

Для покушения футтиотгалы-хй ахпинсстк дсймоцихсз прозодклипхкйминг чегазезкзЕМ яйхсетпггкк иЕгтетфсрснсм, несся eoIOO ®дац акгиэнзста на ка>кдый мклссг-ср среды.

Активность ФКО-а опрздагхли по czrox:«s?so8a^ действию на чувстзнтетыгые язпя L-323, сфабопнпгъгг ажгЕншщяЕОМ Д (Щетлозитозэ О. Н. с осгзг. i960), принимая за чшв единиц гаваазяи то развздззкз, которое вызывает 50 % -кй лонже клеток. 1 ед.ФНО-а осотзегстзует 25 ¡ют резюмбиггинош ФНОкх (Я К Мжукоссоезг. 1991).

Праташвярусную гкяйиссгь интерферона опредатата микромегодом по згдфше цетотшического действия ВВС, кзетого в дозе 100 ТЦ Д з культуре дашхидаых челозсягских фибробластов линии M-I9. Активность выражали з меящународанх единицах (МН), реесчипиных по ТЕцгсналпнсму реффенс-протграху Рю , г-згсгош^гозому з НИЙЗМ им. Н. Ф. Галилея.

Полуляционнкй состаз глоеоиукпегроз изучен с ешдо розгжсобразованзя с эритроцитами барана и эритроцитами мышей и по адгезии макрофапв на пластине (ПТвттаия В. Л с есезг. 1937). Q/боспуюЕдаоЕНЫй соспш Т-лкмфсцшсз и количество акпизЕых Т-лямфоцяшз изучали по БршепЕобраэозанжо (Лаюзой В. II с соззт. 1936). Процент хсшесподабных клеток юодоткшваш но искпкукгжо тришнозого синего 0,25%. Пошету отмывки мемброн ст шнеерзаша (формалина) штрещрезгли по ФС 42-344 BOSO.

Стггшспг-гескую обработку результатов проводили ебтцегрешьми методами (I Ьлякоз И. В.. 1975).

РЕЗУЛЬТАТЫ И0СЛЦЦ03АНИЙ

ПОЛУЧЕНИЕ ФАКТОРАНЕКЮЗА ОПУХОЛЕЙ- (ФКОсх)

В процессе индукции ишерффОЕОпенеза параду с дзушми щгокинами нрижодит синтез ФНСкх (В. П. Кузнецов с еогзт. 1991). Являясь одним из кпгочезых цщокиноз, участвующих в жщепнкх реехцЕЯх оргатежа ври бетгериалкеой инфекции, и обладая собственной антимикробной йхейензсш-з, ФНОкх сбсгапгет потенциал иммутвСиатап^теской акп:зт:ос;и ;аггтр;хро:а

Ерозеденное нами определение содфжания ахганэосги ФКОа сокззшо разное его содержание в различных кс.ммерчзских фосках игт^фдрока: з лейкинфераее - 256 ад^дт ФКОог, в резных «хриях препарата для жгренгзального применения, полученных в ГУЛ «Иммудагфелараг» (г. Уфа) - от 4 до 16 ед/мл, в реаферсне, наказном этгепрзотей гена альфа-2 компонента ЧЛИ в Е. coli, и в щубокосшщетнюм человеческом

лейяагшчрнас ншсрффовг» для Ийьекцкй ФИО« не о&шрз&жзагкж. 3»: докьк отгасукгая с лпершурныш (Кузнецов В. II198'/, Кузнецов В.Ис соазг. 159!., Н. В. Варданян с ссазг. 1552,ШзоизНг 19Ш989).

Большие ргзличкя в холжеетвозом содержании ФНСкх в цяродных препаратах кнкрффжа сваш с -гсхнсгалРЮОЕИз оаобкшяши -их. Ешхгговдения. Су11зесщу:-сщиг технологам палучам цраЕражз кндаж®?01"32 имгкгг

даыо шдчеззе нрепгретоз с еысокой гзшзктусной гхпзшогпго к ке язлеогся сяпкмаг&ньаог для бносантка других гдашинсз, в чагшосш ФНОчх. ЦрседтагапгрЕКсе то технолопзс гржекезге 1% перешей водорода, низких зка-ккнл рЯ (рН 2,2) для офабсгски юлуфгбркэзга с цзлыо ишпведки нирусазощуюсора и щааа «шовзю ¡риугешукщах вирусов, Бьнвдзаегре^ушзЕВ ФНОа (Н. В. Вгрцгнш с еоезт. 1592).

При изучения юзможыояи повышения; выхода астизгюсш ФНОа, ееми гкрзанаяиьно ишждоваа даалика синтеза ФНОкх 1ва издукции ЕШ в доз 5 ТЦД на лейхщкг ноже правздзния праймягага. Вкшхи для гапредэвим ахжанссга ФНОа обкради та кавдыг 2 ЧЕ£а ЕвЗпюдазиз вали в тшеииз 4В часов (тгйл 1).

Кз результата, пр%ставлгш:кх в тгбшщз I ¡кдаэ, чет лекккщгш скшезаругог ФНОа (шузрмзззо с ккЕрфэронок. Однако, пих оо&ршт <Ш&а в культур^лкгой среде щвксдаог ¡г 22 - 24 чаа 1$ясг2афсвани>; тогда ках миекмЕсшое еедэраггзае кш^зферанг кабс-одагхся к 14 -18 яжу с ккиздукхцам агшЕнзш паров к 24 - 4В чгсш.хулмздароагжя, чга свидетельствует о вздзишояьэонгши яеокзцглъш ргзгрза б^осишезаФНОо. '

Предполагая получка даютвпешьиый выход ФНСкх в процвхе шперфероизгаяеи мы вши в тешсшпичетсую схему после 1файмкнга к 20-минупкзй варугаой щдукцкн второй квдукгор - МДП В гашралшом опьгее исшиъзозан топи ВЕН. Оказалось, что при зглх условиях и в оаьпе и в КЕ-проп; СЕпенруггся одешизсе количество ФКОх В ж условиях яейзкхлы, продугзфующие йкгерффон, Ее сл-х^хлг-г щ введение второго кадуютсра

Учгяызгя бсшез Ерздагазгпэдьньй ЕЕрЕод псодукцж ФНОа по срззжнэо с кщерфгрсг-гом и выссжуго жазявсгюсобяаль лжказгада гож бжикиезг инкрфгрскг, мы в гождующих опьлах, да синтеза ФНОчх исполкювага «отработанные »

лшеоциш.

Известно, тк> ез ргшобразнкк ищуктороз синкза ФНОос вирусов (Вет4 8. Ь. <х а!. 1986), лжгаиписах^гщш (Хаитов Р. М. с скгзг. 1995, Рг^а М А. с; е! 1993, ЕкЬга 8. й а! 1989), тошезш рж-фочханнжов (¡ке;гш Т. й а! 19®), муршл^эдшпяпвдоз, (А. Л РахглЕКйзан с соёвг. 1989, ВйзехЕо С. А, Кпг££Г I. М. 1986) и других агентов, шаботам гзскЕкымк ш^ииргми ФНОк шшх мурегшщигшсвд^шжу К1А г! 1937). А олсуствке собсгвелЕой ккмузгогсккосш (Аоуг^ Т. сС 1978), бьгстрсз внзздегай ш фжкша (Еаржкшй И. Ф. с ссезт. 1989, ААт А.ес а1 1981, йЛза А М. 1924) использойгаке в ишжке определили выбор К^ДП и его прогазеддоо (ШЩП- 1ув- й) в кжсгаеицг^ш^роздаябхосзштаФ

Тэ&5Ед1.

Дазккка сж деза ФНО « в продесое кперферонотелеза

1 .....' ' -----' ' ! Время шша нъгемех | стнхжшсжхен ' (чзс) Выход ЕХЕЗЕ-Юлей !

ПВАсд'-кл ОНО ед'кл

1 0 0 о !

2 830 8 I

4 800 16

6 800 16

8 800 16

10 800 16

12 803 16

14 •6С0 16

16 ;бш 16

18 1600 16

20 800 16

22 800 32

24 800 32

48 800 .. 32

Сравняете сжсобнссхи «эрашдажпцда (МДП) и ж^дастЕрсня-М-эдгпкпжздетж^М-^^ (ПУЩШук-й) эдауцфсзггь синтез ФКО-а

«офаботаиыми» дайкодоами показало более зыануго щвужгорвую ешвесснь у П*4ДИуз-й. Эля результаты согтагдвдгся с а^пазжзЕннымз з латкжурных иегачззлеах дазпымя, но хоторьгм б?"сшгячэская ахшаксеть ряда аналогов мураглидпдашвда и их проюводаых зззиекг ог их хшжтахой аруктуры (А. Л Ргшкпеззя с гаазт. 1987, ОгеишюзаЕ. Н. с соазг. 1985).

Оптимальная издзкщрукяцая доза иежггнжх нами иддукгораз составила 10 мхг/ш1. Согласно гаубликозанЕЕЕм дашя достовернее позьзпсиис дщжжоячносш кейгрефкшз происходит при дейсшии 10 мюткп муремзодагжпда (В. В. Кулакова с ссенг., 1997).

Шщщирухящя активность ксаншнных гщцухговез ее «сяработаяЕЖ» лейкоцжах зависела от уелезий проведения биосинтеза. Без прздззрг-ссшгпй обработки лейдапигоз (срайкЕНгг) шлкчэяяо си:ггезирозз:шош ФНО-а не превышало 2 ед да 1-10^ лейкоцитоз, в та врекя как з условиях с г^енъезгом кхцуцрруг-онзая активность кццукгароз возрастала и количество еижзирозаннсго ФНО-а увеличилось в 2 — 8 раз и сошвйло для МДП - 8, а дая ШЩШуз-й - 16 сд на 1-1(Я клеток. В аилогачных ужзиях, з хетрешюм сапе, ВЕН обеспечивал сшпез ФНО з г-согачестве 4 сд на 1-106 клеток. Полу^кнкб результаты сопшсуккта; с слуОпЕЖзасБага, ко которым

прдаг^гющ-заг етжуЕироЕгнйг монсгзужезрав HHrqpdxpoECM вызываю усиленна

На основания гфозедгзшх сгапсз уетансежкэ, что юлучикь ФНО-а етдар:<звд-!й прсврвг 12 саргбживах. кйкяиш. шш rça т«шзовднЕИ iz-iiyKîcpca в следующей пэслздозгшкьногхЕ; сгчат счжцекный Б5Ц злгем мурамшщшяшда (ЦДЛ или ГМДП-fys-sî). В зппях условиях щцуцирующая дои вируса кхшег быть .Х2;ч;::с:п-.::а снижена (с 5,0 до ОД 11Щ ш лейхэцнг) (te&l2). Кстаьзазг-ггс сч*щзашго ЕБН шмаляет (по ддг-ежы ИФА) избех-сть кзшаь&зшзи преснрггг озальбумЕном к друттжи ашкгенама. гшапоигшж аддаосш.

спсеболашгкми ГйЖРГйЕ

I Ьавдшкзинхяь ипеоегия ищуккзроз Кшцсшрада щцуклзров: АзаизнояьФНО ед/МС^лсэз цжгов

ЩПиШДШуий (мжкл) ВБН(1ЦЦ)ш1 лейлщаг

ЩП+ВШ 10,0 5,0 24

ГМДП-Jys^+BEH 10,0 5,0 8-16

вне+шдп-iys-si 10,0 5,0 32-64

ЕЕН+ШДП-b's-si 10,0 0,1 32=64

вш+мдп 10,0 '5,0 8-16

вш+мдп 10,0 од 8-16

МДЦ 10,0 0 24

ШДЩуэ-st 10,0 0 8-16

ВБН 0 5,0 24

ВШ 0 0,1 est

Такой подход поволит более полно кснзнъзозжъ гогенцяалънке еозможнскля лгжоцигав дощраоой и получить дохккигелыю цйгохйпэддежщй пр£1:аргг ка отработанных лейшщшх.

Kqjehccibo сишезщзшанрюго через 24 чага ФКЗ-а ш отработс-еых лежоцккх при ицдувдш сдоим ВШ оссяазига 2- 4 ед, а с Евздашем вюрош ицдукгора - з одгюм вгригнте опыта МДП, в другом - ГМДГ1- lys- st - выросло до 8-16 и 32 - 64 едМО 6 лейзэдеов ахлвеняэеаш.

Тахкм образом общалось, что шшсшъ выход ФКОа з процессе шлсрфераногеыезг на саежих лейкоцитах донорской крови путем наедеиж дс;хггсй-лсзкк) к (ВЕБ) второю ищухгоре (МДП) es удается, тгзс кг< при этом

не происходит амиващш сишеза ФНО-а Лейюцшы в это время жшвко гродаадчог интерферон Цразедеаке по такой же схеме сяшет ш «ограбашшьк» лейкждких, взлгых поств снягяя в которых, по нашим данным, Ефодокааекя, шрклая

к 24 - 48 часам синтез ФНОчх (табл.!), позэалиго тиучипь дошзшжшвый синтез ФНОЧх.

РАЗРАЕОТХА СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА С, АКТИВНОСТЬЮ ФАКТОРА ПЕРЕКОСА (ТРАНСФОКИНА)

3 упьтрзфсшяршнх и даашшвх лтфсжргфньж экстрактов ссщзжшся тривф5$>фаасязр который, ссгакгю згжлеадаегталъгемм (Viza D. et ai 1986) и кпшзгаеиал (Dwysr 1M 1933, VtzaB. et al ÎÇ83, Wcr/r G, Zsial A 1935, FobbsrgH. H. :>37,IiZ;frir. 1987} вгбгаодеггжш, зффгшшюсшо

щт йпфетзжкЕсй пазсисиа, зьшгной разпизнккк иЕт<робаья«я возбуцягеими.

Неакгря на зозмакЕсеть Еяелъзсзгнэ: дая полудня чадсзетаакто фгхгора переноса жгочкижз, альтфг-ЕшзЕкх донорской ;ога - г-жцдалац, лигфобяаспжтеньк линей-(VizaD.etaL 1933,MefcKrG. 1930), wc:uî (Аа'хгл 12. С-. i. е: г! 1982, Kirhrrxki M, Кя±п К J. Е. 1982) и селезенки (Asbom В. G1 1982), лйкшшл игшфгржеосой крови

Дня пслузгаия препарата с гсподкхпыо фактора nqpsioca перзо^гчгльно была иэучкш пригоддосс. грженеигж в кнеетзе сырья л&акщяпромгссьг, язлягашйет со:о.\см гаоаззодега а-ниарферока.

Изззсгао, что з бксег-апсзе ктгерфзразг з сслсзнск Ердажаг-аг участеэ В-ликфздпы и шарофап^ а Т-жетнпый ггул ссггехя прэсически ¡етзадгйяааанньэг. 3:о шегг загског зиггеки^ поскольку' именно Т-лкмфсзщга яюжотся осноня&гм кж-знвм фактора переноса (ImarN. R. et d. 1980).

ПрсэевяЕэьм анализ тздпугицетзюго и суйгамуящетивого состава леСда^-гфомзоет, взяггай после синтеза а-жперфероза, показал юлижеюеггную и фугЕщжапБпую шлиоцснжяь Т-клекгаого пула при сгсутанни сущестзкЕьж ЕЗГСТЗЗЗЙ 3 Т-кяэгок и оодгрвгиии Т-хштсроз (те5л 3). При 3ÎCM

>:жг*еспссобЕость оф"б;тлгг":лх киегок доссязла 35 %. Иззсгпю, чю жзено Т-хгааи олястся kcickiïekdm фактора переноса (TcœarN. R. et al 1920).

Для получения ipsnspaia с ai-сгазнссгью фактора переноса собранную после сигггеза шперферона лаэлмассу осзэбоэздгкл от зржрокдкв яушм их гекоиш 0,83 % ресгзсраи хлфистош аммония. От кродугссз гемолиза лейкоциты отделяли цешрифугерсшанизм при 1200 об/мкн в тетание 10 ищут. Бздосадочкую жадность слипали, а хпегкя из осада суакздЕровглзг з 0,9 % растворе хлсрщза нггрия и дважды ашывали свежими порцкши этого ж; раствора на цгщифуге. После отмквки клетки взовь супкавярозЕли в 0,5 % растворе хлср:-та :знзрия и -определяли их жкгкеспссобжяь с 0,1 % раствором чрлзгсчого с-шего. При содержании >зсиг2зеспогобяьк. клехж ке ки>:<е 80 % дезикгегргцкю срозодапи шзпс|жм

1 (к^регаым :жорЕ>хйзазжм грз -20° С и апггз-гзаЕкем nr^r 2'0° С. БэобхцпгэЕЯ ¡фашость была З5ыбрак гсслодя из прздзаригатано прдаедэлиых опытов

(ркс.1).

Из ирзведеншго ри^тпга 1 ввдно, что при проведении 8-10 вдхпов даигаиреции кродент джншграда достает 1 (X).

Пз^еЕШЫкпэугогеиатхгетсх çaхзбгзгяш. 0,01 Мш1рЕЙ-фосфа1кам ^ффом

(рН 8,5) до зкз/^зажтаой ргцзушйссо 2-108 что

согоасгтазег сок%Дйаш> сскй тесгвзэЕзккэй дик upzspzm (Бережная H. М. с ссазг. 1981, А H KÍ23 с ссгзг. 1939, Zaássr V. е£ al ¿928). Юкотй дкркг удапяш цешрифупрфозазкем при 1500 оЗДсш в течение 39 мж-yr.

. Таблища .3 Cosía лейуэдясв шахе сшнсзг а-аптафгажа

ПЗЦУПЕЦКО МНК% ÏCÎbrÎ! CCXXZ3 CyÖEOiyTsivioisib; 1 йсскл£зТ-л

Сырье

шхрзфот ш В- лимфо-цяш T-je-ж-фоадш Т- хеппсры T-qyn-pexop&î

Лсйхо-мессе cqîisa иззер- Фгяжа 17,5+1,5 3,5±1,5 49,0±5,5 23,С±4Д 2,0±3,0

Лейко- ifflsca щ ДСНОр» с«ш KD03H 18,5±1,8 28,üt3,0 60,0*5,0 30,0±2,0 2+1,8

1 23456789 10

Циклы заморажиаакия-оттаиваняя

рле. 1 д»зж*!ржц>!я лв£«0(3!к»

ЭСМОрв№тХ*Х-еттж«Я!е.

Для нздгпашя егизг-яэж^к^кй фракции, содзр>:-ецгй комнспжгтзт с ксятехугасвсй шххй еийз 10 :<Да, ссотзжлзугощгй колехулярной махе фактера переноса (Ьгигезх Е & й а 1963, Бееп Р., Мокко М, М 1955) езевоезэи последовательную фильтрацию пачучеы-:сго раствора на ка-тбргнЕХ с порогом отсекания по малезулярной казсе ЗСО и 10 кДа ооогзетизеннго.

Потученньтй тпшсмшехутврльш уоюрсфшоргг пргииаяпяя шлуфафэет препарата. Его гфсшппгряфичсская тартгржшжа получена путем фракцгошрсэгния на ишвв с упярегеета АсА 202, зффцшмвн сбгаль фгамронкроражя югорсго 1-15 кДа. Хрэкяотргфжтжй профиль гсяу-тезюго препграла к распределение весовых уаркзрзз представлены ш рисунке 2.___

Рис.2 Хрсматсгргф«ческий профиль препарата

Ш pacyme 2 второй графах (2) прздлашнег реяфздэжни» весовдх маркеров: альбумша чгшзечнсксго (мм. 680С0 Д), м*юш)бяна (км. 17 ООО), гагулжа (мм. 5734 Д), сфешокж^нсупафеяг (иш. 1454- Д): Пероьл": газе сбразуж ачетс мгр:<ф-ы с каясрв^Ей кассой 68 ООО Д к 17 ООО Д, соскпську pcspsxsgnçâ свзсо&зсгть копоей лгннт в c<rrci:-í взбй-ыенх1й32г25оафеых mecs (ICOO-15000 Д); шарай пкх vpazxeseza икупаюи, & трежй -сфешшнцш^пьфггок, Мархерь: с молекулярной г^агсой, эшзгшзьяо пргзьпшощей колехулярных нес компонентов щучгаяхт) нргпгргтг игаасдозака вгггя дня иащхэи хрзлглхтарефкдажосто црофяпя готового препарате, в который добавлен в югазязе стапэдаетсра раетвср альбумина, мажкулетгзЕЯ шхсг которого сссгаадает45000 Д.

Хромагогреглш препарата (икузюк 2) иредстгЕжза первым гргфжим (1), где ифный шк образует альбумин, втсртй, траскй и чгжряый пзки соответствуют юмпшешам, ьтехуя^ный вес шгорых i и>:се 10 кДа.

Известно, что одттж тз свсйяз içcsçsâ с ахгквяосыо фактора nspeiroea хзляетсл «гувешктельжхль к надеванию (M. Ksi cl al 1583). Для i:a;:í.r,:c¡ ка тджслабйпы-хеть nxysœszâ içeaapsr прогревали в тезгиие 30 ми^т içk 56 0 С, затек сцзшвашт его блалогшежую ахгазнсяь в FIMJI с резгаиными ангатеками и ю вдаянгоэ ее уровень шизных Т-хжфсцигов (табл. 4 ).

Табищз.4

Препарат АЮЕЗНЫХ Т- ЛИмфщЛЕ» (%) ИМ в ИМЯ с антигенами (25 ьяог/мл)

РРД Геряети- ЧКЖ2Я ВЗВДЖ Ваквдна ИГВ Хлорэд кгг£рг?ж0,9 %

Нажвнъй i íí^Í-ISÍÍ 5,4±0,3 74 ±3 58 ±6 54±7 83±6

После обработки (56°С, 301,3-21) 3,1±0,2 105±6 113 ±5 114+7 104+6

Хпорвд натрия 0,9% 2,0+0,1 92 ±8 117±6 88 ±5 100

Как ввдзэ из табктдь; 4 врепгргт мхж офабзтаи в течеаиз 30 мзкуг цри 560 С утрачивает способность г:<шз'4хвгпъ кштки, что сопвгуета с опу&шаваннымя данными, характеризующими траисферфисгор (M Ка et г! 1983).

Тгкгм образов депзьis, тпучеашге г.щ изучении физкк^химичасхих свойств препарата, шкшпншшюго по шкшекшй схеме, салвеклзукк параметрам,, х^рахкравуюацм фзкюр пграюса

3. РАЗРАБОТКА МЕТОДА КОНТРОЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЕЙ

ПРЕПАРАТА

'■'.гу?;\::о, 5 г г» фактор переноса итщуатфуег только реакции клеточных ферм итжупитгаа (Haimant J. ctaL 1970,LaswoKsI-I, Sdxswood 1974).!Введсние фактора переноса и vivo обычно приводит к появлению г2гет>!5'зсипегаЕвсгк зекздгкееш) тана (ГЗТ) к офздгпяяацу антигену, bi viro при катаете с ившшамн лейкоцитами фактор переноса вызывает их тргнофорр/жцито, гакнашнуго прогмфграцяго, и выделение ими медиаторов клеточного иумутсттста (лимфстокситта, интерферона, фгхгора, иггптбгрутотцего миграцию ьакрофагоз) (Lavwracc IL, Sáscrwcod 1974).

Известно, что акн^фкчзс<ий эффект фактора шрешеа зависит от отецафичес-юй сенсибилизации доноров (Feferssr С. А, КЫокйса С. Н. 1979). Однако для получения специфического фактора переноса подобрал» доноров, гашунных прошв определенного возбудителя, ¡фактически kchhíoxgto. Позлому в качестве фактора переноса ткредао иешрзуг-спг препарат, получегтньлй из лежщитоз здоровых доноров. При зтсм предполагается, что среди лейкоцитов есть и такие, которые савибилизйразааы против нужных в данном случае ашигшез (Петроз Р. Б. 1983). Такие препараты называют фактором переноса, хотя с;:"*, скорее всего, представляют собой ссзот-фтшссть факторов переноса

Нами ксспедозгна сенсибяжзгтяя лейкоцитов доноров к рзду антигенов и гтЕгаагацифичесвя актиакхль препаратов, палучешкх ш лейжщов свежей доторской крови (табл. 5).

Табиша. 5

Уровень сенст^ишжшзитэЬюцитоз допоров кряду инфекцкокньтх апигстз и аититшспецацкчгская активность гтрепазатез ез доносской крови _

Антиген Количество доноров Индекс миграции

мгкрефегаз

ферма монценг- общее позитив- обработан- не срабо-

рзщия ных в ных препа- танных

мкгАш FÍM % ратом псепасагом

ррд 25 122 27 5ó,Q±8,5 104,0±5,6

Гриппозная 25 122 • 67 55,0±6,2 91,0±4,0

вгхцяпа(ИГВ)

Гериепкеская 25 122 33 53,0+7,0 83,0+4,0

вактщка

Кшщцдш 10 122 нежега. 62,0±7,0 92,0±8,6

Контроль (0S 122 90,Q±4,0 100,0

% кагркя хло

рад

Мз гсжведеззгх з таблице 5 дашьк вгдао, что лйяоаиш докеров кжот высокий урозень секскбжанциз! ко всем зз^ыжгаьм аггжпенам, а препарат, яалучз-жьй ш лейжягжоз разных дшоров, кршвлЕег аншшщфжчйо активность, что согласуется с резулигтньга, вслучекЕьтки ранее дружки азгсрз.га (М. Kid et aL 1SE3).

Дчя оценки бйсгаиг-ззсяш ескзнссш прекараа ежи виальзазанЕ спооэбпоаь траЕгзфффгхюра перепоешь ГЗТ в условиях ta vivo и вызывать угнетение миграции ма:<рсфетза в условиях h. vira.

Как и другие :тмунакспкесхке реаздкя, ГЗТ хгрекгеразуекя: стзифачихпко. Бдложилепшьге кожные пробы возникают только в ответ ка введение тех гнзжшоа, которыми был Ш1СЕбйПЯ£ф03аД организм.

Длк постановки реакции ГЗТ в какесвзе шпшхжа нами использовался: коммерческий ашшсп из Candida aíoicaas - шздвднн. Выбор этого ашюека обусловлен тем, что бапыпиняво людей стаился носителем Qr/i'ú: albicans к сенсибюг-^разакы к его антигенам (Багомгетва Д. 111993, Сгейпиер Р. с соазг. 1979, Kñicpaíiick С. Н. 1978).

Предааршаано нжн были выбраны апкмаягдая юкцаяредэ! каэдщде для разрешения: в подошвенном тесте (табл. 6) и оптимальный срок скявя реакция (табл. 7).

Таблиц ó

Зазжжжкль нырзш нети реаэдка ГЗТ от кащешрадии щтжпгвмгх^зжЕозгагигатеташСЕ^^

Антиген мкгД4мл Выражавосгь ГЗТ(ИР%) . Р

20 2,0б±1,61

30 3,С9>2,33

40 3,33±1,71 в>0,01

50 9,13±U7 р>0,001

0,9 % хпордд Бария 2Дб±0,7

Разрешающею дозу аншлага водили в под^^ыки задних лак мышей через 24 чага после введения препгриа с акшзвосшо фагщра пфекоеа. Были ишьпаны тщешрацяи аншгсза 20 -, 30 -, 40 - и 50 мкт в обзл:,:с 0,04 ют. Pfer/жтат снимали через 24 часа nosrs введения гншша.

В каяеявс ошимашюй для разрешения выбрали концентрацию кавдвдша 50 мкп шраженносп» реакции ГЗТ при использовании згой концешрации быта йщбашпей к составляла - 9,13 ± 133 %, достоверно (р> 0,001) опияаяе от кошрада.

Результат опытов ш влиянию срока учета отвдифичаской акшинссш пргзграга (Г31) счратя в таблице 7.

Таблацз.?

Оагимгльный срок учета ргзушдага раавд ом ОТ

Учет мыражежсяъ ГЗТ

рсзусхътгга Р

(чг;) Опъгт Когапжь

24 16,4 ±6,64 7,2 ±2,39 р>0,01

р=0,1 0=0,02

48 13,7 ±4,13 6,4 ±3,42 р>0,05

р=0,05 р=0,1

72 14,8 ±4,73 5,4 ±1,42 р > 0,01

р=0,02 р 0,02

% 11,2±4Д5 5,2 ±1,44 р>0,05

р=0,05 р= 0,05

120 12,4 ±5,93 6,2 ±3,73 р>0,02

D = 0,1 р^0,05

Кех вудяо яз табли?.! 7, Ежбопшшя аырежяжхль рзахцри, по сражению с поа".еду!0!цкгй1 фокам скяжя результат сххягзкзпет 16,4 ± 6,64 %, догюзерш (р > 0,01) отгспгггь сг кзгязсахе, ссггазхпа 24 часа.' Этот срок и был t.-í^cí з дазкж^ггд з катаете етжмгпыгсго для снятая ОТ шов Еледег ия ргэсгснсздй дозы кгэдояка.

4. ИЗУЧИЖЕ СТАБИЛЬНОСТИ ПРЕПАРАТА ПРИ ХРАНЕНИЙ

Для излучения сухой формы пргнарага. с ахшнноспго фактора переноса кгьа ст:г:Гх";:л режим субдимахоншго Ексуижзйкэя. Для етабижйвяи сзойгга пргкгргта s rpoiyxcc сузки и хранения з кгчссяэг ск«6:-шгзз1хса был Еггюлъэован альбумин из донорской крсвя в когаягой швдяираш 0,35 % Лксфягакэ эксушеЕЕЫй препгргт щтши при 4 0 С в ттсжо Î8 чаосз. Зависимость az6:msiccm гртажа от срока хзшнзш странна в таблице 8. О шхракшш бшптгасксй гхжзнссш гари хранении судатя по епссс&осга пренрага пергжхжь ГЗТ з условиях fa \ivo. Для шягишки 131' препарат кегквзаспгн з рэззедензи 10 "3

Таблиц 8

Впижнк-s продолжигепьносш хранения га стабильность препарата

Препа- Активность вГЭТ

рат (кндсжс реант-и % )

(No 3 f/fSC. 6 KSC. 12 М5С. 18 же.

серки) опыт кскг- pCJîib оп:сг KOIÎT- роль опыт КОНТРОЛЬ опыт контроль

1 32,4 16,1 25,0 12,8 29,0 12,0 30,2 11,7

2 242 123 18,0 8Д 21,5 9,8 23,: 9,0

3 223 10,1 12,7 62 24,0 10,9 27,4 6,4

Ка:< еддно кз яризещгаиой табгашы 8 сжг^гйжегхгя гхпз-жсгв л>:сф:^2?1рсвЕг2;ого ЕрепЕрега ке утат-ЕЕглая юл яргзгнаи 15x1 4 0 С в течеже 18 месяцев.

5. БРОТЕКТКЕ-йЫЙ ЭФФЕКТ ПРНПАРАТАНА МОДЕЛЯХ ЗХСПШ'ИМЕШ'АПЬНЬГХ ИНФЕКЦИЙ

Иучегга шшвг-сезегош аншя^^шкххш) зффгт ярззгргвг, твжучгяххо со разргбслгоюй тасгапсски, прсеедеда из жигдеримешаявках моделях «алыданалкезной к 1ркпп(шой шфгкщй. Резуш-язша отражены в табшгвдх 9 и 10.

Цротаашг^ый зффэс пресзрагаз при зкшеркг/агшжсй _сальмонеллезной кафакции___

Иаъяуем^й Акикязсеть п* Кажкесж» р

ггаврат прешрега в усл. сд. ВЬШЕВШИХ животных (%)

Презаразт 1 20 20 >0,05

из отрг&згензсй 0,1 20 35 <0,01

лейзпмаосы 0,01 20 25 <0,01

-0,001 . 20 25 >0,05

0,0001 20 5 >0,05

Контроль — 40 0 .—

Црешргпг 1 20 30 <0,01

из свежа од 20 40 <0,01

лейсошгтоз 0,001 30 30 <0,01

дснсрсйхй 0,0001 20 15 >0,05

ксози ОДХШ 20 0 —

Контроль — 45 0 —

Примечания: 1) а*- калкчесзво животных в группе; 2) каспрсдыгл тргуппа

Из Ерздлаалешшх в таблице 9 резулыаюз евдео, чю кгхвдгый Еергшеденньй пргягргг, палучелый ю «слре&игннж» лейксцагоз (1 уш. ед. ешзеостй), судя по числу Еыжазших нинотеых, оказывает меяашй юетта^шнЕый эффект (20 % выэжиздих), чем даяшрж) раэедагнкй (ОД усл. ед. активности) (35 % еыжйкхех), чю, возможно, связано с Ержуюиввш в кжщнюм прекзраше кнгабетующж фкгароз, действие которых ври разведении не тркшкдая. За 1 условную едагшцу прегарапа гшнкга активность, получаемая Еря дезЕшшгргщии 2-108 л&шзщггоз (Бережная Н М с ооазт. 1981,МгцА.Нссогзг. 1939,/^¿хгУ. йа!. 1988). В параллельном опьле предарэт, жюучещьз": 23 свежгх дгжодяаш донорской 19032, в таком гаг рвазздггзи (10 "') ззщазел ох габгли 40 % жзслных. Таким обрезам, вршараш, шлучензые кз

<<стре5стенх.тх>> лейкхрнсз и из свежих лейкоцитов донорохй крови прояшюзог сравнимый протксгизньгй эффект при энснералапалшой сашюкелэтежой инфекции.

Резртьтащ испытания цратсхпнвого и дазебшго действия препарата из «отработгтгттх» зхпзхх&вв при зтспержешзлькой вкрусжй (гриппозной) инфекции у белых мътдзсй прздягалжк в таблице 10.

Таблица 10

Протекипнзе и лечебное действие препарата, полуцетшш из «отрабсЕшак» лейкоцитов при зкспермешальной гриппозной инфекции_

Есздедуехьге Эффект грнмекжкя препарата

дсаы (% выживших)

препарата профилаккне лечебный

(услед) ский

1 40 70

а=20, Р <0,05 п=10,Р<0,01

ОД 40 80

il=20, Р <0,05 л=10,Р<0,01

0,01 20 40

a=20, Р >0,05 п= 10, Р <0,05

0,С01 20 30

a - 20, Р >0,05 п=10,Р<0,05

0,СС01 10 20

и=20, Р >0,05 п= 10, Р <0,05

Физиологичес- 0 0

кий раствор п=20 п=20

Как вдцко ш средстгзгештой таблицы 10, при о:~:ср:?,:с;па~;:гл гриппозной гсжЬекцяа трнграг из «отработак-кх» псйхщйгсз оказывает гротекпшньлй эффект до разведения 10 "3 (0,001 усл. сл.) н лгиебжтй эффект до ргззеденж 10 "4 (0,0X1 jas. ед.) при введении по схеме лечения после заражения жиэашых.

Пряеетизксе действие 4ЕетсРа перекоса может бьпь обусловлено как его сйецрфицееккм Bav'.'síciBs;;»; (пфешс антигенной пзмяпг к от^зсделетзньм всзбудзжлям), хек и кеспгцЕфичессм кщфтюсп&цягзрукя'дям действием, в чнспзоспа вседгксшш га функции Екг^укохсмпетенгаьх н гегок.

Под действием траноферчетггора, с сякегаекгшм pense усилешем ккгетишсвой функции макрофагов (A M ЛупЬулпан, Е. В. Бс6:азза Î99Î), происщцигг стимуляция спещфжескош аншикфекциозсюш иммукияяа Опазфиосксе влияете па юетотный атшяшфекцйОЕгый иммунитет изучено а роаксци шпер^узстзигельшсш заагадкнного типа (ОТ) к т^поплазмаптеееккм еггц-гтгем из грибжз Candida albicans (табл. 11).

Как задга из таблицы И, достоверное со сразнентш с контролем (р >0,05) повышение индекса отечной реакции (ИР) в ОТ (до 9,5 %) вызывает препарат в

ризедаии 10 '2(0,01 усл. ед).

Нзсосагфйвесек активность претерезг фскасаксЕ в актkesjs клггсх, обзздживасаюй по ваязгакко в вдюдрзйьной фзде фахкра, икпйвдкадао ызграрс-о 1лнрофггоз (МИФ), вкдекшш) в кутътуральную срещу екшайрачазкимк яяякаги. Величина мжращти ниже 80 % саддакгослвует о продукащт МКФ сжмулированнъаи препаратом Т-лжфсщ-иами. По нашш данным наибольшую вырабопу МКФ вызывают развздеош ттреяараза 10 3 -10 А (0,001 и 0,0001 усл.ед): квдгке ккхрецгг ь^срофгтсз составил 57,43 % и 46,32 % ахлзетстэезю (табл. 11). ЕЬскапьву цх^-сдкя МИФ лнкфссзпани в знгжпельвой мере кссрелирует со стшслью сскшбитваади дафадаш, кожко Егнагеьзавгть рсакцжо МИФ как TSST дгк оценки гхпняюсга rjpesapaia с аюивносшо фактора переноса

Таблща 11

Отсцквичессая и нсслезкЬудеакаг ахгкзжхль пзжазегг

Испытуемые дозыпрешрата (успед.) Влияшзг га бактерицидную ЕК- •ШВгЮОЬ МЗгфофа гов в отношения Sdn-_i.iïa.(AM'î в %) ГЗТ(кэдекс реакции-ИР-в%) МИФ (щдежемж^ рацки-ИМ-в%)

1 83,0+20,0 р>0,05 0,7±1Д р>0,05 —

ОД 64,0±16,9 р<0,05 12,512,8 р<0,05 68,77+6,16 р=0,05

0,01 38Д±123 р0,01 9,5±1,7 р>0,05 60,30+4,77 р 0,03

0,001 80,0±13,0 - р>0,05 73±1,5 р>0,05 57,4312,75 в=0,05

0,0001 • 116,0+21,0 р>0,05 5ß±2,0 р>0,05 46,32±10,05 о=0,05

0,00001 — — 95,97±17,67 р=0,05

0,000001 — — 93,77+12,00 Р=0Д

0,0000001 — — 107,03+19,07 р=0,05

Контроль (0,9 %NaCl) — 3,612,0 100

Примечание: ^ПрйпосгатовхеГЭТтзржрдаю^^

0,5 мл; 2) В качестве ашЕтаЕспсиьзозйны зр-ороцжгы бграш. Способность препарат аюкзирозапь фуищишальную ашшаь магфофагав

шу°яз2 з i&xs бшсрзщцзяя f^-софадз з ошзага бесеркй SsümmcSa Уз прзведеязьдх в ойггпе i i денных вэдао, что басетицитегуЕО аютшосиь 1Шрсфсгсз враггоах сгамуга^узг в ргвздегжя 10 - (0,01 уаь ед.) : количество звзезгяккх хо-Енеагоссбиых гюзбусягэзЯ ткфа cezsdxcj до ЗЕ,2±123 (р<0,01).

Pía саювении 1рсзедгязьк гшазджнзЯ гогппзшы ашдфимеашлыю» проззодстэежые серки гоеанзага, ккшке изучены ее рггхгзхянсгз, безвредность и жмуншспгсесхую безопасность в ееэтзсгсгЕпз: с РД 42-23-8-439 у. ?Д 42-2S-10-SQ, в том ЧЕсга на мухагезазс1ъ, терахсгег-ессгь, змфпоететипосп.. ВгаугЕты проведанных доокгагаэсзкх исившавй гапутеихЕО rasgara псзгзгяи сто беэапкикяь и грсакгогепнссп. при введжяя зэтгрздегягпьвзде шзопгьзл з зффгаизнкх тфесевпгасзовх даэк. Оформлены кисщужтх по хзгшовпйег-ео и кошроио щшра, проекты Еременнсй ффмш<опезпюй сппьм и Зжпфжетнжо-'прох-шодстаеккого ргглакекга, проект Программа испкиийй рзаххогхгзкяЕ, бгзсзхзосж к сазфкваюй гзаггзности : затрата га сгразшадюй группе больных

ВЫВОДЫ

1. Лейкоциты гаряфесичесаой грози дспошв после кнруснЕйуцирсзгжсто сштка ишгофержа содер>:-ег более 80 % >:онзеспссобньз£ клеток и могут быть погпсрно ишапьзованы в кгчестзе сырья дга полу-:сн2£ новых кммунобиологалегазх гфетжрают.

2. Препарат с ахшвнсяыо ФйОкх может бъпъ получен при примексизг з качеств ;-:::;у-пора ШДШуз-й и МДП Нжбататзй жхед ФЕО-а досшгаслся при пржажгзетГЭДДГНуэ-йв дозе 10к<г1и2-106леж>дягоз. ОпшмашЕя схема получения ФКОчх гадерззацего препарата на повперпо шзапьзушых лейиощпзх Еолочаег ссслелозавазную кшщзжпгю БЕН+(МД11).

3. Ргзргбзша тех.колотя получения пжшреха с акгазнссшо фактора переноса (трекэфокина), нхгаочающзя дякниаридаю общего нуда даЗкжкоз, хсиапьзуэсдс после бисетпеза а-кшерффэна, и сгуяетгауго очиспсу па у&трфегяргцготкых мембранах.

4. Получашкй по разработанной 1ш:шога?юж)й стасз препарат с асшзеосшо фактора переноса (тргнефохпн) обладает ЕНП'Зжкробяой ахп-зноежо.

5. Отработан метод контроля спецпфжзгшй апзясет трансфохина в тсеге сереноса пжрчузештелькоетн заведенного типа с использованием 19Ш5плазмапзкескап> ашш'ева - хгядвдгшЕ.

анаЖРАБОГОПУЕЛИКО

!. Влияние состава кудьтуральной среды на выходъг человеческого лейкоцитарного интерферона и других цитокинез / Хафизова Л.Г., Беляев Д.Л., Кутилина М.Е., Фродоза И.С., Кузнецов В .П. // Медицински промышленность и биотехнология, Выпуск 8-9, Москва, 1992, с. 39-43.

2. Способ получения человсчесхош лейкоцитарного интерферона / Хафизоза Л.Г., БобкозгЕ.В. // Патент Российской Федерации 1709615, 1993.

3. Выделение фактора переноса, имеющего сайты аффинного связывания с поверхностными антигенами Candida albicans. / Гарипоза М. PL, Хафизоза Л. Г., Бобхоза Е. В. // Итоги научных исследований биологического факультета Башкирского государственного университета за 1995 год. Тез. докл., Уфа, 1996- с. 57-58.

4. Позториое использование лейкоцитоз после вирусиндуцированного синтеза .интерферона для получения препарата с активностью фактора переноса. Хафизова Л. Г., ГарипоЕа М. И., Бобкова Е. В. //Итоги научных исследований преподавателей биологического факультета Башкирского Государственного Университета. - Уфа, 1998.

. 5. Изучение возможности шпрашкшого бвосишеза фаензра некроза оцухжй в 1ю:пойю Есэальауемкх лекхоцшах пфиффкжкой крови человека. Гареиова М. И., Хафтаза Л Г., Кузнецов В. II, Бабаянц А. А, Бобкюа Е. В. // Итоги научных исследований преподавателей биологического факультета Башкирского Государственного Университета. - Уфа, 1998.

6. Экспериментально-производственный Регламент «Трансфокин человеческий сухой для инъекции».