Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и свойства биотинсвязывающего белка микробного происхождения

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение и свойства биотинсвязывающего белка микробного происхождения"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

Яч. К 8287

На правах рцкопкси Для слуаебного пользования

Экз. И

¿1

КОРЧАГИНА Наталья Александровна

ПОЛУЧЕНИЕ-Н СВОЙСТВА БИОТИНСВаЗЦВАВЗБГО БЕЛКА МИКРОБНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

03.00.23 - Биотехнологиа

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученей степени кандидата биологических наук

Санкт - Петербург 1352

Работа выполнена яг кафедре волеяуязршяг биотехнология Санкт - Петербургского технологического института и в лаборатории инмунологии БйВ ВНИТИЙФ, г. Санкт - Петербург.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, КЙ1КИН

заведуюций лабораторией Аркадий Павлович

Научный консультант: _

кандидат химических наук, ЙЙК

старвий иаучннй сотрудник Олег Владимирович

Официальные оппонента:

доктор биологических нар, ^ ЗЙИКИНА

профессор Надеида Александровна

кандидат биологических наук КйХййЯОБй

Наталья Павловна

Ведудая организация: Нияегородский научно - исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии, г. Нивиий Новгород

Зарта состоится ____1992 г. вчас. на

заседании специализированного Совета Д.083.29,09 в Санкт -Петербургски* технологическом институте по адресу:, 198013, г. Санкт-Петербург, Московский йр., д.26.ШтоВый ш.

С диссертацией иовио ознакомиться в библиотеке института. . V

Замечания и отзывы по работе, заверенные гербовой печать®, направлять по адресу: 196013, Санкт - Петербургский технолг"нческий институт, Учений Совет.

Автореферат разослан 1992 г.

Учений секретарь специализированного совета, кандидат технических иадк

Т.Б.Лисицкая

- 3 -

ОбДО ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актизльность проблемы. Методы иыыуноферментного (ИФА), гибрндизацйонного (ДНИ- и РНК-зонды) и лиганд-рецепторного (ЛРй) анализа БйВ находят все большее применение в биотехнологии, медицине, различных областях проиывленности и сельского хозяйства, Аналитические системы, основанные на этих методах, долины отличаться высокой чувствительностью, специфичностью, наденнссгьв и быстродействием. Наиболее трудной и актуальной задачей при этом является повышение чувствительности анализа. Одно из перспективных направлений реиениа этой задачи состоит в создании и использовании систем усиления первичного сигнала за счет использования оысокоаффинкнх лиганд-рецепторных взаимодействий,

Бнотинсвязывавцие белки(БСБ),обладавцие высоким аффинитетом к этому витамина (константа диссоциации кокплекса биотип - БСБ i£r Ноль/л), нашли широкое применение в качестве компонентов высокочувствительных систем для определения разнообразных БАВ, Благодаря очень высокому сродству меяду биотипом и БСБ при использовании метода, основанного на ли-ганд-рецепторноы взаимодействии и образовании 5СБ-биотиново-го койплекса.достигается чрезвычайно высокая чувствительность определения,Одним из ваанейяих преиаучесгв иетода является его универсальность: лвбне вецества.веченные биоти-нои, могут быть обнаруяени с поно^ьа ВСБ.ковалентно или не ковалентно связанного с теа или иным индикатором.

Известен ряд источников получения БСБ,2 частности белок куриных яиц,содерваший авидии .некоторые виды стрептомицетов - Str, avidini1»Sfr, Iavendulae .накапливающие в культураль-ной нидкости бепки,связываквде биотин (стрептавидин).

Чувствительность аналитических тестов,базирующихся на использовании системы биотии-БСБ.во многой определяется его физико-хииическимн свойствами. Так,использование в анализак авидйна - гликощютеина.ИЭТ которого равна 10,5, часто соп-ровоадаетса неспецифическим связыванием авидина и, каи следствие .высоким уровней фона при проведении анализа.Кроне того, выделение авидина из яичного белка неперспективно вследствие использования болызнх количеств пищевого сирья,

Стрептавидин более предпочтителен для использования в аналитических системах,поскольку злектронейтрален при физи-олопиеских значениях рН и не содернлт углевод.чых остатков.Однако s связи с накоплением в культуральной нидкости значительных количеств пигяента и балластных белков, получение высокоочиценного стрептавидина представляет значительные

трудности и приводит к необходимости многостадийной очистки. Кевдднародная цена на сгрепгавидин составляет порядка 40 долларов СШ за,1 иг, на отечественнгм ршке - 00-100 руб.

Предлагаема наш работа представляет собой этап исследований по поставленной проблеме и осуществлялась в райках комплексной програмыи "Ускорение ÜTtl б целях всеиерного. удовлетворения наяд здравоохранения в лекарственных и диагностических средствах" в соответствии с постановленной Госкомитета по науке и технике Минздрава СССР и АЙН СССР.

Цель работа состояла в поиске нового продуцента ЕСБ и разработке способа его получений, изучения физико-химических свойств и оценки пригодности для биохимического и шшунохи-цичвекого ииироанализов,

Наччная новизна.. Отобран и охарактеризован новнй итака актиноьшцета - продуцент БСБ - актинавидина. -Определены оптимальные условия биосинтеза и выделения нового БСБ. Изучены оснозние физико-хиыическис свойства'актинавидина, произведено сравнение с уне кзвестниии аналогами. Предлоазк ли-ганд-рецепторннй анализ актинавидина в различных, средах.

Практическая значимость. Полученный а ходе викроблого биосинтеза новый 5СБ - актияышдин - иовет заменить авидин и стрептавидик, широко приценаеииз с различных аналитических системах, к удовлетворить кневцийся спрос на них.

Полученный препарат актинавидина проходил испытания в НПО "Биолар" (г.Слайие, Латвия) и в институте цитологии (Ш России и паиунохикичесиих тестах к тестах ДНИ-гибридизацик в сравнения с коциерческшш препаратами авидинои и стрептави-дином, Акт и испытаний прядагантса к диссертационной работе.

Пргклоееннь'Я fiPfi акпшавидвда в различных анализирдеиых жидкостях isosot быть успеено использгчан б ходе селекционной работи и при скрининга кръ»до. способных синтезировать БС5.

А^побашгг р?ботн. Освоение рез«гьтати работу бнлк дьло-HSHU я обседались па конференциях: молодик цчепих Ш!ИШШ С Ленинград, 13CS и 1S30 г.г.)

¡Шгшшиь Во ызгеркаяак дкссертацск квзгтсс Í авторской свидетельства к 4 печатка« работа.

Структура M.ofiwj диссертации. Дпсссртацг.к изленена на 168 страницах иашшписного текста, содсркит 25 рксдакг. и 2S таблиц, состоит кз введения, обзора яптерзтурк, зкеперииек-тольпзД части ¡¡ обсудц;ггшй результатов, Оо сведении обосно-сисаетсй ■ !?о.;шсообг юность поиска нових пхокозФоектквких ЬСБ. Ь обзоро литератур!? я послрыщнх разделе»' рассиатрива-атся гптспатврице дйшшо. п обсдгяаотся ргзультати проводсн-кш; гкспе$>изсигоь, Спксо» латеретурц вкльчает 1S1 работу

■ - s -

отечественных и зарубенныя авторов,

СОДЕРМАНИЕ РАБОТ!!. '

1. Скрининг культуг, Из коллекции ВпИТИАО было отобрано 10 блиггйсродственних птаииов Streptoayces различных видов, которые били испытан» на способность продуцировать з среду авмдкноподобннй- балок, Активным в отношении синтеза 5 СБ сказался щтааа Str.chrosofuscus Т-200, который продуцировал в среду значительное количество БСБ С спвктрофотоивтрический анализ с ПАВА - 2-(4'-гидроксифенилаза)-бензоГной кислотой ); у остальных птанков подобного эффекта не наблздалось,

Даяьнейваа работа делась со итаиаои Str.chrosofuscus Т-200. Зтаьш внесен во Всесовзиуп коллекции микроорганизмов при ИБФН (r.lîocima) - ВКИ Ас-12бВД, В соавторстве получено авторское свидетельство на отава - продуцент SC5.

2. Получение высокоактивного зтаииа-продуцента. Сравнительно невысокий уровень биосинтеза актинавидинэ исходным атаммои Str.chroaofuscus Т-200 (4-5 иг/л) делает необходимом проведения процессов иультивированма и выделения в больвик масштабах для получения необходимого количества 5СБ, что сопряаено с переработкой больиих объемов культу-ральной зидкости и услознлзт процзсс хиночистки. Повысить эффективность процесса получении микробного 5С5 аоано за счет' использования новых оисокопродугстивмих штаааоа-ну-^энтов без дополнительных затрат. Основная методом создания штаммов - суперпродуцентов являзтея индуцированннй иут?генез и ступенчатая селекция, S нааих 'исследованиях брчи исполнзованн 1,2,?,8-диэпоксио;!тан £ Л 3 0 > и 1,8-1.,8-динитргпирен (ДНП), рекомендованные для работи со Streptcnyces. В качестве се-лектннов для Str.chroaofuscus Т-2Э0 Omit использованы «ести-биотин: НАВЛ и антибиотики тетрпмклин и рнфаапицин, отобранные на основан;«! антибяотикограиаа.

Под действием мутагенов ЛЭО и ДНП была получена коллекция- иутантав, устойчивых к вкбрамш сслектлиан. Но только отобранные HflBfl - мутанта по цровна биосинтеза аигинаекдииа превосходили в 4-7 рас исходная итаиа Str.chroaofuscus Т-200. Таким образом, ЛПЗА иозет быть рекпаендовлн и качес-тээ Эффективного селектина для культура Str.chroaofuscus Т-200, Из коллекции НАВА - нутактов бил отобран для дальнэА-'зйх исследований наиболее активнай • »итантннй штамм. Путем naccaaed зтого итамиа на гЛакозо-минеральноЛ среде, с lecne-

- б -

чивавщей наибольший разм?" изменчивости культуры, с отбором высокоактивных клонов, был получен ютами Str.chroaofuscus Т-201 йтаым был передан в БКЙ, где хранится под номером fie - 1329Д, -

3. Разработка условий биосинтеза актинавидина, 3.1. Выбор питательных сред.

Повисить продуктивность исходного втанма мевно таксе создавая наиболее благоприятные условна культивирования его оптимальный состав питательной среды и ревим ферментации. Поэтому наряду с селекционной работай нами проводилась оптимизация процесга выращивания исходной культуры.

были выбрани известные из литературы наиболее распространенные для стрептоаицетов среды,доступные и технологичные.

При выборе оптимальной посевной среды основными критериями слукили количество бйомассн и биосинтетическая активность. Определено, что в качестве посевной предпочтительней использовать крахиало-кукурузнув среду, характеризуются максимальны* приросток биомассы за 48 часов роста при 26 С (1,1-1,4 г/л) и при атом больвим содерванием актинавидина в культуральной среде i3,0-5,5 мг/л).

Принцип отбора питательной среды для проведения ферментации Тот кг,но основным критерием эффективности ферментационной среды является уровень биосинтеза БСБ. Фактором благоприятным является отсутствие пигмента и балластных белков. Наилучвие результаты получены при использовании глвкозо-ни-неральной среда .при этом на 8 сутки культивирования содер-ванив БСБ в культуральной видкости составляет 4,5-6,5 мг/л.

По завервенив селекционной'работы с родительским нтам-иом и получению высокоактивного втапа, с последним бала проведена аналогичная процедура выбора оптимальных для вира-дивания питательных сред и показана пригодность для приготовления инокулвма - крахаало-кукурузной среды и глюкозогми-неральной - для проведения ферментации с максимальным содер-ваниеи актинавидина в культуральной видкости на 8-е сутки -40-50 иг/л,

3.2. Оптимизация процесса биосинтез? актинавидина втайком Str.chroBofuscus Т-201.

Определяли оптимальные параметры биосинтеза актинавидина. За основу были приняты условия культивирования в колбах Эрленмейера (0г?50мл) н& глвкозо-минеральной среде: объем среды - 100 мл; объем инокулвма - об.; вреия культивирования - 8 суток; температура - 2В+-2 С; начальное pH - 7,0.

йз данных экспериментов следует, что повиаение температура с 24° С до 28° С вызывает как сокращение времени культивирования, так и повквсние на ЗОХ уровня актинавидина в культуральной яидкости, Повыиение температуры до 35* С на дает значительного повышения уровня биосинтеза, начиная с 4-х суток культивирования.

С возрастание« аэрации при переходе от и среды 150 мл :< 100 ил наблюдается увеличение уровня биосинтеза на ЗОХ, дальнейиос сниаение объема среда ( до 50 ид) не дает значительного увеличения уровня актинавидина, но уиенызает съем продукта.

йаксимальннй уровень биосинтеза актинавидина для атаааа ЗЬг.сЬгоаоГизсиз Т—201 достигается при засезе ¿3 '/. об. иноку л ¡яма, как и в случае родительского нтаама. При этоа засео следует проводить 2-суточння посевным, поскольку при засеве инокдлааа с возрастом зыэе 3-х суток наблюдается накопление значительных количеств контаминируацих пептидных компонентов а «ультуральчой зидкости на моыент завершения ферментации.

Изменение исходного рН как в кислуе, так и в щелачнуя область тораозит скорость роста « биосинтеза, культуры. При этой независимо от исходного значения рН (в исследозаннои диапазоне) на третьи сутки культивирования значения р!1 зи-равнизавтся.

Далее, считая гликозс-минеральнун среду наиболее пригодной ферментационной средой, определяли в ней оптимальное содержание основных компонентов нэтодса раздельной оптиипэа-ции каздого Фактора при постоянной фонэ.

Так. при исследовании влияния концентрации источника углерода на биосинтез, показана воэноанпсть сииаения содер-вания глпкоза с 50 до 25 г/л, выход актинавидина при этой практически одинаков,

Исследовано такзе влияние различных источников азота -анмонийных солей, нитратов, Ь-аспарагмна и др. Показан? пригодность всех соединений азота и^собеино - сульфата амко-ниа, при зтон неполная утилизация соли( около (Ш) в процессе культивирования позволяет рекомендовать сшпение содеряа-ние сульфата аммония о питательной среде в 2 раза (с 3 до 3 г/Л при неизменной уровне биосинтеза актинавидина.

Изучено влияние ОссСора - з виде спеси солей одно- я двухзаасценного оосоатоп кзлиа. Отиачена исключительная необходимость фосфора для роста культур» и биосинтзза актинавидина ( возрастание содеряание биомасса - в 2,2 и актинавидина - в 1,6 раз, соответственно. В специальных опытах с раститровкой концентрации фосфатов в глякояо-нинерллькой

среде показана необходимость увеличения их исходного содер-яания е среде с 0,4 до I г/л, при этом выход БСБ возрастает на 15У.\ дальнейвее увеличение содераания фосфора в среде не влияет на уровень биосинтеза актинавидина.

Кроме того было исследовано влияние внесения в глвко-зо-микеральнув среду смеси микроэлементов по рецептуре среды, рекомендованной для 5Ьг,ау1сПп11 .Показано увеличение выхода биомассы в I,Б раза, однако содераание ВСЯ остается неизменным.

Исследовано такие влияние добавки дрож?евого экстракта в качестве стимулятора роста культуры. Было отмечено ,что входящий в состав посевных сред кукурузный экстракт стимулирует больший прирост биомассы актиномииета. При внесении в ферментационную среду дроввевого экстракта наблюдается такве возрастание выхода биомассы в среднем в 2,9.раза, увеличение содервания БСБ при этой на 10%.

С цельп уточнения концентрационных параметров проведения процесса был использован метод ,аддитивно-греиетчатого математическое описания объекта. План эксперимента представляли в виде ортогонального латинского квадрате, при втом варьировали 4 основных фактора на 4 уровнях', глвкоза 1-2,5-5-10 V, сульфат аммония - 0,1-0,3-0,6-1 У.; калий ди-гидрофосфат - 0,02-0,04-0,1-0,2 '¿; карбонат кальция 0,1-0,2-и,4-0,8 X. Статистическую оценку адекватности проводили с использованием критерия Фивера.Уточненный, таким образом, состав выбранной наци в качестве ферментационной -глвкозо-минеральной - среды (в г/л): глвкоза - 50; сульфат амыоиия - 3: дигидрофоссат калия - 1; карбонат кальция - 4. Все остальные компоненты - согязсно прописи среды, Динамика роста культура 51г.сЬговоГи5си$ Т-201 и биосинтеза актинави-динс. при выбранных Нсми параметрах культивирования приведены на рис.1.

2 3 4 5,6

Рис.1. Культивирование Лг.

сЬговоГи5си5 Т—20I

3-

в оптимальном рвкиме. Условные обозначения:

1 - РН;

2 - АСВ, г/л;

3 - белок, г/л;

4 - аммонийный азот.г/л;

5 - глвкоза, г/л;

6 - актинавидин. иг/л.

-I -

О 2 4 6 8 время, сут

Маситабирование процесса биосинтеза актинавидина осуществляли на пилотной установке в аппаратах'типа "Лннум" (I) = 10 л) и АВ (V = 100 л). При этом были созданы оптимальные условия. Культивирование проводили в заданном реяиае с под-дерыниеы основных параметров ферментации. В результате проведенных 7 операций фериентации на аппаратах "йнкуи" и 9 -на "ЙВ", наки был сделан вывод о возновности получения актинавидина в ферментаторах различного объема,

Для препаративного получения разработан лабораторный регламент на производство актинавидина и апробирован на базе НИИЗиМ (г.Нианий Новгород).

4. Разработка,ыетода анализа актинавидина в культуральной видкости.

Первоначально -для контроля процессов биосинтеза и хини-ческой очистки актинавидина использовали СФ-нетод определения БСБ с НАВй, Однако данный метод -является малочувствительным и не позволяет наденно определять концентрации БС6 ниве 15 иг/л; более тбго, требуется предварительная продол-, яительняя подготовка проб, сопрявекная с потерями при концентрирования и удалении ионов кальция, иеиавдих определе-

а—О

+ я-о

£]—О

лггш,

ы

€3>

'т

!г

р <3нэ

Рис.2

1йо—о

ро

. Схеиа ЛРЙ актинавидина:

а - "мосчиковая" схема анализа; б - пряной вариант анализа. Условные обозначения: С - биотин; - актинавидин;

О - пероксидаэа.

- 10 -

Поэтому для селекционной работы с БЬг.сЬгоЕоГигсиз и для культур, иаеищих низкий уровень биосинтеза БСБ, представляет интерес исследование возиояности определения БСБ непосредственно в нативном растворе лиганд - рецепторнык анализом С ЯРА ), Нами предлагаются два варианта твердофазного ЯРА актинавкдина, позволявшие увеличить чувствительность определения БСБ в культцральных средах различного компонентного состава на 3-4 порядка, (сьг, рисунок 2.э,б)

Первоначально изучалась "костиковая" слева /1РЙ, ввлвча-зщак следующие стадии: иммобилизация био-БСй; сорбциэ опре-деляеного НСО из раствора; сорбции био-ПХ,

Данная анализ требцет максимальной сорбции биотина е лунках плансета, что достигается не только использованием полней сорбциониой"еккости лунок по беяку-носителв, но и увеличением степени кодификации бнотинок ^мобилизованного белка. Для определения необходимой степени бнатикклировашш определялась енкость лигандного сорбента по ПХ-5СБ при иммобилизации био-БСй разной степени модификации. Условия бмоти-нилирования БСй нэловеии в таблице, I, результата анализа пркБвдонк на рисунках 3-7.

Таблица 1.

Условна бкэшшлироваиня БСЙ

Примечание: конънгат V получен с использованием в качестве спейпера

£ - аыннокапронозой кислоты.

Вариант конъвгата Кол-вб И0Л8Я биотн-на,взятого в рзакиш на 1 гко.аккиогрутш

I 0,02

II 0,1

III 0,2

1« С.5

и . 1.3

Рис.З. Влияние степени бнотмнилирования на сорбционнув 0,2 0,^0,'б 0,61,0.Г,2 Мбиату.иа еккость.

Н МЯггруПП

- и -

Как видно из рис.З, необходима кодификация не целее 1/5 аминогрупп БСЙ. Дальнейвая модификация не приводит к значительному увеличении емкости, Из опытов по сорбции актинави-дина на сорбированный из растворов различной концентрации ВСА-био ( 5 вариантов коиъпгатов ), видно, что иаксииум сорбции наблидается при концентрации 1-2 виг/ил С си, рисунки 4,5).

некие калибровочных кризах для определения БСБ пэ "пестиковой" схоае ( сц, ркс,4) при камобиянэряки бло-БСА и био-я-БСЙ ( где х - спейсер в б углеродных й'оаов - остаток от аиинокапроновой кислотц) подтзэрадает этот внвод, Увеличение степеии биотинидкровзния е*ли сзеденне спейсера, та-киа образом, резко повивает .сорбциониуз емкость,что проявляется в анализе в более резком наклоне калибровочной ионэой.

- Кроме того, в специальных опитах по связавагшп БСБ с имкобилкзованнш! био-БСЙ и проявления различными ионъягатаии

ПХ было показано, „что использование спейсера мевду ПХ и би-отиновыы остатком ( гексаиетиленовой "нонки") позволяет в 3 раза повысить степень связывания меченной ПХ при одинаковой степени бистиьллирования БСЙ ( 4 остатка биотьна на иолеку-я9) (рис.6).

О 0,2 0}* 0,6 Г,0 С. мкг/м

Однако при проведении аиалиэа по данной схеме ми не получили онидаеиой чувствительности. Для оценки причин низкой чувствительности нами била определена константа связывания в системе иииобилизо8аниая ПХ-био при титровании праиыи конъ-ягатоы Йкт-М ( по рассчеган порядок Ксв составил 109 М). Использование спейсера в структуре конгшгата ПХ-био позволяет в 3 'раза повысить сорбционнув еывость, теы кс ыене'е выигрыша в чувствительности анализа не дает. Так как диапазон с'преде^язаых по аостиковой схема концентраций БСБ ( 0,3-0,5 ккг/ил) не представлял интгреса для практической работы, на-ни бнл исследованся прямой вариант ЯРА, основанный на одно-моаентной конкуренции меченного ПК и определяемого в растворе БСБ за центры связввания ишобилизованного биоч-БСЙЛ рис,26) 6 дзнноы варианте анализа для до.стикения максимальной чувствительности шнценграции' всех реагентов, участвуют» в равновесии, долани бить соизиерикн. Это означает не-омодииость воспроизводимой шшог'илизации нанограымовых количеств био-БСЙ, и требует подбора условий иыиобилизации. Для зтого наци исследована динааика сорбции био-БСЙ ( определение количества иммобилизованного белка проводилось в реакции с конъюгатон. Акт-ПХ) в различных буферных растворах нейтральных и щелочных значений рН: ! - в 0,01 Цолъ/л нат-риЯ-фосфатноа бчфере рН 7,2 .содераащем 0,1 Уоль/л хлористого натрия; 2 - в 0,01 йоль/л Трис-НС1 буфере рН 8,5 .содер-кащеи 0,1 Йоль/л хлористого натрия; 3 - в 0,05 Моль/л нат-

>

рий-карбонатном буфере рН 9,6, Из полученных данных следует предпочтительность сорбции в слабо - целочной области. Минимально необходимое время при этом составляет 2,5 часа. Десорбции био-ЕСА в этих условиях на было обнаруяено,

Проведению либого, в той числе биоспецифического анализа реальных объектов препятствувт саше различные компонента йпределяеиых сред. В наоей работе наибольвув ванность представляет определение БСБ в ферментационной глвкоэо-ммнераль-ной среде. Нами исследовано влияние всех компонентов этой среды в ЛРА. Определили, что двухвалентные металлы, и особенно кальций, резко с..иаапт связывание конгюгата Йкт-ПХ с био-БСА. Этот факт объясняется, вероятно, образованием при сиенивании иикроколлоида фосфатов кальция, частицы которого, по-видиному, нрспецифически сорбирувт конъвгат, Устранить влияния кальция на ЛРА оказалось возиовныа при введении в анализируемые пробы избытка ЗЙТА. Бало показано, что при внесении в лунки с био-БСЙ ре°лворов конъвгата и органических сред, используемых при выращивании инокулвма, в равных количествах С 1:1 ), уровень активности сорбируемой метки спивался в средне« в 2,5 раза, Считывая сланный состав органических сред, изучение влияния их отдельных компонентов } не проводилось, а ЛРА далее проводили по метода последовательного насыщения: сорбция актинавидина из исследуемой пробы, а затем - сорбция конъвгата на оставвийсз свободным иммобилизованный биотин. Данннй вариант исклвчает влияние компонентов сред на сорбции и активность конъвга'та Йкт-ПХ. Полученная по данному методу калибровочная зависимость представлена йа рис.7.

Разработанный мегод пазволяет определять концентрации 5СБ в среде в диапазоне 10-300 нг/кл, высокая чувствительность позволяет такие ясштчить влияние кевав^их компонентов путем разведения проба;

ОД 490 2,0. Г,5 1,0

Рис.?. Определение актинавидина в системе: ими БСА-био + Акт + Йкт-ПХ

0,5

О 200 ¡»ЭО 600 С, пг/мя

- 14 -

С цельв увеличения чувствительности специфичности определения бнл разработан rah'se ииыуноферментьшй анализ < ИОН) актинавидина. Принятая схеиа анализа включает следупщие стадии; 1 - и-аобилизация био-БСЙ на полнстироловои планае-те; 2 - сорбция актинавидина из определяемо раствора; 3 -сорбция антител против актинавидина; 4 - сорбция антивндовых антител, меченных ПК, Ь'етод позволяет определить' содержание актинавишша, начиная с 0,1 иг/нл в либой реальной среде,

5, Химическая очистка актинавидина.

Пани била предлоаена схеиа хииочистки, вклачавцая отделение иицельш центрифугированием (6000 в,15'); концентрирование супернатанта на плоских аеьзбраиах ("Рипор"- 120 или "Владипор"- 110) или УФ-латронех с полный волокнами; вцделе-нке продукта на аффинной 'колонке (ийинобиотин-Sepharosa 4В или ишшобиотин-Сфероцелл

Основная проблема, с которой ш столкнулись на данной этапе работы - слоаный коипонектний :остав культуральной аидкости к, что, самое главное,наличие кальциевых солей к целаноидного пигиента, иоторий уопст частично или полностью сорбироваться на аффинном носители, теы саыыи спивая его .специфическая сорбциоинця сикость.

При. сравнении результатов общего анализа белка в куль-' туральиой еядиости во Лоуря и по Бредфорду.иовно предположить, что кульгцральная видность содержит больвие количества низкомолакулярных компонентов пептидной природи. Действительно, -при- проведении B3BJ5 культуральнсй видкости из 4-х. основных пинов (си,рис.8) только два (1-й и 2-й) предстазля-sr собой белкоеие компоненты с иолекулярннаи массами; 1-й пик > 300 иД, 2-й пии - 40 кД (актинавидин), два.других (3-й и 4-й) --инзноиолекулярные компоненты с молекулярной массой, оггделешшЛ в опнтая по концентрирования на целлофане-и пу-tsu добаЬлс.ию сухого Sephadei; G-25, не виие 2 кД. - ОД 200

Д рбО

3.

Л

\

Рнс.0. ВЗЙХ культуральной ендкости Str.chro-

2 \J oofuscus Т-201.

lj\/f\ V верхняя кривпп - М 230 'ff , , ,_ . тпвпяя кривея - ОД 360-

Спектральные характеристики всех обнаруяенных методом ВЗШХ компонентов кцльтуральной аидкости указаваит на их пеп-тиднув природу. Во всех случаях в ЙФ-спектрах отмечена нак-симдмы при 260 ни и минимума при 250 нк с последующим резким увеличением оптической плотности в области поглощения пептидной связи. Из рассмотрения профиля элвции культуральной аидкости с детекцией на длине волна 360 ни видно, что втаим-продуцент секретнрует пигмент в высоко- к низкояолеку-лярной форме. При этом нельзя исключать вознонность ассоциации пигмента с белшдаи и пептндннан компонентами.

Методом В31Х иссльдовали такие динамику изменения компонентного состава посуточно при внрачивании продуцента на глвкозо-минеральной среде. Обнаруаеио, что при выращивании на этой среде кз происходит накопления пептидних непигменти-рованных компонентов С пик 4 ), а скорость их секреции в процессе культивирования зависит от возраста инокулшма. При засеве инокдлвна с возрастом знав 3-х суток накопление пептидов столь значительно, что площадь 4-го пика становится больве плочади 3-го пика яа момент зевервениа ферментации. До 7-х суток культивирования зклачительно не наблюдается Обогащение белкового иомпонзитного состаза культуральной аидкости, что укбзнвает на отсутствие или незначительность лизиса продуцента.

Результаты тйпичннх операций по выделения и очистке ак-гинавидина из культуральной аидкости приведены в таблице 2.

Таблица 2.

. Стадия очистки Объем, Пигмент, Белок, Йктинавиднн

(продукт) л 0410 г /л кг/л выход, У.

Отделение мицелия

(нативный р-р) 4.800 0.884 0.362 30.8 . 100

Концентрирование

(концентрат) 0.320 1.036 .4,778 477.9 ' 88

Пробоподготовка ■

(концентрат) 0.305 0.941 2.182 555,1 91

Аффинная

хроматография

(кислый элват) 0.395 - 0.513 515.2 93

Обессоливание

(активн. фракции) 0.330 - 0.470 470.3 89

Лиофильная суака

(сухой продукт.) - - — - 37

- 16 -

В результате последовательного проведения указанных операций выделения и очистки пояучели препарат актинавидииа с виходои ?0-8С/£. Предложенная схеиа вмделения и очистки препарата актмавиднна позволяет полностью освободиться от пигиента и балласршх белков, что подтверздаетса данными электрофореза ( отсутствий посторонних полос) и активностьи препарата - биртиноваи число« - 11,5+0,3 ед/аг, что составляет 52-Я?Х от ааксиыально возьшной.

6, Изучение свойств актинавидииа.

Гоиогенность полеченного препарата определяли иегсдсм изоэяектрофокусирсвашш в полиакрилавадноа геле с яоследу-вцей окраской на белок С Кукасси ярко-синим Р-250) и прсяв-лением зон БСБ с повоцыз 6йо-ПХ после блоттинга на ннтроцел-лалозиой иеабране. Получении? результаты показивавт, что ак-тинавндин пкрогете'рогеиен,-при ^тои все белковые зош обладают биотинсвяэнваацеЯ акпшиостьа. Зона актинавидииа расгт-лаггштса в интервале р1 ?,5~8,5, что отличает его от стреп-тзвиднна с р1 порядка 5,0,

По дашшн БЭ2К актинарндин гоиогенен и ииает иолекуляр-нуп ызссу около 40 кД, что отличает его от стрептавидинас 55 кД) и авидина С 6Б кД ).

Для определения суЗъедииичного состава белка проводили его диссоциации в' 2 Моль/л гуанидкн-хлориде. Лолекуларнуа массу определяли на ^ерЬадех £-50- при элвция водного раствора гуанидин-хлсрида с рН 2,0 во избевашш реассоциации субъэаняиц, Продукте диссоциации .здвнровади однки сивиет-ркчкла ппнсу, соотвётстсуицаи молекулярной uar.ce 20 кД. Та--кип образом, -актинавидлн состоит из двух субъединиц одинаковой молекулярной. иассл.

Эти дйннае подтверждается результатам электрофореза с П'Г»г в пр«.!гутеши додацилсульфата натрия, йктинаввдш под Ж^ствиеиЧзркаптоатанолз распадается на две субъединици с г.слекрярной -'вассой около 20 кД кавдая.

1к>-спситр антнназидина ииеет характерную для богатах 'т ннпофаном ' белков форму ( си,рис.9), ОД 2,0

Рис,9. УФ - спектр 1,0 - 1 актинавидине

О

- 17 ~

Оптическая плотность 0,12-го раствора с фасфатно-соле-вом буфера при 282 ки составляет 2,42.ед,.

Титрованиез Т1ШС б белке обнаружено 13 аминогрупп.

Одной из ваяних характеристик БСБ являются параметры йзаинодейст&из белка и красителя ПАВА по биотиисвязивавдш центрам ( Кдисс, вольная экстинция комплекса ). Для определения иольного коэффициента зкстинщш проводили спектрофого-метрическое титрование комплекса актикавндкн - 1!йВй о 0,1 1'иль/л натрпй-Сосфатиои буфере р!! 7,2 раствором биотнка известной концентрации. При витеснеют биотипом НйВЯ из комплекса происходит дкеньаенне поглощения раствора при 500 ии.Титрозаниев бнотинок в иолекцло акгииавкдина било обнару-аеио 1,71 связизащкх центра, что отракает неполноту свази-сания с красите пей, Из концентрации центров св„зиоаниа с разности 00 при 500 ни ( 0 300 ) бия определен иолышй коэффициент зкстинщш комплекса - 29540 ( 35500 - для авмдииа н 35000 для стрептавядинз ).

Затеи проводили определение Кдмсс кокллзвса на основа даннах СФ-тнтроваиня раствора акткназидкца известной концентрации раствором НЯЙЙ, Из полцччшшх значений 00 при 500 ни рассчитнвали равяовсснуи кощектрацка коаплекса и далее рассчитывали Кдисс по уравнения равновесия, Величина Кдисс составила Ноль/л £?*10"'> Д^й азидика н 1*10"* - для 'стрсптавидниа ).

Окуней В. 13. в твердофазной ЯРЯ па II схеме ( при одио-ионентиой конкуренции иоядд мечепгшн ИХ 'й иативинм ПСЕ д1шш определены реальниз константы срязмваикя БСБ и биотинилфо-вашшми макронаясульи«, п( частности,биа-ОСП. Для акткгзэи-дяна Ксв составила 9,05*10'1 л/Ноль, это с 2 раза боль«, чеу для авидина к стрептавидшт (около л/Коль).

Татш образок, гшипйЕпдип лзвготся саностоятелышн белкой груши» _гнжроО!шЯ БСБ, рг.пес кз оппсаикш? г. литературе. - .

0,- К«ядНОШт"вСКгЧ ПДСИГКТШГЦ^З

8 результате Гфзл:":0и ецгаает«.»?.«!? Сзлл

получека врсокоэкгигвая и о гп с п с г г ТО"с с я ^ « гпг.'о*,* с троп

антител на ектйшшдна п !Д0'- , 1гдсв%и:--¡г «г« " ппа со строптовидиио« и-пп 0::>л п^згглеп Г!Л и с:-':,С :гг гзй БСа-био на пат:старо/огик йгяп!ЫТ»;Г.: кто 5СП-б:'о 1 ССБ (>Н;г, С4> г (П:п) ♦ где Ат (Пит) - и:!ТНТС.1;\> !'!! О К'! I

Пт '({¡т )-11л - аигкйилт; *: /.Т|«*.Ьлл#."счс1:п:;г ис?г>:сигг.1-с£.

Поду^шче для о&оип егхшноии 0Р ЯЯ от йог.-

центрацнй участвувщих в анализе 5С5 ( 10-3-1-0,1 нг/мл) и разведений сыворотки ( i/lö5 - 1/2*10 - 1/4*1QS ) позволявт определить степень гомологичноети полик/шиальной сыворотки в стновении акт:.кавйднна и стрептавидина и определить 7. перекреста. Ок составляет в средней 502, что говорит о частичном совпадении их антчгенных детервинант.

7. Изучение воэиохности использования актинавидина в имиуно-хикическом анализе, /¡ля подтвервдения поливалеитности актинавидина, обеспечивавшей образование мостиков иеаду биотинилированными молекулами совместно с институтом цитологии АН СССР Сг,Ленинград), проводили гетерогенный рецепторно-ферментннй тест в модельной системе,

Для этого на полистироловий планвет сорбировали биоти-нилированнме антитела ( 1 час; 4 С; 0,05 Иоль/л карбонатнмй буфер pH 9.0) и далее в стандартной системе проводили последовательно сорбции актинавидина а био-ПХ с промывкой планшета иевду стадиями. Фераентативнуз реакцию проводили с о-фе-ннлендиамкном, йктинавндин сравнивали в этой системе с коа-ыерческим авидинов ( "LKB" ),

йз полученных результатов следует, что исследуемый белок - поливалентен и имеет аффинитет к биотина, сравнимый с авидннои. То обстоятельство, что для достиаения одинакового связывания аерокегдазн требуется на порядок- меньвее количество исследуемого БСБ в сравнении с авадином монет указывать как на болызуа чистоту его, так к на его более высокий аффинитет и валектнос',0. В контрольных- опытах было показано так-ве низкое значение"фонового сигнала в случае актинавидина,

Пригодность препарата актинавидина такве оценивали в НГ0 "Биолаг" (г.Олайяе, Латвия) при сравнении с авидиноы и ei d лроизСодшши ("Биолар"), стрептавидином (г.Новосибирск) и стрептЬвидином ("Sigaa", СОД) в ИФй на нитроцеллшшзных Ф".льтр-х по схеме: биотинилировакний иммуноглобулин - БСБ -б;ютииияиройанив0 фермент ( ПИ или щелочная фосфатаза), и в т-зстах ДНК-гибридизации: биотнни-ироваиний зонд - БСБ - би-с-тинилированная цепочная фосфатаза. Концентрация БСБ составляла 2,5 икг/мл, йктинавидин в описанных выше тестах дает хорошие результаты, фоновое окрашивание, наблюдаемое в случае авидина, отсутствует, неспецифической сорбции нет. Препарат актинавидина не уступает препарату стрептавидина ("SigDs") по результатам анализа.

Такии образом, актинавидии, обладая всеии достоинствами известных аналогов - авидина и стрептавидина - и имея несом-

ненное преимущество перед последними - более высокуп (приблизительно в/2 раза) аффинность при взаимодействии с биоти-нилированными макромолекулами, мовет быть рекомендован для использований в качестве компонента различных аналитических систем, построенных на принципе взаимодействия биотин-БС5.

ВНВОДН:

1. В результате скрининга почвенных актиноиицетов бил получен »таим 5Ьг.сЬгоюГизси5 Т-200, способный синтезировать в среду новый биотинсвязывавдий белок - актинавидин - в количестве 4-5 иг/л.

2. Под действием мутагена - 1,2,?,8,^диэпоксиоктана -была полдчена коллекция мутантов Б^.сЬговоГизсиз, устойчивых к селектину - 2-(4'-гидроксифенилазо)-бензойний кислоте ( НйВй ), с повнвеиной продукцией актинавидина, Иэ коллекции отобран высокоактивный вташ-иутант - БЬг.сЬговоГизсцд Т-201, превывавций исходный гтамм по уровни биосинтеза актинавидина в 5-7 раз.

3. Определены оптимальные параметры культивирования; температура (28'С), рН (7,0), аэрация (Уср=100 мл, п=220 об/вин), количество вносимого инокулвма (10 об.2), время^ (8 суток).

4. Подобран оптимальный компонентный состав питательной - глвкозо-мниеральной среда, обеспечивавший продукции актинавидина на уровне 40-50 иг/л.

5. Разработана технология выделения'и очистки актинави-дина из культуральной видшсТи,. вкличаадая этапы фильтрации, микрофильтрации, концентрирования на ЗФ-латроиах с полыми волокнами, аффиннуи хроматографии на нмйиобкотин-Сфероцелле и лиофильнув суаку. В результате получали препарат актинавидина, не содернаний неактивных примесей, с выходом 70-602 и активисст'ьв -. биотиновыы числом - 11,8+6,3 ед/вг, что составляет 92-97% 01 максимально вознааной.

9, Предловеин новые чувствительные и специфичные методы определения актииавигина - лиганд-рецепторна£ е использованием бнотинилированних БСЯ и ПК я прямого конъвгата БСБ-ПХ, и ивиунсферментный - с использованием кроличьи* поликлональ-ных антител на , актинавидин. Чувствительность определения составляет 10 н 0,1-1 ::г/кя, соответственно.

7. Изучены основные фиэико-хянические свойства актинавидина - нового представителя аикробннх БСВ. Показано, что актинавидин имеет молекулярную массу 40 кД, состоит из 2 субъединиц (20 нД),имеет ИЭТ 7.5-8.3, что отличает его от известных аналогов.

- 20 -

6. Показана возкоеность использования актинавидина в различных аналитических системах, г той числе ИФА и тестах ДНК-гкбридиэнцмг. Проведено сравнение с коыиерческиыи аналогами; актннавпдмн при этой ке уступаетпрепарата стрептави-дина ("SlgEa"); фоновое окравквание, наблюдаемое в случае авидина отсутствуат, кеспецкфической сорбции не наблвдается. При взаимодействии с Онотиыилироваишшк макромолекулами ак-тинавидин обладает более высоким аффинитетом.

Основные результаты Диссертации опубликованы в следу-ецих работах;

1, ЙС 'N 1643610 СССР, ККМ С 12 Q 1/32 Йикрофильмирущие систем./ Оташа Strepioi^ces chroaofuscus - продуцент би-откксвязивав^его белка,/ Кааиш fi.fi., Аак О.В., Корчагина ll.fi., Конев В.Е,, Галактионов.К.И., Деыин В.Г. и йазебник S.fi. - заяглЛ2.10.88. опубл. 4,05,99: бал. N 29. Зс.

2, Получение актинавндина - ынкробкого БСБ. / Корчагина Н.Й., йак О.Б., Каякнн А.П. // Сбориик трудов ЛенНИИВС, /1. ,1985.

3, Изучение аозиовности биосинтеза биотинсвязываа^его белка. / Корчагина li.fi., йак о!Е. // Тез. докл, конференции иалодкк ученик ЕНЙТЙЙФ, Л. ,1988. с.2.

4, Получение иутангов Sir.cfiroaofuscus с . повышенной продукцией актинавидкна./ Сорсиалетова Е.Ф., Корчагина Н.Й.//Тоз. докл. Конференции володых ученик ВКИТИЙФ.Л.,1990, с.8

5," Иетод определений актнкавидина - иккробного ЕСБ./Норчат.а-'Н.Й,, Йак О.Ь., Окунь В J.// Таы ве, с.88.

21.04,92 г. Зак. 13ДСП - 70. РТР. ЯТИ, Московски! пр., 26.