Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимическая характеристика и биологическая активность гликозаминогликанов лейкоцитов крови птиц

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимическая характеристика и биологическая активность гликозаминогликанов лейкоцитов крови птиц"

л1инистерств0 сельского хозяйства

российской федерации

санкт-петербургский ветеринарный институт

биохимическая характеристика

и биологическая активность

гл икозаминогликанов лейкоцитов крови птиц

Специальность: 03.00.04 — Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

ИВАНОВА Наталья Владимировна

УДК 612.112.1.015:612.396.11-084

санкт-петербург 1992

Работа выполнена в лаборатории иммунологии и радиобиологии Российского ветеринарного института птицеводства и лаборатории но изучению белков крови Ленинградского научно-исследовательского института гематологии и переливания крови.

Научный руководитель: доктор биологических' наук Харченко М. Ф.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Рудаков В. В.; члеп-корреспондент Российской академии технологических наук, доктор биологических наук, профессор Хованских А. Е.

Ведущая организация — Российский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский и технологический институт птицеводства.

13 час. на заседании Специализиро™...^~ — --------1 в Санкт-

Петербургском ветеринарном институте по адресу: 196084, Санкт-ПетеО' бург, Московский пр., 112.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербург ского ветеринарного института.

Защита диссертации состоится

1992 г. в

Автореферат разослан «

»

1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доценг

Эйсымонт Т. А.

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблема. Современное птицеводство - одна' из отраслей животноводства, производящая продукцию на промышленной основе. Существующий комплекс ветеринарно-санитарннх мероприятий но всегда позволяет достичь высоких показателей сохранности и продуктивности птицы, что связано с увеличением различного рода возбудителей болезней, резистентных к антимикробным средствам, высокой частотой ассоциированных вирусных инфекций, резким повышением агрессивности условно-патогенной микрофлоры.

В связи с тем, что иммунная система птиц первых дней жизни подвергается воздействию различного рода антигенов при иммунизации и применении химико-фармацевтических средств, а также часто действующих стресс-факторов, которые способствуют снижению резистентности организма и сохранности поголовья, изучение биохимических и иммунологических основ устойчивости организма птиц к заболеваниям с целью ее повышения является актуальным. Актуальной остается проблема разработки эффективных мер борьбы с различными заболеваниями с учетом особенностей физиологии организма и патогенеза болезней. Поэтому исследование макромолеку-лярных соединений, участвующих в индукции и контроле иммунной системы, ваяно для раскрытия патогенеза заболеваний и коррекции защитных систем организма на клеточном и молекулярном уровнях.

Известно, что в иммунологических реакциях принимает участие большое количество биохимических факторов, имеющих преимущественно гликопротеиновую природу (иятерлейкины, интерферон и др.)« Кроме того, в последние годы показано, что в качестве шшуномо-дуляторов могут выступать ПГ*^, ГАГ и другие гликоконъюгаты (Закенфельд Г.К., 1990; Cate-r-son /Vahmochan J., ¿ore//

ГАГ - вещества полианионной природы, гетеролинейные полисахариды, присутствуют практически во всех клетках и тканях организма, где они выступают в вида полисахаридных цепэй или ко-валентно связанные с белком в форме протеогликанов (Врзикян К.А.,

В работе использованы следующие сокращения: ПГ - протеогли-каны, ГАГ - гликозаминогликаны, ЛС - хондроитинсульфат, ДС - дерматанеульфат, ГС - гепарансульфат, ГК - гиалуроновая кислота, ФИ - Фагоцитарный индекс, ФА - фагоцитарная активность, <54 - 4агоцитарное число, Й-РОХ - >£Т клеток, образующих розетки с эритроцитами барана, ЛКБ - лизосомально ка-тионные белки, БАВ - биологически активное вещество.

Трапков В.А., 1988; Раг&опл 1988; La у не* L., v/i'ce-s., 1990).

Значительный прогресс достигнут в изучении структуры и функций ГАГ гемопоэтических и лимфоидных клеток человека и животных (Харченко М.Ф., 1985; И/с/сг С., 1987; Ateward W. Р. ei. cd-, 1990).

Сообщений о содержании ГАГ в клетках крови птиц отсутствуют. Наг данных oö ах биологической активности, не изучено влияние экгогенных и эндогенных ГАГ на организм птиц. Остается невыясненной перспектива их применения в качестве биологически активных веществ.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение содержания, химического состава и биологической активности ГАГ лейкоцитов птиц.

Исходя из намеченной цели били поставлены следующие задачи:

- отработать методы выделения и накопления сухой формы лейкоцитов крови птиц;

- разработать методы е¡»делания ГАГ из форменных элементов крови птиц;

- исследовать содержание и состав ГАГ лейкоцитов интактных

птиц;

- изучить биологическую активность ГАГ на модели экспериментального иммунодефицитного состояния цыплят и при экспери- ' ментальной колибактараоэе.

Научная новизна работы. Впервые выделены ГАГ из лейкоцитов крови птиц, идентифицированы основные классы этих соединений, ■ включающие ГАГ с различной степенью сульфатирования: хондро- ' итинсульфат, дерматансульфат, гепарэнсульфат-I, гепарансульфат-2 и гиалуроновую кислоту.

Выявлены особенности в составе ГАГ лимфоцитов и гранулоци-тов интактной птицы и при экспериментальном заражении возбудителем болезни Марека.

Показано, что сульфатированные ГАГ из лейкоцитов крови птод повышают естественную резистентность цыплят и устойчивость их' к •бактериальным инфекциям.

Доказано, что ГАГ обладают противовирусной активностью и бактериостатическим действием. Получено положительное решение на изобретение: "Средство для повышения резистентности организма птиц к бактериальной инфекции" J* 4890025/I5/118/92.

Практическое значение работы. Научно обоснована возможность использования аллогешшх ГАГ для повышения резистентности организма птиц, предложены схемы и дозы применения.

Внедрение показало положительное? влияние ГАГ на продуктивность бройлеров в условиях промышленного птицеводства на баэз Чуйской птицефабрики (Кыргызстан). Материалы результатов работы по биохимической характеристика и биологическим свойствам ГАГ птиц используются в учебном процессе Санкт-Петербургского .ветеринарного института на кафедрах органической и биологической химии, гистологии и птицеводства.

Положения, выносимые на защиту.

1. Сульфатированные и нэсульфатированные ГАГ являются биохимическими компонентами лейкоцитов птиц. Содержание и состав ГАГ различны в клетках лимфоидного и миелоидного ряда.

2. ГАГ оказывают влияние на иммунобиологические показатели организма цыплят при иммунодепрессии, вызванной введением гидрокортизона и цикл'офосфана, а также при экспериментальном колибак-териозе.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на Всесоюзной научно-производственной конвенции "Комплексная система ветеринарных мероприятий в птицеводстве - резерв повышения эффективности производства" (Ленинград, 1990 г.), на научно-производственной конференция молодых ученых и аспирантов Всесоюзного Ш1ВИ птицеводства (1990), на заседаниях методических советов ВНУШИЛ и ЛенНИИПЖ.

' Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальных исследований, обсуждения и выводов, практических предложений, описка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 17 рисунками, указатель литературы содержит 236 источников из них 100 отечественных и I3S зарубежных авторов. Диссертация изложена на 129 страницах, из них 81 страница текста.,

П. СОБСТВЕННЫЙ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материал и методы.

Работа выполнена в I988-I99I гг. в лаборатории иммунологии и радиобиологии Всесоюзного научно-исследовательского ветеринарного института птицеводства и лаборатории по изучения белков

крови Ленинградского научно-исследовательского института гематологии и переливания крови.

Материалом для исследования биохимического состава ГАГ служили тотальные лейкоциты крови птиц кросса "Бройлер-6", полученные из крови при плановом yöoe птиц на птицефабрике, а также тотальные лейкоциты, лимфоциты и гранулоцигы крови бройлеров при экспериментальной болезни Марека. Материал для исследования представлен оотрудаиками отдела опухолевых болезней птиц ВНИВИП.

Лейкоциты птиц получали как из цельной крови, так и после удаления плазмы, путем гемолиза эритроцитов ледяной дистиллированной водой. Быделонные таким образом лейкоциты высушивали охлажденным ацетоном.

Разделение лимфоцитов и гранулоцитов из цитратной крови проводили путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-веро-графина ( ßÖija/n А, 1968).

В основу способа получения ГАГ из лейкоцитов птиц был положен метод, разработанный М.Ф.Харченко (1984) и модифицированный нами (Иванова Н.В., Харчанко М.Ф., 1990).

Количественное содержание ГАГ определяли по уровню урановых кислот. '

Для идентификации ГАГ, выделенных из клеток крови, использовали электрофорез на ацетат-целлюлозных пленках с применением двух буферных систем, ферментную обработку (хондроитинаэами ABC i: АС {¿t]KA6AKU - Япония), бактериальной и тестикулярной гвалурс-нидазами) и химическую обработку нитритом натрия ъ кислой среда (Coldow Cr.L.,ft, аС1588). Денситсметрии алзкчрпфорегрэмм проводилась на анализаторе фора грамм К-1-ДЮ.

Биологическую активность ГАГ исследовали п, > и /><.., ^ При изучении эффекта ГАГ на иммунобиологический показатели в опытах in tiic использовали модель с экспериментальным иммунодефицитом, вызванным введением гидрокортизона или циклофосфапа (Сухинин A.A., 1991) и модель с экспериментальным заражением бройлеров культурой f.. cp(¿ штамм эпизоотический Б^.

В лабораторных опытах использовали 800 цыплят кросса "Брой-лер-S" суточного возраста, сформированных по принципу аналогов ь подопытные и контрольные группы, находящиеся ь одинаковых условиях содержания и кормлении. ГАГ вводили цыплятам подопытных групп двукратно, ь дозах^Ю, ¡¿О, 50 мкг/кг ън/гришшечно, а также в объеме I,5-'¿,0 иг/а13 аарозольно, однократно.

У цыплят опытных и контрольных групп исследовали показатели

неспецифической резистентности и специфического иммунитета, состав условно-патоганной микрофлоры кишечника, привесы, сохранность птицепоголовья.

Уровень tyb сыворотки крови, бройлеров определяли по Манчи-ни (1965), фагоцитарную активность лейкоцитов, уровень лизосо-мально-катионншс белков - на основании методических рекомендаций Л.С.Колабской и соавт. (1987), количественное содержание Т-лим-фоцитов определяли в реакции спонтанного розегкообразованля о эритроцитами барана, согласно методическим рекомендациям проф. Катаева (1987).

Реакцию задержки гемагглютинации проводили по методике В.Н.Сюрина и др. (1986).

Статистическую обработку данных на достоверность различий проводили по методике, изложенной в руководстве И.П.Ашмарина, ' А.А.Воробьева (1982).

Определение качественного и количественного состава условно-патогенной микрофлоры энгерэльного тракта цыплят проводили общепринятым методом десятикратных серийных разведений исследуемого материала - содержимого отростков слепой кишки (Воронцова Т.А. и соавт., 1991).

Исследования по влиянию ГАГ на рост микроорганизмов в опытах in vitro проводили с использованием музейного штамма Л-pu Horum gall/ no.ru m из коллекции Инотитута микробиологии и эпидемиологии им. Н.Ф.Гамалеи.

Влияние ТАГ на репродуктивную способность вируса ларинго-трахеита исследовали на 300 девятидневных куриных эмбрионах-совместно с проф. В.В.Малушко. Реакцию нейтрализации ставили по общепринятой методике В.Н.Сюрина и соавт. (1962). Статистическую обработку данных проводили по методу Рида и Менча.

Влияние ГАГ на показатели сохранности и продуктивности ис-оледовали в производственных условиях на базе Чуйской птицефабрики на поголовье 44370 бройлеров.

Экономический эффект от применения ГАГ лейкоцитов птиц рассчитывали по "Методике определения экономической эффективности использования в сельском хозяйстве результатов научно-исследовательских работ" (1980).

Настоящая работа является самостоятельным разделом, хоздоговорной тематики № 3415/3316, а также фрагментом комплексных исследований, отраслевой НТП 0. Х.63 Je гос.регистрации 01.90.0; 060.901.

- в -

Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ ИОШДОГШШн

3.1.1. Получение о ухой фГ'П/-!Ч лейкоцитов итчц ¡1 ьшьцсшпе ГАГ из лейкоцитов

Необходимой предпосылкой для выделения п изучении структура и биологической активности ГАГ лейкоцитов птиц являлаоь отработка метода выделении сухой формы лейкоцитов ив пильной крови. О целью увеличения выяода лейкоцитов использовали гвмолии эритроцитов дистиллированной водой (1-1,5 мин), который Сил оольо эффективен, чем методы, обычно прш.шшемие дли гемолиза безъндар~ них эритроцитов. Сухую форму лейкоцитов получали путам обработки выделенных клеток охлажденным ацетоном.

Сравнительная оценка существующих методов получения ГАГ показала, что ванаиновый метод, применяемый при выделении ГАГ из лейкоцитов крови человека, не обеспечивал полной солюбилизации клеток птиц. Увеличение концентрации фермента до 20 мг на 100 иг ацетонового порошка клеток и продолжительности переваривания до 6 чаоов позволило увеличить выход ГАГ в два раза но сравнению с исходны« методом (о 22,7.^2,40 мкг уроновых кислот/ТОО мг сухого веса клеток до 42,8КЗ,7 мкг урсшовых. кпслот/ЮО мг сухого веса клеток).

Воспроизводимость метода получения ГАГ из лейкоцитоь птиц ■ подтверждена путем проведения серийных опытов при использовании одних и тех же образцов ацетонового порошка лейкоцитов.

3.2. Изучение оодернанин и оосива Га Г лейкоплтов виоьи птиц

3.2.1. Определение содержании и идентч ижацьи ГАГ тотальны/ лейкоцитов

В результате двадцати серий опытов определено, что содер-кание ГАГ в лейкоцитах бройлеров составляет 41,8*8,4 мкг уроно-вых кислот/100 мг сухого веса клеток (св). ^акционирование це-таълоновых комплексов растворами хлористого натрия возрастающей концентрации позволило выделить две основные фракции, различающиеся анионными свойствами: фракция I содержит несульфатирован-ние и низкооуль'^атированниа формы ГАГ (10,0^2,0 мкг уроновцс кислот/ЮО мг св), фракция II содержит сулъфатировашше формы ГАГ (32,8^2,4 мкг уроновых кислот/Ш) мг св). Отношение фракции I к фракции II составляло в большинстве опытов 1:3.

Дополнительная идентификация выделенных ГАГ с помощью комп-

лоиса ферментативных методов и химической обработки позволила установить наличие ГК и ГС-, во фракции I и ХС, ДО, ГС во фракции I/, причем 1И и ГО2 выступали .в качестве минорных компонентов.

3.2.2. Особенности ГАГ лимфоцитов и гранулоцитов птиц

Поскольку лейкоциты представляют собой совокупность клеточных популяций, выполняющих различные функции в организме, необходимо было идентифицировать ГАГ отдельно в гранулоцитах и лимфоцитах. ■

Установлено, что как лимфоциты, так и гронулоциты содержат оульфатированные и неоульфатировчнные формы ГЛГ, однако их количество и соотношение фракций в клетках лимфоидного и миелоидного ряда у янтактной птицы различны (табл,1).

В лимфоцитах основными представителями ГАГ являются ХС и ДС (38,55? и 44,8/? соответственно), минорными компонентами являются ГС(ы) и ГК (ГС1 - 9,8:31; ГС2 - 5,0%; ГК - 2,0%). В гранулоцитах преобладает ХС (48,3,?), а содержание ДС составляет 17% и ГС! -24,1$. Минорным компонентом является ГК (105?). ГС? - отсутствует.

Таким образом, гемопоэтические клотки, выполняющие различные функции в организме, имеют различный качественный и количественный состав ГАГ.

Таблица I

Содержание ГАГ в лимфоцитах и гранулоцитах периферической крова г.итактной птицы

п = 12

Количество ГАГ в мкг уроновых кислот Клетки крови /100 мг сухого веса

Фракция I_ ' Фракция II Всего

лимфоциты ' 15,6+1,7 39,4+2,1 55,0+1,9

гранулоциты 14,4+2,0 18,0+1,4 32,4+1,7

Учитывая, что ГАГ в виде свободных цепей или ковалентно связанные с белком участвуют в обеспечении клеточных взаимодействий, в регуляции пролиферации и дифференциации клеток, неоплаоти-ческой трансформации, представляло интерео изучение данных соединений клеток крови в норма и при гемобластозах птиц. Нами исследован биохимический профиль ГАГ лейкоцитов птиц на модели эксде-риментальной болезни Марека как лнмфопролпфератлвного заболева-'

шя вирусной этиологии.

В результате исследований установлены различия в содержании и составе ГАГ лимфоцитов и гранулоцитов птиц при болезни Марека, по сравнению с интактной птицей. Общее количество ГАГ лимфоцитов (36,3+1,0 мкг уроновых кислот/100 мг св) и гранулоцитов (13,7+

I,2 ыкг уроновых кислот/100 мг св) при этом заболевании было .онижено в основном за счет фракции сульфатированных ГАГ.

При анализе фракционного состава ГАГ гранулоцитов установлено, что при болезни Марека имеет место снижение доли XG в среднем в два раза, ГС^ - в три раза при трехкратном увеличении относительного содержания ДС, по сравнению с интактной птицей. Во фракции I (не- и низкосульфатированных ГАГ) на была выявлена ПС, но был обнаружен ГС2, отсутствующий у интактной птицы.

В лимфоцитах птиц при болезни Марека уровень ГАГ фракции

II, содержащей сульфатированные формы, был на Ы% нижа, чем у интактной птицы. При этом шало место увеличение доли ХС при снижении содержания ГС и ДС, что, по нашему мнению.указывает на опухолевый фенотип клетки, поскольку, согласно литературным данным, эти особенности характерны для злокачественных клеток (Яо1-¡niOtíJ., • Ц ti.il., Ноёк. М., IS84; Mike. Lo- L.J., Си/р ¿-A, 1983; .^oz¿0.} 1988 И др.).

Таким образом, экспериментальные данные свидетельствуют о вовлечении ГАГ в патологический процесс, связанный с неопласти-чесюш ростом у цыплят при болезни Марека.

Учитывая функциональные потенции ГАГ в организме, нами были проведены исследования влияния аллогенных ГАГ из лейкоцитов на иммунобиологическое состояние организма бройлеров.

3.3. Биологическая активность ГАГ лейкоцитов крови птиц

3.3.1. Влияние ГАГ на организм цыплят в экспериментальных условиях

Первичные и вторичные иммунодефицитные состояния молодняка птиц, бактериальные и вирусные инфекции имеют значительный удельный вео в условиях промышленного птицеводства. В этой связи наряду с традиционными .способами терапии фундаментальными ' 'исследованиями установлены средства корректировки иммунной ой-стемы при помощи иммуномодулнторов (тимолин, тиыоген, полири-бонат и др.). В последние годы возрос интерес к иммуномодуля-торнш свойствам полисахаридов (хитозан, полиглшин, пептидо-глаканы и др.). Также имеются данные, указывающие на участив

ГАГ и ЛГ в иммунном ответе (-Ьлл I .,1983; Харченко М.Ф., 1985).

Поэтому нам представлялось целесообразным изучить влияние ГАГ на защитные системы организма молодняка птиц на модели с экспериментальным заражением £ сс>& .

Было определено, что иммунобиологические показатели организма птиц, такие как уровень , ®-Р0К, ЛКБ, ФИ, ФЧ, ФА у пт»цы, получавшей ГАГ, были выше, чем у птиц контрольной группы, что указывает на стимуляторное действие ГАГ в отношении иммунологических .показателей и фагоцитарной активности и обуславливает большую сохранность животных в опытных группах. На пятые сутки, в острый период заболевания сохранность птицы, получашей ГАГ, была выше на 30-40$, чем у птицы в группе без применения препарата. Причем, дозы 10-20 мкг были наиболее эффективными (табл.2). В работе показано, что уровень условно-патогенной микрофлоры энтерального тракта птиц, получавших ГАГ, соответствовал таковому у интактной птицы, что также свидетельствует о повышении неспецифической защиты под действием ГАГ.

Исследования влияния. ГАГ на иммунобиологические показатели организма цыплят были продолжены в опытах при экспериментальном иммунодефиците.

На фоне иммунодепрессии, вызванной гидрокортизоном или циклофосфаном, цыплята получали внутримышечно ГАГ в дозах 10 и 20 мкг/кг двукратно.

Установлено, что введение ГАГ птице на фоне иммунодепрессии, вызванной циклофосфаном, приводило к восстановлению иммунобиологических показателей: уровень сыворотки кроЕИ возрастал на 132$, содержание ЛКБ - на 129$, на 9$ увеличивался $Н-Р0К клеток. Введение ГАГ птице на фоне применения гидрокортизона способствовало частичному восстановлению исследуемых показателей: уровень сыворотки крови был выше на 86$, содержание ЛКБ - на 10-14$, $К-Р0К - на 6-9$, по сравнению с данными показателями у животных в состоянии иммунодепрессии и не получавших БАВ (табл.3).

.' ■ Введение ГАГ способствовало увеличению напряженности иммунитета к ньюкаслской болезни. В группах с применением ГАГ в до-: зе 10-20 мкг/кг на фоне, иммунодепрессии, вызванной циклофосфа-ном, титр: антител был достоверно выше, чем у животных, не полу-, •чавашх ГАГ'(3,23+0,3 ) и составил 5,60+0,20-^ - 5,75+ 0,3 и 4,2+0,15 -йуг - 4,6+0,21 Ау,г в сыворотке крови цыплят получавших ГАГ в дозе 10-20 мкг/кг на фоне гидрокортизона,

Таблица 2

Влияние ГАГ из лейкоцитов крови птиц на иммунобиологические показатели организма цыплят при экспериментальном колибактериозе

п = 10'

Приме- |10аы Иммунобиологические показатели

•руа- пы няемые препа-, раты препаратов & . ' мг/мл • 23-РОК ЖБ Фагоцитарный индекс V /0) Фагоцитарное число Бактерицидная-'активность (%)

I Контроль 2,3+0,12 А 19,7+2,9 0 ,93+0 ,05 43,6+7,7 "1,8+0,6 34,58+15,51 1 ( го

2 ГАГ 20 мкг • 2,97+0,59 - 25,7+4,28 0 ,95+0 ,05 80,01+2,8й 5,43+3,03* 61,2+10,63й 1

;3 ГАГ 50 мкг 3,4+0,22й . 26,0+2,Iй I ,05+0 ,25х 65,6+9,9* 3,32+0,73я 53,44+П,53г

4 ГАГ. 100 мкг . 3,3+0,64х 21,0+2,7 0 ,93+0 .25 53,5+17,4й 3,78+2,23* 54,3+14,5х

ж р^.0,05

Таблшхз 3

Показатели резистентности птпд б огктах с иммунодззрессизй

к р^.0,05, п = 7)

гругдш

2 3

Название препарата

Контроль

антактнак

птгда

Паклофосфан . Пиклофосфан Пвклофосфан Гидрокортизон Гидрокортизон -Гадрокоргкзон

0,03с; ГАГ, мклг/'кг

лмму но л ог лче с кие п о на з а те ли

10 20

10 20

£3-?0Х

ЛКЕ

мг [ мл [¿г/мл (о тн. е г.;

на 1э день на 30 день на 30 день на 30 дань

2.83+С.53 0,5510,10 3,35+0,51* 4,12+1,92й 1,04+0,20 ' 1,71+0,29* 2,3+0,17"

4,78+0,55

2,03+0,53

4,7+0,17*

4,35+1,37й

1,45+0,17

2,43+0,19х

2,81+0,17*

22,75+3,9 10,5+1,2" 19,6+4,Iх 18,4+3,4й 9,0+3,3-15,6+1,5х 18,1+2,4*

1,20± 0,12 1,45+0,03 1,88+0,002* 1,71+0,12* 1,37+0,051,64+0,03* 1,55+0,03й

4

тогда как у интактной птицы титр антител составил 5,75+0,21 /л^,.

Следует отметить, что введение иммунодепрессантов вызывало дисбактериозы. Применение ГАГ на фоне иымунодефицитного состояния способствовало снижению удельного веса условно-патогенной микрофлоры энтерального тракта цыплят. Иммунодепрессия вызывала снижение продуктивности и жизнеспособности птицы: сохранность снизилась на 12-20%, среднесуточный привес - на 1,0-1,4 г. Введение аллoreиных ГАГ обусловило увеличение сохранности цыплят подопытных групп на 8-12$, среднесуточных привесов - на 0,4— 1,0 г.

Таким образом, проведенные исследования показали, что ГАГ, выделанные из лейкоцитов пт!щ, оказывают иммунокоррегирующий эффект и повышают резистентность организма животных.

При изучении биологической активности ГАГ была также проведена серия опытов по влиянию ГАГ непосредственно на микробную клетку, в частности на рост сальмонелл. Опыты ¡п у/tro проводились о культурой ■A.pullorum gaKJnaram , Результаты• исследований показали, что концентрация ГАГ в интервале от 50 до 60 ыкг/мл полностью подавляет рост колоний микроорганизмов при исходной концентрации клеток 6,4+0,4 /мл. При большей концентрации микроорганизмов (8,2+0,3 ) установлен бактериостатичвс-кий эффект ГАГ.

Кроме того; нами была выявлена антивирусная активность ГАГ, которые в дозе 5 мкг/эыбрион снижали биологическую активность вируса ларинготрахеита о 5,7+0,17 ty до 4,36+0,17 , а в дозе ; .10 мкг - до 5,2+0,10/у . ~ 4

Установленные результаты лабораторных исследований свидетельствуют о высокой биологической активности ГАГ лейкоцитов . крови птиц (влияние на резистентность организма птиц, восстанов- . ление иммунобиологических показателей при иммунодёпрессии цып- . лят, снижение заражающей способности вируса ларинготрахеита,бак-териоотатические свойства). Полученные данные явились основанием испытания эффективности ГАГ в условиях промышленного, производства птиц.

3.3.2, Применение аллогенных ГАГ из лейкоцитов птиц в условиях птицефабрики

Испытания эффективности применения ГАГ при выращивании бройлеров проводились в условиях Чуйской птицефабрики на осно-

вании приказа № 33 от 12.06.91 г. республиканского ПНО "Ветеринария".

Внутримышечное введение ГАГ в условиях производства способствовало увеличению прироста живой ыасоы на 60-80 г и сохранности птицепоголовья на 2-4$. Экономическая эффективность составила 0,33 рубля на одного бройлера.

Протективные свойства аллогенных ГАГ при аэрозольном способе введения подтверждены на поголовье из 44170 бройлеров. Расчет экономической эффективности был проведен посла планового убоя птиц в возрасте 56 дней.

Цыплята, получавшие ГАГ, были более устойчивы к заболеваниям, отличались хорошим ростом, развитием, подвижностью. Сохранность бройлеров увеличилась на 1,6$, живая масса при аэрозольном введении ГАГ увеличилась на 41 г. Экономический эф|ект составил 0,17 рубля па одного бройлера.

Результаты испытания по применению ГАГ подтвердили вывод о положительном влиянии ГАГ на резистентность организма птиц в условиях производства.

Таким образом, в результате исследований биологической роли аллогенных ГАГ лейкоцитов была выявлена антибактериальная, антивирусная активность, а такие стимулирувдее действие на процессы антптелообр'';зовз1шм и показатели неспецифической резистентности органика птиц.

По нашему мнению, ГАГ имеат высокий потенциал в использовании их в качестве стимуляторов резистентности и явлшзтся важными биологическими регуляторами,

выводи

1. Гликозиминоглаканы являются биохимическими компонентами как гранулоцитов, так и лимфоцитов крови птиц.'

2. Отработаны метода выделения лейкоцитов и фрс.кцисавроь'З-¡шн ГАГ из тотальных лейкоцитов, гранулоцитов и лимфоцитов кро-•би птиц. В основе способа получения ГАГ лежит пдпаиновая депро-теиназация высушенных ацетоном клеток, осаждение ГАГ о ятплтри-мотиламмоний бромидом, фракционирование цетавлонових комплексов солевыми растворами о возрастающей ионной силой.

3. Общее содержанке ГАГ в тотальных лейкоцитах составляет в среднем 41,8+3,4 мкг уроноьых к;:слот/1СО мг св клеток, из которых несульфатироь.-1!11ше и низкосульфятлровэнние формы ГАГ со-

ставляют 10,0+2,0 мкг уроновых кислог/100 мг св клеток; сульфа-тированные - 32,8+2,4 мкг уроновых кислот/100 мг св клеток.

4. Главными компонентами ГАГ в лейкоцитах птиц являются хондроитиноульфаты, дерматансульфат, гепарансульфат и гиалуроно-вая кислота. ''

5. Содержание ГАГ в клетках лимфоидного и миелоидного ряда различно: в лимфоцитах интактной птиЦы ГАГ содержится в количестве 55,0+1,9 мкг уроновых кислот/100 мг св клеток, из них не-сульфатированных форм ГАГ - 15,6+1,7 мкг уроновых кислот/100 мг св. клеток, сульфатированных ГАГ - 39,4+2,1 мкг уроновых кислот/ 100' мг св клеток. В гранулоцитах интактной птицы содержится 32,4+1,7 мкг уроновых кислот/100 мг св клеток, из них несульфа-

. тированных форм - 14,4+2,0 мкг уроновых кислот/100 мг св клеток и сульфатированных - 18,0+1,4 мкг уроновых кислот/100 мг св клеток. Главными компонентами ГАГ лимфоцитов являются хондроитин-сульфат, гепарансульфат, дерматансульфат, гиалуроновая кислота . и гепарансульфат-2; в гранулоцитах интактной птицы идентифицированы: хондроитиноульфат, гепарансульфат, дерматансульфат, 'гиалуроновая кислота. Классы ГАГ в гранулоцитах и лимфоцитах имеют разное соотношение.

6. При экспериментальной болезни Марека имеет место значительное снижение содержания и изменение состава ГАГ в лейкоцитах по сравнению с таковыми у интактной птицы. В гранулоцитах уровень несульфатированных форм ГАГ ниже на 87$, а сульфатированных - в 3 раза, в лимфоцитах - уровень несульфатированных форм ГАГ ниже на 39;?, а сульфатированных - на чем .в тех же фракциях у интактной птицы. л

7. Увеличение доля ХС при снижении ГС и ДС в составе ГАГ . . лимфоцитов птиц при экспериментальной болезни Марека указывает

. на опухолевый фенотип трансформированных вирусом клеток. Снижение доли ХС и ГС и увеличение содержания ДС в гранулоцитах птиц при болезни Марека свидетельствует о вовлечении данных соединений, в патологический процесс.

8. Сульфатированные ГАГ лейкоцитов бройлеров являются биологически активными веществами и обуславливают повышение резистентности птицы к бактериальной инфекции. При введении ГАГ в-дозе 10-20 мкг/кг увеличивается сохранность молодняка на 25,3+ 6,6% в условиях экспериментального заражения <>?<■ . Высокая жизнеспособность цыплят зарегистрирована на фоне повышения иммунобиологических показателей: уровня сыворотки, крови

(3,0+0,19 - 3,4+0,22 мг/мл), содержания лизооомальных катионных белков гранулоцитов (1,05+0,05 ед.), jSB-POK. Т-клеток (25,7+1,2 -26,0+2,1$), усиления активности фагоцитоза (ФИ: 80,0+2,6; ФЧ: 5,43+0,1) и снижения уровня условно-патогенной микрофлоры кишечника по сравнению с указанными показателями у птицы, не получавшей ГАГ.

9. В условиях экспериментального иммунодефицита, вызванного циклофосфаном, введение ГАГ цыплятам обуславливает восстановление изучаемых иммунобиологических показателей до их уровня у лнтактной птицы. В условиях иммунодепрессии, вызванной введением гидрокортизона, применение сульфатированных ГАГ способствует повышению указанных показателей.

10. При прямом контакте с микробной клеткой ГАГ оказывают бактериостатический эффект.

11. ГАГ снижают заранающую способность вируса инфекционного ларинготрахеита птиц на 0,5-1,5^проявляя дозозависимый эфТект.

12. Применение ГАГ способствовало увеличению сохранности птицепоголовья на 1,6-4$, 'живой массы птицы к концу откорма -

на 41-89 г. Экономическая эф}>ективность при внутримышечном введении - 330 руб., а при аэрозольном способе введения - 170 руб. на 1000 голов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЩ1Д0ШШ

Предложены метода получения сухой формы лейкоцитов и ГАГ из тотальных лейкоцитов, гранулоцитов и лимфоцитов птиц, открывающие возможность изучения патогенеза некоторых заболеваний птиц.

Экспериментальные исследования и производственные испита-ния показывают, что ГАГ лейкоцитов являются биологически активными веществами, обладающие протзктивным действием при колнбак-териозе, иммуномодулирующими свойствами при иммунодефиците и антивирусной активностью. В условиях производства способствуют 'повышению сохранности и продуктивности птицепоголовья.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЯЖ ДИССЕРТАЦИИ

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

I. Иванова Н.В., Харченко М.Ф. Выделение гликозаминогли-канов из лейкоцитов крови птиц / ЛенШИГПК. - Л., IS9I. - 7с.

Библиогр. - 12 назв. - Деп. в ВИНИТИ 18.04.91, й 1636-91.

2. Иванова Н.В., Харченко Ы.Ф. Содержание л состав гли-козамяногликанов лейкоцитов 1ф0ви птиц / ЛенНИИПЖ. - Л., 1991. - 7. с. Библиогр..- 10 назв; - Доп. в ВИНИТИ 18.04.91,

№ 1635-91. ' . ■

3. Горецкая Т.И., Колабская Л.С., Иванова Н.В. Повышение резистентности о помощью иммуномодулятора // Ветеринарные проблемы птицеводства: Тез. докл., Научн.конф. - Ленинград-Ломоносов, 1990. - С.80-82.

4. Сухинин А^А., Сухинина Т.Л., Иванова Н.В. Влияние гидрокортизона и-циклофосфана на иммунобиологическое состояние организма цыпляг // Эффективные средства и методы профилактики болезней птиц в промышленном птицеводстве: Сб.науч.трудов ВНИВИП. - Л.., 1991., - С.44-52.